Экспериментальный подход к получению базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Карпова, Наталья Викторовна

• Карпова, Наталья Викторовна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Карпова, Наталья Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика и биологическая роль некоторых стероидных соединений

1.2 Важнейшие базовые стероидные соединения, получаемые микробиологической трансформацией стеринов

1.3 Сырье для получения базовых стероидных соединений

1.4 Механизм деградации стеринов микроорганизмами

1.4.1 Микробиологическое расщепление стероидного ядра

1.4.2 Микробиологическое расщепление боковой цепи стеринов

1.5 Взаимодействие микроорганизмов с гидрофобными стероидными субстратами

1.5.1 Использование циклодекстринов и их производных в микробиологических трансформациях стероидов

1.5.2 Применение иммобилизованных биокатализаторов

1.6 Подбор штамма-трансформатора

1.7 Процесс микробиологического 9а-гидроксилирования

1.8 Применение смешанных культур микроорганизмов

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Микроорганизмы и методы их культивирования

2.2 Условия проведения микробиологических трансформаций

2.2.1 Проведение процесса трансформации ФС с помощью М. пеоаигит

2.2.2 Проведение процесса трансформации АД с помощью Я. е^ИгороИя

2.3 Реактивы для выращивания культур и проведения процесса трансформации

2.4 Выделение продуктов микробиологической трансформации

2.5 Методы анализов, используемые в микробиологических трансформациях

2.5.1 Тонкослойная хроматография (ТСХ)

2.5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

2.5.3 Ядерный магнитный резонанс

2.5.4 Определение содержания глюкозы

2.5.5 Определение содержания СОг

2.6 Метод иммобилизации клеток бактерии Я. егуЖгороШ

2.7 ПЦР гена 168 рРНК, секвенирование полученных продуктов и

анализ последовательностей 16Б гРНК

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Микробиологическая трансформация фитостерина (ФС) с помощью

М. пеоаигит

3.1.1 Определение оптимальных условий микробиологической трансформации ФС с помощью М. пеоаигит

3.1.1.1 Влияние жирности соевой муки на биоконверсию ХС и ФС в андростендион (АД) с помощью М. пеоаигит

3.1.1.2 Влияние концентрации глюкозы и характера перемешивания культуральной жидкости М. пеоаигит на процесс трансформации ФС в АД

3.1.1.3 Влияние концентрации гидрокарбонатного иона на полноту биоконверсии ФС в АД с помощью М. пеоаигит

3.1.1.4 Исследование зависимости скорости накопления АД от дозы посевного материала М. пеоаигит

3.1.2 Трансформация ФС с нагрузкой 20 г/л помощью культуры М. пеоаигит

3.1.3 Трансформация ФС с нагрузкой 30 г/л с помощью культуры М. пеоаигит

3.1.4 Трансформация ФС культурой М. пеоаигит при повышенной

нагрузке (50 г/л)

3.2 Микробиологические трансформации стероидов с помощью бактериальной культуры Я. егуМгороШ ВКПМ Ас-1740

3.2.1 Идентификация нового штамма Я. егуМгороНя

3.2.2 Определение оптимальных условий проведения трансформации АД при нагрузке 4 г/л с помощью нового штамма Я. егуЖгороШ

3.2.3 Трансформация АД до 9а-ОН-АД культурой Я. егуЖгороШ с нагрузкой субстрата 6-20 г/л

3.2.4 9а-гидроксилирование АД культурой Я. егуМгороШ с нагрузкой субстрата 50 г/л

3.2.5 Гидроксилирование стероидов ряда андростана и ряда прегнана культурой Я. егуМгороШ

3.3 Трансформация АД иммобилизованной культурой Я. егу^гороШ

3.4 Трансформация ФС в 9а-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости смешанными культурами М. пеоаигит и Я. егуЖгороШ

3.4.1 Трансформация ФС в 9а-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости смешанными культурами М. пеоаигит и Я. егуМгороШ в присутствии солюбилизатора

3.4.2 Трансформация ФС до 9а-ОН-АД смешанными культурами М. пеоаигит и Я. етуМгороШ без солюбилизатора

3.5 Получение нового 9а-гидроксилирующего штамма Якос1ососсш

3.6 Микробиологическая трансформация 3-метилового эфира ХС до 3-метилового эфира ДГЭА культурой М. пеоаигит

3.7 Апробация микробиологического метода получения АД из ФС с помощью М. пеоаигит и превращения его в 9а-ОН-АД с помощью Я.

егуЖгороШ в ферментерах

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальный подход к получению базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов»

ВВЕДЕНИЕ

Стероиды, будучи регуляторами многих жизненно важных процессов в организме человека, нашли широкое применение в качестве лекарственных препаратов в онкологии, заместительной гормональной терапии, как противовоспалительные и антиаллергические средства, а также для решения таких социальных программ, как безопасное планирование семьи. Большая часть из них входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств (Машковский М.Д., 2012).

Потребность в стероидных лекарственных препаратах, как в мире, так и в России с каждым годом возрастает. Это связано с ухудшением общей экологической ситуации и соответственно с возрастающим количеством аллергических и воспалительных заболеваний. Несмотря на растущий спрос на стероидные лекарственные препараты, за последние 20 лет в России производство стероидных субстанций практически прекращено. Дефицит стероидного сырья возмещают за счет импорта, что в значительной степени влияет на стоимость готовых лекарственных форм, которые становятся недоступными для потребителей.

В настоящее время основным стероидным сырьем являются стерины растительного и животного происхождения - фитостерины (ФС) и холестерин (ХС) соответственно (Андрюшина В.А., и др., 2004). Большинство фармацевтических гигантов в области производства стероидных препаратов, такие как Upjohn (США), Serl (США), Schering (Германия), Mitsubishi (Япония) и др. используют стерины в качестве сырья для стероидного синтеза.

Для нашей страны наиболее перспективным и доступным видом стероидного сырья является ФС, получаемый из сульфатного мыла - отхода переработки древесины. Этот источник сырья для России практически неограничен. Содержание ФС в сульфатном мыле достаточно высокое - около 3% (по сухому весу) (Conner А., 1976). Рассматривается также возможность получения ФС из отходов производства рапсового и соевого масел.

Синтез стероидов из стеринов включает в себя окисление и деградацию боковой цепи стеринов.

Несмотря на имеющиеся достижения по химическим методам окисления боковой цепи стеринов, их использование в качестве стероидного сырья становится экономически выгодным только при наличии микробиологического способа окисления боковой цепи ФС (ХС) до 17-кетоандростанов: андростендиона (АД), 9а-гидрокси-АД (9а-ОН-АД), андростадиендиона (АДД), и дегидроэпиандростерона (ДГЭА) - ключевых промежуточных продуктов в синтезе практически всей номенклатуры стероидных препаратов из стеринов (Wang F., et al., 2011, Donova M.V., Egorova O.V., 2012).

Поэтому важной задачей нашего исследования является разработка эффективных микробиологических способов получения этих базовых продуктов (АД, АДД, 9а-ОН-АД, ДГЭА) из доступного отечественного сырья.

Расщепление боковой цепи стеринов с сохранением стероидного скелета осуществляют следующими способами: синтезом модифицированных стеринов; инкубацией стеринов в присутствии соединений, ингибирующих действие ферментов 9а-гидроксилазы или 1,2-дегидрогеназы; получение мутантных штаммов. Самым эффективным из этих способов деградации боковой цепи стеринов до 17-кето-андростанов является применение селективных мутантных штаммов бактерий, которые успешно применяются в промышленных микробиологических процессах (Wei W., et al., 2010).

Для окисления боковой цепи стеринов в мировой практике получены и используются мутантные штаммы микроорганизмов родов Mycobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Arthrobacter, Flavobacterium.

