Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат медицинских наук Забелин, Никита Николаевич

• Забелин, Никита Николаевич
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Забелин, Никита Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.5.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.11.

1.1. Структура генома ВГВ.11.

1.2. Жизненный цикл вируса ГВ.13.

1.3. Экспрессируемые белки ВГВ.17.

1.4. Генетическая вариабельность ВГВ.19.

1.4.1. Генотипы, субгенотипы, серотипы вируса гепатита В.19.

1.4.2. Мутанты ВГВ.23.

1.5. Серологическая диагностика вирусного гепатита В.31.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.37.

ГЛАВА 3. ДИНАМИКА ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ

ГЕПАТИТОМ В НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ В ПЕРИОД С 2000 ПО 2006 ГОДЫ.44.

3.1. Оценка динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы.44.

3.2. Динамика заболеваемости гепатитом В в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах в период с 2000 по 2006 годы.52.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА

ГЕПАТИТА В ПО PreSl/PreS2/S-rEHAM.58.

4.1. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей.60.

4.1.1. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории г.Москвы.61.

4.1.2. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории

Республики Кабардино-Балкария (г.Нальчик).78.

4.1.3. Генетическая характеристика штаммов вируса гепатита В, выделенных от пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией г.Череповца.80.

4.1.4. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных от пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией на территории Республики Саха (Якутия).84.

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ КОММЕРЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ HBsAg С ПОМОЩЬЮ ПАНЕЛИ ОБРАЗЦОВ

ОХАРАКТЕРИЗОВАННЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В.92.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией»

В настоящее время проблема гепатита В (ГВ) сохраняет свою актуальность и является одной из социально-значимых инфекций в Российской Федерации. Несмотря на наличие эффективных средств профилактики гепатита В, таких как активная и пассивная иммунизация, противовирусных препаратов, по данным J.M. Pawlotsky (2005) более 350 млн. людей во всем мире хронически инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ). Одним из ведущих аспектов проблемы ГВ является генетическая вариабельность возбудителя этого заболевания, которая обусловливает, в ряде случаев, недостаточную эффективность вакцинации, серологической диагностики, а также лечения противовирусными препаратами.

Проблема вариабельности ВГВ становится более значимой для медицинской практики, поскольку частота встречаемости генетических вариантов ВГВ растет, особенно в регионах с высокой заболеваемостью. Принятые и реализуемые национальные и международные программы вакцинопрофилактики ГВ, широкое применение химиотерапевтических средств являются активными селективными факторами, способствующими распространению редко встречающихся и ускользающих вариантов вируса.

Одной из составляющих проблемы генетической вариабельности ВГВ является вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса, кодирующих оболочечные белки вируса. Прошло почти 20 лет с тех пор, как появилось первое сообщение о способности мутантных форм вируса по S-гену ускользать от индуцированного вакциной иммунитета [W.F.Carman et al., 1990]. Последующий период характеризовался накоплением данных о вариантах ВГВ, которые вызывали проблемы в серологической диагностике или лечении инфекции, а также их распространенности в популяции [W.F. Carman, 1997; P.F.Coleman et al., 1999; C.He et al., 2001; M.S.Ho et al., 1998; J.Hou et al., 2001; J.H.Ireland et al., 2000; K.M.Lee et al., 2001; B.Moerman et al., 2004; C.J.Oon et al., 1996; C.J.Oon et al., 1999; L.Roznovsky et al., 2000; S. Seddigh-Tonekaboni et al., 2000]. В России данные об обнаружении различных вариантов ВГВ единичны и недостаточны. В связи с этим представляет интерес изучение распространенности генотипов, субгенотипов и различных вариантов ВГВ среди хронических больных в различных регионах Российской Федерации, характеризующихся различной интенсивностью эпидемического процесса вирусного гепатита В и этническим составом населения.

В настоящее время отсутствуют данные о возможностях иммупоферментных тест-систем (ИФТС), применяемых в Российской Федерации, выявлять HBsAg, принадлежащий различным генотипам и субгенотипам ВГВ, в том числе и известным мутантным формам вируса. Выполнение таких исследований позволит существенно повысить качество серологической диагностики гепатита В.

Изложенное выше послужило основанием для выполнения работы по изучению современных проявлений эпидемического процесса гепатита В на территории Российской Федерации и отдельных федеральных округов, определению структуры генотипов, субгенотипов ВГВ в различных регионах страны, генетической вариабельности pre-Sl/pre-S2/S генов у изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической ЫВ-вирусной инфекцией, а также оценки способности современных тест-систем определять HBsAg, принадлежащий различным генотипическим, серотипическим и мутантным формам вируса.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - изучение динамики заболеваемости гепатитом В на территории отдельных федеральных округов РФ, генетического разнообразия циркулирующих изолятов ВГВ, а также оценка диагностических возможностей тест-систем для детекции HBsAg.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:

1. Рассчитать многолетние тенденции динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории России, а также

Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов за период с 2000 по 2006 годы;

2. Изучить генетическую вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса гепатита В у лиц с хронической НВ-вирусной инфекцией, а также структуру циркулирующих генотипов на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов;

3. Охарактеризовать диагностические возможности коммерческих тест-систем для детекции HBsAg.

Научная новизна.

Выявлена значительная территориальная неравномерность по уровню заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В (суммарные показатели) по трем федеральным округам Российской Федерации. В Дальневосточном округе уровень заболеваемости гепатитом В при использовании метода сигмальных отклонений определен как высокий. Наиболее благополучными являются Центральный и Южный федеральные округа, уровень заболеваемости ГВ в которых квалифицирован как низкий и ниже среднего.

