Гидрофильные гексапептиды - новый класс регуляторов АТФ-зависимых транспортных белков множественной лекарственной устойчивости тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.25, кандидат медицинских наук Новиков, Сергей Александрович

• Новиков, Сергей Александрович
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Новиков, Сергей Александрович

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Общая характеристика явления множественной лекарственной устойчивости.

1.1.1. Основные механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

1.1.2. Структурная организация семейства транспортных белков множественной лекарственнаой устойчивости.

1.1.3.Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная P-gp.

1.1.4.Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная MRP.

1.1.5.Множественная лекарственная устойчивость и белок BCRP.

1.1.6.Мноэюественная лекарственная устойчивость, обусловленная LRP.

1.1.7. Система глутатиона.

1.1.8.Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная изомеразой II. .26 И.Я.Множественная лекарственная устойчивость: роль генов, контролирующих апоптоз.

1.2.Регуляторные пептиды.

1.2.1.Классификациярегуляторных пептидов.

1.2.2.Происхоэ1сдение и основные эффекты пептидов центральных органов иммунитета.

1.2.3.Действие пептидов центральных органов иммунитета на лимфоидные клетки.

1.2.4. Фармакокинетикарегуляторных пептидов иммунотропного типа действия.

1.2.5.Перспективы использования регуляторных пептидов иммунотропного типа действия.

П.Материалы и методы.

II.1.Линии опухолевых клеток, использованные в работе.

II. 2. Фармакологические препараты и субстанции, использованные в работе.

II.3.Исследование влияния гексапептидов на продукцию антителообразущих клеток в селезенке мышей.

II. 4.Исследование влияния гексапептидов на экспрессию маркера силы иммунного ответа (HLA-DR), маркеров Т-лимфоцитов (CD2, CD4, CD8) иВ-лимфоцитов (CD22).

II. 5.Изучение влияния активности гексапептидов на белки транспортеры P-gp, MRP, LRP, BCRP.

П.б.Определение чувствительности опухолевых клеток к фармакологическим препаратам (МТТ-метод).

II. 7.Цитофлуориметрическое исследование экспрессии антигенов транспортных белков MRP, P-gp, LRP, BCRP.

II.8.Исследование влияния пептидов на экспрессию генов MRP, MDR, LRP, BCRP.

Ш.Результаты и обсуждения.

III 1.Исследование влияния гексапептидов на экспрессию маркера силы иммунного ответа (HLA-DR), маркеров Т-лимфоцитов (CD2, CD4, CD8) и В-лимфоцитов (CD22).

III. 2.Исследование влияния гексапептидов на продукцию антителообразущих клеток в селезенке мышей.

III. 3.Влияния гидрофильных гексапептидов и конкурентного гидрофобного ингибитора циклоспорина А на транспорт субстрата из опухолевых клеток.

III. 4.Влияние гидрофильных гексапептидов на функциональную активность транспортных белков множественной лекарственной устойчивости.

III. 5. Влияние гидрофильных гексапептидов на действие цитостатических препаратов.

III. 6.Влияние гидрофильных гексапептидов на уровень экспрессии генов и белковтранспортеров.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гидрофильные гексапептиды - новый класс регуляторов АТФ-зависимых транспортных белков множественной лекарственной устойчивости»

Актуальность проблемы:

Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ - это система защиты популяции опухолевых клеток от множества лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку [50,122].

Транспортные белки, ответственные за МЛУ, принадлежат к суперсемейству ABC транспортеров ( ATP-Binding Cassette ) [84]. К ABC семейству относят более сотни транспортных белков, обнаруженных у про и эукариотов[56,87].

В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны, в основном, два типа транспортных белков: multidrug resistance associated protein (MRP) и P-glycoprotein (P-gp). Субстратами для обоих типов транспортных белков является широкий спектр противоопухолевых соединений: антрациклины, этопозид, винкристин, таксол и др. В результате работы транспортных белков клетки приобретают устойчивость к действию широкого спектра химиотерапевтических средств.

Важно отметить, что ABC транспортеры отвечают не только за выведение токсичных и вредных веществ из клетки, но и принимают участие в транспорте медиаторов, цитокинов воспалительной и иммунной системы. В свою очередь, цитокины, посредствам взаимодействия с рецепторами, осуществляют контроль роста и развития клеток иммунной системы. Поэтому АБС транспортеры опосредовано влияют на развитие иммунной реакции организма. В этой связи вполне логично предположить, что регуляторные пептиды, влияющие на клетки иммунной системы, могут регулировать и активность транспортных белков.

МЛУ возникает в результате активации клеткой её естественных защитных механизмов. Такие механизмы посредством АТФ-зависимых транспортных белков обеспечивают интенсивное откачивание из клетки любых токсических соединений, включая химиотерапевтические препараты [100]. Этот процесс существенно снижает эффективность средств, используемых для терапии бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций, а также злокачественных новообразований.

До настоящего времени поиск лекарственных средств для преодоления МЛУ основывался на использовании принципа конкурентного ингибирования транспортных систем путем введения избыточной концентрации субстрата. Однако применение конкурентных ингибиторов для преодоления МЛУ осложняется их высокой токсичностью. Конкурентные ингибиторы одновременно подавляют активность тех транспортных белков, которые выполняют ряд жизненно важных физиологических функций. Ингибирование жизненно важных функций транспортеров приводит к токсическому поражению клеток и резкому нарастанию явлений токсикоза. Поэтому применение конкурентных ингибиторов в качестве лекарственных препаратов для преодоления МЛУ оказывается бесперспективным. В этой связи представляется целесообразным применение биологически активных соединений, обладающих регуляторной активностью на транспортную функцию белков МЛУ. Из перечисленного широкого спектра заболеваний, лечение которых осложняется, а порой и невозможно из-за МЛУ, очевидна необходимость поиска эффективных регуляторов МЛУ. В этой связи принципиальное решение проблемы создания средств преодоления МЛУ видится в использовании таких соединений, которые обладают низкой токсичностью и способностью оказывать регуляторное действие на активность транспортных систем.