Серьезными проблемами в процессах микробиологической трансформации являются ингибирование процесса деградации боковой цепи стеринов продуктами реакции и низкая растворимость стеринов в воде (1 мг/л), что делает их недоступными для микроорганизмов. Для проведения ферментативного расщепления субстрат вносят в среду в форме

микрокристаллов (1-10 мкм), получают его водорастворимые формы или используют природные или синтетические полимеры.

Одним из важнейших базовых стероидов является андростендион (АД), из которого по совмещенной схеме синтеза может быть получена большая часть стероидных гормональных препаратов - гестагены, андрогены, минерало- и глюкокортикоиды, диуретики, анаболики и др. (Zhang X., et al., 2009).

В промышленном масштабе АД в основном получают из фитостеринов (ФС) и ХС с помощью мутантных штаммов рода Mycobacterium.

9а-ОН-АД - базовое соединение для получения 11Р-гидрокси-9а-галоидсодержащих аналогов ряда прегнана, обладающих высокой противовоспалительной и антиаллергической активностями, пользующихся широким спросом на фармацевтическом рынке. 9а-ОН-АД получают либо непосредственно из стеринов (иногда в присутствии адсорбентов), либо из АД. Конверсия АД в 9а-ОН-АД наиболее эффективно осуществляется мутантными штаммами микроорганизмов, у которых блокирован синтез фермента 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназы, отвечающего за нежелательную деструкцию стероидной молекулы (R. van der Geize, et al., 2008).

Преимущество микробиологического гидроксилирования актинобактериями очевидно, поскольку данная реакция в положение С9 полициклической системы стероидной молекулы химическим способом в промышленных масштабах не выгодно экономически и из соображений производственной безопасности. Также перспективным способом получения базовых гидроксисоединений является применение иммобилизованных культур микроорганизмов. Иммобилизованные биореагенты обеспечивают возможность многократного использования биомассы, создания длительных полунепрерывных и непрерывных микробиологических процессов, в которых существенно упрощаются способы выделения и очистки продуктов реакции (Fokina V.V., et al., 1996).

Дегидроэпиандростерон (ДГЭА) - полифункциональный стероидный гормон, который вырабатывается естественным образом надпочечниками из ХС и может

служить для организма отправным материалом для производства других гормонов, таких как эстрогены или андрогены.

ДГЭА производят из дефицитного стероидного сырья - диосгенина и в медицинской практике применяют при лечении онкологических, сердечнососудистых заболеваний, а также он обладает иммуностимулирующим действием.

В последнее время появилось много публикаций об уникальных биологических свойствах 7а-гидроксилированных производных ДГЭА (Janeczko Т., et al., 2009). У этой группы веществ установлено наличие противораковой, иммуностимулирующей, антихолестеринемической и ноотропной активностей, эффективности при лечении болезни Альцгеймера, что делает проблему их синтеза чрезвычайно актуальной.

Цель и задачи работы. Основной целью данной работы являлась разработка экспериментального подхода получения базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия проведения микробиологического расщепления боковой цепи стеринов до АД и с помощью культуры Mycobacterium neoaurum разработать метод получения АД при повышенных нагрузках ФС (до 50 г/л).

2. Провести селекционирование культур Rhodococcus для получения штаммов, обладающих высокой 9а-гидроксилазной активностью, и с их помощью разработать эффективный метод получения 9а-ОН-АД при повышенных нагрузках АД (до 50 г/л).

3. Исследовать 9а-гидроксилирующую способность культуры Rhodococcus erythropolis на примере стероидов ряда андростана и ряда прегнана.

4. На основе иммобилизованных клеток культуры R. erythropolis создать метод получения 9а-ОН-АД.

5. С помощью смешанных культур актинобактерий М. пеоаигит и Я. егуЖгороПя разработать одностадийный метод получения 9а-ОН-АД из ФС.

6. Создать одностадийный способ получения 3-метилового эфира ДГЭА (Ме-ДГЭА) из 3-метилового эфира ХС (Ме-ХС) с помощью культуры М. пеоаигит.

Научная новизна работы

Впервые определены оптимальные условия (влияние концентрации глюкозы, дозы посевного материала, режимов перемешивания и т.д.) микробиологического расщепления боковой цепи стеринов с помощью культуры М. пеоаигит до андростендиона в условиях насыщения среды гидрокарбонатным ионом.

Впервые с помощью культуры М. пеоаигит показана возможность проведения микробиологической трансформации фитостерина до

андростендиона - ценного ключевого соединения для фармацевтической промышленности - при высоких нагрузках, достигающих 50 г/л.

Селекционированием Юю(1ососст эр, получены 2 новых высокопродуктивных гидроксилирующих штамма, в которых отсутствует фермент 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназа. Штамм Ююйососсш егуЖгороНя с высокой 9а-гидроксилазной активностью, устойчивый к высоким концентрациям диметилформамида в реакционной среде, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Ас-1740 и защищен патентом РФ № 2351645 (Опубликовано 10.04.2009. Бюл. №10). Информация об идентификации штамма ЯЪ.о(1ососст уоузкуШИ, обладающего устойчивостью к гентамицину, внесена в международную базу данных ОепЬапк для дальнейшего депонирования в ВКПМ.

Впервые с помощью актинобактерии Якос1ососст егуЛгороИя проведено 9а-гидроксилирование стероидов ряда андростана и ряда прегнана. Получено 11

новых фармацевтически перспективных 9а-гидрокси-аналогов андростанового и прегнанового рядов. Структура новых соединений подтверждена данными спектров ядерного магнитного резонанса ЯМР 'Н.

С помощью биокатализатора длительного действия с включением в гранулы клеток оригинальной культуры Я. егугкгороИз разработан новый способ получения 9а-ОН-АД.

Впервые с помощью смешанных культур М. пеоаигит и Я. егуЖгороИз проведена микробиологическая трансформация фитостерина до 9а-гидроксиандростендиона без стадии химического выделения полупродукта -андростендиона - и применения дорогостоящих солюбилизаторов и токсичных органических растворителей.

Разработан экспериментальный подход микробиологического получения фармакологически ценного стероидного соединения - 3-метилового эфира ДГЭА с помощью культуры М. пеоаигит.

Практическая значимость

Усовершенствование процесса микробиологической трансформации стеринов с помощью культур М. пеоаигит и Я. егу^гороШ до АД, 9а-ОН-АД, ДГЭА позволило значительно поднять концентрацию стеринов и выход целевых продуктов, которые являются исходными субстратами для промышленных технологий получения высокоактивных стероидных лекарственных препаратов как у нас в стране, так и за рубежом.

Получен оригинальный селективный штамм Я. егугкгороШ и на его основе разработан новый микробиологический метод, который может быть использован в промышленном синтезе высокоактивных стероидных лекарственных препаратов, в том числе и фторированных.

С помощью нового штамма Я. егуНю-ороИя получены новые фармацевтически перспективные 9а-гидроксисоединения андростанового и прегнанового рядов. Разработан эффективный способ получения 9а-ОН-АД

непосредственно из ФС с использованием смешанных бактериальных культур М. пеоаигит и Я. егуМгороШ, позволяющий избежать дополнительных стадий химического выделения и очистки, что позволяет значительно сократить временные и трудовые затраты, а также улучшить экологические характеристики процесса.

Разработан новый способ получения фармакологически ценного соединения Ме-ДГЭА из Ме-ХС с помощью культуры М. пеоаигит.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Осуществление экспериментального микробиологического подхода получения АД из ФС с использованием культуры М. пеоаигит .

2. Исследование 9а-гидроксилазной активности культуры Я. егуЖгороИя и разработка метода получения 9а-ОН-АД из АД с помощью данного микроорганизма-трансформатора.

3.Использование смешанных культур М. пеоаигит и Я. егуЫгороШ для получения 9а-ОН-АД из ФС.

