17β-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Егорова, Ольга Валерьевна

• Егорова, Ольга Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Егорова, Ольга Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Тестостерон и его производные

2.2 Способы получения 17(3-восстановленных стероидов. Преимущества микробиологических методов

2.3 Биотехнологическое значение процесса 17Р-восстановления 3,17дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями

2.4 Микроорганизмы, осуществляющие обратимое 17Р-восстановление 3,17дикетостероидов

2.5 Взаимосвязь 17Р-восстановления с другими реакциями трансформации стероидов

2.6 Ферменты, катализирующие процессы окисления-восстановления стероидов при Сп

2.6.1 Типы и свойства 17|5-гидроксистероидных дегидрогеназ (17J3-OH СДГ) млекопитающих

2.6.2 17Р-ОН СДГ микроорганизмов

2.6.3 Физиологическая роль 17Р-ОН СДГ

2.6.4 Субстратная специфичность 17Р-ОН СДГ

2.6.5 Индукция 17р-ОН СДГ

2.6.6 Активность 17Р-ОН СДГ и возраст культуры

2.6.7 Локализация 17Р-ОН СДГ у микроорганизмов

2.7 Окисление боковой цепи стеринов микобактериями

2.7.1 Получение мутантных штаммов Mycobacterium

2.7.2 Роль процесса 17р-восстановления в окислении стеринов микобактериями и подходы к его регуляции

2.7.3 Факторы регуляции процесса 17Р-восстановления

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «17β-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями»

Актуальность проблемы.

17Р-восстановление является одной из ключевых реакций трансформации стероидных соединений микроорганизмами, которая играет важную роль в метаболизме стероидных субстратов, регуляции пула восстановительных эквивалентов, детоксикации экзогенных стероидов. Имеются сведения о значении 17Р-гидроксистероидной дегидрогеназы (17Р-ОН СДГ), катализирующей процесс 17р-восстановления, как элемента примодиальной сигнальной системы трансдукции у микроорганизмов (Horinouchi et al., 2003, Sedlaczek, 1988, Dlugonski and Wilmanska, 1998, Zakelj-Mavric et al., 1995).

Способность микроорганизмов к образованию 17Р-гидроксистероидов известна с 50х годов. Однако, биохимические основы процесса изучены лишь для нескольких видов бактерий и мицелиальных грибов. Тем не менее, имеющиеся данные позволяют сделать вывод о разнообразии свойств, строения и функций микробных 17Р-ОН СДГ, ответственных за осуществление окисления-восстановления 3,17-дикетостероидов при с17.

17р-восстановление часто сопровождает другие процессы биоконверсии стероидов: моно- или дигидроксилирование стероидного ядра, дегидрирование — гидрирование двойных связей, а также окисление боковой цепи стеринов и прегнанов при С п.

Особое значение обратимое 17Р-восстановление 3,17-дикетостероидов имеет в полиферментном процессе трансформации природных стеринов (ситостерина, холестерина и др.). Этот биотехнологический процесс в настоящее время является основным способом получение андростендиона (АД) и андростадиендиона (АДД) -ключевых предшественников синтеза широкого ряда стероидных фармацевтических субстанций. В качестве биокатализаторов процесса общепризнанно использование стеринтрансформирующих микобактерий с блокированными ферментами расщепления стероидного ядра. Последующее 17Р-восстановление АД(Д) приводит к образованию тестостерона и(ли) 1(2)-дегидротестостерона. Направленная регуляция 17Р-гидроксистероиддегидрогеназной активности микобактерий позволяет, с одной стороны, повысить селективность процесса образования 3,17-дикетостероидов, с другой стороны, открывает перспективы получения тестостерона и его производных в одну биотехнологическую стадию.

Как известно, тестостерон и его производные представляют собой фармакологически активные соединения, применяющиеся в терапии различных заболеваний (Машковский, 1997). В настоящее время тестостерон получают четырехстадийным химическим синтезом из АД (Mahato, Majumdar, 1995). Биотехнологический способ получения тестостерона из ситостерина позволит упростить общую схему получения, повысить эффективность процесса и снизить себестоимость продукта.

Между тем, биохимические основы процесса 17р-восстановления, свойства 17р-гидроксистероидных дегидрогеназ у микобактерий практически не изучены, не исследована взаимосвязь процесса с другими реакциями модификации стероидного ядра, сопровождающими окисление боковой цепи стеринов.

Высокий биотехнологический потенциал стеринтрансформирующих микобактерий как продуцентов 3,17-дикетостероидов и их 17р-восстановленных аналогов, а также недостаточная изученность основ регуляции 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности обусловили актуальность настоящей работы.

Состояние вопроса.