В настоящее время отсутствуют точные сведения о частоте возникновения МЛУ среди пациентов, получающих химиотерапию.

Предполагают, что не менее половины всех случаев развития токсикоза и невозможного завершения полного курса химиотерапии вызваны возникновением МЛУ. МЛУ возникает не только при лечении онкологических больных. Ряд инфекционных агентов, например, малярийный плазмодий, грамм положительные бактерии, гельминты и другие способны к появлению МЛУ. До настоящего времени все попытки создать лекарственные препараты обеспечивающие преодоление МЛУ оказались безуспешными.

Среди множества лекарственных препаратов и биологически активных соединений, обладающих свойством регулирования МЛУ не обнаружено средств с достаточной специфической активностью и безвредностью. В этой связи становится, очевидно, высокая актуальность проблемы поиска средств преодоления МЛУ.

Как уже было отмечено традиционное направление, основанное на поиске конкурентных ингибиторов МЛУ, не позволяет достигнуть положительных результатов. Создание эффективных средств преодоления : МЛУ требует применение принципиально иных подходов к решению проблемы. Таким подходом может быть применение синтетических регуляторных пептидов, обладающих выраженным действием на показатели активности транспортных систем в зависимости от их функционального состояния.

Одним из перспективных направлений в создании новых регуляторных пептидов является подход, основанный на модификации последовательности аминокислот путем замены или элонгации структуры, для получения соединений, обладающих более высокой фармакологической потенцией. Цель работы:

Изучить регуляторное влияние и механизм действия гидрофильных гексапептидов структурной формулы: аргинил-алъфа-аспартш-лизгт-валил-тирозил-аргинин (имунофан), лизил-гистидил-глицгт-лизш-гистидш-глицин (биопоэтин), цишо-лшггл-гистндш-глгщш-лызш-гистидш-глкцин (циклобурсин) на АТФ-зависимые транспортные белки множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Задачи исследования:

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние трех гексапептидов структурной формулы: аргинил-алъфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (имунофан),лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин (биопоэтин), цикяо-лизил-гистидш-глицш-лизил-гистидил-глицин (циклобурсин) на транспорт субстрата из опухолевых клеток.

2. Определить специфичность действия гексапептидов в отношении транспортных белков МЛУ.

3. Изучить влияние гексапептидов на функциональную активность различных типов транспортных белков множественной лекарственной устойчивости.

4. Определить влияние гексапептидов на чувствительность опухолевых клеток к действию цитостатических препаратов.

5. Определить влияние гексапептидов на экспрессию генов и белков МЛУ.

6. Исследовать влияние гексапептидов на экспрессию маркера силы иммунного ответа (HLA-DR), маркеров Т-лимфоцитов (CD2, CD4, CD8) и В-лимфоцитов (CD22).

7. Исследовать влияние гексапептидов на продукцию антителообразущих клеток.

Научная новизна работы:

Впервые обнаружено ранее неизвестное свойство гидрофильных гексапептидов оказывать регуляторное действие на транспортную систему МЛУ и определена избирательность их действия на отдельные классы АТФ-зависимых транспортных белков. Впервые обнаружено свойство гидрофильных гексапептидов оказывать влияние на чувствительность опухолевых клеток к действию цитостатического препарата - доксорубицина и проведена оценка возможности их применения в качестве средств преодоления МЛУ. Практическая значимость:

Практическое значение работы включает научное обоснование возможного применения гидрофильных регуляторных пептидов в качестве средств преодоления МЛУ. Разработка комплекса экспериментальных моделей изучения регуляторов МЛУ открывает возможность проведения доклинической оценки специфической активности регуляторных пептидов. В дальнейшем это позволит создать новые оригинальные препараты для преодоления МЛУ. Положения, выносимые на защиту:

1. Гидрофильные гексапептиды обладают способностью модулировать активность АТФ-зависимых транспортных белков МЛУ.

2. Гидрофильные гексапептиды обладают высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ и не менее чем в 1000 раз превышают действие гидрофобных пептидов - известных ингибиторов транспортных насосов.

3. Регуляторное действие гексапептида имунофана проявляется в -зависимости от функционального состояния транспортных белков МЛУ. В период транспорта субстрата гексапептид ингибирует белки АТФ-зависимой транспортной системы, а в латентный период стимулирует их активность.

4. Модулирование транспорта субстрата белками, ответственными за МЛУ под действием гексапептидов, регулируется путем изменения экспрессии транспортных белков или их активности.

5. Гидрофильные гексапептиды обладают плеотропным типом действия -восстанавливают нарушенные функции транспортной системы клетки и обладают иммунорегуляторной активностью.

6. Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата в сверх низких дозах.

I. Обзор литературы

Главной задачей нашей работы было исследование действия гексапептидов на регуляцию транспортных белков множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. В этой связи представлялось целесообразным включить в обзор литературы одного раздела, посвященного общей характеристике явления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, а другой данным научной литературы относительно регуляторных пептидов, которые были опубликованы к началу нашей работы.