4. Создание метода получения фармакологически ценного соединения Ме-ДГЭА из Ме-ХС с помощью культуры М. пеоаигит.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 7 статей, 6 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК, 1 сообщение и 9 тезисов; получен 1 патент РФ.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на Всероссийской научно-технической конференции- выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (2004, Санкт-Петербург); III международном конгрессе

«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2005, Москва); международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (2005, Москва); XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2005, Москва); I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (2007, Пущино); XX зимней международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва); XXVIII Российской Школе «Наука и технология» (2008, Миасс); International Scientific Conference on "Chemistry for Development and Integration" (2008, Hanoi); VI международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2012, Москва); VII международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2013, Москва); V Международной научно-практической конференции (2013, Ростов); Научной кафедральной конференции кафедры биохимии РУДН (Смирнова И.П., Карпова Н.В.)(2013, Москва).

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей главу «Описание материалов и методов исследования» и главу «Изложение результатов и их обсуждение», заключения, выводов, списка цитируемых литературных источников (142), из которых 120 зарубежных. Работа содержит 119 страниц машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 32 рисунками.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Характеристика и биологическая роль некоторых стероидных соединений Стероиды представляют собой широко распространенную группу органических соединений, в которую входят желчные кислоты (холевая, дезоксихолевая кислоты и др.), гормоны, выделяемые половыми железами и корой надпочечников млекопитающих, сердечноактивные вещества, растительные алкалоиды (соласодин, томатидин) и стерины.

Структура стероидов представляет собой конденсированную систему циклопентанпергидрофенантрена, в которой объединены четыре кольца — три шестичленных кольца (А, В, С) и одно пятичленное кольцо (D) (рисунок 1). Эта система называется «стероидным скелетом», поскольку она характерна для всех стероидов (Ахрем A.A., Титов Ю.А., 1970; Физер JL, Физер М., 1964).

Рисунок 1 - Структурная формула р-ситостерина

Желчные кислоты, в основном, холевая и дезоксихолевая (в виде натриевых солей производных с глицином или таурином), входят в состав желчи (рисунок 2). Они играют важную роль в усвоении жиров организмом. Желчные кислоты склонны к образованию комплексов с разнообразными органическими соединениями, благодаря чему в желчи растворяются многие нерастворимые в воде вещества, например каротин, жиры. Предшественником в биосинтезе желчных кислот является холестерин.

Стероидные гормоны осуществляют контроль над специфическими процессами роста, нормального развития и функционирования организма. В

зависимости от биологического действия стероидные гормоны подразделяются на четыре группы:

1) андрогенные (тестостерон, дегидроэпиандростерон, андростерон, последний служит стандартом для сравнения андрогенной активности различных препаратов);

2) гестагенные (прогестерон);

3) эстрогенные (эстрон, эстриол, эстрон);

4) кортикостероиды, разделяемые по биологическому действию на минералокортикостероиды (дезоксикортикостерон) и глюкокортикостероиды (кортикостерон, кортизон, гидрокортизон).

Основные пути биосинтеза кортикоидов и половых гормонов представлены на рисунке 3.

Стерины встречаются в природе в виде свободных спиртов, либо в виде эфиров высших жирных кислот. Они представляют собой кристаллические вещества, практически нерастворимые в воде. Стерины являются жизненно необходимым компонентом, как эукариотов, так и прокариотов. Стерины обнаружены в клетках микроводорослей, дрожжей, простейших. В структуре клеточных мембран стерины контролируют проницаемость, в некоторых растениях отвечают за специфическую функцию размножения клеток. Все стерины построены по общей схеме, у многих стеринов имеется 5,6-двойная связь (рисунок 2).

Стерины в больших таксономических группах различаются по строению и составу. Стерины, встречающиеся в организме животных, называются зоостеринами, из которых наиболее важным является холестерин. Стерины, выделяемые из дрожжей или плесневых грибов, называются микостеринами. К микостеринам относится эргостерин. Стерины низших и высших растений называются фитостеринами (ФС).

ФС, выделяемые из растительного сырья, представляют собой, как правило, смесь Р-ситостерина, кампестерина, стигмастерина, брассикастерина и других

видов стерииов в различном количественном соотношении в зависимости от

источника происхождения (Ахрем А.А., Титов Ю.А.,197; Уо1кшап 1.К., 2003)

(Я=Н), холевая кислота (Я=ОН)

но

Соласодин

Эргостерин

Стигмастерин

Бета-ситостерин Холестерин

Рисунок 2 - Типы стеринов.

ХОЛЕСТЕРИН

МИНЕРАЛОГЛЮКОКОРТИКОИД

Рисунок 3 - Основные пути биосинтеза кортикостероидов и половых гормонов

В таблице 1 приведены формулы стеринов, наиболее часто встречающиеся в растительных источниках.

Таблица 1 - Структуры наиболее часто встречающихся фитостеринов

Соединение Структурная формула Брутто-формула Мол. вес

Р-Ситостерин (I) /СНз НзС,,,, % "Г-н т "эр HjC н \ н н С29Н50О 414

Стигмастерин (II) сн3 нзс...... Нэ| I -н Т н3с Н3С Г Н Г \ н н С29Н480 412

Кампестерин (III) СН, % "Г-н т НзС НдС н у н н С28Н480 400

Брассикастерин (IV) нэс НзС..... Т-н т Н3С Н3С н \ С28Н460 398

Известно, что фитостерины способны снижать уровень ХС в крови (Plat J., et al. 2000; Mensink R.P., et al., 2002). Потребление ФС от 2 до 3 г/сут позволяет у человека снизить уровень липопротеинов низкой плотности ХС примерно на 10% (Katan М.В., et al., 2003). Так же ФС обладают противовоспалительным и жаропонижающим действием (Bouic P.J., 2001).

Первым стерином, строение которого удалось установить лишь в 30-х

годах прошлого столетия, был холестерин. ХС содержится почти во всех клетках и жидкостях организма животных. Помимо участия в регуляции процессов диффузии в клетках, ХС служит источником образования в организме других стероидных соединений (рисунок 3). Около 27% ХС в крови находится в свободном состоянии, остальное количество этерифицировано жирными кислотами С16 и С18 (Rozner S., Garti N., 2006).

Среди микостеринов наиболее хорошо изучен эргостерин (рисунок 2), синтезируемый дрожжами.

ФС, как было сказано выше, встречаются в виде смесей, часто очень сложных, поэтому выделение чистых индивидуальных компонентов сопряжено с большими трудностями (Ахрем A.A., Титов Ю.А., 1970; Физер Д., Физер М., 1964).

1.2 Важнейшие базовые стероидные соединения, получаемые микробиологической трансформацией стеринов

В настоящее время основным сырьем для синтеза гормональных стероидов являются стерины растительного и животного происхождения - ФС и ХС (Sallam L. А. R., et al., 2008).

Практически вся номенклатура современных жизненно необходимых стероидных лекарств может быть получена из стеринов через 17-кетоандростаны: андростендион (АД), 9а-гидрокси-АД (9а-ОН-АД), андростадиендион (АДД) и дегидроэпиандростерон (ДГЭА) (Donova М. V., Egorova O.V., 2012) (рисунок 4).

Рисунок 4 - Схема получения базовых соединений с помощью микробиологического расщепления боковой цепи стеринов.

Из АДЦ получают эстрогены и 19-норстероиды. Остальной спектр стероидных лекарств получают из АД, 9а-ОН-АД и ДГЭА.

Андростендион (АД, андрост-4-ен-3,17-дион) - один из первичных андрогенов, выделяемых надпочечниками человека вместе с ДГЭА. Они на пару отвечают за 5-10% андрогенной активности у взрослых мужчин. АД впервые был выделен в 1935 году, а в конце пятидесятых годов было обнаружено, что АД обладает слабой андрогенной активностью и может превращаться в активные стероиды - тестостерон и дегидротестостерон или эстрогены - в гормонозависимых чувствительных тканях и органах (Ruta L., et al., 2011).