Установлены различия в структуре циркулирующих генотипов ВГВ па исследуемых территориях: в Центральном и Южном округе с наибольшей частотой обнаружен генотип D (87%), тогда как в Дальневосточном округе генотипы А и D составляют по 44% и генотип С - 12%.

Впервые на основании широкомасштабных молекулярно-генетических исследований изолятов ВГВ, циркулирующих на различных территориях Российской Федерации, установлено, что в pre-Sl/pre-S2/S области генома ВГВ, наиболее вариабельными участками оказались область pre-S2/S промотора у изолятов генотипа D (до 31% нуклеотидных замен), 5'- конец pre-S2/S генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конец S-гена у изолятов генотипа А (до 28%). При этом область S-гена, соответствующая главному гидрофильному региону (MHR) была менее вариабельной (до 25% нуклеотидных замен у изолятов генотипа А).

Положения, выносимые на защиту.

В результате проведенного эпидемиологического анализа рассчитаны многолетние тенденции заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории Российской Федерации, Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов в период с 2000 по 2006 годы: а) для совокупного населения установлено:

- выраженное снижение заболеваемости острым гепатитом В и носительства ВГВ ('Тсниэ1сения=>-5,\%), стабильный уровень заболеваемости хроническим гепатитом В (Т снижения — -1%); б) для детей до 14 лет установлено:

- выраженное снижение заболеваемости острым, хроническим гепатитом В и носительства ВГВ (Тснижения — >-5,1%).

Для изученных изолятов ВГВ, циркулирующих на территории трех федеральных округов, показана более высокая генетическая вариабельность областей pre-Sl, pre-S2 генома, по сравнению с участком S-гена, соответствующего главному гидрофильному региону (MHR).

Зафиксированы существенные различия в чувствительности четырех коммерческих тест-систем для детекции HBsAg - при определении HBsAg, принадлежащего генотипам D и А они достигали 44 и 40 раз соответственно.

Различия в диагностических возможностях тест-систем для детекции HBsAg не всегда обусловлены наличием замен в «а»-детерминанте главного гидрофильного региона HBsAg.

Практическая значимость.

Оценка диагностических возможностей четырех тест-систем для детекции HBsAg на примере изученных изолятов ВГВ показала, что тест-системы «Roche Elecsys HBsAg» (основана на хемилюминесцентном методе детекции) и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» (основана на методе флюоресцентно-поляризационном иммунном анализе) являются более чувствительными тестами в отношении генотипических (генотипы А и D) и мутантных форм (М133Т, P120S) HBsAg. Отечественная тест-система - «ДС

ИФЛ-HBsAg» продемонстрировала сравнительно более низкие диагностические возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg.

Выявленные различия в диагностических возможностях разных тестов при детекции HBsAg с установленными генотипами, субтипами и мутантными формами обосновывают необходимость создания экспертных панелей, содержащих образцы с наличием HBsAg различных генотипических, субтиповых и мутантных форм принадлежности.

Внедрение полученных результатов.

Материалы диссертационной работы использованы при разработке приказа Министерства здравоохранения Республики Саха (Якутия) №01-8/4289 от 31.05.2006 г. «Об обследовании беременных на перинатальные инфекции в PC (Я)».

Научные положения, выводы и практические рекомендации, вытекающие из результатов диссертационной работы, используются при чтении лекций и проведении семинарских занятий на кафедре вирусологии Московской Медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на: VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2007 год); XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2007 год).

Апробация диссертации состоялась 22 мая 2008 года на заседании Ученого совета отдела вирусологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, состоящего из 125 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 14 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Забелин, Никита Николаевич

выводы.

1. Эпидемиологический анализ многолетней динамики (2000-2006 годы) заболеваемости гепатитом В совокупного населения в Российской Федерации показал наличие выраженных тенденций снижения заболеваемости ОГВ, носительства ГВ (Т снижения—>-5,1%) и стабилизации заболеваемости ХГВ (Т снижения = -1%.)3 тогда как, для детей до 14 лет выраженные тенденции снижения заболеваемости отмечаются для всех трех регистрируемых форм ГВ (Т сню1сения->-5,1%).

2. Выявлены значительные различия в интенсивности эпидемического процесса гепатита В в отдельных федеральных округах Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы: в Дальневосточном ФО зафиксирована стабильно высокая заболеваемость ГВ (суммарные показатели), в Центральном и Южном - ниже среднего и низкая. Различия между максимальными и минимальными показателями в анализируемый период составляли от 2,1 до 2,5 раз.

3. Показано, что на территории Российской Федерации циркулируют три генотипа ВГВ - А, С, D. На территории Центрального и Южного федеральных округов доминирует генотип D - 87%, удельный вес генотипов А и С составляет 11% и 2% соответственно. На территории Дальневосточного федерального округа генотипы А и D обнаружены в 44% каждый и доля генотипа С составила 12%.

4. Впервые для изолятов ВГВ, циркулирующих в различных регионах Российской Федерации, установлена высокая генетическая вариабельность области pre-S2/S промотора у изолятов генотипа D (до 31% нуклеотидных замен pre-Sl/pre-S2/S участка), 5'- концов pre-S2/S генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конца S-гена у изолятов генотипа А (до 28%) при меньшей вариабельности участка S-гена, соответствующего главному гидрофильному региону HBsAg (до 25% у изолятов генотипа А).