Ы.Общая характеристика явления множественной лекарственной устойчивости.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - это невосприимчивость популяции клеток опухоли одновременно к целому ряду химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия на клетку. Явление устойчивости к широкому классу лекарственных соединений известно для различных биологических объектов[64,71]. Оно существенно снижает эффективность средств, используемых для терапии бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций, а также злокачественных новообразований. Из перечисленного широкого спектра заболеваний, лечение которых осложняется, а порой и невозможно из-за МЛУ, очевидна необходимость поиска эффективных ингибиторов МЛУ.

В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны в основном два типа транспортных белков: multidrug resistance associated protein (MRP) и P-glycoprotein (P-gp), которые обнаружены в опухолях различного происхождения (лимфомах, саркомах, карциномах и нейробластомах) [6,29,71]. Субстратами для обоих типов транспортных белков является широкий спектр противоопухолевых соединений; например, антрациклины, этопозид, винкристин, таксол[89]. Однако в отличие от P-gp, MRP

10 транспортирует различные соединения из клеток в измененном виде, как коньюганты с глутатионом или глюкуроновой кислотой[71].

Изучение резистентности клеток к химиотерапии важно и для практической онкологии, поскольку с ней нередко связывают неудачи лечения злокачественных новообразований. Неэффективность терапии обусловлена не только изменением опухолевых клеток, но и целым рядом других причин, по которым препарат не доходит до клетки в адекватной и активной форме.

В частности, апоптоз - один из основных механизмов самопрофилактики онкологических заболеваний.

Апоптоз играет главную роль как в развитии, так и в гомеостазе. Апоптоз вызывает большинство химиопрепаратов[54]. Из таблицы 1 видно, что механизмы резистентности популяций опухолевых клеток к токсическим воздействиям разнообразны, а изменения в клетке, приводящие к лекарственной устойчивости обладают возможностью прерывать путь реализации повреждения на любом этапе.

МЛУ была впервые обнаружена Biedler J.L. и соавторами в 1970 году в опытах с культивируемыми клетками[15]. Было показано, что воздействие на культуры клеток одного препарата может привести к возникновению популяции, резистентной одновременно ко многим другим веществам, с которыми клетки не встречались (перекрестная устойчивость) [45]. Разнообразие механизмов МЛУ значительно затрудняют как диагностику причин устойчивости больных к терапии, так и выработку разумных протоколов по преодолению МЛУ опухолевых клеток. Обсуждение каждого отдельного механизма МЛУ показывает, что чувствительность опухолевых клеток к терапии в большой степени зависит от того, что сейчас принято называть «клеточным контекстом»: от сочетания особенностей регуляции жизненно важных процессов клетки, связанных с ее видовой и тканевой принадлежностью, а также с теми генетическими изменениями, которые произошли в клетке в ходе ее малигнизации и прогрессии новообразования.

Природная» МЛУ исходно свойственная опухолевым клеткам (например, опухоли головного мозга, резистентны к химиотерапии из-за гематоэнцефалического барьера).

Таблица 1. Основные механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток[47,122].

Основные этапы реализации цитотоксического действия лекарственных препаратов Изменения, приводящие к лекарственной устойчивости Механизм лекарственной устойчивости (примеры)

1 Накопление препарата в клетке Снижение накопления препарата в клетке Активация белков транспортеров (P-gp, MRP).

2 Активация или сохранение активности препарата внутри клетки Инактивация препарата или отсутствие его активации Активация ферментов системы глутатиона, секвестрация препарата во внутриклеточных везикулах

3 Повреждение мишени препарата Изменение мишени, повышенная репарация повреждений Мутации генов топоизомераз, увеличение степени репарации ДНК

4 Блок клеточного цикла и гибель клетки Отмена апоптоза или блокада клеточного цикла, возникающих в ответ на действие цитостатика; активация Мутации гена р53, активация гена BCL-2 генов, контролирующих апоптоз

Приобретенная МЛУ может возникать в результате химиотерапии. В популяциях опухолевых клеток в результате воздействия цитостатика появляются редкие генетические варианты резистентных клеток, которые получают селективное преимущество и размножаются.

Селективное преимущество клеткам обеспечивает не обязательно лекарственная устойчивость, но и, такие признаки как ускоренное размножение, изменение чувствительности к факторам роста и пр. Эти факторы влияют на селекцию клеток лекарственными препаратами. Существенный интерес представляют также так называемые «адаптационные изменения», в условиях которых большинство клеток популяции оказывается устойчивым к лечению за счет временной активации защитных механизмов клеток.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Новиков, Сергей Александрович

V. Выводы

1. Впервые в мире, обнаружено свойство гидрофильных гексапептидов структурной формулы аргинил-алъфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (имунофан); лизил-гистидил-глицш-лизил-гистидил-глицин (биопоэтин); цикпо-лизш-гистидш-глш(ил-лизш-гистидил-глицин (цикло-бурсин) модулировать активность АТФ-зависимых транспортных белков МЛУ.

2. Гидрофильные гексапептиды обладают высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ и не менее, чем в 1 ООО раз превышают действие гидрофобных пептидов - известных ингибиторов транспортных насосов.

3. Регуляторное действие гексапептида имунофана проявляется в зависимости от функционального состояния транспортных белков МЛУ. В период транспорта субстрата гексапептид ингибирует белки АТФ-зависимой транспортной системы, а в латентный период стимулирует их активность.

