Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Одиноков, Георгий Николаевич

• Одиноков, Георгий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Одиноков, Георгий Николаевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления об организации генома 15 возбудителя чумы

1.2. Схемы внутривидовой классификации Yersinia pestis 28 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы бактерий, использованные в работе, и условия 36 их культивирования

2.2. Методы исследования денитрифицирующей активности, 46 ферментации глицерина, арабинозы, рамнозы, мелибиозы, продукции изоцитралиазы у штаммов Y. pestis

2.3. Определение питательных потребностей штаммов Y. pestis

2.4. Выделение бактериальной ДНК

2.5. Проведение полимеразной цепной реакции

2.6. Электрофоретический учет результатов

2.7. Определение нуклеотидных последовательностей генов

2.8. Проведение филогенетического анализа

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИ- 51 ЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ Y. pestis ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ПРИРОДНЫХ

ОЧАГОВ ЧУМЫ

3.1. Характеристика штаммов Y. pestis из различных природных Оча- 51 гов чумы по биохимическим признакам, лежащим в основе деления на подвиды и биовары

3.2. Определение питательных потребностей штаммов К резНБ кавказ- 56 ского подвида

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ 60 ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БИОВАРОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

4.1. Определение структурно-функциональной организации генов пар 60 оперона и других генов кодирующих редукцию нитратов

4.2. Сравнительный анализ вариабельности нуклеотидных 71 последовательностей генов арабинозного оперона у штаммов К реяШ

ГЛАВА 5. ВЫЯВЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В ГЕНАХ КОДИРУЮЩИХ 83 ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ДЕЛЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ НА ОСНОВНОЙ И НЕОСНОВНЫЕ ПОДВИДЫ

5.1. Выявление изменений в структуре генов, у штаммов возбудителя 83 чумы основного и неосновных подвидов, кодирующих ферментацию мелибиозы

5.2 Определение мутаций в генах биосинтеза изоцитрат-лиазы у штаммов У. реяШ

ГЛАВА 6. УСТАНОВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ АУКСОТ- 99 РОФНОСТИ ШТАММОВ К рехГм КАВКАЗСКОГО ПОДВИДА

6.1. Сравнительный компьютерный анализ вариабельности нуклео- 100 тидных последовательностей генов, участвующих в биосинтезе аргинина

6.2. Выявление мутаций в генах биосинтеза фенилаланина, тирозина и 101 витамина В1 (тиамина)

6.3. Исследование структурно-функционального состояния генов био- 103 синтеза аргинина, фенилаланина, тирозина и витамина В1 (тиамина) у штаммов кавказского подвида

ГЛАВА 7. ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ ДАН- 113 НЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ВНУТРИВИДОВОЙ КЛАССИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов»

Актуальность проблемы

Чума - зоонозная природно-очаговая особо опасная карантинная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя [Черкасский, 1996]. Чума представляет реальную угрозу для населения из-за существования многочисленных природных очагов чумы, 42 из которых расположены в Российской Федерации и ближнем зарубежье [Они-щенко и др., 2004]. Существует опасность заноса возбудителя чумы на территорию России из соседних, неблагополучных по этому заболеванию стран, а также в результате биотеррористических актов. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 2000 случаев заболевания чумой, многие из которых заканчиваются летальным исходом. Большая вспышка легочной чумы в 2009 г. произошла в Хайнань-Тибетском автономном округе Китая, в которой тоже был зарегистрирован ряд смертельных случаев [WHO / plague sheets, 2009]. Все эти факты настоятельно требуют разразботки новых, основанных на современных технологиях высокоэффективных методов диагностики возбудителя чумы, средств профилактики и лечения, вызываемой им особо опасной болезни.

Использованные до настоящего времени классификации Yersenia pestis учитывали лишь морфологические, культуральные, биохимические и другие фенотипические свойства, а также различия в вирулентности штаммов возбудителя [Безсонова, 1928; Берлин A.JL и др., 1938; Туманский, 1959; Тимофеева, 1972; Кутырев с соавт., 1998; Devignat, 1951; Dale et al., 2002; Cobbs et al., 2004; Dennis et al, 2004; Lazarus et al., 2004]. Такие классификации, безусловно, внесли свой вклад в систематизацию Y. pestis и в целом отражают реально существующие филогенетические связи внутри этого вида. Они не утратили-своего значения и по сей день и по-прежнему широко используются, в практи- ' ческой микробиологии. Однако достигнутые в последнее время успехи в фундаментальной генетике и молекулярной микробиологии позволяют перевести решение задач по систематизации возбудителя чумы на качественно новый уровень, основанный на использовании его молекулярно-генетических особенностей [1л е1 а1., 2009; ЫпсИег е! а1., 2009]. Перевод существующей классификации возбудителя чумы на генетическую основу позволит повысить надежность, достоверность и качество систематизации, а также избежать присущих классическим схемам недостатков, обусловленных изменчивостью фе-нотипических свойств возбудителя. Геном бактерий имеет достаточно консервативную структуру, защищенную от случайных изменений системами репарации ДНК, и поэтому схемы генетической дифференциации являются более надежными, воспроизводимыми и обладают большей разрешающей способностью по сравнению с используемыми фенотипическими классификациями.

В соответствии с принятой в настоящее время отечественной классификацией штаммы возбудителя чумы делят на основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский) подвида [Кутырев и др., 1998]. Согласно распространенной зарубежной классификации штаммы 7. реяйБ на основании различий по ряду биохимических свойств (способность к ферментации глицерина, редукции нитратов, окислению аммиака) и по историко-географическому принципу [Devignat, 1951], делят на три биовара: апйяиа (античный), тесНеуаНз (средневековый) и опеп1аНз (восточный). По феноти-пическим характеристикам штаммы основного подвида соответствуют трем биоварам (античному, средневековому и восточному), принятым в зарубежной классификации. Однако штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах чумы, в. Российской Федерации и ближнем зарубежье, остаются не систематизированными по биоварной принадлежности.

По экспрессии дифференциально-значимых биохимических признаков наиболее активными являются штаммы античного биовара. Они ферментируют глицерин и обладают денитрифицирующей активностью. Штаммы средневекового биовара У. реяйз не способны редуцировать нитраты, но ферментируют глицерин и арабинозу. Штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин, но активно редуцируют нитраты и утилизируют арабинозу.

Генетические причины различной экспрессии биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на биовары, остаются к настоящему моменту изученными недостаточно. В литературе имеется ограниченное число публикаций по этому вопросу. Достоверно установлено лишь то, что причиной отсутствия ферментации глицерина у штаммов восточного биовара является мутация в гене глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (glpD). Показано, что в этом гене у всех штаммов восточного биовара присутствует делеция размером 93 п.н. [Parhill et al., 2001; Motin et al., 2002]. В отношении изменений в генах, детерминирующих другие биохимические особенности, используемые при дифференциации биоваров, имеются противоречивые данные [Motin et al., 1998; Richardson et al., 2001; Deng et al., 2002; Zhou et al., 2004].

В основе деления Y. pestis на подвиды в соответствии с классификацией, принятой в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба, лежит неодинаковая биохимическая активность штаммов, их различия в вирулентности по отношению к лабораторным животным и разная ландшафт-но-географическая приуроченность [Кутырев, Проценко, 1998; Anisimov et al., 2004]. Штаммы основного подвида, как правило, высоко вирулентны и имеют высокую эпидемическую значимость. Они не ферментируют рамнозу и мели-биозу, не чувствительны к пестицину I, имеют высокий уровень продукции изоцитралиазы. Штаммы неосновных подвидов, ферментируют рамнозу и ме-либиозу, чувствительны к пестицину I, не проявляют изоцитрат-лиазной активности, избирательно вирулентны для лаборторных животных, эпидемически малозначимы.

Генетические основы различной биохимической активности штаммов, возбудителя чумы разных подвидов практически не исследованы. За рубежом этот вопрос мало изучен в связи с отсутствием в зарубежных коллекциях штаммов неосновных подвидов, которые распространены, в основном, в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья. В отечественной литературе имеются лишь единичные работы по определению различий в структуре генов, У. резИя основного и неосновных подвидов; кодирующих редукцию нитратов и ферментацию рамнозы [Ерошенко и др., 2008; Куклева и др., 2008, 2009]. Штаммы возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, циркулирующие в России и ближнем зарубежье, остаются не изученными по структуре генов, участвующих в редукции нитратов, ферментации глицерина, арабинозы, мелибиозы, изоцитрат-лиазы и других важных для классификации признаков. Не установлена причина гетерогенности штаммов чумного микроба по питательным потребностям. Штаммы из различных природных очагов чумы имеют различные питательные потребности, определяемые нарушениями генов промежуточного метаболизма, что может быть использовано в генетической схеме дифференциации штаммов ¥. реяйз из различных природных очагов чумы.