5. Среди изолятов ВГВ, циркулирующих на территории Российской Федерации, гетерогенность генотипа D, представленного тремя субгенотипами (Dl, D2, D3), более выражена, по сравнению с генотипами А и С, представленными только субгенотипами А2 и С2 соответственно.

6. Выявлены существенные различия в диагностических возможностях четырех тест-систем для детекции HBsAg вируса гепатита В, принадлежащего генотипам А и D, а также его мутантных форм (замены М133Т, P120S), которые достигали 40-44 раз.

Заключение

Таким образом, было показано, что из четырех коммерческих тест-систем для детекции HBsAg наибольшие диагностические возможности проявляют тесты «Roche Elecsys HBsAg» и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» как в отношении генотипических (генотипы A, D), серотипических (серотипы ay, ad) различий, так и в отношении мутантных форм HBsAg (мутации М133Т, P120S).

Отечественная тест система «ДС-ИФА-HBsAg» демонстрирует низкие возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg. Это, по-видимому, связано с тем, что в отечественных тестах преимущественно используют моноклональные и/или поликлопальные антитела, направленные на эпитопы HBsAg серотипа ау (генотип D), наиболее распространенного (до 90%) на территории РФ.

Помимо этого, нами получены данные, что не только замены в пределах MHR и «а»-детерминанты HBsAg обеспечивают различия в диагностических возможностях различных тест систем, но возможно и аминокислотные замены в PreSl, PreS2, N-, С- концах S белка, что в разное время и в разных странах было показано рядом авторов [62, 67, 103].

ГЛАВА 6

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Проблема вирусных гепатитов с парентеральным механизмом передачи остается серьезной и актуальной для здравоохранения России. Эпидемиологическая ситуация в отношении НВ-вирусной инфекции в Российской Федерации сохраняя напряженность, претерпевает существенные изменения. В последние шесть лет (2000-2006 годы) отмечается постоянное снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В. Необходимо отметить, что суммарный показатель заболеваемости гепатитом В в 2006 году самый низкий за все время регистрации. Снижению заболеваемости гепатитом В способствовал комплекс широкомасштабных противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на предупреждение распространения НВ-вирусной инфекции. Основными из приоритетных направлений являются включение в Национальный календарь (2001 год) вакцинации против гепатита В, положившее начало, в масштабах страны, формированию популяции, обладающей протективным иммунитетом, и значительное повышение качества иммуноферментных тест систем, что обусловило более точную диагностику гепатита В. Но, несмотря на это, в разных регионах страны закономерности, характеризующие заболеваемость регистрируемыми формами гепатита В, выражены в различной степени, что обусловлено особенностями регионов России. К особенностям, влияющих на развитие эпидемического процесса гепатита В следует отнести снижение качества оказания медицинской помощи, усиление миграционных потоков, широкое распространение наркомании. Сочетание различных медико-социальных факторов, присущих той или иной территории, приводит к отличиям, иногда весьма существенным, в динамике заболеваемости, структуре путей передачи возбудителя, ,а также в возрастной структуре заболевших гепатитом В.

Целью настоящей работы было проведение сравнительного эпидемиологического анализа заболеваемости гепатитом В на примере трех федеральных округов (Центрального, Южного и Дальневосточного) с одновременным изучением молекулярно-генетических свойств изолятов ВГВ, выделенных на территории указанных округов.

Одной из задач работы являлось проследить динамику и структуру суммарного показателя заболеваемости регистрируемых форм гепатита В на территории Российской Федерации, а также изучить многолетние тенденции, характеризующие динамику заболеваемости гепатитом В на территории Российской Федерации и отдельных федеральных округов среди совокупного населения и детей до 14 лет. Использование суммарного показателя позволяет наиболее полно охарактеризовать динамику заболеваемости гепатитом В. Это подтверждают и исследования И.Л.Шаханиной в соавт. (2003), Л.И.Шляхтенко (2003) [22, 26, 27]. С этой целью был проведен анализ динамики показателей заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В в целом по РФ (20002006 годы) и в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах (2000-2006 годы) среди совокупного населения и детей до 14 лет.

Полученные данные позволили дать объективную оценку эпидемиологической ситуации и заболеваемости гепатитом В в трех федеральных округах РФ. В результате выполненной работы выявлены различия в динамике суммарного показателя заболеваемости регистрируемых форм гепатита В, как среди населения в целом, так и у детей до 14 лет.

В многолетней динамике заболеваемость ОГВ в России среди совокупного населения в период 2000 по 2006 годы характеризовалась снижением в 6,1 раза. Наибольший уровень абсолютного снижения (-15,6 на 100 тысяч населения) и максимальный темп убыли (44,2%) имел место в 2002 году. В последующие годы темп убыли снизился и в 2006 году зафиксирован самый низкий показатель заболеваемости ОГВ - 7,0 на 100 тысяч населения. Многолетняя (2000-2006 годы) тенденция заболеваемости ОГВ среди совокупного населения характеризуется выраженным снижением — Т сниэ/сения =>-5,1%.