Способность к осуществлению 17Р-восстановления стероидов известна для широкого ряда микроорганизмов различного таксономического положения. Однако, большинство публикаций ограничивается лишь констатацией факта образования таких соединений и подтверждением их структуры.

Из бактериальных ферментов наиболее изученным является 3(17)0гидроксистероидная дегидрогеназа (3(17)р-ОН СДГ) Comamonas testosteroni (ранее f идентифицированной как Pseudomonas testosteroni), осуществляющая наряду с 17р-восстановлением кето- и дегидрированием гидроксигруппы при Сп, также окислительно-восстановительные реакции при Сз.

Изучены 17Р-ОН СДГ ряда грибных культур (Cylindrocarpon radicicola, Cochliobolus lunatus, Pleurotus ostreatus и др.). При этом ферменты, выделенные из различных организмов, отличаются по молекулярному весу, строению, локализации и функциям (Schultz et al., 1977, Payne and Talalay, 1985, Itagaki and Iwaya, 1988, Lanisnik et al., 2000, Lanisnik et al., 2001). Литературные данные о внутриклеточной локализации микробных 17Р-ОН СДГ ограничиваются результатами, полученными при фракционировании клеток. Показано, что 17р-ОН СДГ может находиться как в свободной, так и мембрано-связанной формах.

Данные о свойствах, строении и локализации 17р-ОН СДГ микобактерий в доступной литературе отсутствуют.

В литературе имеются ограниченные сведения о способности микобактерий восстанавливать 3,17-дикетостероиды в 17-м положении. В частности, была показана принципиальная возможность получения тестостерона из стеринов (фитостерина, холестерина, p-ситостерина) при его трансформации штаммом Mycobacterium sp. NRRL 3805 В и предприняты попытки оптимизации процесса (Jiu et al., 1983, Liu et al., 1994, Lo et al., 2002) Однако, выход тестостерона даже при небольших нагрузках субстрата (1-3 г/л) был относительно невысоким (19-20%).

Обнаружено, что 17р-восстановление АДД микобактериями сопровождается гидрированием 1 (2)-двойной связи. В связи с этим в ряде литературных источников обсуждается вопрос о сопряженности процессов восстановления 17-кетогруппы и 1(2)-двойной связи стероидного кольца. Однако биохимический механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)- и 17Р-восстановления не был изучен (Goren et al., 1983, Hung et al., 1994).

Целью настоящей работы являлось изучение процесса 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов микобактериями, деградирующими боковую цепь стеринов.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Провести сопоставительный анализ 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности штаммов, обладающих способностью к деградации боковой цепи стеринов.

2. Исследовать факторы регуляции процесса 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов и определить оптимальные условия, обеспечивающие повышение целевой активности.

3. Выделить и охарактеризовать ферменты, катализирующие 17р-восстановление 3,17-дикетостероидов, и изучить их внутриклеточную локализацию.

4. Разработать биотехнологический метод получения тестостерона из Р-ситостерина с выходом кристаллического продукта, превышающим результаты изестных литературных данных.

Научная новизна.

Впервые выделены и охарактеризованы две внутриклеточные 17Р-гидроксистероидные дегидрогеназы Mycobacterium sp. Etl, участвующие в окислительно-восстановительных превращениях при С п. Показано, что 17Р-ОН СДГ (1) - мономер с молекулярной массой ~68 ООО, катализирует 17р-окисление 17р-гидроксистероидов, тогда как 17Р-ОН СДГ (2) - тетрамер с молекулярной массой ~210 ООО проводит как 17рвосстановление, так и 17Р-окисление. Обнаружено, что 17Р-ОН СДГ (2) также катализирует окисление 3-ОН группы 3-гидроксистероидов. Предложен механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)- и 17р-восстановления при трансформации 1 (2)-ненасыщенных 3,17-дикетостероидов.

Впервые установлена внутриклеточная локализация 17 (3-ОН СДГ в клетках микобактерий. Адаптирован для работы с микобактериями цитохимический метод выявления дегидрогеназной активности ферроцианидом меди. Применение модифицированного метода позволило установить, что 17(3-ОН СДГ локализована преимущественно в периферической зоне цитоплазмы и слабо ассоциирована с цитоплазматической мембраной.

Впервые обнаружена внеклеточная 17Р-ОН СДГ стеринтрансформирующих микобактерий, входящая в комплекс внеклеточных стероидтрансформирующих ферментов, включающий также 3-гидроксистероид оксидазу, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназу и 1-ен-редуктазу.

Практическая значимость работы.