Выявление изменений в структуре генов, лежащих в основе различной экспрессии микробиологических и биохимических признаков, послужит надежной основой для создания генетической схемы классификации штаммов возбудителя чумы, а также для определения основных направлений внутривидовой эволюции У. рехНя.

Цель работы. Определение генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых для деления штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать использованные в работе штаммы Г. резИз, выделенные в природных очагах чумы в Российской Федерации и ближнего зарубежья, по биохимическим свойствам (редукция нитратов, продукция изо-цитрат-лиазы, ферментация арабинозы и мелибиозы), лежащим в основе деления на подвиды и биовары. Установить принадлежность штаммов, циркулирующих на территории России и сопредельных стран, к определенным био-варам.

2. Изучить структурно-функциональную организацию генов, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении^ на биова-ры, - редукцию нитратов и ферментацию арабинозы.

3. Выявить изменения в генах У. реБйБ, детерминирующих ферментацию мелибиозы и продукцию изоцитрат-лиазы, лежащих в основе дифференциации основного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

4. Определить питательные потребности штаммов У. реяНз кавказского подвида и установить генетические основы их ауксотрофности.

5. Оценить перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов У. реяШ и установления основных направлений внутривидовой эволюции этого возбудителя.

Научная новизна работы. На основании данных комплексного микробиологического, биохимического и генетического анализа установлено, что штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

Впервые показано, что причиной отсутствия нитратредуцирующей активности у части штаммов основного подвида, циркулирующих на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, является наличие замены единичного нуклеотида О на Т в позиции 613 гена периплазматической нит-ратредуктазы - пар А, что доказывает принадлежность этих штаммов к средневековому биовару. Отсутствие экспрессии этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов вызвано вставкой тиминового нуклеотида (+Т) в 302 позиции другого гена — гена которая приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры кодируемого транспортного белка -8 эй А, также участвующего в восстановлении нитратов.

Впервые установлено, что отсутствие ферментации арабинозы у штаммов У. резИя алтайского и гиссарского подвидов связано с наличием мутации в регуляторном гене, арабинозного оперона — агаС, который' содержит инсер-цию гуанинового нуклеотида (+в) в позиции 773 от начала гена, приводящую к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры регуляторного белка АгаС, необходимого для инициации транскрипции генов арабинозного оперона.

Впервые установлена генетическая основа различной продукции изо-цитрат-лиазы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, связная с наличием вставки двух нуклеотидов (+СС) в регуляторном гене ШК. в позиции 269-270, которая приводит к инактивации кодируемого им бел-ка-репрессора ацетатного оперона 1с1Я и является причиной конститутивного синтеза фермента изоцитрат-лиазы у штаммов основного подвида. Штаммы неосновных подвидов содержат интактный ген юШ и не способны к конститутивному синтезу изоцитралиазы.

Показано, что отсутствие ферментации мелибиозы у штаммов 7. резНз основного подвида обусловлено внедрением инсерционной последовательности 18255 в генте1В, кодирующий фермент галактозидпермеазу. У штаммов неосновных подвидов вставка 1Б255 в гене те1В отсутствует.

Впервые выявлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида, которые связаны с внедрением инсерционных последовательностей 1$>100 в гены а^А и агор, вставкой 10 п.н. в ген агоО, инсерцией тиминового нуклеотида в ген й/Яи делецией 13 п.н. в гене гкЮ.

Полученная молекулярная, характеристика штаммов У. реяШ основного и неосновных подвидов по генам, кодирующим биохимические признаки, лежащие в основе деления на подвиды и биовары, создает основу для разработки генетической схемы внутривидовой классификации возбудителя чумы.

По результатам работы оформлены заявки на изобретение «Способ определения подвидовой- принадлежности штаммов возбудителя'чумы, методом секвенирования» (№ 2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено положительное решение о выдаче патента) и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс — типирования (№ 2009146094. Приоритет от 11.12.2009).

Практическая значимость работы. По результатам работы оформлены и утверждены методические рекомендации «Определение подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы на основе секвенирования генов rhaS и агаС, контролирующих ферментацию рамнозы и арабинозы» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 6 от 16 июня 2009) и «Определение подвидовой принадлежности штаммов Yersinia pestis методом мультилокусмного сиквенс — типирования (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 1 от 23 февраля 2010).

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы три штамма: Y. pestis КМ 910 алтайского, КМ 596 гиссарского и КМ 1861 улегей-ского подвидов в качестве референс-штаммов этих подвидов.

Полученные в ходе выполнения исследования данные по генетической организации штаммов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика возбудителя чумы» на курсах специализации по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы возбудителя чумы основного подвида, циркулирующие в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам, о чем свидетельствуют данные комплексного анализа микробиологических, биохимических и генетических свойств этих штаммов.

2. В основе разного проявления, биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары, лежат различные типы мутаций в генах, кодирующих эти признаки. Отсутствие способности к редукции нитратов у штаммов основного подвида средневекового биовара связано с наличием нонсенс-мутации (G Т) в гене парА периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов — с инсерцией единичного нуклеотида в ген ssuA транспортного периплазмати-* ческого белка SsuA. Отсутствие ферментации арабинозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено вставкой гуанинового нуклеотида в последовательность гена агаС.

3. Разная биохимическая активность штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы по ряду дифференциальных признаков вызвана редукцией кодирующих их генов у основного подвида и их интактно-стью у неосновных подвидов. Отсутствие ферментации мелибиозы штаммами основного подвида обусловлено внедрением IS2S5 в ген melB галактозидпер-меазы, а конститутивный синтез изоцитрат-лиазы у штаммов этого подвида — вставкой двух нуклеотидов (СС) в последовательность регуляторного гена iclR. Штаммы неосновных подвидов содержат интактные гены melB и iclR.

4. Причиной множественных питательных потребностей штаммов Y. pestis кавказского подвида является инактивация у них ряда генов биосинтеза аминокислот и витаминов. Зависимость штаммов этого подвида по аргинину вызвана инсерцией 100 в ген argA, по фенилаланину — вставкой 10 п.н. в ген aroG, по тирозину - внедрением IS100 в ген aroF, по тиамину (В]) делецией 13 п.н. - в ген thiG и инсерцией единичного нуклеотида в thiH. На основе всего комплекса выявленных мутаций для штаммов кавказского и других подвидов, а также биоваров возбудителя чумы определены характерные генотипы, которые могут быть использованы при создании генетической схемы-, внутривидовой классификации Y. pestis.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств — участников содружества независимых государств», Волгоград, 2008; VI Международной конференции «Молекулярная диагностика и биобезопасность», М., 2009; научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», 25 — 27 мая 2010 г.; на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов 2008 - 2010 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России.». Оформлено два патента на изобретения «Способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования» (№ 2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено положительное решение о выдаче патента) и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного-сиквенс типирования» (№ 2009146094. Приоритет от 11.12.2009).

Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 156 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель содержит 203 отечественных и зарубежных источников.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Одиноков, Георгий Николаевич

выводы

1. На основании проведенного комплексного анализа биохимических и генетических свойств природных штаммов У pestis из различных природных очагов чумы установлено, что штаммы основного подвида, циркулирующие на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

2. Причиной отсутствия экспрессии дифференциального биохимического признака - редукции нитратов у штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в природных очагах чумы в России и ближнего зарубежья, является наличие мутации - замены единичного нуклеотида в гене парА периплазма-тической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов — инсерции единичного нуклеотида в гене ssuA периплазматического транспортного белка.

3. Впервые установлены генетические основы различной экспрессии признаков ферментации мелибиозы и продукции изоцитрат-лиазы у штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба. Показано, что отсутствие способности штаммов основного подвида ферментировать дисахарид мели-биозу обусловлено инсерцией IS2&5 в последовательность структурного гена melB, кодирующего галактозидпермеазу. Установлено, что конститутивный синтез изоцитрат-лиазы, характерный для основного подвида чумного микро1 ба, обусловлен вставкой двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 — 270 гена -репрессора iclR.