4. Модулирование транспорта субстрата белками, ответственными за МЛУ под действием гексапептидов, регулируется путем изменения экспрессии транспортных белков или их активности.

5. Гидрофильные гексапептиды оказывают плеотропное действие на клетки: восстанавливают нарушенные функции транспортной системы, влияют на экспрессию генов иммунного ответа, созревание Т-лимфоцитов, количество антителообразующих клеток.

6. Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата в сверх низких дозах, что открывает возможность их использования для лечения злокачественных новообразований, осложненных МЛУ.

1У.Заключение

Развитие МЛУ представляет собой одну из основных причин безуспешной химиотерапии злокачественных новообразований. Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы МЛУ разнообразны и лекарственная устойчивость клетки может определяться включением различных механизмов - от ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы гибели клетки, индуцируемой веществом.

Обсуждение каждого отдельного механизма МЛУ показывает, что чувствительность опухолевых клеток к терапии в высокой степени зависит -от сочетания особенностей регуляции жизненно важных процессов клетки, связанных с ее видовой, тканевой принадлежностью, а также с теми генетическими изменениями, которые произошли в клетке в ходе ее малигнизации и прогрессии новообразования.

Множественность и разнообразие механизмов МЛУ значительно затрудняют как диагностику устойчивости больных к химиотерапии, так и выработку разумных протоколов по преодолению МЛУ опухолевых клеток.

Естественно, на первый план выходит исследование механизмов возникновения МЛУ и поиск фармакологических средств воздействия на данные механизмы.

В настоящее время обнаружено или синтезировано три поколения ингибиторов МЛУ, с возрастающей эффективностью и уменьшающимися побочными явлениями. Впервые ингибирование МЛУ было показано для верапамила - блокатора кальциевых каналов. В дальнейшем были обнаружены ингибиторы МЛУ, относящиеся к другим классам соединений. Все эти ингибиторы были активны при высоких концентрациях (5-50мкМ), в которых они были токсичны, или оказывали нежелательные эффекты (иммунносупрессия, нарушения сердечной деятельности и др.). Наиболее активным из первого поколения ингибиторов МЛУ считают циклоспорин А.

Все известные ингибиторы МЛУ оказывают действие по принципу конкурентного ингибирования транспорта лекарственных веществ из клетки во внеклеточное пространство.

С 1993 г и по настоящее время синтезирован ряд конкурентных ингибиторов проявляющих ингибирующую активность в интервале 20-100 нМ. Наиболее эффективный из ингибиторов третьего поколения -циклопропилдибензосуберан (LY 335979) который в 10 раз активнее циклоспорина А. Однако, до настоящего времени нет ингибиторов МЛУ, которые приемлемы для применения в клинике, поскольку в эффективных дозах они оказывают мощное токсическое действие.

Создание клинически приемлемых средств для преодоления МЛУ 1 требует применения принципиально нового подхода к решению поставленной задачи.

Перспективным направлением поиска средств преодоления МЛУ могут быть биологически активные соединения, оказывающие регуляторное действие на работу ABC транспортеров. Типичным представителем таких соединений являются гидрофильные регуляторные пептиды, которые оказывают свое действие через сигнальную систему клетки. Диапазон поиска новых гидрофильных регуляторных гексапептидов определяется возможностями модификации химической структуры естественных регуляторных пептидов с целью повышения их регуляторной активности.

Предложенное нами научное направление по созданию лекарственных средств для преодоления МЛУ основывается на принципе фармакологического регуляторного действия на АТФ-зависимую транспортную систему клеток путем применения биологически активных гидрофильных гексапептидов. Изучали три гидрофильных гексапептида: структурной формулы: аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (имунофан), структурной формулы: лизгш-гистидил-глицип-лизил-гистидил-глицин (биопоэтин), структурной формулы: цикло- лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидш-глицин (циклобурсин). Указанные соединения являются оригинальными и разработаны под руководством профессора В.В. Лебедева в лаборатории иммунологии и биотехнологии ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

В условиях целостного организма действие регуляторных гидрофильных гексапептидов проявляется в виде множества параллельных эффектов, как со стороны иммунной системы, так и со стороны других органов и систем[73]. Так, например, посредством изменения продукции регуляторных пептидов клетками тимуса, костного мозга и селезёнки поддерживается нейроэндокринная регуляция гомеостаза всего организма[73]. Модулирующее действие является универсальным для регуляторных пептидов различного происхождения и выражается в восстановлении функции ЦНС и эндокринных органов через изменение содержания вторичных мессенджеров и каскадного усиления сигнала в соответствующих клетках-мишенях[73].

Полученные данные свидетельствуют о том, что гексапептиды действует на С02-положительные Т-клетки, имеющие фенотип CD8+ (Т-супрессоры) и модулирующие экспрессию одного из антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса — HLA-DR. Указанное свойство может иметь важное практическое значение в комплексной терапии опухолей.

Как показали проведенные исследования гидрофильные регуляторные гексапептиды, в отличие от других биологически активных веществ оказывают специфическое действие на различные функции клетки, в том числе на транспортную систему ABC.

В отличие от конкурентных ингибиторов МЛУ регуляторные гидрофильные гексапептиды обладают исключительно низкой токсичностью, что принципиально важно для их применения в клинике.