С использованием метода химического мутагенеза из коллекционной культуры Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д получен стабильный мутантный штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующимся высокой 17Р-гидроксистероиддегидрогеназной активностью и способностью к окислению боковой цепи стеринов. Оптимизированы условия 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов. Показана возможность микробиологического получения 1 (2)-дегидротестостерона из АДД (5 г/л) с выходом кристаллического продукта не менее 43% от загруженного субстрата и содержанием основного вещества не менее 98%.

Найдены эффективные способы повышения селективности процессов получения 3,17-дикетостероидов (АД и АДД) из Р-ситостерина за счет снижения 17Р-гидроксистероидеги дрогеназной активности.

Разработан конкурентоспособный метод получения тестостерона в одну биотехнологическую стадию из р-ситостерина (5 г/л) с выходом кристаллического продукта не менее 31-35% и содержанием основного вещества не менее 95%. Использование метода позволит, значительно упростить схему синтеза производных тестостерона и снизить себестоимость конечной продукции.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных конференциях: школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (2000, Пущино), International Symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology" (2000, Pushchino), International Symposium "Biocatalysis and Biotransformations" (2001, Darmshtadt), на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН (2000, 2003). Основные положения диссертации были представлены на совместных семинарах Лаборатории Микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи и 3 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, которая включает описание методов исследования, используемых материалов и изложения результатов, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 129 страницы машинописного текста, 33 таблицы и 33 рисунка. Библиография включает 131 наименований, из них 121 иностранных работ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Егорова, Ольга Валерьевна

6. ВЫВОДЫ:

1. Методом химического мутагенеза из коллекционной культуры Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д получен стабильный мутантный штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующийся высокой 17 р -гидроксистероиддегидрогеназной активностью и способностью к окислению боковой цепи стеринов.

2. Изучены основные факторы регуляции 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов мутантным штаммом Mycobacterium sp. Etl, и предложен эффективный способ получения 1(2)-дегидротестостерона из андростадиендиона (5 г/л) с выходом кристаллического продукта 40-43% и содержанием основного вещества не менее 98%.

3. Впервые выделены и охарактеризованы внутриклеточные 17Р-гидроксистероидные дегидрогеназы стеринтрансформирующих микобактерий. Обнаружено наличие двух ферментов (17Р-ОН СДГ), отличающихся по молекулярному весу, субъединичному составу и свойствам. Показано, что 17р-ОН СДГ (1) является мономером и катализирует 17Р-окисление, тогда как 17Р-ОН СДГ (2) — тетрамер — проводит как 17р-восстановление, так и 17р-окисление С^-стероидов. Обнаружено, что 17Р-ОН СДГ (2) также катализирует окисление ЗР-гидроксигруппы стероидов.

4. Впервые изучена внутриклеточная локализация 17Р-ОН СДГ Mycobacterium sp. Etl. Установлено, что фермент находится в периферической зоне цитоплазмы и слабо ассоциирован с цитоплазматической мембраной.

5. Впервые обнаружена внеклеточная микобактериальная 17Р-ОН СДГ, входящая в комплекс внеклеточных стероидтрансформирующих ферментов, включающий также Зр-гидроксистероид оксидазу, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназу и 1-ен-редуктазу.

6. Разработан и масштабирован до лабораторно-технологического уровня микробиологический метод получения тестостерона из Р-ситостерина. Метод обеспечивает выход кристаллического продукта - 31-35% с содержанием основного вещества не менее 95% и исключает промежуточное выделение 3,17-дикетостероидов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Егорова, Ольга Валерьевна, 2004 год

1. Ахрем А.А., Титов Ю.А. 1970. Стероиды и микроорганизмы. Издательство "Наука". Москва. 526 С.

2. Войшвилло Н.Е., Парнес Я.А. 1981. Селективное расщепление стеринов микроорганизмами. Биол. Науки. Т. 2. С. 32-46.

3. Гайер Г. 1974. Электронная гистохимия. Издательство "Мир". Москва. 488 С.

4. Донова М.В, Довбня Д.В, Калиниченко А.Н, Аринбасарова А.Ю, Вагабова JI.M., Морозова З.В, Кощеенко К.А. 1995. Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона. Патент РФ 2039824.

5. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н., Аринбасарова А.Ю., Вагабова JI.M., Морозова З.В., Кощеенко К.А. 1997. Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона. Патент РФ 2079258. БИ N 13.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика. Издательство "Мир". Москва. С. 160-162.

7. Машковский М.Д. 1997. Лекарственные средства. Издательство "Торсинг". Харьков. Т. 2. С. 60-67.

8. Миллер Д. 1976. Эксперименты в молекулярной гинетике. Издательство "Мир". Москва. 436 С.

9. Навашин С.М, Фомина И.П. 1982. Рациональная антибиотикотерапия. Издательство "Медицина". Москва. 495 С.