4. Причиной арабинозонегативности штаммов У pestis алтайского и гиссарского подвидов является мутация в регуляторном гене арабинозного оперона - агаС, которая вызвана вставкой единичного гуанинового нуклеотида в 773 позиции этого гена.

5. Впервые определены генетические основы ауксотрофности штаммов У. pestis кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по аргинину обусловлена внедрением IS 100 в ген argA, по фенилаланину — вставкой 10 р.н. в aroG , по тирозину - инсерцией IS 100 в aro F , по витамину Bi - делецией 13 п.н в thiG и инсерцией тимина в thiH.

6. Определены характерные генотипы основного (античного, средневекового, восточного биоваров) и неосновных подвидов возбудителя чумы, использование которых позволяет проводить внутривидовую дифференциацию Y. pestis. Показана перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На протяжении более чем столетней истории изучения возбудителя чумы после его открытия в 1894 г. А. Иерсеном и С. Китазато неоднократно предлагались разнообразные схемы классификации Y. pestis, которые были основаны на различном проявлении микробиологических, биохимических и других фенотипических свойств. Предложенные классификации, безусловно, соответствовали тому уровню знаний и методических подходов, которыми располагали исследователи. Так в 1928 г. A.A. Безсоновой все штаммы Y.pestis были разделены по способности ферментировать глицерин на две группы: глицеринонегативные и глицеринопозитивные. В 1938 г А.Л. Берлин и А.К. Борзенков разделили штаммы возбудителя чумы на океаническую и континентальную расы. R. Devignat в 1951 на основании ряда биохимических свойств (различной способности к денитрификации и ферментации глицерина) и особенностей ландшафтно-географического происхождения предложил деление штаммов Y. pestis на три группы, которые в настоящее обозначают как биовары чумного микроба: античный, средневековый и восточный. В 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба была принята единая систематическая схема подвидовых категорий для возбудителя чумы, основанная на фенотипических свойствах, вирулентности по отношению к лабораторным животным, ареале распространения. Штаммы чумного микроба, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, были разделены на пять подвидов: основной, кавказский, алтайский, гиссарский, улегей-ский (Тимофеева 1972; Кутырев, Проценко, 1985).

Все предложенные схемы были, безусловно, полезны для исследователей и внесли свой вклад в систематизацию Y. pestis, а многие из них (деление на подвиды и биовары) широко используются и в настоящее время. Однако бурное развитие современных технологий молекулярной биологии, секвени-рование полных геномов патогенных иерсиний позволяет решать задачу по усовершенствованию внутривидовой классификации возбудителя чумы на современном молекулярно-генетическом уровне, основанном на сравнительной геномике штаммов возбудителя чумы. Перевод существующих дифференциальных схем классификации этого возбудителя на генетический уровень повысит их разрешающую способность, эффективность и надежность, а также улучшит качество систематизации видов Y. pestis.

Генетические основы различной биохимической активности штаммов возбудителя чумы разных подвидов остаются практически не исследованными. Определены лишь отдельные генетические дефекты в генах, используемых для внутривидового деления Y. pestis. Так, показано, что у штаммов основного подвида средневекового биовара отсутствие способности редуцировать нитраты связано с наличием мутации в структурном гене пар Л пери-плазматической нитратредуктазы, необходимой для проявления этого свойства, а неспособность штаммов восточного биовара (глицериннегатиные штаммы или океаническая раса) к ферментации глицерина собусловлена делецией в гене glpD глицерол-3-фосфатдегидрогеназы [Parhill et al., 2001; deng et al., 2002; Motin et al., 2002; Zhou et al., 2004]. Получены данные о том, что причиной рамнозонегативности всех изученных штаммов основного подвида является наличие несинонимической замены единичного нуклеотида в регулятор-ном гене rhaS рамнозного оперона [Куклева и др., 2008; 2009]. В отношении других генов, детерминирующих значимые биохимические признаки, имеется либо достаточно противоречивая информация [Brubaker et al., 1972; Wren, 2003; Brubaker, 2004], либо данные просто отсутствуют. Практически не исследованы по генам дифференциально-значимых биохимических признаков штаммы Y. pestis основного и неосновных подвидов, персистирующие в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья. Изучение генетической организации штаммов различных подвидов, находящихся на разных ступенях эволюции Y. pestis, представляет важную задачу, поскольку позволит определить те эволюционные преобразования генома возбудителя, которые привели к становлению высоковирулентной бактерии Y. pestis.

Для установления генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых при делении штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары, нами были использованы как традиционные микробиологические и биохимические методы, так и современные методы молекулярной биологии — полимеразная цепная реакция, секвенирование, а таюке методы биоинформатики. Были применены ресурсы сети Интернет - базы данных NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modeller и использованы компьютерные программы: Mega 4.0 и PHYLIP с дистанционно-матричными методами.

Для установления генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых для деления штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары, использовали общий алгоритм проведения анализа. На первом этапе изучали экспрессию исследуемого микробиологического или биохимического признака у природных штаммов Y. pestis. Была изучена экспрессия дифференциально-значимых признаков (редукции нитратов, ферментации арабинозы, мелибиозы, продукции изоцитрат-лиазы) у большого количества (около ста) штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы.

Одновременно с помощью компьютерного анализа штаммов Y. pestis KIM (средневековый биовар), С092 (восточный биовар), Antiqua, Angola, Ne-ра1516 (античный биовар), 91001 (биовар microtus), Pestoides F (кавказский подвид) и Y. pseudotuberculosis РВ1/+, IP32953, IP31758, YPIII, полные нук-леотиды геномов которых представлены в базе данных NCBI GenBank выявляли вариабельные участки генов, продукты которых в соответствии с базами данных KEGG Metabolic Pathways и PF AM принимают участие в экспрессии данного признака. На вариабельные участки генов, которые предположительно являлись причиной отсутствия фенотипического проявления признака, конструировали праймеры, с помощью которых амплифицировали в ПЦР вариабельные фрагменты генов у различных природных штаммов, возбудителя чумы. На основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов у штаммов, отличающихся по экспрессии изучаемого признака, выявляли мутации, которые послужили причиной отсутствия этого признака.

С использованием этого алгоритма нами проведено изучение структурно-функциональной организации генов, продукты' которых принимают участие в проявлении дифференциальных признаков, лежащих в основе деления« штаммов Y. pestis на биовары, — редукции нитратов и ферментации арабино-зы. Выполнен сравнительный компьютерный анализ генов пар оперона, а также генов пагР и ssuA — регуляторного (NarP) и транспорного (SsuA) белков, участвующих в восстановлении нитратов, у штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank, а также у большого количества (около ста) природных штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов, выделенных в различных природных очагах чумы в Российской Федерации, ближнем и дальнем зарубежье.

Установлено, что причиной отсутствия денитрифицирующей способности у части штаммов основного подвида является наличие единичной нуклео-тидной замены G на Т в 613 позиции гена пар А, кодирующего белок - пери-плазматическую нитратредуктазу. Причина неспособности восстанавливать нитраты штаммами алтайского и гиссарского подвидов иная и связана с наличием мутации в гене транспортного белка — ssuA, который у этих штаммов в позиции 302 содержит инсерцию единичного нуклеотида (+Т). Полученные данные, наряду с биохимическими характеристиками штаммов (способности к редукции нитратов, ферментации арабинозы и глицерина), позволили сделать вывод о том, что на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья циркулируют штаммы античного и средневекового биоваров, в то время как штаммы восточного биовара выявляются только среди штаммов из дальнего зарубежья.

По-видимому, причиной отсутствия нитратредуцирующей активности • у штаммов биовара microtus является-та же мутация, что и у штаммов алтайского и гиссарского подвида — инсерция единичного нуклеотида в гене ssu. Нами установлено, что мутация в гене парА - вставка единичного в позиции 1021 гена пар А не может быть причиной отсутствия экспрессии признака у штаммов microtus [как это предположено D. Zhou et al., 2004], поскольку она выявлена нами и у штаммов кавказского подвида, а также у штаммов 7 pseudotuberculosis, которые редуцируют нитраты. "

Впервые у большого количества природных штаммов, возбудителя чумы проведен структурно-функциональный анализ генов арабинозного оперо-на, и определена полная нуклеотидная последовательность регуляторного гена агаС, участвующего в регуляции экспрессии ферментации арабинозы. Установлено, что причиной отсутствия этого признака у алтайского и гиссарско-го подвидов является наличие вставки единичного нуклеотида в гене агаС в позиции 773 от начала гена. Штаммы основного, кавказского и улегейского подвидов не содержат такой мутации, что коррелирует с их способностью ферментировать арабинозу.