Несмотря на то, что в норме воздействие АД уступает воздействию других мужских половых гормонов (в первую очередь тестостерона), его значение

возрастает при развитии «вирилизующих» синдромов. Измерение концентрации АД применяется для дифференциальной диагностики и контроля лечения этих заболеваний. Кроме того, «слабые» андрогены играют ведущую роль в метаболизме пациентов с низкой концентрацией тестостерона в норме (например, мальчиков до периода полового созревания). АД также является основным стероидным гормоном женщин в постменопаузе.

Организм вырабатывает андростендион двумя различными путями: или из ДГЭА, или из 17а-гидроксипрогестерона (рисунок 3).

Для фармацевтической промышленности АД получают микробиологическим отщеплением боковой цепи стеринов. АД является важнейшим ключевым соединением, из которого может быть получена большая часть стероидных препаратов:

1.Минерало- и глюкокортикоиды: гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, флудрокортизон;

2. Андрогены: метилтестостерон, эфиры тестостерона и др.;

3.Гестагены: ацетомепрегенол, мегестрола ацетат, эфиры 17а-гидроксипрогестерона и др.;

4. Диуретики: спиронолактон, канренон и др.;

5. Анаболики: метандростенолон.

Дегидроэпиандростерон (ДГЭА) - ЗР-гидроксиандрост-5-ен-17-он или прастерон - и его сульфатный эфир (ДГЭА-Б), являются естественными и одними из самых важных гормонов, вырабатываемых надпочечниками и гипофизом.

В последнее десятилетие наблюдается огромный интерес в изучении биологической роли этих гормонов, имеющих разнообразные физиологические, биологические и биохимические эффекты, охватывающие различные типы клеток, тканей и органов (КаНгш М., е1 а1., 1994).

ДГЭА и ДГЭА-Б, как известно, оказывают основные физиологические и патологические эффекты на когнитивные функции и память (811еа1уа С. Ы., 1995). Интересно, что уровни ДГЭА и ДГЭА-Б постепенно снижаются в процессе

старения (Shealya С. N., 1995; Jennifer L., et al., 2013). Это снижение связано процессами дегенерации нейронов и дисфункцией. Кроме того, ДГЭА недавно был идентифицирован как регулятор пролиферации нейронов стволовых клеток (Shealya С. N., 1995). В моделях на животных, ДГЭА показал защитные свойства против различных заболеваний, включая ожирение, диабет, иммунные нарушения, атеросклероз и рак. Существует ряд доказательств положительных эффектов ДГЭА у больных с надпочечниковой недостаточностью (Shealya С. N., 1995; Krug A., et al., 2008).

По литературным данным ДГЭА может применяться при лечении астмы. ДГЭА предотвращает и смягчает аллергическое воспаление в дыхательных путях и не обладает нежелательными побочными эффектами глюкокортикоидов (Kasperska-Zajac А., 2010).

ДГЭА производят из дефицитного стероидного сырья - диосгенина. Далее, используя гидроксилирующую способность микроорганизмов, получают гидроксипроизводные ДГЭА, обладающие уникальной биологической активностью и представляющие огромный интерес для медицины. (Из литературных источников известно, что 7а-гидрокси-производные ДГЭА обладают в несколько раз более высокими иммунозащитными и иммунорегуляторными свойствами по сравнению с самим ДГЭА (Janeczko T., et al., 2009). Кроме того, 7а,15а-дигидрокси-ДГЭА является ключевым промежуточным соединением для синтеза фармакологически активных стероидов, таких как антагонисты альдостерона, диуретики и препараты для лечения гинекологических заболеваний. Это ключевой промежуточный продукт для синтеза дроспиренона, который является активным компонентом оральных контрацептивов последнего поколения, отличающихся отсутствием минералокортикоидного эффекта. Химически получить 7а,15а-дигидрокси-ДГЭА очень сложно, и поэтому используют способ микробиологического дигидроксилирования ДГЭА с помощью грибной культуры Colletotrichum lini (Li H., et al., 2013).

9а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион (9а-ОН-АД) - ключевой предшественник в синтезе большого числа высокоактивных противовоспалительных и антиаллергических кортикостероидных препаратов, фторированных по С9, таких как - дексаметазон, синафлан, триамцинолон и др.(Ниу L. D., et al., 2014). 9а-ОН-АД обладает антиандрогенной и анти-эстрогенной активностью (Slijkhuis Н., Marx A. F., 1992). В настоящее время 9а-ОН-АД получают из стеринов двумя способами:

1)двухстадийным процессом с получением АД из стеринов методом микробиологического синтеза бактериями рода Mycobacterium (Kennecke М., Weber А., 1996., Malaviya A., Gomes J., 2008; Wei W., et al., 2010), а затем - 9a-гидроксилированием АД трансформацией микроорганизмами (Kieslich К., 1983; Jiu J., et al., 1983; Malaviya A.; Wei W., et al., 2010),

2) получение 9а-ОН-АД из ФС ферментативным окислением боковой цепи мутантными микроорганизмами (Marx A. F., Slijkhuis Н., 1994; Slijkhuis Н., Marx A. F., 1992).

1.3 Сырье для получения базовых стероидных соединений

В настоящее время во всем мире резко увеличилось потребление стероидов, применяющихся в медицине и ветеринарии. Рынок 17-кетоандростанов превысил сотни млн. долларов США, и потребности фармацевтического рынка в этих соединениях продолжают расти (Donova М. V., Egorova О.V., 2012). Поэтому важными являются разработки технологий получения базовых соединений из доступного сырья.

Существует 2 основных способа получения базовых стероидных соединений с использованием различного сырья:

-химическая трансформация сапогенинов, таких как, диосгенин, гекогенин, соласодин, до С21-стероидов;

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Карпова, Наталья Викторовна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алебян Г.П., Арзуманов Е.Н., Мкртчан М.Б., Тозалакян П.В., Лозинский В.И., Вайнерман Е.С., Рогожин С.В. Кинетические аспекты функционирования L-аспартат-Р-декарбоксилазы в свободных и иммобилизованных клетках Alcoligenes faecalis при трансформации L-аспарагиновой кислоты. // Биотехнология.-1990.-N.6.-C.29-32.

2. Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Савинова Т.С. и др. Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона из стеринов растительного и животного происхождения и их производных. // 2002,-Евразийский патент № 003019. Кл. С12Р 33/16.

3. Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Скрябин К.Г. и др. Штамм бактерий Mycobacterium neoaurum и способ его использования для получения андрост-4-ен-3,17-диона из стеринов растительного и животного происхождения. //-2004,-Патент РФ № 2231553. Кл. С12Р 33/00.

4. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Микробиологическая трансформация стероидов. // Москва. Наука.-1965.-С.504.

5. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. // Москва. Наука.-1970.-Т.2.-С.526.

6. Блуэ Э. Нативные и модифицированные циклодекстрины KLEPTOSE®: многофункциональные вспомогательные вещества для молекулярной инкапсуляции. // Фармацевтическая отрасль. 2011.-T.-29.-N.6.-C.46-48.

7. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий. // Микробиология.-2002.-Т.71.-К4.-С.500-508.

8. Ван Дер Гейзе Р., Хесселс Г., Дейкхейзен Л. Способ конструирования генетически модифицированного штамма микроорганизма.-2006.-Патент РФ 2268935.

9. Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Савинова Т.С. Идентификация нового штамма трансформирующих стероиды микобактерий как Mycobacterium neoaurum. II Прикладная биохимия и микробиология.-2003 .-Т.39,- N.2.-С. 173-179.

Ю.Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Стыценко Т.С. Трансформация андростендиона и андростадиендиона бактериями, деградирующими стерины. // Прикладная биохимия и микробиология.-2004.- Т.-40. -N.5.-C. 536-543.