10. Физер Л., Физер М. 1964. Стероиды. Издательство "Мир". Москва. 982 С.

11. Abul-Hajj Y., Qian Н. 1986. Transformation of steroids by Algae. J Nat Product. Vol. 49 N 2. pp. 244-248.

12. Ahmad S., Garg S., Johri B. 1992. Biotransformation of sterols: selective cleavage of the side chain. Biotechnol Adv. Vol. 10. pp. 1-67.

13. Al-Awadi S., Afzal M., Oommen S. 2003. Studies on Bacillus stearothermophilus. Part III. Transformation of testosterone. Appl Microbiol Biotechnol. Vol. 62 N 1. pp. 48-52.

14. Barry C., Mdluli K. 1996. Drug sensitivity and environmental adaptation of mycobacterial cell wall components. Trends in Microbiol. Vol. 4 N 7. pp. 275-281.

15. Barthakur S., Roy M., Bera S., Ghosh A. 1996. Steroid transformation by mutants of Mycobacterium sp. with altered response to antibiotics. J Basic Microbiol. Vol. 36. pp. 383-387.

16. Brannon D., Parrish F., Wiley В., Long L. 1967. Microbial transformation of a series of androgens with Aspergillus tamarii. J Org Chem. Vol. 32 N 5. pp. 1521-1527.

17. Brzezowska E., Dmochowska-Gladysz J., Kolek T. 1996. Biotransformation XXXIX. Metabolism of testosterone, androstenedione, progesterone and testosterone derivatives in Absidia coerulea culture. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 57 N 5-6. pp. 357-362.

18. Cabrera J., Pruneda Paz J., Genti-Raimondi S. 2000. Steroid-inducible transcription of the 3p/17P-hydroxysteroid dehydrogenase gene (S$l\l$-hsd) in Comamonas testosteroni. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 73. pp. 147-152.

19. Capek A., Tadra M., Tuma J. 1964. Microbial transformation of Steroids. XXTV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiol. Vol. 9 N 6. pp. 380-382.

20. Choudhary M., Musharraf S., Shaheen F., Atta-Ur-Rahman G. 2002. Microbial transformation of (+)-androsta-l,4-diene-3,17-dione by Cephalosporium aphidicola. Nat Prod Lett. Vol. 16 N 6. pp. 377-382.

21. Choudhary M., Shah S., Musharraf S., Shaheen F. 2003. Atta-Ur-Rahman G. Microbial transformation of dehydroepiandrosterone. Nat Prod Res. Vol. 17 N 3. pp. 215-220.

22. Cruz A., Fernandes P., Cabral J., Pinheiro H. 2001. Wholle-cell bioconversion of P-sitosterol in aqueous-organic two-phase system. J Mol Cat В Enzymatic. Vol. 11. pp. 579-585.

23. Csaba G., Inczefi-Gonda A., Feher T. 1985. Induction of steroid binding sites (receptors) and presence of steroid hormones in the unicellular Tetrahymena pyriforms. Comp Biochem Physiol. Vol. 82 A N 3. pp. 567-570.

24. Culos D., Watanabe M. 1982. Testosterone-dependent oxygen consumption in membrane vesicles of Pseudomonas testosteroni. J Steroid Biochem. Vol. 17 N 1. pp. 67-69.

25. Davies J. 1998. Antibiotic resistance in mycobacteria. Genetics and Tuberculosis. Vol.217, p. 195-208.

26. Davis B. 1964. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann N Y Acad Sci. Vol. 124. pp. 404-409.

27. Dlugonski J., Wilmanska D. 1998. Deleterious effects of androstenedione on growth and cell morphology of Schizosaccharomyces pombe. Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 73. pp. 189-194.

28. Dmochowska-Gladysz J. 1991. Reduction of saturated derivatives of testosterone by a strain Aphanocladium album. J Basic Microbiol. Vol. 31 N 5.pp. 357-362.

29. Donova M., Dovbnya D., Koshcheyenko K. 1996. Modified CDs-mediated enhancement of microbial sterol sidechain degradation. In: Proc. of Eighth Int. Symp. on Cyclodextrins. Kluwer Ac. Pub. Dordrecht, pp.527-530.

30. Duchmann H., Trager L. 1979. Purification and characterization of a 3,17P-hydroxysteroid dehydrogenase from Streptomyces hydrogenans. Z Naturforsch. Vol. 34. pp. 533540.

31. Dutta R., Roy M., Singh H. 1992. Metabolic blocks in the degradation of beta-sitosterol by a plasmid-cured strain of Arthrobacter oxydans. J Basic Microbiol. Vol. 32 N 3. pp. 167-176.