Проведено исследование структуры генов, кодирующих ферментацию мелибиозы и продукции изоцитрат-лиазы, которые используются при делении штаммов Y. pestis на основной и неосновные подвиды. Ранее генетическая детерминированность различного проявления этих свойств у штаммов основного и неосновных подвидов не исследовалась. Данные по этому вопросу в литературе отсутствуют.

Проведенный сравнительный компьютерный анализ нуклеотидной последовательности генов ферментации мелибиозы (melA, melB и melR) у штаммов Y. pestis и 7. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, показал наличие в гене melB (1232 п.н.), детерминирующем синтез галактозидпермеазы, вставки инсерционной последовательности IS2&5 (1322 п.н.) после 73 п.н. у штаммов возбудителя4 чумы С092, KIM, Antiqua, Nepal516. У других штаммов 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F и у всех штаммов 7 pseudotuberculosis обнаружена интактная структура гена melB. В ПЦР анализе с помощью рассчитанных праймеров, фланкирующих область внедрения IS2SJ, у большого количества природных штаммов возбудителя чумы получены специфические фрагменты гена melB. У изученных штаммов 7 pestis неосновных подвидов - кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского, в ПЦР образовывались амплификаты размером 325 п.н., что соответствовало интактной структуре гена melB. В отличие от них у штаммов основного подвида фрагменты имели больший размер 1648 п.н., что свидетельствовало о внедрении инсерционной последовательности в этот ген и коррелировало с отсутствием у них ферментативной активности в отношении ме-либиозы. Таким образом, нами впервые установлена генетическая причина; различной экспрессии дифференциального признака — ферментации мели-биозы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, которая связана с нарушением структуры гена melB у штаммов основного подвида за счет внедрения инсерционной последовательности IS2&5.

Для дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида от неосновных и возбудителя псевдотуберкулеза, используется их способность к конститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы. Сравнительный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов ацетатного оперона (асеА, асеВ, асеК, iclR) у штаммов Г. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, показал наличие в iclR (размер гена 843 п.н.) вставки двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269-270 от начала гена у штаммов Y. pestis С092, KIM, Antiqua, Nepal516. В отличие от них у других штаммов чумного микроба Angola, 91001, Pestoides F и у всех штаммов псевдотуберкулезного обнаружена интактная структура гена iclR. Секвенирование вариабельной области гена iclR, проведенное нами у природных штаммов Y. pestis, выявило наличие у штаммов основного подвида Y. pestis одинаковой мутации — инсерции двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 — 270., в отличие от неосновных подвидов у которых обнаружена интактная структура этого гена. Выявленная мутация приводит к инактивации гена и нарушению структуры (и функции) белка-репрессора ацетатного оперона IclR, связанному с потерей с С-терминального конца домена (148 - 271 а.о.), который связывает молекулу индуктора. Это приводит к конститутивной экспрессии генов ацетатного оперона и коррелирует с высокой активностью у штаммов основного подвида Y. pestis фермента изоцитрат-лиазы.

Ранее высказывались предположения о том, что наиболее древними штаммами чумного микроба являются штаммы кавказского подвида [Бобров, Филлипов, 1997; Куклева и др., 2002]. Их изучение представляет значительный интерес, поскольку позволяет определить те этапы эволюционных изменений генома, которые привели к преобразованию сапрофитной энтеропато-генной бактерии - псевдотуберкулезного микроба в высоковирулентный системный патоген с принципиально другим механизмом передачи возбудителя. Полученные нами результаты указывают на то, что кавказский подвид наиболее активен по дифференциальным биохимическим признакам и содержит интактные гены {парА, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), как и возбудитель псевдотуберкулеза. Это подтверждает большую близость кавказского подвида к предшественнику - Y. pseudotuberculosis по сравнению с другими подвидами Y. pestis.

Нами были также проведены микробиологические исследования по изучению питательных потребностей штаммов Y. pestis кавказского подвида, поскольку в литературе имелись противоречивые сведения по этому вопросу. Установлено, что все изученные штаммы кавказского подвида вели себя единообразно. У них выявлена потребность в двух ароматических аминокислотах - фенилаланине и тирозине, а также в аминокислоте аргинине и витамине Bi (тиамине). У штаммов из Восточно-Кавказского высокогорного очага чумы кроме потребностей в аргинине, фенилаланине, тирозине, и витамине В1 обнаружена также зависимость по лейцину, в то время как штаммы кавказского подвида из Ленинаканского, Присеванского, Зангезуро-Карабахского, При-араксинского природных очагов такой зависимости не имели.

Для установления генетических основ ауксотрофности штаммов кавказского подвида с помощью баз данных KEGG и PFAM был проведен анализ метаболических путей и определение ферментативных систем, участвующих в биосинтезе ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина, аминокислоты аргинина и витамина Bt (тиамина). В генах биосинтеза аргинина (argA), фенилаланина (aroG), тирозина (aroF), и витамина Bl( thiH, thiG) у штаммов кавказского подвида обнаружены значимые мутации. В структурном гене а^А выявлена вставка инсерционной последовательности \S100 по-* еле 196 п.н., что является причиной ауксотрофности кавказского подвида по аргинину. В гене аго<Э кодирующем изофермент ДАГФС-рРЬе] (З-дезокси-Б-арабиногептулозонат-7-фосфат-синтаза), у штаммов кавказского подвида присутствует вставка 10 нуклеотидов (в позиции 820 - 829), приводящая к сдвигу рамки считывания и являющаяся причиной неспособности синтезировать аминокислоту фенилаланин. Другой структурный ген агор (1071 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФС-[Туг], у штаммов кавказского подвида, инактивирован внедрением инсерционной последовательности 18100 после 888 нуклеотида от начала гена, что является причиной отсутствия способности синтезировать тирозин. Структурный анализ генов метаболического пути биосинтеза витамина В] (тиамина) показал наличие мутаций в генах ¿/г/Сг и МН, кодирующих фермент тиазолсинтазу, которые инактивированы соответственно делецией размером 13 п.н. в позиции 384 - 396 и инсерцией тимина (+Т) в позиции 552.

Таким образом, нами впервые установлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида. Полученная генетическая характеристика штаммов кавказского подвида по генам дифференциальных биохимических признаков {{ггарА, вви, glpD, агаС, те1В, юШ) и по генам биосинтеза факторов роста (а^А, агоС, агор, ¿/г/С и ШН) свидетельствует о наибольшей древности этого подвида, а также длительном периоде его эволюции, независимой от других подвидов У. ре,М'я.

На основе проведенного развернутого молекулярно-генетического анализа природных штаммов У. резИБ из различных очагов чумы также определены генетические особенности штаммов других подвидов, циркулирующих на территории России, ближнего и дальнего зарубежья. Применение выявленных генетических мутаций в генах парА, агаС, glpD, теШ, ШЯ позволяет с высокой эффективностью и надежностью определять принадлежность штаммов У. реБИз к основному или неосновным подвидам, а штаммов основного подвида к одному из трех биоваров — античному, средневековому или восточному. Выявлены характерные генотипы" каждой из этих таксономических единиц— вида Y. pestis.

Установленная в ходе выполнения этой работы вариабельность генов пар A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH и thiG, наряду с ранее выявленной вариабельностью гена glpD [Parhill et al., 2001] была использована для реконструкции филогенетической схемы эволюции штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, которая подтвердила древность штаммов кавказского, а также других неосновных подвидов Y. pestis (рисунок 34).

Как следует из этой схемы, возбудитель чумы ведет свое происхождение от псевдотуберкулезного микроба и является ветвью эволюции этой энте-ропатогенной иерсинии. Наиболее древний подвид Y. pestis филогенетически более близок Y. pseudotuberculosis по сравнению с другими подвидами чумного микроба. Другую древнюю ветвь эволюции Y pestis представляют собой улегейский, алтайский и гиссарский подвиды, которые генетически близки друг другу и, по-видимому, отделились от общего ствола эволюции единой группой, которая в дальнейшем распалась на отдельные подвиды. По-видимому, наиболее древним среди них является, улегейский подвид, который содержит меньшее число мутаций в генах жизнеобеспечения (в частности, у него отсутствует мутация в гене агаС) по сравнению со штаммами алтайского и гиссарского подвидов. Последние филогенетически близки друг другу, а также штаммам группы microtus, которые содержат такие же мутации в генах дифференциальных биохимических признаков, что и штаммы алтайского и гиссарского подвидов. Нами впервые высказано предположение о том, что штаммы microtus относятся к группе алтайско-гиссарских подвидов.