В 2001 году отмечен максимальный показатель заболеваемости ХГВ среди совокупного населения за период наблюдения, при котором темп и показатель абсолютного прироста имели наибольшие значения +12,7% и 1,8 на 100 тысяч населения соответственно. В последующие (2002-2003) годы уровень заболеваемости ХГВ снизился и ее показатели сопоставимы - 15,0-14,9 на 100 тысяч населения. В 2004 году вновь отмечено повышение уровня заболеваемости ХГВ, однако, темп роста (+4,0%) ниже аналогичного показателя периода 2000-2001 годов. В 2005 году последовало снижение показателя заболеваемости ХГВ до 13,9 на 100 тысяч населения, при темпе убыли -10,3%, что является наибольшим значением в анализируемый период времени. В 2006 году отмечено повышение показателя заболеваемости ХГВ, составившего 14,0 на 100 тысяч населения. Вариабельность динамики показателя заболеваемости ХГВ отражена в многолетней тенденции (2000-2006 годы), которая характеризуется стабилизацией заболеваемости ХГВ: Т снижения = -1%.

В период 2000 по 2006 годы показатель носительства вируса гепатита В на территории Российской Федерации снизился в 2 раза, с 95,5 на 100 тысяч населения (2000 год) до 47,7 на 100 тысяч населения (2006 год). Максимальный показатель абсолютного снижения составил 15,5 на 100 тысяч населения (2002 год). Темп убыли не превысил -18,4% (максимальное значение, 2005 год). Многолетняя (2000-2006 годы) тенденция показателей носительства ВГВ характеризуется выраженным снижением - Т снижения =>-5,1%.

В период с 2000 по 2006 годы суммарный показатель заболеваемости ГВ, включающий все три регистрируемые формы гепатита В, среди совокупного населения снизился с 152,4 до 68,7 на 100 тысяч населения, характеризуясь снижением в 2,2 раза, что свидетельствует о значительном снижении уровня заболеваемости гепатитом В (суммарный показатель) в целом по России. В структуре суммарного показателя заболеваемости гепатитом В среди совокупного населения удельный вес ОГВ снизился с 27,9% (2000 год) до 10,2% (2006 год). Доля ХГВ за тот же период времени увеличилась с 9,3% до 20,4%, а удельный вес вирусоносительства гепатита В составил, не менее, 62% с увеличением доли до 70,5% (2004 год), с последующим снижением до 69,4% (2006). На территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов также зафиксировано снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В, при этом в Дальневосточном округе отмечено стабильное превышение суммарного показателя заболеваемости в сравнении со среднероссийским за весь период наблюдения, тогда как в Южном округе суммарный показатель превысил среднероссийский уровень в 2003, 2004 и 2006 годах.

Необходимо отметить, что многолетняя динамика заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В у детей до 14 лет, в анализируемый период, характеризовалась выраженной тенденцией к снижению. Начиная с 2000 года и до 2006 года, отмечено устойчивое снижение заболеваемости ОГВ детей до 14 лет - показатель 2006 года (1,2 на 100 тысяч населения) ниже в 8,3 раза, чем в 2000 году. Наиболее интенсивное снижение заболеваемости ОГВ отмечено в 2006 году, когда показатель абсолютного снижения составил 0,7 на 100 тысяч населения, а темп убыли - 36,8%. Общая многолетняя динамика заболеваемости ОГВ детей до 14 лет имела выраженную тенденцию снижения -Т снижения—>-5,1 %.

С 2000 года отмечалось стабильное снижение заболеваемости ХГВ с достижением минимального уровня в 2006 году - 1,9 на 100 тысяч населения. Многолетняя динамика заболеваемости ХГВ детей до 14 лет на территории России характеризуется выраженной тенденцией снижения - Ташжения= >-5,1%.

Помимо этого, с 2000 года имело место стабильное снижение вирусоносительства гепатита В с наибольшим расчетным темпом убыли (

26,3%), выявленном в 2003 году. Общее снижение в период с 2000 по 2006 годы уровня вирусоносительства гепатита В составило 2,9 раза - до 7,9 на 100 тысяч населения в 2006 году. Расчет многолетней тенденции свидетельствует о выраженном снижении уровня вирусоносительства гепатита В у детей до 14 лет на территории России - Тснижения= >-5,1%.

В период с 2000 по 2006 годы суммарный показатель заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет снизился в 3,4 раза с 37,5 до 11,0 на 100 тысяч населения, тогда как среди совокупного населения в 2,2 раза, что связано с различиями в многолетних тенденциях заболеваемости. Существенное влияние на более интенсивное снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В, в том числе формированию общей тенденции заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В среди детей до 14 лет, оказала иммунопрофилактика гепатита В [7, 8, 9].

Рассчитанные тенденции многолетней динамики показателей на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов показали также выраженное снижение заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительсва гепатита В у детей до 14 лет - Тс//ш/сешш=>-5,1%.

Необходимо отметить что, несмотря на снижение заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В у населения в целом и детей до 14 лет, уровень носительства превышает как показатели заболеваемости ОГВ, так и ХГВ. Поэтому, можно констатировать, что ведущую роль, определяющую интенсивность эпидемического процесса гепатита В, как у населения в целом, так и у детей до 14 лет, играет носительство вируса гепатита В, формирующее общие тенденции в динамике заболеваемости ГВ [1, 2, 3, 6, 22, 29].

Важно отметить, что выявленное снижение суммарного показателя, по-видимому, не может быть расценено как существенное снижение интенсивности эпидемического процесса гепатита В среди детей до 14 лет в трех рассматриваемых федеральных округах. С помощью метода сигмальных отклонений выявлена территориальная неравномерность по уровню суммарной заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет в этих федеральных округах. Эффективность использования этого метода в проведении эпидемиологического анализа была показана ранее И.Л.Шаханиной с соавт. (2003) [22]. Так, было установлено, что Дальневосточный округ можно квалифицировать как регион с высоким уровнем заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет. Тогда как в Центральном округе имеет место, преимущественно, низкий уровень заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет, а в Южном округе - уровень ниже среднего. Отсутствие существенных изменений в уровне распространенности суммарного показателя гепатита В среди детей до 14 лет на территории Южного и Дальневосточного федеральных округов обусловлен, по-видимому, недостаточной охватом своевременной вакцинацией, что является сдерживающим фактором дальнейшего снижения заболеваемости гепатитом В.