Впервые нами было обнаружено, что гидрофильные гексапептиды обладают исключительно высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Новиков, Сергей Александрович, 2008 год

1. Adams J.M., Cory S.: The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. // Science. 1998; 281: 1322-6.

2. Allikmets R., Schriml L.M., Hutchinson A., Romano-Spica V. and Dean M.: A human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is involved in multidrug resistance. // Cancer Res, 1998; 58: 5337-5339.

3. Allouche M., Bettaieb A., Vindis C., Rousse A. et al.: Influence of Bcl-2 overexpression on the ceramide pathway in daunorubicin-induced apoptosis of leukemic cells. //Oncogene. 1997; 14: 1837-45.

4. Ambudkar S.V., Kimchi-Sarfaty C., Sauna Z.E. and Gottesman M.M.: P-glycoprotein: from genomics to mechanism. // Oncogene, 2003; 22: 7468-7485.

5. Ambudakar S.V., Dey, S., Hrycyna C. A., Ramachandra, M., Pastan, I., Gottesman, M.M.: Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter. //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999; 39: 361-398.

6. Annereau J.P., Szakacs G., Tucker C.J., Arciello A. et al.: Analysis of ATP-binding cassette transporter expression in drug-selected cell lines by a microarray dedicated to multidrug resistance. // Mol Pharmacol, 2004; 66: 1397-1405.

7. Ashmarin I.P., Karazeeva E.P.: New role of a highly-stable oligopeptides, neurotrophins, and immunomodulators in the regulatory continuum. // Usp. Fiziol. Nauk. 2003; 34: 14-19.

8. Ashmarin I.P., Obukhova M.F.: Regulatory peptides. A functional continuum. // Biokhimiia. 1986; 51: 531-545.

9. Audhya Т., Scheid M.P., Goldstein G.: Contrasting biological activities of thymopoietin and splenin, two closely related polypeptide products of thymus and spleen. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984; 81: 2847-2849.

10. Audhya Т., Schlesinger D.H., Goldstein G.: Complete amino acid sequences of bovine thymopoietins I, II, and III: closely homologous polypeptides. // Biochemistry. 1981; 20: 6195-6200.

11. Beck W.T.: The cell biology of multiple drug resistance. // Biochem. Pharmacol. 1987. V.36:2879-2887.

12. Beck W.T., Cirtain M.C., Glover C.J. et al.: Effects of indole alkaloids on multidrug resistance and labeling of P-glicoprotein by a photoaffinity analig of vinblastine. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988; 153: 959-966.

13. Beringer P.M., Slaughter R.L.: Transporters and their impact on drug disposition. // Ann. Pharmacother. 2005; 39: 1097-1108.

14. Bhushan A., Abramson R., Chiu J.F. and Tritton T.R.: Expression of c-fos in human and murine multidrug-resistant cells. // Mol. Pharmacol. 1992; 42: 69-74.

15. Biedler J.L. and Reihm H.: Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro: cross-resistance, radioautographic, and cytogenetic studies. //CancerRes. 1970; 30: 1174-84.

16. Black S.M., Beggs G.D., Hayes J.D. et al.: Expression of human glutathione S-transferases in Saccharomyces cerevisiae confers resistance to the anticancer drugs adriamycin and chlorambucil. // Biochem. J. 1990; 268: 309-315.

17. Bodo A., Bakos E., Szeri F., et al.: The role of multidrug transporters in drug availability, metabolism and toxicity. // Toxicol. Lett. 2003; 140-141: 133-143.

18. Borst P.: Genetic mechanisms of drug resistance. // Acta Oncol. 1991; 30: 87105.

19. Borst P., Evers R., Kool M., Wijnholds J.: A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. 2000, J Natl Cancer Inst., 92, 1295-302.

20. Borst P., Kool M. and Evers R.: Do cMOAT (MRP2), other MRP homologues, and LRP play a role in MDR? // Semin. Cancer Biol. 1997; 8: 205213.

21. Borges-Walmsley M.I., McKeegan K.S. and Walmsley A.R.: Structure and function of efflux pumps that confer resistance to drugs.// Biochem J, 2003; 376: 313-338.

22. Bosch I. and Croop J.: P-glycoprotein multidrug resistance and cancer. // Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1288: F37-54.

23. Bradley G., Juranka P.P. and Ling V.: Mechanism of multidrug resistance. // Biochim. Biophys. Acta. 1988; 948: 87-128.

24. Bradley G., Ling V.: P-glycoprotein, multidrug resistance and tumor progression. // Cancer and Metast. reviews 1994; 13: 223-233.

25. Bradley G., Pitts J.: The use of genetic marking to assess the intraction of sensitive and multidrug-resistant cells in mixed culture. // Br. J Cancer. 1994; 70: 795-798.

26. Broxterman H.J. and Schuurhuis G.J.: Transport proteins in drug resistance: detection and prognostic significance in acute myeloid leukemia. // J Intern. Med. Suppl. 1997; 740: 147-151.

27. Burt R.K. and Thorgeirsson S.S.: Coinduction of MDR-1 multidrug-resistance and cytochrome P-450 genes in rat liver by xenobiotics. // J Natl. Cancer Inst. 1988; 80: 1383-1386.

28. Bush J.A. and Li G.: Cancer chemoresistance: the relationship between p53 and multidrug transporters.// Int J Cancer, 2002; 98: 323-330.

29. Chang G. Multidrug resistance ABC transporters.// FEBS Lett, 2003; 555: 102-105.

30. Chaudhary P.M. and Roninson I.B.: Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs. // J Natl. Cancer Inst. 1993; 85: 632-639.

31. Chaudhary P.M., Roninson I.B.: Expression and activity of P-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells. // Cell. 1991; 66: 8594.