С092 (orientalis)

ЮМ

KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)

NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. hismrica

91001 (microtus) subsp. altaica .

Ansoia

231, 680 subsp. caucasica

F. pestis

Y. pseu dotu bereu losis

Yersinia spp.

Рисунок 34. Схема внутривидовой эволюции У. реяТ^я

После отделения неосновных подвидов в ходе дальнейшей эволюции вида, связанной с нарастанием паразитизма, патогенности и вирулентности и сопровождавшейся дальнейшей редукцией генома, сформировался античный биовар У. резШ, который дал начало средневековому и восточному биоварам (рисунок 34). Многие штаммы, представляющие отдельные этапы и ветви эволюции возбудителя чумы сохранились в природе и циркулируют в различных очагах чумы, в том числе и на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, что создает надежную основу для разработки полной схемы генетической классификации У. реБШ. В настоящее время уже очевидно, что внутривидовая популяционная структура У. резйз достаточно сложна, и принятое деление на подвиды и биовары не отражает в полной мере всего многообразия внутривидовой таксономии этого возбудителя. Для выявления всего мирового разнообразия штаммов Y. pestis требуется проведение дальнейших исследований генетических особенностей штаммов из различных природных очагов чумы.

Проведенные в этой работы исследования составляют основу для разработки молекулярной систематики возбудителя чумы, целью которого является создание полной внутривидовой таксономии Y. pestis на основе вариабельности генов дифференциально-значимых микробиологических и биохимических признаков чумного микроба.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Одиноков, Георгий Николаевич, 2010 год

1. Акиев А.К. О физиологической изменчивости чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. — 1969. Вып. 6 (10). - С. 22 - 25.

2. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 // Молекул, генетика. 2002. - № 3. - С. 3 - 23.

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 2 // Молекул, генетика. 2002. - № 4. - С. 3 - 11.

4. Апарин Т.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы: Руководство. — Иркутск / Изд во Иркут. ун - та, 1989. — 90 с.

5. Базанова Л.П., Иннокентьева Т.И. О роли блох — основных и второстепенных переносчиков чумы — в циркуляции возбудителя в сибирских природных очагах // Мед. параз. и параз. болезни. 2008. - № 3. - С. 54 - 60.

6. Балахонов C.B., Ценджаев С.Н., Эрдэмэбат A.B. Новые плазмидовары штаммов возбудителя чумы, изолированных в Монголии // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 1991. — № 11. 27 — 29.

7. Безсонова A.A., О двух разновидностях 7. pestis, обнаруживаемых при росте на глицериновых средах // Вестник микробиологии, эпидемиологии и паразитологии. 1928. - Т. 7. - Вып. 3. - С. 325 - 326.

8. Берлин А.Л., Борзенков А.К., Рамнозо-позитивные варианты 7. pestis и дифференциально-диагностическое значение среды с рамнозой // Вестник микробиологии, эпидемиологии и паразитологии. 1938. - Т. 17. - Вып. 3-4. -С. 238-246.

9. Бибикова В.А., Классовский В.Н., Передача чумы блохами. — М.: — Медицина, 1974. 188 с.

10. Бобров А.Г., Филлипов А.А. Распространенность IS285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1997. - № 2. - С. 36 - 40.f

11. Ващенок B.C. Блохи переносчики возбудителей болезней человека и животных. - Л.: Наука, 1988. — 160 с.

12. Величко Л.Н., Кондрашкина К.И., Ермилов А.П. и др. Экскременты блох естественная среда долговременного хранения микроба чумы // Проблемы особо опасных инфекций. — 1978. - Вып. (64). — С. 51 — 53.

13. Волков Ю.П., Ерошенко Г.А. Анализ эффективности некоторых методов построения филогенетических деревьев, используемых при оценке эволюционного родства микроорганизмов // Проблемы особо опасных инфекций. 2009. - Вып. 1 (99). - С. 35 - 41.

14. Гасфилд Дж. Строки, деревья и последовательности в алгоритмах: Информатика и вычислительная биология. — СПб.: Невский диалект, БХВ-Петербург, 2003. 654 с.

15. Гольдфарб Л.М., Домарадская Т.И., Джапаридзе М.Н. К оценке изоцит-рат-лиазного теста для дифференциации возбудителей чумы и псевдотуберкулеза// Актуальные вопросы лабораторной диагностики и биохимии возбудителей чумы и холеры. — 1984. С. 23 - 27.

16. Гольдфарб Л.М., Домарадская Т.И., Джапаридзе М.Н. Изоцитрат-лиазная активность тест для внутривидовой дифференциации иерсиний чумы // Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. - 1984. — ч. 2.-С. 21 -22.

17. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998. - 173 с.

18. Ильина Т.С., Романова ЮМ., Гинцбург A.JI. Биопленка как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. — 2004. -Т. 40, № 11. — С. 1 12.

19. Классовский Л.Н., Мартиневский И.Л., Степанов В.М. О факторах роста штаммов бактерий чумы, выделяемых на Закавказском нагорье от полевок и их блох // Проблемы особо опасных инфекций. 1972. - Вып. 1. - С. 186 — 188.

20. Козлов М.П. Чума. М.: Медицина, 1979. - 192 с.

21. Кокушкин A.M. Некоторые особенности алиментарного заражения и проявления чумы у диких грызунов // Пробл. особо опасных инфекций. — 1994.-№5.-С. 23-31.

22. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Автореф. дис. докт. мед. наук. 1995. — 46 с.

23. Куклева Л.М. Ерошенко Г.А. Шавина Н.Ю. и др. Сравнительный анализ распределения псевдогенов в. геноме штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы // Молекул.генет., микробиол. и вирусол. 2009. - №2. - С. 32-36.

24. Куклева Л.М., Ерошенко- Г.А., Павлова А.И. и др. Характеристика штаммов возбудителя чумы» разных подвидов по признакам нитратредукции, ферментации глицерина и арабинозы // Проблемы особо опасных инфекций. — 2007.-№ 94.-С. 50-53.

25. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ю. и др. Сравнительный анализ распределения псевдогенов в геноме штаммов основного и неосновныхподвидов возбудителя чумы // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 2008. -№ 2.-С. 32-36.

26. Куклева JI.M., Кузьмиченко И.А., Проценко О.А. Сравнительная характеристика биохимических свойств штаммов разных подвидов Yersinia pestis и штаммов Yersinia pseudotuberculosis II Проблемы особо опасных инфекций. — 2001.-Вып. 1.-С. 105-110.

27. Куклева JI.M., Проценко О.А., Кутырев В.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза / Молекул, генет., микробиол. и вирусол // 2002. №.1 - С. 3 - 7.

28. Кутырев В.В., Ерошенко Г.А., Попов Н.В. и др. Молекулярные механизмы взаимодействия возбудителя чумы с беспозвоночными животными // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2009. № 4. - С. 7 — 12.

29. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель чумы ультраструктура и локализация в переносчике / Под ред. В.В. Кутырева. — М.: Медицина. 2007. 224 с.

30. Кутырев В.В., Попов Ю.А., Проценко О.А. Плазмиды патогенности чумного микроба// Мол. генет., микробиол., вирусол. 1986. - № 6. - С.З -11.

31. Кутырев В.В., Проценко О.А. Классификация и молекулярно-генетические исследования Yersinia pestis II Проблемы особо опасных инфекций. 1998. - № 78. - С. 11 - 12.

32. Кутырев В.В., Смирнова Н.И., Генодиагностика и молекулярное типи-рование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. — 2003 — № 1. — С. 6 14.

33. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генетическое разнообразие и эволюция геномов возбудителей особоопасных инфекций чумы, холеры и сибирской язвы: настоящее и будующее // Биотехнология: состояние и переспективы раз-видия.-М., 2005.-Ч. 1.-С. 17.

34. Лаборатрорная диагностика особо .опасных инфекциооных болезней. Практическое руководство/ Под ред Г.Г.Онищенко, В.В.Кутырев.-М.: Медицина, Шико , 2009. 472 с.

35. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-480 с.

36. Мартиневский И.Л. Таксономия рода Yersinia II Мат. 4-ой науч. конф. по прир. очаг, и проф. чумы. — Алма-Ата, 1965. С. 142 — 148.