32. Ercoli A., Ruggieri P. 1953. An improved method of preparing testosterone, dihydrotestosterone and some of their esters. J Am Chem Soc. Vol. 75 N 5. pp. 650-653.

33. Fabian J. 1964. Contribution on the Diagnosis of Staphylococcus aureus Rosenbach. Folia Microbiol. Vol. 9 N 5. pp. 310-311.

34. Farooq A., Tahara S. 2000. Biotransformation of testosterone and pregnenolone catalyzed by the fungus Botrytis cinerea. J Nat Prod. Vol. 63 N 4. pp. 489-491.

35. Feldman D., Burshell D., Stathis P., Loose D. 1982. An estrogen-binding protein and endogenous ligand in Saccharomyces cerevisiae: possible hormone receptor system. Science. Vol. 218. pp. 297-298.

36. Fernandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro H., Cabral J. 2003. Microbial conversion of steroid compounds: recent development. Enzyme Microb Technol. Vol. 32. pp. 688-705.

37. Filling C., Wu X., Shafdat X., Hult M., Martensson E., Shafdat J., Oppermann U. 2001. Subcellular targeting analysis of SDR-type hydroxysteroid dehydrogenases. Mol Cel Endocrinol. Vol. 171. pp. 99-101.

38. Francis M., Watanabe M. 1981. Membrane-associated steroid-binding proteins of Pseudomonas testosteroni. Can J Microbiol. Vol. 27. pp. 1290-1297.

39. Gachok V., Grisak V. 1989. Kinetic model of hydrocortisone 1-en-dehydrogenation by Arthrobacter globiformis. Biotechnol Bioeng. Vol. 33. pp. 661-667.

40. Glass Т., Wheeler L., Sutter V., Finegold S. 1979. Transformation of 4-androsten-3,17-dione by growing cultures and cell exracts of Clostridium paraputricum. Biochim et Biophysica Acta. Vol. 523 N 2. pp. 332-342

41. Goren Т., Harnik M., Rimon S., Aharanowitz Y. 1983. 1-ene-steroid reductase of Mycobacterium sp. NRRL B-3805. J Steroid Biochem. Vol. 19 N 6. pp. 1789-1797.

42. Goswami P., Singh H., Baruah P. 1984. Factors limiting the microbial conversion of sterols to 17-ketosteroids in the presence of metal chelate inhibitors. Folia Microbiol. Vol. 29. pp. 209-216.

43. Guehler P., Dobson R., Tsuchiya H. 1962. Transformation of steroids with Chlorella pyrenoidosa. Proc Natl Acad Sci US. Vol. 48 N 3. pp. 377-379.

44. Horhold C., Gottschald В., Grosse H.-H. 1989. Microbial transformation of sterols to androstane-compounds in presence of organic resins. Proc Vth Internat Conf on Chem and Biotechnol of Biol Active Natur Prod. pp. 92-110.

45. Hu S., Genain G., Azerad R. 1995. Microbial transformation of steroids: contribution to 14 alpha-hydrohylations. Steroids. Vol. 60 N 4. pp. 337-352.

46. Hui J., Gordon N., Kajioka R. 1997. Permeability barrier to rifampicin in mycobacteria. Antimicrob Agents Chemoter. Vol. 11. pp. 773-779.

47. Hull S, Wallace R, Bobey D, Price K, Goodhines R, Swenson J and Silcox V. 1995. Presence of aminoglycoside acetyltransferase and plasmids in Mycobacteruim fortuitum. Am Rev Resp Dis. Vol. 129. pp. 614-618.

48. Hung В., Falero A., Llanes N., Perez C., Ramirez M. 1994. Testosterone as biotransformation product in steroid conversion by Mycobacterium sp. Biotechnol Lett. Vol. 16 N5. pp. 497-500.

49. Huszcza E., Dmochowska-Gladysz J. 2003. Transformations of testosterone and related steroids in Absidia glauca culture. J Basic Microbiol. Vol. 43 N 2. pp. 113-120.

50. Hydroxysteroid dehydrogenase. 1979. In: Worthington"11, Enzymes and related biochemicals. USA. pp. 105-106.

51. Itagaki E., Iwaya T. 1988. Purification and characterization of 17|3-hydroxysteroid dehydrogenase from Cylindrocarbon radicicola. J Biochem. Vol. 103. pp. 1039-1044.

52. Jarlier V., Nikaido H. 1994. Microbacterial cell wall: Structure and role in natural resistance to antibiotics. FEMS Microbiol Lett. Vol. 123. pp. 11-18.

53. Jiu J., Marsheck W., Kvetkas M. 1983. Microbial production of testosterone and 1-dehydrotestosterone. US Patent GB 2 103 620 A.