11.Войшвилло Н.Е., Парнес Я. А. Селективное расщепление стеринов микроорганизмами. // Биологические науки.-1981.-N.2.-C.32-45.

12.Герасименко В.А. Обзор методов определения глюкозы. Справочное пособие.// Издательство Экспертиза.- Ижевск.- 2002.

13.Гиндуллина Т.М., Дубова Н.М. Хроматографические методы анализа. Учебно-методическое пособие. // Издательство Томского политехнического университета.- 2010.

Н.Давиденко Т. И., Бондаренко Г. И. Использование иммобилизованных в каррагинан клеток микроорганизмов для получения органических веществ. // Успехи химии.-1990.-Т.59.-В.З.-С.509-521.

15.Донова М. В., Добвня Д.В., Калиниченко А.Н. и др. Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона. // 1997.- Патент РФ 94017640.

16. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии.-2002.-T.7.-N.6.-C.559-585.

17.Машковский М.Д. Лекарственные средства. // Москва. Новая волна. 16-издание.-2012.-С. 1216.

18.Радбиль Б.А., Кочев Д.М., Золин Б.А., Климанский В.И., Крепкий Е.Н., Лобанова Л.В.Способ получения ситостерина из таллового пека. // 1999. -Патент РФ N.2128662.

19.Скрябин Г. К., Головлева JI. А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. // Москва. Наука -1976.-c.336.

20.Стелла В.Ж., Раевски Р. Очищенные производные сульфалькильных эфиров циклодекстрина или их смесь, клатратный комплекс производных циклодекстрина с лекарственным веществом и фармацевтическая композиция.// 1998.- Патент РФ N.2113442.

21.Турута A.M., Войшвилло Н.Е., Камерницкий A.B. Микробиологическое гидроксилирование 5а-Н-стероидов. // Успехи xhmhh.-T.61.-N.10-1992.-С.1883-1931.

22.Физер Л., Физер М. Стероиды. // Москва. Мир.-1964.-С.982.

23.Alekhina Т. М., Ryzhkova V. М., Gusarova Т. I., Kurakova V. V., Klubnichkina G. A. Microbiological transformation of inclusion compounds of steroids with ß-cyclodextrin. //Pharmaceutical Chemistry J.-1993.-V.27.-I.4.-pp.288-293.

24.Ariga O., Kato M., Sano Т., Nakazawa Y., Sano Y. Mechanical and kinetic properties of PVA hydrogen immobilizing ß-galactosidase. // J. of Fermentation and Bioengineering. -1993 .-V.7-6.-N.3 .-pp.203-206.

25.Arima K., Sih C. Roussel Prize Lecture. // 1980.-Paris.-pp. 1-32.

26.Atrat P., Hösel P., Richter W., Meyer H., Hörhold С. Interactions of Mycobacterium fortuitum with Solid Sterol Substrate Particles. // J. of basic microbiology.-1991 .-V.31 .-pp.413-422.

27.Atrat P., Hüller E., Hörhold С. Steroid Transformation with Immobilized Microorganisms. // European J. Appl Microbiol Biotechnol.-1981.-V.12.-pp.157-160.

28.Bell A.M., Boul A.D., Ewart R.H., Meakins G.D., Miners J.O., Wilkins A.L. Introduction of 16a, 9a and За-hydroxy-groups into deoxygenated 5a-androstans by the fungus Diaporthe celastrina. II J. Chem. Soc. Perkin Trans.-1975.-N. 14.-pp.1364-1366.

29.Benites C.I., Concha V.O.C., Reis S.M.P.M., de Oliveira A.C. Physiochemical Characterization of Soybean Oil Deodorizer Distillate. //Chemical Engineering Transactions.-2009.-V.17.-pp.903-908.

30.Bouic P.J. The role of phytosterols, phytosterolins in immune modulation: a review of the past 10 years. // Curr Opin Clin Nutr Metab Care.-2001.-V.4.-pp.471-5.

31.Charney W. H. Microbial transformation of steroids. // N. York.London: Academic Press.-1967.-p.728.

32.Chen K.-C., Yin W.-S., Houng J.Y. 1 la-hydroxylation of progesterone using modified alginate-immobilized cells. //Enzyme Microb. Technol.-1994.-V.16.-pp.551-555.

33.Conner A. H., Nagaoka M., Rowe J. W., Perlman D. Conversion of Tall Oil Sterols to C19 Steroids. //Appl and Environmental Microb.-1976.-V.32.-N.2.-pp.310-311.

34.Dias A.C.P., Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. Sterol side-chain cleavage with immobilized Mycobacterium cells in water-immiscible organic solvents. //Enzyme Microb. Technol.-1994.-V.16. pp.708-714.

35.Dlugonski J., Wilmanska D. Deleterious effects of androstendione on growth and cell morphology of Schizosaccharomycec pombe. II Antonie van Leeuwenhoek.-1998.-N.73.-pp. 189-94.

36.Donova M. V., Egorova O.V. Microbial steroid transformations: current state and prospects. // Appl Microbiol Biotechnol.-2012.-V.94.-pp. 1423-1447.

37.Donova M.V., Nikolayeva V.M., Dovbnya D.V., Gulevskaya S.A., Suzina N.E. 2007 Methyl-(3-cyclodextrin alters growth, activity and cell envelope features of sterol-transforming mycobacteria. //Microbiology.-2012.-V. 153 .-N.6-pp. 19811992.

38.Dutta R.K., Roy M.K., Singh H.D. Metabolic blocks in the degradation of sitosterol by a plasmid-cured strain of Arthrobacter oxydans. II J.Basic Microbiol. 1992.-V.32.-N.3 .-pp. 167- 176.

39.Egorova O., Gulevskaya S., Puntus I., Filonov A., Donova M. Mutants of Mycobacterium sp. Producing androstendione. //J. Chem Technol Biotech.-2002.-V.77.-pp.141-147.

40.Egorova O.V., Nikolayeva V.M., Sukhodolskaya G.V., Donova M.V. Transformation of C19-steroids and testosterone production by sterol-transforming strains of Mycobacterium spp. //J. Mol Cat B: Enzym.-2009.-V.5.-pp. 198-203.

41.E1-Hady A.A., El-Rehim H.A. Production of prednisolone by Pseudomonas oleovorans cells incorporated in radiation crosslinked hydrogels. //J. Biomed. Biotechnol.-2004.-V.4.-N.4.-pp.219-226.

42.Fernandes P., Cruz A., Angelova B., Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. Microbial Conversion of Steroid Compounds: Recent Developments. // Enzyme and microbial technology.-2003.-V.32.-pp.688-705.

43.Fokina V., Susina N., A.Arinbasarova, Zubov A., Lozinsky V., Koshcheenko K. Immobilization of Arthrobacter globiformis 193 cells into PVA cryogel. //Dehydrogenation of steroid substrates. In: Immobilized Cells: Basics and Applications. ( R.H.Wijffels, R.M. Buitelaar, C.Bucke, J.Tramper eds) Elsevier Sci. B.V. Amsterdam e.a.-1996.-pp.90-97.

44.Fujimoto Y., Chen C.S., Gopolan A.S., Sih C.J., Wang K.C., Tai H.H. Microbial degradation of the phytosterol side chain. Incorporation of NaHi4C03 onto the C-28 position» J. Am.Chem. Soc.-V.104.-pp.4720-4722.

45.Fujimoto Y., Chen C.S., Szeleczky Z., Tullio D.D, Sih C.J. 1983. Microbial degradation of the phytosterol side chain. //J.Am.Chem.Soc.-1982.-V.104.-pp.4718-4720.

46.Fukui S., Tanaka A. Immobilized cells: transformation of steroids. European. //J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1982.-V.36.-pp. 145.