Изучение молекулярно-генетических характеристик изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории различных регионов Российской Федерации показало, что имеет место циркуляция трех генотипов ВГВ -генотипы А, С, D. На территории Центрального и Южного федеральных округов преимущественным генотипом ВГВ является генотип D - 87,1%, доля генотипа А и С составляет 11,3% и 1,6%, соответственно. Иная ситуация на территории Дальневосточного федерального округа, в Республике Саха (Якутия), где генотипы А и D представлены в равном соотношении по (43,75%) и большее значение по сравнению с Центральным и Южным округами приобретает генотип С, доля которого составила (12,5%). Полученные данные о циркулирующих генотипах и их структуре в целом отражают тенденцию распространения генотипов ВГВ в странах Восточной Европы [48, 111, 119] и на территории центральной и восточной части России [61].

Генотип D на изученных территориях РФ был представлен большим количеством субгенотипов - Dl, D2, D3, по сравнению с генотипами А и С, которые были представлены только субгенотипами А2 и С2, соответственно.

Тем самым, можно констатировать, что гетерогенность генотипа D более выражена по сравнению с генотипами А и С, что также было показано в работе [68]. В структуре генотипа D на территории г. Москвы субгенотипы Dl, D2, D3 составили 11,54%, 19,23%) и 69,23%) соответственно. На территории республики Саха (Якутия) структура генотипа D была следующей — D2 (14,3%), D3 (85,7%). Таким образом, можно говорить, что субгенотип D3 является доминирующим в структуре генотипа D на территории исследованных регионов.

Анализ аминокислотной последовательности главного гидрофильного региона (MHR) HBsAg у изученных изолятов HBV показал наличие следующих аминокислотных замен: Q101R, L109Q, L109R, I110L, G112R, S113T, Т114К, Т118А, V118A, V118T, P120S, Р127Т, A128V, М133Т, M133I, Y134N, Y134F, G159A. Наиболее вариабельными позициями MHR оказались 109, 118, 133 и 134. При этом замена P120S была описана С. J.Oon el al. 1999 [70] у вакцинированных против гепатит В детей, рожденных от матерей с носительством ВГВ. Также замена P120S в комбинации с заменой S143L в работе J.H.Ireland et al. (2000) [107] были введены в рекомбинантный HBsAg и при детекции подобного HBsAg с помощью семи коммерческих иммуноферментных тест-систем были получены расходящиеся результаты, свидетельствующие о влиянии этих замен на иммунодоминантную область HBsAg. Замены Ml331, Y134N и М133Т были описаны в литературе как вызывающие проблемы при детекции HBsAg с помощью различных иммуноферментных тест-систем [37, 50, 103].

В результате сравнительной оценки четырех тест-систем для детекции HBsAg, нами было установлено, что наибольшие диагностические возможности проявляют тесты «Roche Elecsys HBsAg» и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» как в отношении генотипических (генотипы A, D), серотипических (серотипы ay, ad) различий, так и в отношении мутантных форм HBsAg (мутации М133Т, P120S). Отечественная тест-система «ДС-ИФА-HBsAg» продемонстрировала сравнительно более низкую возможность при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg. Это, по-видимому, связано с тем, что в отечественных тестах преимущественно используют моноклональные и/или поликлональные антитела, направленные на эпитопы HBsAg серотипа ау (генотип D), наиболее распространенного (до 90%) на территории РФ.

Выявленные различия в возможностях обнаружения HBsAg этими тест-системами при использовании стандартных образцов ОСО свидетельствуют о необходимости разработки и аттестации независимых экспертных панелей, с целью получения объективной оценки качества иммуноферментных тест систем, применяемых в диагностике НВ-вирусной инфекции на территории Российской Федерации.

Некоторые образцы сывороток давали значительные расхождения в диагностических возможностях четырех тест-систем. При анализе аминокислотной последовательности «а»-детерминанты и MHR HBsAg этих образцов было показано, что их последовательности были идентичны некоторым изолятам ВГВ, которые не проявляли существенных различий в этих четырех изучаемых тест системах. В ряде работ [62, 67, 103] указывалась возможность влияния на детекцию HBsAg изменений генома ВГВ не только в рамках MHR и «а» -детерминанты S гена, но и в PreSl/PreS2 генах, 5'- и 3'-концах S гена.

При анализе нуклеотидных замен на участках генома вируса, соответствующих PreSl/PreS2/S генам, у изолятов ВГВ, выделенных на территории г. Москвы, г. Череповца и Республики Саха (Якутия), было установлено, что нуклеотидные замены в основном сосредоточены в PreS2/S промоторном участке, 5'- концах PreS2/S и в 3'- конце S-гена. Участок S-гена, соответствующий главному гидрофильному региону (MHR) HBsAg у большинства изолятов являлся менее вариабельным по сравнению с другими участками оболочечных генов ВГВ. По данным J.Hou et al. (2001) [101] и K.M.Weinberger et al. (2000) [67] при доказанной виремии ВГВ, только 43%

57% случаев отрицательного результата обнаружения HBsAg, объясняются заменами в главном гидрофильном регионе (MHR). Отрицательные или сниженные результаты детекции HBsAg являются следствием не только структурных изменений иммунодоминантной области HBsAg. Все чаще дискутируются причины, которые приводят к нарушению процессов синтеза вирусных белков, сборки и секреции из клетки зрелых вирионов и субвирусных частиц, изменения в участке оболочки вируса, взаимодействующей с клеточным рецептором, а также интерферирование коинфецирующими вирусами [33, 35, 95, 41, 114, 59, 65, 60].