32. Chaudhary P.M. and Roninsin I.B.: Activation of MDR1 (P-glycoprotein) gene expression in human cells by protein kinase С agonists. // Oncol. Res. 1992; 4:281-90.

33. Chen C.J., Chin J.E., Ueda K. et al.: Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells. // Cell 1986; 47: 381-389.

34. Chin J.E., Soffir R., Noonan K.E. et al.: Structure and expression of the human MDR (P-glycoprotein) gene family. // Molecular and Cellular Biology. 1989; 9: 3808-3820.

35. Chin K-V., Ueda К., Pastan I. and Gottesman M.M.: Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53. // Science. 1992; 255: 459-462.

36. Chiou S.K., Rao L., White E.: Bcl-2 blocks p53-dependent apoptosis. // Mol Cell Biol. 1994; 14: 2556-63.

37. Clarke A.R., Purdie C.A., Harrison D.J., Morris R.G. et al.: Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. // Nature. 1993; 362: 849-52.

38. Deeley R. and Cole S.P.: Function, evolution and structure of multidrug resistance protein (MRP). // Semin. Cancer Biol. 1997; 8: 193-204.

39. Deeley R.G., Westlake C. and Cole S.P.C.: Transmembrane transport of endo-and xenobiotics by the ATP binding cassette multidrug resistance proteins (MRPs). // Physiol Rev, 2006; 86: 849-899.

40. Dive C.: Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance. // J Intern. Med. Suppl. 1997; 740: 139-45.

41. Doyle L.A., Yang W., Abruzzo L.V., Krogmann Т., Gao Y., Rishi A.K. and Ross D.D.: A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells.//Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95: 15665-15670.

42. Doyle L.A., Ross D.D.: Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP (ABCG2). // Oncogene 2003, 22: 7340-58.

43. Egudina S.V., Stromskaya T.P., Frolova E.A. and Stavrovskaya A.A.: Early steps of the P-glycoprotein expression in cell cultures studied with vital fluorochrome. //FEBS Lett. 1993; 329: 63-66.

44. Eischen C.M., Kottke T.J., Martins L.M. et al.: Comparison of apoptosis in wild-type and Fas-resistant cells: chemotherapy-induced apoptosis is not dependent on Fas/Fas ligand interactions. // Blood. 1997; 90: 935-43.

45. Endicott J.A., Ling V.: The biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance. // Annu. Rev. Biochem. 1989; 58: 137-171.

46. Eytan G.D.: Mechanism of multidrug resistance in relation to passive membrane permeation. // Biomed. Pharmacother. 2005; 59: 90-97.

47. Geourjon С., Orelle С., Steinfels E., Blanchet C., Deleage G., Di Pietro A., and Jault J.M.: A common mechanism for ATP hydrolysis in ABC transporter and helicase superfamilies. // Trends Biochem Sci, 2001; 26: 539-544.

48. Giaccia A.J., Kastan M.B.: The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. // Genes Dev. 1998; 12: 2973-83.

49. Gilbert L., Etwood L., Merino M. et al.: A pilot study of pi-class glutathione S-transferase expression in breast cancer: correlation with estrogen receptor expression and prognosis in node-negative breast cancer. // J Clin. Oncol. 1993; 11:49-58.

50. Glavinas H., Krajcsi P., Cserepes J. and Sarkadi В.: The role of ABC transporters in drug resistance, metabolism and toxicity. // Current Drug Delivery 2004, 1: 27-42.

51. Goldstein L.J., Gottesman M.M., Pastan I.: Expression of the MDR1 gene in human cancers. // Cancer Treat. Res. 1991; 57: 101-119.

52. Grant C.E., Valdimarsson G., Hipfner D.R. et al.: Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs. // Cancer Res. 1994; 54: 357-361.

53. Gros P. and Buschman E.: The mouse multidrug resistance gene family: structural and functional analysis. //Int. Rev. Cytol. 1993; 137C: 169-97.

54. Hannun Y.A.: Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy. // Blood. 1997; 89: 1845-53.

55. Hill B.T., Deucharts K., Hosking L.K., et al.: Overexpression of P-glycoprotein in mammalian tumor cell lines after fractionated X irradiation in vitro. //J Natl. Cancer Inst. 1990; 82: 607-612.

56. Higgins C.F.: The ABC of channel regulation. // Cell. 1995; 82: 693-696.

57. Hollo Z., Homolya L., Davis C.W. and Sarkadi В.: Calcein accumulation as a fluorometric functional assay of the multidrug transporter. // Biochim Biophys Acta, 1994; 1191:384-388.

58. Homolya L., Hollo Z., Germann U.A., Pastan I., Gottesman M.M. and Sarkadi В.: Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. //JBiol Chem, 1993; 268: 21493-21496.

59. Honjo Y., Morisaki K., Huff L.M., Robey R.W., Hung J., Dean M. and Bates S.E.: Single-nucleotide polymorphism (SNP) analysis in the ABC half-transporter ABCG2 (MXR/BCRP/ABCP 1).// Cancer Biol Ther , 2002; 1: 696-702.

60. Hung L.W., Wang I.X., Nikaido K., Liu P.Q., Ames G.F. and Kim S.H.: Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter.// Nature, 1998; 396: 703-707.

61. Jones P.M. and George A.M.: The ABC transporter structure and mechanism: perspectives on recent research. // Cell Mol Life Sci 2004; 61: 682-699.