37. Мартиневский И.Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов. М.: Медицина, 1969. — 295 с.

38. Мартиневский И. Л., Степанов В.М., Кенжебаев А .Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. Нукус. Из-во «Каракалпакстан», 1990. — 151 с.

39. Методы общей бактериологии под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984. —264 с.

40. Михайлова P.C. Таксономия чумного микроба, циркулирующего среди полевок в Закавказском нагорье // Материалы к конф., посвящ. 50 летию института «Микроб». Саратов, 1968. - С. 67 - 68.

41. Определитель Бактерий Берджи под ред. Дж. Хоулта. Н. Крига, П.Снита, Дж. Стейли и Уильямса. — М.: Мир, 1997. 9-е изд. (в 2-х томах). — 799 с.

42. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Попов Н.В. и др. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири / Под ред. Г.Г.Онищенко, В.В. Кутырева. -М.: Медицина, 2004. 192 с.

43. Пейсахис Л.А., Степенов В.М. Внутривидовая классификация*возбудителя чумы по принципу географического районирования // Проблемы особо опасных инфекций. 1975. — Вып. 2. - С. 5 — 9.

44. Попов Ю.А. Конструирование и использование ДНК зондов на представителях рода Yersinia// Генетика, микробиол. и совершенствование методов лаб. диагностики особо опасн. инф. Саратов, 1991. — С. 3-13.

45. Попов Ю.А. Структурная и функциональная организация плазмид и генно-инженерные разработки на этой модели: Дис.докт. биол. наук. Саратов, 1991. - 248 с.

46. Попов Ю.А., Горшков О.В., Савостина Е.П. и др., Генотипирование штаммов Yersinia pestis из различных природных очагов чумы // Молекул, генетика, микробиология и вирусология 2000. - № 3. — С. 12-17.

47. Попов Ю.А., Проценко O.A., Анисимов П.И., Кокушкин A.M., Можаров

48. Т. Обнаружение плазмид пестициногенности чумного микроба методом электрофареза в агарозном геле // Профилактика особо опасн. инф.- Саратов, 1980.-С. 20-25.

49. Попов Н.В., Слудский A.A. Удовиков А.И. и др. Роль биопленок Yersinia pestis в механизме энзоотий чумы // Журн. микробиол., эпидемиол. иммунол. 2008. - № 4. - С.118 - 120.

50. Попов Ю.А., Фурсов В.В., Структурная организация производных плазмиды пестициногенности, меченных транспозонами Тп1 и Тп9 // Мол. биол., генет. и иммунол. чумы и холеры Саратов, 1983. - С. 34 - 39.

51. Попов Ю.А., Яшечкин Ю.И., Дроздов И.Г. Молекулярно-генетический анализ структуры ДНК плазмид pFra штаммов возбудителя чумы различных биоваров // Генетика. 1998. - Т. 34. - С. 198 - 205.

52. Проценко O.A., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина1, антигена фракция I и экзотоксина «мышиного» токсина // Генетика. 1983. -Т. 19, №7.-С. 1081-1090.

53. Ратнер В.А. Молекулярная генетика: принципы и механизмы. Новосибирск: Наука, 1983. - 256 с.

54. Розанова Г.Н., Сердюкова Т.В., Шехикян М.Т. и др. Возбудитель чумы из очагов полевочьего типа на Кавказе Науч.-исслед. противочумный ин-т Кавказа и Закавказья. Ставрополь, 1987. 17 с.

55. Савостина Е.П., Попов Ю.А., Геномный полиморфизм штаммов основного подвида возбудителя чумы // Молекул, генетика, микробиология и вирусология 2009. - № 4. - С. 23 - 26.

56. Смирнов Г.Б. Механизмы приобретения и потери генетической информации бактериальными геномами // Успехи современной биологии. 2008. — Т. 128. — № 1.-С. 52-76.

57. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близкие к нему микроорганизмы // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. — 2004. — Т. 6, № 1. — С. 10 -21.

58. Смирнова Н.И., Кутырев В.В., Сравнительный анализ молекуярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2006. - № 2. - С. 9 - 19.

59. Стыбаева Г.С., Атшабар Б.Б. Молекулярно-генетические особенности возбудителя чумы (обзор литературы) // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. 2003. - № 1 (7). - С. 52 - 67.

60. Сулейменов Б.М. Механизм энзоотии чумы. Алматы, 2004. — 236 с.

61. Султанов Г.В., Козлов М.П. Чума. Микробиология, патогенез, диагностика. Том 1. Махачкала: Из-во Акад. сельск. наук, 1995. 223 с.

62. Тимофеева Л.А. О таксономии чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 1972. - Вып. 1(23).- С. 15 - 22.

63. Тимофеева Л.А., Апарин Т.П., Трофименко Н.З. Потребности в аминокислотах штаммов чумного микроба, выделенных в очагах Сибири // Докл. Иркутск, противочумного ин-та. Иркутск, 1971. - Вып. 9. — С. 43 — 44.

64. Тимофеева Л.А., Жамьян Сурен, Сотникова А.Н. и др. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969 — 1971 гг. // Проблемы особо опасных инфекций. 1974. - №3 (37). - С. 37 - 42.

65. Тимофеева JI. А., Логачёв А. И. Yersinia pestis ulegeica новый подвид чумного микроба, выделенный в МНР. В кн.: Эпидемиология и профилактика особо опасных инфекций в МНР и СССР. - Улан-Батор.: Б.и., 1975. - С. 63 -64.

66. Туманский В.М. Изменчивость чумного микроба в природных условиях очаговости чумы // Кн.: Природ, очагов, и эпидемиол. особо опасных инф. — Саратов, 1959. С. 189 - 199.

67. Филиппов A.A., Кутырев В.В., Видяева H.A. и др. Клонирование локуса плазмиды кальций зависимости Yersinia pestis (Lehmann, Neumann), кодирующего синтез белка внешней мембраны (БВМ2) // Генетика. 1991. - Т. 27, №4.-С. 598-606.

68. Филиппов A.A., Солодовников Н.С., Куклева Л.М. и др. Изучение плаз-мидного состава штаммов возбудителя чумы из различных природных очагов // ЖМЭИ. 1992. - № 3. - С. 10 - 13.

69. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2002. - Т. 4, № 3. - С. 248 - 266.

70. Черкасский Б. Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека,- М.: Медицинская газета, 1994. — 617с.

71. Яшечкин Ю.И., Кириллина O.A., Попов Ю.А. и др. Физическая картирование 68 мд плазмиды Y pestis 231 // Проблемы особо опасных инфекций. -1999. -№ 1 С. 26-28.

72. Achtman М., Morelli G., Zhu Р. et al. Microevolution and histoiy of the plague bacillus, Yersinia pestis II Proc. Natl'. Acad. Sei. USA. 2004. - 101. - P. 17837-17842.

73. AchtmanM., Zurth K., Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II PNAS. 1999. - V. 96;N24. -P. 14043-14048.

74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific Diversity of Yersinia pestis II Clin. Microbiol. 2004. - V. 17(2). - P. 434 - 464.

75. Anisimov P.I., Popov Iu.A., Kokushkin A.M. Functional phenotypic variability in a plague pathogen and plague enzootics // Med. Parazitol. (Mosk). 2001. — N2.-P. 35-40.

76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. et al. Differential gene regulation in Yersinia pestis versus Yersinia pseudotuberculosis: effects of hypoxia and potential role of a plasmid regulator // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. - P. 131 — 144.

77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Bioinformatics. A practical guide to the analysis of genes and proteins / John-Willey N.Y., 2001. 470 p.

78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. et al. Attenuated enzootic (pestoides) isolates of Yersinia pestis express active aspartase // Microbiology. 2009 - V.155. -P. 198-209.

79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Structure of the aliphatic sulfonate-binding protein SsuA from Escherichia coli II Acta Cryst. 2010. - V. 66. - P. 391 -396.

80. Ben-Gurion R., Hertman J., Bacteriocin-like material linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends // Moll. Microbiol. — 1958-V. 48.-P. 989-1003.

81. Bercovier H. Intra- and interspecies relatedness of Yersinia pestis by DNA hybridization and its relationship to Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Microbiol. 1980. - Nu 4. - P. 225 - 229.

82. Bobrov A.G., Kirillina O.A., Forman S. et al. Insight into Yersinia pestis biofilm development: topology and co-interaction of hms inner membrane proteins involved in exopolisaccharide production // Environ.microbiol. — 2008. V. 10, N 6.-P. 1419-1432.