47.Gilliland S.E., Nelson C.R., Maxwell C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. //Appl. Environ. Microbiol.-1985.-V.49.-pp.377-381.

48.Goetschel R., Bar R. Formation of Mixed Crystals in Microbial Conversion of Sterols and Steroids. // Enzyme and microbial technology.-1992.-V.14.-pp.462-469.

49.Goswami P.C., Singh H.D., Bhagat S.D., Baruah J.N. Mode of uptake of insoluble solid substrates by microorganisms. I. Sterol uptake by an Arthrobacter species. // Biotechnol. Bioeng.-1983.-V.25.-pp.2929-2943.

50.Gramera R., Caimi R., Cyclodextrin polyethers and their production.//1969.-US Patent N3459731.

51.Harms H., Smith K.E.C., Wick L.Y. Introduction: Problems of Hydrophobicity. Bioavailability. In: Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. //Timmis K.N. (Ed.). Springer. ISBN: 978-3-540-77588-1. Berlin. Germany.-2010.-pp. 1479-1490.

52.Heipieper H.J., Cornelissen S., Pepi M. Surface Properties and Cellular Energetics of Bacteria in Response to the Presence of Hydrocarbons. In: Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. //Timmis K.N. (Ed.). Springer ISBN: 978-3-540-77588-1. Berlin. Germany.-2010.-pp. 1479-1490.

53.Hesselink P.G., van Vliet S., de Vries H., Witholt B. Optimization of steroid side-chain cleavage by Mycobaterium sp.in the presence of cyclodextrins. //Enz. Microb. Technol.-1989.-V.ll.-pp.398-404.

54.Hirota Y., Nagao T., Watanabe Y., et al. Purification of Steryl Esters from Soybean Oil Deodorizer Distillate. // J. of the American Oil Chemists Society.-2003.-V.80.-pp.341-346.

55.Holland H. L., Poddar S., Tripet B. Effect of cell immobilization and organic solvents on sulfoxidation and steroid hydroxylation by Mortierella isabellina. //J. of Industrial Microbiology.-1992.-V. 10.-pp. 195-197.

56.Holland H.L. Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalysts. //Steroids.-1999.-V.64.-N.3 .-pp. 178-186.

57.Huang J., Xie S., He J., Wang P. Effects of Ionic Liquids on the Growth of Arthrobacter simplex and Improved Biodehydrogenation in an Ionic Liquid-Containing System with Immobilized Cells. //Appl. Biochem.-2012.-V.167.-pp.2131-2143.

58.Huy L. D., Diep N. T., and Nhung L. T. K. Alternative road for synthesis of 16a,17a-epoxy-preg-4,9(l l)-dien-21-ol-3,20-dione from 9a-hydroxy-androstenedione. // Pharmaceutical Chemistry J.-2014.-V. 47.-N. 10.-pp.562-565.

59Janeczko T., Dmochowska-Gladysz J., Kostrzewa-Suslow E., Bialonska E., Ciunik Z. Biotransformations of steroid compounds by Chaetomium sp. KCH 6651. //Steroids.-2009.-V.74.-pp.657-661.

60Jennifer L., Heaney J., Carroll D., Phillips A. C. DHEA, DHEA-S and Cortisol responses to acute exercise in older adults in relation to exercise training status and sex. //AGE.-2013.-V.35.-pp.395^105.

61.Jiu J., Marsheck W. J., Wang P. T. Microbial process for 9a-hydroxylation of steroids. //1983.-US 4397947A.

62.Johnsen A.R., Karlson U. Evaluation of Bacterial Strategies to Promote the Bioavailability of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. //Appl. Microb. and Biotechnology.-2004.-V.63.-pp.452-459.

63.Jones E. R.H. Microbiological hydroxylation of steroids and related compounds. //Pure Appl. Chem.-1973 .-V.33 .-N. 1 .-pp.39-52.

64.Kasperska-Zajac A. Asthma and Dehydroepiandrosterone (DHEA): Facts and Hypotheses. //Inflammation.-2010.-V.33.-N.5.-pp.320-324.

65.Katan M.B., Grundy S.M., Jones P., Law M., Miettinen T.A., Paoletti R., et al. Efficacy and safety of plant stanols and sterols in the management of blood cholesterol levels. //Mayo. Clin. Proc.-2003.-V.78.-pp.965-78.

66.Kennecke M., Weber A. Process for the production of 4-androstene-3,7-dione and 1,4- androstadien-3,17-dione from ergosterol with mycobacterium. //1996.-US Patent 5516649.

67.Kieslich K. Process the preparation of 9a-hydroxy -4- andeosten-3,17-dione. //1983.-EP 0027829 Bl.

68.Kieslich K. Microbial side-chain degradation of sterols. // J. Basic Microbiol.-1985.-V. 25.-pp. 461-474.

69.Kim S.J., Kweon O., Cerniglia C.E. Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Mycobacterium Strains. In: Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. // Timmis K.N. (Ed.). Springer, ISBN: 978-3-540-77588-1. Berlin. Germany. 2010. pp. 1479-1490.

70.Korycka-Machala M., Ziolkowski A., Rumijowska-Galewicz A., Lisowska K., Sedlaczek L. Polycations Increase the Permeability of Mycobacterium vaccae Cell Envelopes to Hydrophobic Compounds. // Microbiology-SGM.-2001.-V.147.-pp.2769-2781.

71.Krug A. W., Ziegler C. G., Bornstein S. R. DHEA and DHEA-S, and their Functions in the Brain and Adrenal Medulla. //Neuroactive Steroids in Brain Function, Behavior and Neuropsychiatrie Disorders.-2008.-pp.227-239.

72.Kuman R., Dahiya J., Singh D., Nigam P. Biotransformation of cholesterol using Lactobacillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor. //Bioresour Technol.-2001 .-N.78.-pp.209-l 1.

73.Kurakov V.V., Korobova Y.N., Skvortsova L.F. Influence of physico-chemical factor. //1989.-V.4.-pp.486-493.

74.Leusch F. D. L., MacLatchy D. L. In vivo implants of ^-sitosterol cause reductions of reactive cholesterol pools in mitochondria isolated from gonads of male goldfish (Carassius auratus). //General and Comparative Endocrinology.-2003.-V.134.-N.3.-pp.255-263.

75.Li H., Fu Z., Li H., Dou W., Shi J., Xu Z. Improvement of the Steroid Dihydroxylation Efficiency from Dehydroepiandrosterone Using a Substrate Pre-induction Biotransformation Process. //Biotechnology and Bioprocess Engineering.-2013 .-V. 18.-pp.486-490.

16.1Â J.H., Guan Y.X., Wang H.Q., Yao S.J. Dehydrogenation of lla-hydroxy-16a,17-epoxyprogesterone by encapsulated Arthrobacter simplex cells in an aqueous/organic solvent two-liquidphase system.//J. Chem. Technol. Biotechnol.-2009.-V.84.-pp.208-214.

77.Li Z., Wang M., Wang F., Gu Z., Du G., Wu J., Chen J. y-Cyclodextrin: a review on enzymaticproduction and applications.//Appl. Microbiol. Biotechnol.-2007-V.77.-pp.245-255.

78.Lianes N., Hung B., Falero A. Perez C., Aguila B. Glucose and lactose effect on AD and ADD bioconversion by Mycobacterium sp. //Biotecnol. Lett.-1995.-V. 17.-N. 11 .-pp. 1237-1240.

79.Lo C.K., Pan C.P., Lui W.N. Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by a mutant of Mycobacterium sp. IIJ. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2002(b).-V.28.-pp.280-283.

80.L0 C.K., Wu K.L., Liu W.H. Interconverdion of androst-4-ene-3,17-dione and testosterone by an enzyme from Mycobacterium sp. or its resting cells. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2002 (a).-V.14.-pp.260-263.