В задачи нашего исследования входило также изучение PreSl и PreS2 областей генома ВГВ, чтобы оценить, как вариабельность этих участков влияет на HBsAg в свете его детекции иммуноферментными тест-системами. В N-конце PreSl белка располагается участок, который взаимодействует с клеточным рецептором, и при высокой его вариабельности у вируса снижается способность инфицировать гепатоцит [33, 59]. Нами были обнаружены аминокислотные замены в этом участке PreSl белка у ряда изолятов ВГВ — 3 (Q18L; A28S; N29D; Т40Р; D43G), К (Т40Р), 26 (F14S), 19 (A28V), 30 (D16E), 333 (D27E), 12 (T40S). Кроме того, у изолята 13 имелась делеция в PreSl - 5264 аа, в пределах участка необходимого для инициации инфекции, но дистальнее основного участка (9-18 аа), взаимодействующего с рецептором клетки. Однако оценить роль этих замен в процессах связывания вируса с клеточным рецептором и проникновении в клетку в рамках данного исследования не представлялось возможным.

Как уже упоминалось выше, PreS2/S промоторная область у исследованных изолятов ВГВ оказалась наиболее вариабельной по сравнению с другими изученными участками генома ВГВ. Наиболее значимым элементом PreS2/S промотора является ССААТ мотив. У изолята 23 в ССААТ элементе была выявлена двойная мутация — ССССТ, однако сыворотка крови, в которой был выявлен изолят 23, была позитивной на HBsAg, хотя ряд авторов утверждал, что мутации в этом элементе приводят к нарушению продукции HBsAg и секреции вирионов [87, 108].

В пределах Pre-Sl белка (92-113 аа) располагается участок, который как полагают, выполняет матриксную функцию при морфогенезе вирионов с последующей их секрецией из клетки [35, 36]. Следовательно, изменения в этом регионе могут привести к нарушению сборки и секреции вирусных частиц. В этом участке нами были выявлены следующие замены - N103D; М1Т - замена, повреждающая инициирующий кодон для М белка; W3R . Обнаруженная у изолята 5 делеция, захватывает L-M домены (94-108/1-10 аа), которая почти полностью исключает матриксный участок, что должно приводить к нарушению формирования оболочки вирионов и их секреции. В работе M.Melegari et al. (1997) [83] описывается мутантный вирус гепатита В с делецией в L белке (47-107 аа), которая наряду с матриксным участком удаляла и S промотор, в результате синтеза HBsAg и секреции вирионов не происходило. Но в эксперименте при котрансфекции подобного вируса с конструкцией, несущей S-ген, секреция вирионов, несущих делецию, восстанавливалась. Это наблюдение противоречит данным V. Bruss (1997) [36], который показал, что матриксный участок в L домене (92-113 аа) является необходимым для секреции вирионов. В нашем случае, изолят 5, несущий делетированный матриксный участок, выделен из сыворотки, положительной на HBsAg. Возможно, наша ситуация напоминает эксперимент M.Melegari et al. (1997) [83], когда к мутаитному ВГВ с делецией матриксного участка была добавлена конструкция с S-геном ВГВ, экспрессирующая HBsAg и при этом секреция вируса восстанавливалась. Также возможна комплементация делетированного генома ВГВ геномом дикого типа, присутствующего как минорный компонент в вирусной популяции, в результате вирусный геном с делецией использует оболочечные белки генома дикого типа и успешно секретируется.

Цитозольная петля (33-80 аа) S белка, как полагают H.Loffler-Mary et al. (2000) [65] и D.R.Milich et al. (1990) [82], участвует в сборке и секреции вирионов и субвирусных частиц. Нами на этом участке были выявлены следующие аминокислотные замены N40S, F41L, G44E, T45N, S45A, Р46Н, T57I, S61T, P67Q, T68I, W74S, C76Y, C76R, R79H, F80S. Все изоляты ВГВ с аминокислотными заменами в этом участке S-белка были выделены из сывороток крови, в которых определялся HBsAg иммуноферментными тест-системами.