62. Jones P.M., George A.M.: Multidrug resistance in parasites: ABC transporters, P-glycoproteins and molecular modelling. // Int. J Parasitol. 2005; 35: 555-566.

63. Juliano R.L., Ling V.: A surfase glicoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. // Biochim. Biophys. Asta. 1976; 455: 152162.

64. Juranka P.F., Zastawny L., Ling V.: P-glicoprotein: multidrug-resistance and a superfamily of membrane-associated transport proteins. // FASEB Journal 1989; 3: 2583-2592.

65. Kartner N., Riordan J.R., Ling V.: Cell surface P-glycoprotein associated with multidrug resistance in mammalian cell lines. // Science 1983; 22: 1285-1288.

66. Kartner N., EverndenPorelle D., Bradley G., Ling V.: Detection of P-glycoprotein in multidrug resistant cell lines by monoclonal antibodies. // Nature 1985; 316: 820-823.

67. Klein I., Sarkadi В., Varadi A.: An inventory of the human ABC proteins. 1999, Biochim Biophys Acta., 1461, 237-62.

68. Komissarenko V.P.: Splenin, its biological and medical properties. // Probl. Endokrinol. Gormonoter. 1961; 7: 104-17.

69. Krishna R., Mayer L.D.: Multidrug resistance (MDR) in cancer. Mechanisms, reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs. // Eur. J Pharm. Sci. 2000; 11: 265-283.

70. Landowski Т.Н., Gleason-Guzman M.C., Dalton W.S.: Selection for drug resistance results in resistance to Fas-mediated apoptosis. // Blood. 1997; 89: 185461.

71. Lebedev V.V., Shelepova T.M., Stepanov O.G., et al.: Immunofan, a Regulatory Peptide for Treating Infectious and Noninfectious Diseases. // Moscow: Praminko, 1998.

72. Lecureur V., Sun D., Hargrove P., Schuetz E.G., Kim R.B., Lan L.B., Schuetz J.D.: Cloning and expression of murine sister of P-glycoprotein reveals a more discriminating transporter than MDRl/P-glycoprotein. 2000, Mol Pharmacol., 57, 24-35.

73. Legrand O., Simonin G., Perrot J. Y. et al.:P-gp and MRP activities using calcein-AM are prognostic factors in adult acute myeloid leukemia patients. // Blood. 1998;91:4480-8.

74. Leslie E.M, Deeley R.G, Cole S.P.: Multidrug resistance proteins: role of P-glycoprotein, MRP1, MRP2, and BCRP (ABCG2) in tissue defense. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005; 204: 216-237.

75. List A.F.: Role of multidrug resistance and its pharmacological modulation in acute myeloid leukemia. //Leukemia. 1996; 10: 937-42.

76. Loe D.W., Deeley R.G. and Cole S.P.: Biology of the multidrug resistance-associated protein, MRP. // Eur. J Cancer. 1996; 32A: 945-957.

77. Loo T.W., Bartlett M.C. and Clarke D.M.: Disulfide cross-linking analysis shows that transmembrane segments 5 and 8 of human P-glycoprotein are close together on the cytoplasmic side of the membrane. // J Biol Chem 2004; 279: 7692-7697.

78. Nagata S.: Apoptosis mediated by the Fas system. // Prog Mol Subcell Biol. 1996; 16: 87-103.

79. Ozvegy C., Varadi A. and Sarkadi В.: Characterization of drug transport, ATP hydrolysis, and nucleotide trapping by the human ABCG2 multidrug transporter. Modulation of substrate specificity by a point mutation. // J Biol Chem , 2002; 277: 47980—47990.

80. Pawagi A.B., Wang J., Silverman M., Reithmeier R.A. and Deber C.M.: Transmembrane aromatic amino acid distribution in P-glycoprotein. A functional role in broad substrate specificity. // J Mol Biol, 1994; 235: 554-564.

81. Polgar O., Bates S.E.: ABC transporters in the balance: is there a role in multidrug resistance? // Biochem. Soc. Trans. 2005; 33: 241-245.

82. Pommier Y., Leteurte F., Fesen M.R. et al.: Cellular determinants of sensitivity and resistance to DNA topoisomerase inhibitors. // Cancer Invest. 1994; 12: 530-542.

83. Reyes C.L., Chang G.: Structure of the ABC transporter MsbA in complex with ADP vanadate and lipopolysaccharide. // Science. 2005; 308: 1028-1031.

84. Ritter С.A., Jedlitschky G., Meyer zu Schwabedissen H. et al.: Cellular export of drugs and signaling molecules by the ATP-binding cassette transporters MRP4 (ABCC4) and MRP5 (ABCC5). // Drug. Metab. Rev. 2005; 37: 253-278.

85. Robert J.: Resistance to cytotoxic agents. // Curr Opin Pharmacol. 2001, 4, 353-7.

86. Roninson I.B.: Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells. // Plenum Press, N.Y.- London. 1990.

87. Roninson I.B., Pastan I., Gottesman M.M.: Isolation and characterization of the human MDR (P-glycoprotein) genes. // From 1991.

88. Sarkadi B. and Muller M.: Search for specific inhibitors of multidrug resistance in cancer. // Semin. Cancer Biol. 1997; 8: 171-182.

89. Scheffer G.L., Schroeijers A.B., Izquierdo M.A., Wiemer E.A., Scheper R.J.: Lung resistance-related protein/major vault protein and vaults in multidrug-resistant cancer. // Curr Opin Oncol., 2000; 12: 550-6.