81.Malaviya A., Gomes J. Androstenedione Production by Biotransformation of Phytosterols. //Bioresource Technology.-2008.-V.99.-pp.6725-6737.

82.Malaviya A., Gomes J. Enhanced biotransformation of sitosterol to androstenedione by Mycobacterium sp. using cell wall permeabilizing antibiotics //J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2008.-V.35.-pp. 1235-1239.

83.Marx A. F., Slijkhuis H. Preparation of 9a-hydroxy-17-keto steroids using Mycobacnerium species CBS 48286. //1994.-US 5298398 A.

84.Mauersberger S., Novikova L. A., Vladimir M. Shkumatov V. M. Cytochrome P450 Expression in Yarrowia lipolytica and Its Use in Steroid Biotransformation. //Microbiology Monographs.-2013.-V. 25.-pp. 171-226.

85.Mazumder T. K., Sonomoto K., Tanaka A., Fukui S. Sequential conversion of cortexolone to prednisolone by immobilized mycelia of Curvularia lunata and

immobilized cells of Arthrobacter simplex. II Appl. Microbiol. Biotechnol.-1985.-V.21.-pp.l54-161.

86.McLeod M. P., Warren R. L., Hsiao W. W., Araki N. , Myhre M., Fernandes C., Miyazawa D., Wong W., Lillquist A. L., Wang D., Dosanjh M., Hara H., Petrescu A., Morin R. D., Yang G., Stott J. M., Schein J. E., Shin H., Smailus D., Siddiqui A. S., Marra M. A., Jones S. J., Holt R., Brinkman F. S., Miyauchi K., Fukuda M., Davies J. E., Mohn W. W., Eltis L. D. The complete genome of Rhodococcus sp. RHA1 provides insights into a catabolic powerhouse. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA-2006.-V.103.-pp. 15582-15587.

87.Mensink R.P., Ebbing S., Lindhout M., Plat J., van Heugten M.M. Effects of plant stanol esters supplied in low-fat yoghurt on serum lipids and lipoproteins, non-cholesterol sterols and fat soluble antioxidant concentrations. //Atherosclerosis.-2002.-V.160.-pp.205-13.

88.Miyata N., Iwahori K., Foght, J.M., Gray M.R. Saturable, Energy-dependent Uptake of Phenanthrene in Aqueous Phase by Mycobactetium sp. Strain RJGII-135. //Appl. and Env. Microb.-2004.-V.70.-pp.363-369.

89.Kalimi M., Shafagoj Y., Loria R., Padgett D., Regelson W. Anti-glucocorticoid effects of dehydroepiandrosterone (DHEA). //Molecular and Cellular Biochemistry.-1994.-V. 131 .-pp.99-104.

90.Mohn W.W., van der Geize R., Stewart G.R., Okamoto S., Liu J., Dijkhuizen L., Eltis L.D. The Actinobacterial mce4 Locus Encodes a Steroid Transporter. //J. of Biological Chemistry.-2008.-V.283.-pp.35368-35374.

91.Moreau R.A., Whitaker B.D., Hicks K.B. Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods: Structural diversity, quantitative analysis, and healthpromoting uses. //Progress in Lipid Research.-2002.-V.41.-N.6.-pp.457-500.

92.Muller M., Patureau D., Godon J., Delgenes J., Hernandez-Raquet G. G. Molecular and kinetic characterization of mixed cultures degrading natural and synthetic estrogens. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-2010.-V.85.-pp.691-701.

93.Nedovic V., Willaert R. Application of Cell Immobilisation Biotechnology. Ser. Focus on Biotechnology. //Berlin Heidelberg. New York: Springer.-2005.-V. 8.-P. 573.

94.Nussinovitch A. Polymer Macro- and Micro-Gel Beads: Fundamentals and Application. // Springer Science+Business Media. LLC.-2010.-Ch.4.-pp.75-116.

95.0hlson S., Flygare S., Larsson P., Mosbach K. Steroid Hydroxylation Using Immobilized Spores of Curvularia lunata Germinated in situ. //European J. Appl. Microbiol.Biotechnol.-1980.-V. 10.-pp. 1 -9.

96.0hlson S., Larsson P., Mosbach K. Steroid Transformation by Living Cells immobilized in Calcium Alginate. // European J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1979.-V.7.-pp. 103-110.

97.Parales R.E., Ditty J.L. Substrate Transport. In: Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. // Timmis K.N. (Ed.). Springer. ISBN: 978-3-540-77588-1. Berlin. Germany.-2010.-pp. 1479-1490.

98.Parmerter S. M., Allen E. E. JR. Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products.//1969.-Patent US N 3453259.

99.Peart P.C., Chen A.R.M., Reynolds W.F, Rese P.B. Entrapment of mycelial fragments in calcium alginate: a general technique for the use of immobilized filamentous fungi in biocatalysis.//Steroids.-2012.-V.12.-pp.85-90.

100. Plat J., van Onselen E.N., van Heugten M.M., Mensink R.P. Effects on serum lipids, lipoproteins and fat soluble antioxidant concentrations of consumption frequency of margarines and shortenings enriched with plant stanol esters. //Eur. J. Clin. Nutr.-2000.-V.54.-pp.671-677.

101. Preisig C. L, Laakso J. A., Mocek U. M, Wang P.T., Baez J., Byng G. Biotransformations of the cardiovascular drugs mexrenone and canrenone. //J. Nat. Prod.-2003.-V 66.-N. 3.-pp.350-356.

102. R. van der Geize, G. I. Hessels, M. Nienhuis-Kuiper, and L. Dijkhuizen Characterization of a Second Rhodococcus erythropolis SQ1 3-Ketosteroid 9a -Hydroxylase Activity Comprising a Terminal Oxygenase Homologue, KshA2,

Active with Oxygenase-Reductase Component KshB. //Appl. and Env. Microb.-2008.- V.74.-N.23.-pp.7197-7203.

103. Rajkhowa R.C., Goswami P., Singh H.D. Mode of Uptake of Sterol by Arthrobacter simplex. //World J. of Microbiology and Biotechnology.-2000.-V.16.-pp.63-68.

104. Ramamurthi S., McCurdy A.R. Enzymatic Pretreatment of Deodorizer Distillate for Concentration of Sterols and Tocopherols. //J. of the American Oil Chemists Society.-1993.-V.70.-pp.287-295.

105. Rozner S., Garti N. The activity and absorption relationship of cholesterol and phytosterols. //Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects.-2006.-pp.43 5^456.

106. Rumijowska A., Lisowska K., Ziolkowski A., Sedlaczek L. Transformation of sterols by Mycobacteruim vaccae: effect of lecitin on permeability of cell envelops to sterols. //World J. Microbiol. Biotechnol.-1997.-V.13.-pp.89-95.

107. Ruta L, Ingudomnukul E, Taylor K, Chakrabarti B, Baron-Cohen S. Increased serum androstenedione in adults with autism spectrum conditions. //Psychoneuroendocrinology.-201 l.-V.36.-N.8.-pp.l 154-63.

108. Saenger W., Steiner T. Cyclodextrin Inclusion Complexes: Host-Guest Interactions and Hydrogen-Bonding. //Networks Acta Cryst.-1998.-V.54.-pp.798-805.

109. Sallam L. A. R., Osman M. E., Hamdy A. A., Zaghlol Gihan M. Microbial transformation of phytosterols mixture from rice bran oil unsaponifiable matter by selected bacteria. //World J. Microbiol. Biotechnol.-2008.-V.24.-pp.1643-1656.

110. Schlosser D., Irrgang S., Schmauder H.P. Steroid hydroxylation with free and immobilized cells of Penicillium raistrickii in the presence of P-cyclodextrin. //Appl. Microbiol. Biotechnol.-l993 .-V.39.-pp. 16-20.