Как было указано выше, к снижению чувствительности ИФА тест систем для детекции HBsAg могут приводить аминокислотные замены не только в иммунодоминантном участке главного гидрофильного региона (MIIR) HBsAg, но и изменения вне этого участка. В этой связи хотелось отдельно остановиться на двух изолятах HBV, обнаруженных нами. Один из них, изолят К (генотип D, субгенотип D3, серотип ayw2) был выделен из сыворотки крови пациента с хроническим гепатитом В. Единственным серологическим маркером вирусного гепатита В был anti-HBc. Молекулярно-генетический анализ PreSl/PreS2/S белков показал наличие следующих аминокислотных замен: PreSl -Т40Р, L74I, N103D; PreS2 - V32A, V35A; S - S204R, Y206H. Как видно в области главного гидрофильного региона и «а»- детерминанты нет пи одной замены. Сравнение с другими изолятами ВГВ того же генотипа показало, что аминокислотные замены V32A, V35A (PreS2) и S204R, Y206H (S) обнаруживаются только у этого изолята. По-видимому, эти аминокислотные замены, расположенные вне «а»- детерминанты, могут изменять ее пространственную структуру, тем самым, препятствуя взаимодействию со специфическими антителами. Другой, изолят 5 (генотип D, субгенотип D2, серотип ayw3) был выделен из сыворотки крови пациента с хроническим гепатитом В. В его сыворотке крови определялись следующие серологические маркеры - HBsAg, anti-HBc (сумм.), anti-HBe, anti-HBc IgM, HBeAg. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности PreSl/PreS2/S белков этого изолята показал наличие делеции 94-108 (PreSl/PreS2); W74Stop, G112R, V118A, G185R, L186P, S207R. Изолят 5 имеет две особенности в структуре изученных белков: во-первых, это наличие делеции, которая приводит к удалению матриксного участка PreSl — белка, тем самым по данным [35, 36] должна нарушаться сборка и секреция зрелых вирионов; во-вторых, это наличие стоп кодопа в 74 позиции S белка, который при трансляции с вирусной mRNA (S) должен приводить к прекращению дальнейшего синтеза HBsAg, но как мы видим, сыворотка крови позитивна на HBsAg. В ряде исследований [39, 45, 93] преждевременный стоп код он в S белке в позициях 61, 69, 94 был описан, в одних случаях, сыворотки крови, из которых выделены подобные изоляты были позитивны на HBsAg, в других нет. Одним из возможных объяснений может быть гетерогенность вирусной популяции — наличие квази-видов, которые компенсируют утраченную функцию и/или поврежденную структуру доминантной субпопуляции вируса.

Как было нами показано, изоляты ВГВ, выделенные у разных пациентов, гетерогенны между собой. Помимо этого, каждая вирусная популяция в пределах одного инфицированного организма обладает различной гетерогенностью, степень которой нарастает со временем в процессе хронической НВ-вирусной инфекции, что также было показано в работах Y.-F.Fan et al. (2000) [102] и T.Pollicino et al. (1995) [99]. По-видимому, несмотря на наличие доминирующей субпопуляции вируса, дефектной в структурном и/или функциональном отношении, жизнеспособность общей популяции поддерживается минорным компонентом, например диким типом вируса. Из этого следует, что для диагностических и терапевтическим мероприятий в отношении хронической НВ-вирусной инфекции необходимо изучать всю вирусную популяцию и ее динамику, что позволит объяснить появление атипичного серологического профиля и эффективно контролировать противовирусную терапию.

На примере двух изолятов ВГВ (5) и (К) ясно прослеживается противоречивый характер генетической вариабельности вируса, выражающийся в фенотипическом проявлении наличия или отсутствия HBsAg. Это лишний раз подчеркивает многофакторность проблемы «диагностического ускользания» НВ-вирусной инфекции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Забелин, Никита Николаевич, 2009 год

1. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор, 3 выпуск. / Под редакцией проф. А.Б. Жебруна.// С-Петербург. 2000. - 256с.

2. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор, 5 выпуск./ Под редакцией проф. А.Б. Жебруна.// С-Петербург 2005. — 158с.

3. Вирусный гепатит В у детей первого года жизни в г.Вологде./ Т.Ю.Курганова, Н.И.Белавина, Г.Л.Макарова и соавт.// В кн.: «Вирусный гепатит В — диагностика, лечение и профилактика (к 40-летию открытия HbsAg)». Москва. - 2004. - с.89-90.

4. Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Основы математико-статистической обработки данных.// В кн. «Прикладная медицинская статистика». — Санкт-Петербург. 2003. - с. 169-245

5. Исаева О.В. Разработка системы внешней оценки качества лабораторных исследований при диагностике вирусных гепатитов В и С.// Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва. - 2003. - 24 с.

6. Итоги изучения и нерешенные вопросы эпидемиологии и профилактики парентеральных вирусных гепатитов в России./ И.В.Шахигильдян, Г.Г.Онищенко, П.А.Хухлович и соавт.// ЖМЭИ. 1994. - №5. - с.26-31.

7. Мукомолов С.Л., Валькова И.В., Чайка Н.В. Вирусные гепатиты.// Санкт-Петербург. — 1992. — 93 с.

8. Нетесова И.Г., Цой Л.В., Жуков В.А., Ярославцева О.А. Проблемы контроля качества неколичественных методов иммуноферментного анализа.// В кн.: «Вирусные гепатиты эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». - Москва. - 2007. - с.49-50.

9. Основы ретроспективного анализа инфекционной заболеваемости./ Учебное пособие для врачей эпидемиологов под ред. В.В.Шкарина.// Н.Новгород. 2000. - 315 с.

10. Палтышев И.П., Филатов Н.Н. Изучение распределений показателей заболеваемости всего населения.// В кн.: «Содержание и методика проведения описательного эпидемиологического исследования»-Москва 2003.- с. 10-74.

11. Петрухина М.И., Старостина Н.В. Статистические методы в эпидемиологическом анализе.// Москва. 2003.-93 с.

12. Савилов Е.Д. Применение статистических методов в эпидемиологическом анализе. Москва. - 2004. — с.5-12.

13. Черкасский Б.Л. Эпидемиологический метод: лекция.// Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. 1999.

14. Черкасский Б.Л. Эпидемиологический надзор.// Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. — 2000. 24 с.