54. Kastelic-Suhadolc Т., Lenasi H. 1993. Androgen binding proteins in Cochliobolus lunatus. FEMS Microbiol Lett. Vol. 108. pp. 121-126.

55. Kastelic-Suhadolc Т., Plemenitas A., Zigon D. 1994. Isolation and identification of testosterone and androstenedione in the fungus Cochliobolus lunatus. Steroids. Vol. 59 N 6. pp. 357-361.

56. Kieslich K. 1985. Microbial side-chain degradation of sterols. J Basic Microbiol. Vol. 25. pp. 461-474.

57. Kolek Т., Swizdor A. 1999. Biotransformation XLV. Transformation of 4-ene-3-oxo steroids in Fusarium culmorum culture. Biochem J. Vol. 1 N 337(Pt 3). pp. 425-431.

58. Korycka-Machala M., Rumijowska-Galewicz A., Lisowska K., Ziolkowski A., Sedlaczek L. 2001. Enhancement of p-sitosterol transformation in Mycobacterium vaccae with increased cell wall permeability. Acta Microbiol Pol. Vol. 50 N 2. pp. 107-115.

59. Kumar R., Dahiya J., Singh D., Nigam P. 2001. Biotransformation of cholesterol using Lactobaccillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor. Bioresource Technol. Vol. 78. pp. 209-211.

60. Labrie F., Luu-The V., Lin S.-X., Labrie C., Simard J., Breton R., Belanger A. 1997. The key role of 17p-hydroxysteroid dehydrogenases in sex steroid biology. Steroids. Vol. 62. pp. 148-158.

61. Laemmli U. 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. Vol. 227. pp. 680-685.

62. Lanisnik Т., Zakelj-Mavric M., Belie I. 1992. Fungal 17p-hydroxysteroid dehydrogenase. FEMS Microbiol Lett. Vol. 99. pp. 49-52.

63. Lanisnik Т., Adamski J., Stojan J. 2000. 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Cochliobolus lunatus: model structure and substrate specificity. Arch Biochem Biophys. Vol. 15 N 384(2). pp. 255-262.

64. Lanisnik Т., Adamski J., Zakelj-Mavric M. 2001(a). Expression of 170-hydrohysteroid dehydrogenases in mesophilic and extremophilic yeast. Steroids. Vol. 66. pp. 4954.

65. Lanisnik Т., Moeller G., Thole H., Akelj-Mavri M., Adamski J. 1999. A novel 17-hydrohysteroid dehydrogenase in the fungus Cochliobolus lunatus: new insight into the evolution of steroid-hormone signalling. Biochem J. Vol. 1 N 337 (Pt 3). pp. 425-431.

66. Lanisnik Т., Zakelj-Mavric M. 2000. Characterization of fungal 170-hydrohysteroid dehydrogenases. Comp Biochem Physiol Part B. Vol. 127. pp. 53-63.

67. Lefebvre Y., Schultz R., Groman E., Watanabe M. 1979(6). Localization of 30- and 170-hydroxysteroid dehydrogenase in Pseudomonas testosteroni. J Steroid Biochem. Vol. 10. pp. 523-528.

68. Lisowska К., Korycka M., Hadlaw-Klimaszewska O., Ziolkowski A., Sedlaczek L. 1996. Permeability of mycobacterial cell envelopes to sterols: peptidoglycan as the diffusion barrier. J Basic Microbiol. Vol. 36. pp. 407-409.

69. Liu W.-H., Kuo C.-W., Wu K.-L., Lee C.-Y., Hsu W.-Y. 1994. Transformation of cholesterol to testosterone by Mycobacterium sp. J Indust Micriobiology. Vol. 13. pp. 167-171.

70. Llanes N., Hung В., Falero A., Perez C., Aguila B. 1995. Glucose and lactose effect on AD and ADD bioconversion by Mycobacterium sp. Biotechnol Lett. Vol. 17 N 11. pp. 12371240.

71. Lo C.-K., Pan C.-P., Liu W.-N. 2002. Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by a mutant of Mycobacterium sp. J Ind Microbiol Biotech. Vol. 28. pp. 280-283.

72. Lowry O., Rosenbrough N., Farr A., Randall R. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. Vol. 193. pp. 265-267.

73. Luu-The V. 2001. Analysis and characteristics of multiple types of human 170-hydroxysteroid dehydrogenase. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 76. pp. 143-151.

74. Madyastha K., Joseph T. 1995. Transformation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by Mucorpiriformis. Appl Microbiol Biotechnol. Vol. 44 N 3-4. pp. 339-343.