83. Bobrov A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ expresses a beta-galactosidase with low enzymatic activity // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 255, N 1. - P. 43 -51.

84. Brubaker R.R. Interconversion of purine mononucleotides in Pasteurella pestis II Infect. Immun. 1970. - V. 1. - P. 446 - 454.

85. Brubaker R.R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence // Current Topics in Microbiol, and Immunol. 1972. -N 57. - P. 293 - 299.

86. Brubaker R.R. The recent emergence of plague: a process of felonious evolution // Microbial ecology. 2004. - V. 47. - P. 293 - 299.

87. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - P. 59-113.

88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. The 102-kilobase unstable region of Yersinia pestis comprises a high-pathogenicity island linked to a pigmentation segment which undergoes internal rearrangement // J. Bacterid. — 1998. — V. 180. — P. 2321-2329.

89. Cao Y., Huang H., Meng K. et al. Cloning and functional expression of an a-galactosidase from Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001 //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008. -V. 72, N 8. - P. 2203 - 2205.

90. Chain P.S., Carniel E., Larimer F.W. et al. Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis! I Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - V. 191,N38.-P. 13826-13831.

91. Chain P.S., Hu P., Malfatti S. A. et al. Complete genom sequence of Yersinia pestis strain Antiqua and Nepal516: evidence of gene reduction in an emerging pathogen // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - P. 4453 - 4463.

92. Chuang Peng / Distance based methods in phylogtetic tree construction, p. 1 -11,2007.

93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Plague. // Clin. Dermatol. 2004. - V. 22(3). -P. 303-312f

94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, №4. -P. 1315-1352.

95. Cowan C. et al., Invasion of epithelial cells by Yersinia pestis: evidence for a Y. pestis-specific invasion // Infect. Immun. 2000. - V. 68(8). - P. 4523 - 4530.

96. Dale C., Wang B. et al. Plague // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. -Vol.99, № 19.-P. 12397-12402.

97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Identification of gmhA a Yersinia pestis gene required for flea blockage by using a Caenorhabditis elegans biofilm// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. - P. 7236 - 7242.

98. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. Genome sequence of Yersinia pestis KIM // J. Bacteriol. 2002 - V. 184 - P. 4601 - 4611.

99. Dennis D.T., Chow C.C. Plague // J. Pediatr. Infect. Dis. 2004. - V. 23(1). -P. 69-71.

100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Techniques in molecular systematics and evolution/ Birkhauser, 2002. 420 p.

101. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis // Bull. WHO. 1951. — V. 4.-P. 247-263.

102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Draft genome sequences of Yersinia pestis isolates from natural foci of endemic plague in Cine // J. Bacteril. 2009. - V. 191. - P. 7628 - 7629.

103. Epinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.F. et al. The complete genome sequence of Yersinia pseudotuberculosis IP31758, the causative agent of Far East Scarlet-Like Fever // Plos Genetics 2007. - V. 3 - P. 1508 - 1522.

104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. et al. Genome sequence of the deep-rooted Yersinia pestis strain Angola reveals new insights into the evolutionand pangenome of the plague bacterium // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.

105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Three Yersinia pestis adhesins facilitate Yop delivery to eukaryotic cells and contribute to plague virulence // Infect. Immun. V. 77(2). - P. 825 - 836.

106. Felsenstein J., PHYLIP—Phylogeny Inference Package (version 3.2). Cladis-tics, 1989, vol. 5, pp. 164 -166, http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html.

107. Fetherston J.D., Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6+ is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2 // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, №4. - P. 697 - 708.

108. Forman S., Wulff C.R., Myers-Morales T. et al. yadBC of Yersinia pestis, a new virulence determinant for bubonic plague // Infect Immun. — 2008. V. 76(2). -P. 578-587.

109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. et al. Pestoides F, an atypical Yersinia pestis strain from the former Soviet Union // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -P. 17-22.

110. Gascuel O. / Mathematics of evolution and phylogeny. / Clarendon press. Oxford. 2004.-33 p.

111. Gintsburg A.L., Shovadaeva G.A., Shubin F.N. et al. Integration with the chromosome-an alternative state of calcium-dependency plasmids in Yersinia // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 1989. -N 5. -P. 7 - 11.

112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. et al. Transferable plasmid-mediated resistance to streptomycin in a clinical isolate of Yersinia pestis II Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7, № 1. - P. 43 - 48.

113. Guo Y., Zhang L., Xia L. et al. Biochemical characters of Yersinia pestis isolated from Yulong County of Yunnan Province in China // Endem. Dis. Bull. -2008.-V. 23.-P. 12-14.

114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004, N2. - P 95 -108.

115. Hare J.M., McDonough K.A. High-frequency RecA-dependent and -independent mechanisms of Congo red binding mutations in Yersinia pestis. H J. Bacteriol. 1999. -V. 181(16). - P. 4896-4904.

116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Rapid diagnostic test that uses isocitrate lyase activity for identification of Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol. — 1981. V.13, N4. -P. 661-665.

117. Hinnebusch B .J. The evolution of flea-borne transmission in Yersinia pestis II Curr. Issues Mol. Biol. 2005. - V. 7, N2. - P. 197 - 212.

118. Hinnebusch BJ., Fisher E.R., Schwan T.G. Evaluation of the role of the Yersinia pestis plasminogen activator and other plasmid encoded factors in temperate dependent blockage of the flea // Infect. Immun. 1998. - V. 178. - P. 1406 -1415.

119. Hinnebusch B .J., Perry R.D., Schwan T.G. Role of the Yersinia pestis hemin storage (hms) locus in the transmission of plague by fleas// Science. 1996. — V 273,N5273-P. 367-370.

120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Cherepanov P.et al. Role of Yersinia murine toxin in survival of Yersinia pestis in the midgut of the flea vector // Science. — 2002.-V. 296.-P. 733-735.

121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. et al. Structure and sequence analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesins // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - P. 5989 - 5999.

122. Iriarte M., Cornelis G.R. Molecular determinants of Yersinia pathogenesis // Microbiologia. 1996. -V. 12(2). - P. 267- 280.

123. Jackson S., Burrows T.W. The virulence-enhancing effect of iron on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Pathol. — 1956. —Y. 37.- P. 577-583.

124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. et al. A Caenorhabditis elegans model of Yersinia infection: biofilm formation on a biotic surfaces // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 3221 - 3229.

125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O'Toole P.W. Adhesive properties conferred by the plasminogen activator of Yersinia pestis. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.

126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Cladistics. The theory and practice of parsimony analysis. — Oxford science publications, 1998. — 223 p.

127. Kutyrev V.V., Boolgakova E.G., Yidyaeva N.A. et al. Comparative characteristics of different bacterial groups of the genus Yersinia // Natural Infect. Dis.: Abst. of Scient. Conf. 6 December. Ulanbaatar, 2001. - P. 39 - 40.

128. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S. et al. Analysis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm+ and Psts associated with virulence // Microb. Pa-tog. 1992.-V. 12.- P. 177-186.

129. Kutyrev V.Y., Vidyaeva N.A., Bobrov A.G. et al. The murine toxin gene encodes for a secreted phospholipase D // Bacterial protein toxins. Jena- Stuttgart. — 1997.-P. 59-60.

130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. et al. Expression of plasminogen activator pla of Yersinia pestis enhances bacterial attachment to the mammalian extracellular matrix // Infect Immun. 1998. - V. 66(12). - P. 5755 - 5762.

131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. A plasminogen-activating protease specifically controls the development of primary pneumonic plague // Science. 2007. - V. 315 (5811). - P. 509 - 513.

132. Lazarus A.A., Decker C.F. Plague // Respir Care Clin. N Am. 2004. -V. 10(1).-P. 83-98.

133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. et al., Genotyping and analysis of Yersinia pestis by ML VA: insights into the worldwide expasion of Central Asia plague foci // PLoS ONE. 2009. -V. 4 (6)., e6000.j

134. Liang Y., Hou X., Wang Y. et al. Genome rearrangements of completely sequenced strains of Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. — 2010. — V. 48 (5). — P. 1619-1623.

135. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L. et al. Sequence and genetic analysis of the hemin storage (hms) system of Yersinia pestis II Gene. — 1997. V. 193. — P. 13-21.

136. Lindler LE. Typing methods for the plague pathogen, Yersinia pestis II J. AOAC Int. 2009. - V. 92(4). - P. 1174 - 1183.