111. Sedlaczek L. Biotransformation of steroids. // Crit. Revs. Biotechnol.-1988.-V.7.-N.3.-pp. 187-236.

112. Shealya C. N. Review of Dehydroepiandrosterone (DHEA). // Integrative Physiological and Behavioral Science.-1995.-V.30.-N.4.-pp.308-313.

113. Sih C.J. Process for preparing steroids. //1988.-US Patent 4 755 463.

114. Sih C.J. Process for preparing steroids. //1984.-US Patent 4 444 884.

115. Sih C.J. Synthesis of 17-ketosteroids from 19-oxygenated steroids. //Roussel Prize Lecture Paris.- 1980.-pp.3 5-43.

116. Singh M., Sharma R., Banerjee U.C. Biotechnological applications of cyclodextrins. // Biotechnology Advances.-2002.-V.20.-pp.341-359.

117. Singh R., Bharti N., Madan J., Hiremath S. N. Characterization of Cyclodextrin Inclusion Complexes - A Review. //J. of Pharmaceutical Science and Technology.-2010.-V.2.-N.3.-pp. 171 -183.

118. Skryabin G.K., Koscheenko K. A. Immobilization of living microbial cells in Polyacrylamide gel. //Meth. Enzymol.-1978.-135B.-pp.l98-216.

119. Slijkhuis H., Marx A. F. Microbiological preparation of 9-alpha-hydroxy-17-keto steroids. // 1992.-EP0322081 Bl.

120. Sokolovska I., Rozenberg R., Riez C., Rouxhet P. G., Agathos S. N., Wattiau P. Carbon Source-Induced Modifications in the Mycolic Acid Content and Cell Wall Permeability of Rhodococcus erythropolis El. //Applied and Environmental Microbiology.-2003 .-V. 69.-N.12.-pp.7019-7027.

121. Sonomoto K., Nomura K., Tanaka A., Fukui S. 11 a-Hydroxylation of Progesterone by Gel-Entrapped Living Rhizopus stolonifer Mycelia. //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1982.-V.16.-pp.57-62.

122. Sonomoto K., Tanaka A., Omata T., Yamane T., Fukui S. Application of Photo-Crosslinkable Resin Prepolymers to Entrap Microbial Cells. Effects of Increased Cell-Entrapping Gel Hydrophobicity on the Hydrocortisone A1-Dehydrogenation European. // J. Appl. Microbiol.Biotechnol.-1979.-V.63.-pp.25-334.

123. Sonomoto K., Usui N., Tanaka A., Fukui S. 9a-Hydroxylation of 4-Androstene-3,17-Dione by Gel-Entrapped Corynebacterium sp. Cells. //Eur J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1983 .-V. 17.-pp.203-210.

124. Sukhodolskaya G. V., Nikolayeva V. M., Khomutov S. M., Donova M. V. Steroid-1-dehydrogenase of Mycobacterium sp. VKM Ac-1817D strain producing 9a-hydroxy-androst-4-ene-3,17-dione from sitosterol. //Appl. Microbiol. Biotechnol.-2007.-V.74.-pp.867-873.

125. Szejtli J. Past, present, and future of cyclodextrin research. //Pure Appl. Chem.-2004.-V.76.-N. 10.-pp. 1825-1845.

126. Sjövall J.Fifty years with bile acids and steroids in health and disease. //Lipids.-2004.-V.39.-N8.-pp.703-722.

127. Szentirrnai A. Microbial physiology of sidechain degradation of sterols. //J. of Industrial Microbiology.-1990.-V.6.-pp. 101-116.

128. van der Geize R., Dijkhuizen L. Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications. //Curr. Opin. Microbiol.-2004.-V.7.-pp.255-261.

129. van der Geize R., Hessels G. I., Nienhuis-Kuiper M., Dijkhuizen L. Characterization of a Second Rhodococcus erythropolis SQ1 3-Ketosteroid 9a -Hydroxylase Activity Comprising a Terminal Oxygenase Homologue, KshA2, Active with Oxygenase-Reductase Component KshB. //Applied and Environmental Microbiology.-2008.-V.74.-N.23.-pp.7197-7203.

130. van der Geize R., Yam K., Heuser T., Wilbrink M. H., Hara H., Anderton, E. Sim M. C., Dijkhuizen L., Davies J. E., Mohn W. W., Eltis J. D. A gene cluster encoding cholesterol catabolism in a soil actinomycete provides insight into Mycobacterium tuberculosis survival in macrophages. //Proc. Natl. Acad. Sei. US A.-2007.-V. 104.-pp. 1947-1952.

131. Volkman J.K. Sterols in microorganisms.//Appl. Microbiol. Biotechnol.-2003.-V.60.-pp.450-506.

132. Wang F., Yao K., Wei D. From Soybean Phytosterols to Steroid Hormones, Soybean and Health. //Prof. Hany El-Shemy (Ed.), ISBN: 978-953-307-535-8.-2011.-pp. 231-252.

133. Weber A., Kennecke M., Nickish K., Rhode R., Process for he production of 17-oxosteroids via the fermentative oxidation of 17ß-hydroxysteroids by Mycobacterium. //1995.- Patent US.-N.5472854.

134. Weber S., Leuschner P., Kämpfer P., Dott W., Höhender J. Degradation of estradiol and ethinyl estradiol by activated sludge and by a defined mixed culture. //Appl. Microbiol. Biotechnol.-2005.-V. 67.-pp. 106-112.

135. Wei W., Wang F., Fan S., Wei D. Inactivation and Augmentation of the Primary 3-Ketosteroid-l-Dehydrogenase in Mycobacterium neoaurum NwIB-01: Biotransformation of Soybean Phytosterols to 4-Androstene-3,17-Dione or 1,4-Androstadiene-3,17-Dione. // Applied and Environmental Microbiology.-2010.-V.76.-N.13.-pp.4578-4582.

136. Wei W., Fan S., Wang F., Wei D. A New Steroid-Transforming Strain of Mycobacterium neoaurum and Cloning of 3-Ketosteroid 9a-Hydroxylasein NwIB-01. //Appl. Biochem. Biotechnol.-2010.-V.162.-pp.l446-1456.

137. Wick L.Y., de Munain A.R. Springael D., Harms H. Responses of Mycobacterium sp LB501T to the Low Bioavailability of Solid Anthracene. //Applied Microbiology and Biotechnology.-2002.-V.58.-pp.378-385.

138. Wilmafiska D., Milczarek A., Rumijowska K., Bartnicka L., Sedlaczek L. Elimination of by-products in 1 lß-hydroxylation of Substance S using Curvularia lunata clones regenerated from NTG-treated protoplasts. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1992.-V.37.-N.2-3 .-pp.626-630.

139. Yoshida T., Sueki M., Taguchi H., Kulprecha S., Nilubol N. Modeling and Optimization of Steroid Transformation in a Mixed Culture. // European J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1981.-V. 11.-pp.81-88.

(119s)

140. Zhang L., Wang M., Shen Y., Ma Y., Luo J. Improvement of steroid biotransformation with hydroxypropyl-ß-cyclodextrin induced complexation. Appl Biochem Biotechnol.-2009.-V.-159.-pp.-642-654.

141. Zhanga W., Shaoa M., Raoa Z., Xua M., Zhanga X., Yanga X., Li Hui, Xub Z. Bioconversion of 4-androstene-3,17-dione to androst-l,4-diene-3,17-dione by recombinant Bacillus subtilis expressing ksdd gene encoding 3-ketosteroid-A1 -dehydrogenase from Mycobacterium neoaurum JC-12. //J. of Steroid Biochemistry & Molecular Biology.-2013.-V.135.-pp.36-42.

142. Zhu Y., Huang W., Ni J., Liu W., Li H. Production of diosgenin from Dioscorea zingiberensis tubers through enzymatic saccharification and microbial transformation.//Appl. Microbiol. Biotechnol.-2010.-V.85.-pp. 1409-1416.