75. Mahato S., Banerjee S., Sahu N. 1984. Metabolism of progesterone and testosterone by Bacillus sp. Steroids. Vol. 43 N 5. pp. 545-558.

76. Mahato S., Garai S. 1997. Advances in microbial steroid biotransformation. Steroids. Vol. 62. pp. 332-345.

77. Mahato S., Majumdar I. 1995. Current trends in microbial steroid transformation. Phytochemistry. Vol. 34. pp. 883-898.

78. Mahato S., Mukheijee A. 1984. Microbial transformation of testosterone by Aspergillus fumigatus. J Steroid Biochem. Vol. 21 N 3. pp. 341-342.

79. Marcus P., Talalay P. 1955. Induction and purification of a- and P-hydroxysteroid dehydrogenases. J Biol Chem. Vol. 218. pp. 661-674.

80. Marshek W., Kaychy S., Muir R. 1972. Microbial degradation of sterols. Appl Microbiol. Vol. 23 N 1. pp. 72-77.

81. Martin C. 1984. Sterols. In: Biotechnology. A Comprehensive Treatise in 8 Volumes edited by H.-J. Rehm and G. Reed. Vol. 6a «Biotransformations», pp. 79-97.

82. Michel-Briand Y. and Raynal M. 1976. An example of enzyme synthesis regulation in Pseudomonas: the dehydrogenases of Pseudomonas testosteroni. Bui Inst Pasteur. Vol. 74. pp. 271-284.

83. Minninkin D. 1991. Chemical principles in the organization of the lipid components in the mycobacterial cell envelope. Res Microbiol. Vol. 142. pp. 419-481.

84. Nikaido H., Jarlier V. 1991. Permeability of the mycobacterial cell wall. Res Microbiol. Vol. 142. pp. 437-441.

85. Nordling E., Oppermann U., Jornvall H., Persson B. 2001. Human type 10 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase: molecular modelling and substrate docking. J Mol Graph Model. Vol. 19 N6. pp. 514-520.

86. Peltoketo H., Luu-The V., Simard J., Jerzy Adamski. 1999. 17p~hydroxysteroid dehydrogenase (HSD)/17-ketosteroid reductase (KSR) family; nomenclature and main characteristics of the 17HSD/KSR enzymes. J Mol Endocrinology. Vol. 23. pp. 1-11.

87. Perez С., Perez I., Herve E. 1995. Isolation and partial characterization of a new mutant for sterol biotransformation in Mycobacterium. Biotechnol Lett. Vol. 17 N 11. pp. 12411246.

88. Peterson G., Thoma R., Perlman D., Fried G. 1957. Metabolism of progesterone by Cylindrocarpon radicicola and Streptomyces lavendulae. J Bacteriol. Vol. 74 N 5. pp. 684-688.

89. Plemenitas A., Lenasi H., Hudnik-Plevnik T. 1993. Identification of progesterone binding sites in the plasma membrane of the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 45. pp. 281-285.

90. Porter R., Gallimore W., Reese P. 1999. Steroid transformation with Exophiala jeanselmei var. lecaniicorni and Ceratocystisparadoxa. Steroids. Vol. 64. pp. 770-779.

91. Rheinwald J., Chakrabarty A., Gunsalus J. 1973. A transmissible plasmid controlling camphor oxidation in Pseudomonas putida. Proc Nat Acad Sci USA. Vol. 70. pp. 885-890.

92. Rumijowska A., Lisowska K., Ziolkowski A., Sedlaczek L. 1997. Transformation of sterols by Mycobacterium vaccae: effect of lecithin on the permeability of cell envelopes to sterols. Word J Microbiol Biotech. Vol. 13. pp. 89-95.

93. Schaaf O., Dettner K. 1998. Transformation of steroids by Bacillus strain isolated from the foregut of water beetles (Coleoptera.Dytiscidae): I. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione (AD). J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 67 N 5-6. pp. 451-465.

94. Schmid A., Dordick J., Kiener A., Wubbolts M., Witholt B. 2001. Industrial Biocatalysis today and tomorrow. Nature. Vol. 409. pp. 258-268.

95. Schoemer U., Martin C. 1980. Microbial transformation of sterols. Biotechnol Bioeng. Vol. 22 N 11. pp. 11-24.

96. Schultz R., Groman E., Engel L. 1977. 3(17)p-Hydroxysteroid dehydrogenase of Pseudomonas testosteroni. A convenient purification and demonstration of multiple molecular forms. J Biol Chem. Vol. 252 N 11. pp. 3775-3783.

97. Sebek K., Michaels R. 1957. Interconversion of 17-keto and 17P-hydroxyl groups in Steroids by Protozoa. Nature. Vol. 179 N 4552. pp. 210-211.