137. Lindler L.E. The Yersinia pestis — specific plasmids pFra and pPla // Yersinia molecular and cellular biology / Ed.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bio-sciense, 2004. - Chapt.

138. Matsumoto H., Young G.M. Translocated effectors of Yersinia // Curr. Opin. Microbiol. 2009. - V. 12(1). - P. 94 - 100.

139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. et al. Mutation in the pla gene of Yersinia pestis alters the course of the plague bacillus-flea (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) interaction I I J.Med. Enthomil. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.

140. Mollaret H., Mollaret C. Melibiose fermentation in the genus Yersina and its importance in the diagnosis of the varieties of Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales. 1965.-V. 58(2).-P. 154-156.

141. Mount D. W. / Bioinformatics. Sequence and genome analysis. Gold Spring Harbor laboratory press, 2003. - 50 p.

142. Naumov A.V., Kuz'michenko I.A., Taranenko T.M. et al. The biochemical aspects of the pathogenicity of the causative agent of plague // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.

143. Navid A., Almaas E. Genome-scale reconstruction of the metabolic network in Yersinia pestis, strain 91001 // Mol. Biosyst. 2009. - V. 5(4). - P. 368 -375.

144. Odaert M., Berche P., Simonet M. Molecular typing of Yersinia pseudotuberculosis by using an IS200-like element // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34(9). -P. 2231-2235.

145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Role of the Yersinia outer membrane protein YadA in adhesion to rabbit intestinal tissue and rabbit intestinal brush border membrane vesicles // APMIS. 1991. - V. 99(3). - P. 226 - 232.

146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Biochemical characteristics of Yersinia pestis samples isolated in Brazil // Rev. Latinoam. Microbiol. 1977. -V. 19(4).-P. 189- 197.

147. Pan N.J., Brady M.J., Leong J.M., Goguen J.D. Targeting type III secretion in Yersinia pestis II Antimicrob. Agents Chemother. 2009. — V. 53(2). - P. 385 -392.

148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Regulation of aromatic Amino acid byosynthesis in Gamma-proteobacteria // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 3, N 4. - P. 529 - 543.

149. Parhill J., Wren B:W., Thomson N.R. et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague// Nature. 2001. - V. 413. - P. 523 - 527.

150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. et al. Poliamines are essential for the formation of plague biofilm// J.Bacteriol. 2006. -V. 188, N 7. - P. 2355 - 2363.

151. Pendrak M.L., Perry R.D. Characterization of a hemin-storage locus of Yersinia pestis I I Biol. Metals 1991. - V. 4. - P. 41 - 47.

152. Pendrak M.L., Perry R.D. Proteins essential for expression of the Hms+ phe-notype of Yersinia pestis II Mol. Microbiol. 1993. - V.8. - P. 857 - 864.

153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Identification and cloning of a hemin storage locus involved in the pigmentation phenotype of Yersinia pestis II J. Bacte-riol. 1990. - V. 172. - P. 5929 - 5937.

154. Perry R.D., Balbo P.B., Jones H.A. et al. Yersiniabactin from Yersinia pestis'. biochemical characterization of the siderophore and its role in iron transport and regulation // Microbiology. 1999. - V. 145, Part. 5. - P. 1181 - 1190.

155. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiological agent of plague // Clin. Mcrobiol. Rev. 1997. - V. 10. - P. 35.

156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. et al., Storage reservoirs of hemin and inorganic iron in Yersinia pestis II Infect. Immun. — 1993. V. 61. - P. 32 — 39.

157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. et al. DNA sequencing and analysis of the low-Ca2+-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 // Infect. Immun. 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611 - 4623.

158. Perry R.D. A plague of fleas: survival and transmission of Yersinia pestis II ASM News. 2003. - V.69, N 7. - P. 385 - 389.

159. Plague. Fact sheets N267. World Health Organization, Available at: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm.Accessed April 18, 2006.

160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Characterization of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - P. 775 - 782.

161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Characterization of chromosomal regions conserved in Yersinia pseudotuberculosis and lost by Yersinia pestis I I Infect. Immun. 2008. - V. 76(10). - P. 4592 - 4599.

162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. The role of isocitrate lyase and the glyoxylate cycle in Escherichia coli growing under glucose limitation // Res. Microbiol. 2005. - V. 156(2). - P. 178 - 183.

163. Prentice MB, Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. - V. 369, N 9568. - P. 1196-1207.

164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. The Yersiniapestis V antigen is a regulatory protein necessary for Ca2(+)-dependent growth and maximal expression of low-Ca2+ response virulence genes // J. Bacterid. 1991. - V. 173(8). - P. 2649 - 2657.

165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Structural and functional organization of the Yersinia pestis bacteriocin pesticin gene cluster // J. Microbiol. 1996. -V. 142.-P. 3415-3424.

166. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. et al. Functional, biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases // CMLS. 2001. - V. 58. - P. 165-178.

167. Sneath P.H., Socal R.R. Numerical taxonomy II Nature. 1962. - N 193. - P. 855 - 860.

168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Evaluation of a gualitative isocitrate lyase assay for rapid presumptive identification of Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. 1982.-V. 15,N16.-P. 1178-1179.

169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5463 -5467.

170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Kashtanova T.N. et al. Genomic polymorphism of the main subspecies of the plague agent strains // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. -2009-N4. P. 23-27.

171. Sebbane F., Jarrett C.O., Gardner D. et al. Role of the Yersinia pestis plasminogen activator in the incidence of distinct septicemic and bubonic forms of fleaiborne plague // Proc.Natl. AcadlSci.USA. 2006. - V.103, N 14 - P.5526 - 5530.

172. Sebbane F., Jarrett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Evaluation of the role of constitutive isocitrate lyase activity in Yersinia pestis infection of the flea vector and'mammalian host // Infect, and Immun. — 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.

173. Semple C., Steel M. / Phylogenetics. Oxford university press, 2003. - 256 P

174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Invasin production by Yersinia pestis is abolished by insertion of an IS200-like element within the inv gene // Infect Immun. 1996. - V. 64(1). - P. 375 - 379.

175. Skrzypek E., Straley S.C. Differential effects of deletions in lcrV on secretion of V antigen, regulation of the low-Ca2+ response, and virulence of Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. - V. 177(9). - P. 2530 - 2542.

176. Song Y., Tong Z., Wang J. et al., Complete genome sequence of Yersinia pestis strain 91001, an isolate avirulent to humans // DNA Res. 2004. - V. 11 (3). -P. 179-197.

177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. et al. Plague: past, present, and future // PLoS Med. 2008. - V. 5(1)., e3.

178. Straley et al., Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia // Trends Microbiol. 1995. - V. 3(8). - P. 310 - 317.

179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Experimental evidence for negative selection in the evolution of a Yersinia pestis pseudogene // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. V. 105, N 2. - P. 8097 - 8101.tyf

180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Congo red-agar plating medium for detecting pigmentation in Pasteurella pestis // Appl. Microbiol. — 1969. V. 18(5). - P. 834 -837.

181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, the multifaceted Yersinia adhesin // Int. J. Med. Microbiol. 2001. - V. 291(3). - P. 209 - 218.

182. Takahashi H., Watanabe H. Plague // Nippon Rinsho. 2007. - V. 65. - P. 54-59.

183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis and plague I I Biochem. Soc. Trans. 2003. - V. 31. - P. 104 - 107.

184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. et al. Stationary phase expression of arginine biosynthetic operon argCBH in Escherichia coli II BMC Microbiology. 2006. - V. 6. - P. 14 - 26.

185. Williamson ED. Plague. // Vaccine. 2009. - V. 4. - P. 56 - 60.

186. Wren B.W. Microbial genome analysis: insights into virulence. Host adaptation and evolution// Nature Rev.Genet. 2000. - V. 1. - P. 30 - 39.

187. Wren B.W. The Yersinia a model genus to study the rapid evolution of bacterial pathogen//Nature reviews. Microbiology. 2003.-V.l. - P.55-64.

188. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, a Yersinia pestis strain lacking plasminogen activator, is virulent by the aerosol route // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. — V. 529. -P. 129-131.

189. Xiong Jin / Essential bioinformatics. Cambridge univ. press. 2006. 361 p.

190. Zhou D., Han Y., Song Y. et al. Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis II Microbes Infect. 2004. - V. 6(13). - P. 1226 - 1234.

191. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar, microtus // J. Bacteriol. -2004. V. 186. - P. 5147 - 5152.