90. Schinkel A.H.: The physiological function of drug-transporting P-glycoproteins. // Semin. Cancer Biol. 1997 Jun; 8: 161-170.

91. Schisselbauer J., Silber R., Papadopoulous E. et al.: Characterization of glutathione S-transferase expression in lymphocytes from chronic lymphocytic leukemia patients.//Cancer Res. 1990; 50: 3562-3568.

92. Scotto K.W., Johnson R.A.: Transcription of the multidrug resistance gene MDR1: a therapeutic target. // Mol Interv., 2001; 1: 117-25.

93. Sharom F.J, Lu P, Liu R, Yu X.: Linear and cyclic peptides as substrates and modulators of P-glycoprotein: peptide binding and effects on drug transport and accumulation. // Biochem J. 1998; 333: 621-630.

94. Shen H., Kauvar L. and Tew K.D.: Importance of glutathione and associated enzymes in drug response. // Oncol. Res. 1997; 9: 295-302.

95. Simon S.M., Schindler M.: Cell biological mechanisms of multidrug resistance in tumors. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 3497-3504.

96. Silveira P.F., Gil J., Casis L., Irazusta J.: Peptide metabolism and the control of body fluid homeostasis. // Curr. Med. Chem. Cardiovasc. Hematol. Agents. 2004; 2: 219-238.

97. Smith J.J., Schinkel A.H., Borst P. et al.: Homozygous disruption of the murine mdr2 P-glycoprotein gene leads to a complete absence of phospholipid from bile and to liver disease. // Cell. 1993; 75: 451-62.

98. Stambolic V., Suzuki A., de la Pompa J.L. et al.: Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN. // Cell. 1998; 95: 29-39.

99. Stavrovskaya A., Turkina A., Sedyakhina N., Stromskaya Т., Zabotina Т., Khoroshko N., Baryshnikov A.: Prognostic value of P-glycoprotein and leukocyte differentiation antigens in chronic myeloid leukemia.// Leuk Lymphoma, 1998, 28, 469-82.

100. Stromskaya T.P., Rybalkyna E.Yu., Shtil A.A. ey al.: Influence of exogenous RAR alpha gene on MDR1 expression and P-glycoprotein function in human and rodent cell lines. //Br. J Cancer. 1998; 77: 1718-1725.

101. Szakacs G., Paterson J., Ludwig J., Booth-Genthe C. and Gottesman M.M.: Targeting multidrug resistance in cancer. // Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 219— 234.

102. Teeter L.D., Ecksberg Т., Tsai Y. and Kuo K.T.: Analysis of the Chinese hamster P-glycoprotein/multidrug resistance gene P-gpl reveals that the AP-1 site is essential for full promoter activity. // Cell Growth Differ. 1991 Sep; 2: 429-437.

103. Tew K.D.: Glutathione-associated enzymes in anticancer drug resistance. // Cancer Res. 1994; 54: 4313-20.

104. Thebaut F., Tsuruo Т., Hamada H. et al.: Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987; 84: 7735-7738.

105. Thottassery J.V., Zambetti G.P., Arimori K. et al.: p53-dependent regulation of MDR1 gene expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. //Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1997; 94: 11037-42.

106. Toffoli G., Frustaci S., Tumiotto L. et al.: Expression of MDR1 and GST-pi in human soft tissue sarcomas: relation to drug resistance and biological aggressiveness. //Ann. Oncol. 1992; 3: 63-69.

107. Van Veen H.W., Callaghan R., Higgins C.F. et al.: A bacterial antibiotic-resistance gene that complements the human multidrug-resistance P-glycoprotein gene. //Nature. 1998; 391: 291-295.

108. Varadi A., Szakacs G., Bakos E., and Sarkadi В.: P glycoprotein and the mechanism of multidrug resistance.// Novartis Found Symp 2002; 243: 54-65.

109. Volk E.L. and Schneider E.: Wild-type breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) is a methotrexate polyglutamate transporter. // Cancer Res 2003; 63: 5538-5543.

110. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., and Gay N.J.: Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold.// EMBO J , 1982; 1:945-951.

111. Wang Y., Blandino G., Oren M., Givol D.: Induced p53 expression in lung cancer cell line promotes cell senescence and differentially modifies the cytotoxicity of anti-cancer drugs. // Oncogene. 1998; 17: 1923-30.

112. Wielinga P.R, HeijnN., Westerhoff H.V. et al.: A method for studying plasma membrane transport with intact cells using computerized fluorometry. // Anal. Biochem. 1998; 263: 221-31.

113. Willingram M.C., Richert N.D., Cornwell M.M. et al.: Immunocitocemical localization of PI 70 at the plazma membrane of multidrug-resistant human cells. // J.Histochem.Cytochem. 1987; 35: 1451-1456.

114. Zamora J.M., Beck W.T.: Cloroquine enhancement of anticancer drug cytotoxicity in multiple drag resistant human leukemic cells. // Biochem. Pharmacol. 1986; 35: 4303-4310.

115. Ставровская А. А.: Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. // Биохимия 2000, 65, 112126.

116. В заключение выражаю глубокую благодарность Василию Вячеславовичу Лебедеву за предоставленную возможность выполнить настоящее исследование и за содействие в выполнении и завершении работы.

117. Приношу искреннюю благодарность Рыбалкиной Екатерине Юрьевне и Заботиной Татьяне Николаевне за участие в обсуждении и за техническую помощь.

118. Благодарю сотрудников лаборатории иммунологии и биотехнологии за всестороннюю поддержку в выполнении диссертации.