98. Sedlaczek L. 1988. Biotransformation of steroids. Crit Revs Biotechnol. Vol. 7. pp. 187-236.

99. Sedlaczek L., Gorminski В., Lisowska K. 1994. Effect of inhibitors of cell envelope synthesis on P-sitosterol side chain degradation by Mycobacterium sp. NRRL MB 3683. J Basic Microbiol. Vol. 34. pp. 387-399.

100. Seidel L., Horhold C. 1992. Selection and characterisation of new microorganisms for the manufacture of 9-OH-AD from sterols. J Basic Microbiol. Vol. 32. pp. 49-55.

101. Smith L. 1984. Steroids. In Biotechnology. A Comprehensive Treatise in 8 Volumes edited by H.-J. Rehm and G. Reed. Vol. 6a «Biotransformations», pp. 31-79.

102. Smith K., Kirk D., Latif S. 1989. Microbial transformation of steroids-II. Transformation of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus. J Steroid Biochem. Vol. 32 N 3. pp. 445-451.

103. Smith K., Latif S., Kirk D. 1990. Microbial transformation of steroids-VI. Transformation of testosterone and androstenedione by Botryosphaerica obtuse. J Steroid Biochem. Vol. 35 N 1. pp. 115-120.

104. Smith M., Zahnley J., Pfeifer D., Goff D. 1993. Growth and cholesterol oxidation by Mycobacterium species in Tween 80 medium. Appl Environ Microbiol. Vol. 59 N 5. pp. 14251429.

105. Singer Y., Shity H., Bar R. 1991. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part 2. Reduction of androstenedione to testosterone by Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotech. Vol. 35. pp. 731-737.

106. Swizdor A., Kolek T. 1999. Biotransformation XLV. Transformation of 4-ene-3-oxo steroids in Fusarium culmorum culture. Biochem J. Vol. 1 N 337 (Pt 3). pp. 425-431.

107. Szejtli J. 1991. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed.: Duchene D. Published in France by Editions de Sante. 625 p.

108. Szentirmai A. 1990. Microbial physiology of sidechain degradation of sterols. J Indust Microbiology. Vol. 6. pp. 101-116.

109. Tortoli E., Reischl U., Besozzi G., Emler S. 1998. Characterization of an isolate belonging to the newly described species Mycobacterium hassiacum. Diagn Microbiol Infect Dis. Vol. 30. pp. 193-196.

110. Udou Т., Ogawa M., Mizuguchi Y. 1982. Spheroplast formation of Mycobacterium smegmatis and morphological aspects of their reversion to the bacillary form. J Bacterid. Vol. 151 N2. pp. 1035-1039.

111. Uwajima Т., Yagi H., Nakamura S., Terada O. 1973. Isolation and crystallization of extracellular Зр-hydroxysteroid oxidase of Brevibacterium sterolicum nov. sp. Agr Biol Chem. Vol. 37 N 10. pp. 2345-2350.

112. Watanabe M., Lefebvre D., Lefebvre Y., Sy L. 1980. Membrane bound dehydrogenases of Pseudomonas testosteroni. J Steroid Biochem. Vol. 13 N 7. pp. 821-827.

113. Watanabe M., Phillips K., Chen T. 1973. Steroid-receptor in Pseudomonas testosteroni realeased by osmotic shock. J Steroid Biochem. Vol. 4. pp. 613-621.

114. Wilson M., Gallimore W., Reese P. 1999. Steroid transformation with Fusarium oxysporum var. cubense and Colletotrichum musae. Steroids. Vol. 64. pp. 834-843.

115. Winter J., Rourke-Locasio S., Bokkenheuser V., Mosbach E., Conen B. 1984, Reduction of 17-keto steroids by anaerobic microorganisms isolated from Human fecal flora. Biochim et Biophysica Acta. Vol. 795. pp. 208-211.

116. Wix G., Buki K., Tomorken E., Ambrus G. 1968. Inhibition of steroid nucleus degradation in mycobacterial transformation. Steroids. Vol. 11 N 3. pp. 401-413.

117. Wovcha M., Brooks K., Kominek L. 1979. Evidence for two steroid 1,2-dehydrogenase activities in Mycobacterium fortuitum. Biochim Biophys Acta. Vol. 574. pp. 471479.

118. Zakelj-Mavric M., Kastelic-Suhadols Т., Plemenitas A., Lanisnik Т., Belie I. 1995. Steroid hormone signalling system and fungi. Comp Biochem Physiol. Vol. 112B N 4. pp. 637642.

119. Zorko M., Gottlieb H., Zakelj-Mavric M. 2000. Pluripotency of 17|3-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. Steroids. Vol. 65. pp. 46-53.