15. Шарара А., Хант С., Гамильтон Д. Гепатит С.// Международный журнал медицинской практики. 1997. - №2. - с.35-47.

16. Шаханина И. Л., Кучеровская Т.В., Чернова Т.П. Показания к применению различных статистических методов эпидемиологического анализаи ограничения при оценке динамики эпидемического процесса.// ЖМЭИ. — 1990. №4 - с.49-54.

17. Шаханина И.Л., Кучеровская Т.В., Чернова Т.П. Применение различных статистических методов эпидемиологического анализа при оценке сезонности и территориальной распространения инфекционных болезней.// ЖМЭИ. — 1990. -№5 -с.43-47.

18. Шаханина И.Л., Осипова Л.А., Болотовская Т.П. Инфекционная патология в России. Эпидемиологическая и экономическая значимость.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - №1. - с. 15-20.

19. Шаханина И.Л., Радуто О.И., Осипова Л.А., Приказчикова Г.С. Распространенность гепатита В среди населения федеральных округов Российской Федерации.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. -№5 - с.7-11.

20. Шаханина И. Л., Саравайская Л.И. Метод картографирования показателей заболеваемости при изучении географического распространения инфекционных болезней.// ЖМЭИ- 1970. №2 - с.140-141.

21. Шаханина И.Л., Чернова Т.П. Некоторые аспекты методологии эпидемиологического надзора.// В кн.: Эпидемиологический надзор за инфекционными болезнями». Москва. - 1987. - с.27-33.

22. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты: эпидемиология, диагностика, профилактика.// Москва. -2003.-383 с.

23. Шляхтенко Л.И. Системный подход к изучению эпидемического процесса гепатитов В и С.// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2003.4(11)-с. 15-19.

24. Шляхтенко Л.И., Сулягина Л.Г. Эпидемиологический контроль хронических вирусных гепатитов В и С как социально-значимая проблема.// В кн.: «Вирусные гепатиты — проблемы диагностики, лечения и профилактики». -Москва. 2005. - с.395-397.

25. Эпидемиологическая оценка хронического носительства поверхностного антигена вируса гепатита В и других маркеров этой инфекции./ Л.И. Шляхтенко, С.А.Козлов, С.С.Першин и соавт.// ЖМЭИ. 1991. - №8 - с.46-49.

26. Alhababi F., Sallman Т.A., Tong C.Y.W. The significance of anti-HBc only in the clinical virology laboratory // J. Clin. Virol. — 2003. — v.27. p. 162-169.

27. Analysis of HBs antigen negative variant of hepatitis В virus: unique substitutions, Glu 129 to Asp and Gly 145 to Alain the surface antigen gene./ T.Koyanagi, M.Nakamuta, H.Sakai et al.// Med. Sci. Monit 2000. - v.6. - p.l 1651169.

28. Bartholomeusz A., Schaefer S. Hepatitis В virus genotypes: comparison of genotyping methods // Rev. Med. Virol. 2004. - v.14. - p.3-16.

29. Blanchet M., Sureau C. Infectivity determinants of the hepatitis В virus Pre-S domain are confined to the N-terminal 75 amino acid residues // J. Virol. 2007. -v.81. -p.5841-5849.

30. Brunetto M.R., Rodriguez U.A., Bonino F. Hepatitis В virus mutants // Intervirology. 1999. - v.42. - p.69-80.

31. Bruss V. A short linear sequence in the Pre-S domain of the large hepatitis В virus envelope protein required for virion formation // J. Virol. 1997. - v.71. -p.9350-9357.

32. Bruss V. Hepatitis В virus morphogenesis // World J. Gastroenterol. 2007. — v.13. -p.65-73.

33. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis В virus // J. Viral. Hepat. 1997. - v.4. - p.l 1-20.

34. Carman W.F. Infections associated with medical intervention: hepatitis viruses and HGV // Br. Med. Bull. 1998. - v.54. - p.731-748.

35. Clade analysis and surface antigen polymorphism of hepatitis В vims American genotypes / M.Devesa, C.Rodriguez, G.Leon et al. // J. Med. Virol. — 2004. v.72.-p.377-384.

36. Characterization of unusual escape variants of hepatitis В virus isolated from a hepatitis В surface antigen-negative subject / S.Grethe, M.Monazahian, I.Bohme et al. / J. Virol. 1998. - v.12. - p.7692-7696.

37. Chu C-M., Yen C.-T., Liaw Y.-F. Low-level viremia and intracellular expression of hepatitis В surface antigen (HBsAg) in HBsAg carriers with concurrent hepatitis С vims infection // J.Clin.Microbiol—1998—v.36.-p.2084-86.

38. Cloning and expression of surface antigens from occult chronic hepatitis В vims infections and their recognition by commercial detection assays / D.Jeantet, I.Chemin, B.Mandrand et al. / J. Med. Virol. 2004. - v.73. - p.508-515.

39. Coleman P.F., Jack Chen Y.-C., Mushahwar I.K. Immunoassay detection of hepatitis В surface antigen mutants // J. Med. Virol. 1999. - v.59. - p. 19-24.

40. Complete genome sequence and phylogenetic analysis of hepatitis В vims isolated from Turkish patients with chronic HBV infection / G.Bozdayi, A.R. Turkyilmaz, R.Idilman et al. // J. Med. Virol. 2005. - v.76. - p.476-481.

41. Correlation between anti-HBc titers and HBV DNA in blood units without detectable HBsAg / H.Okamoto, H.Iizuka, K.Ohmura, et al. / Vox. Sang. 1992. -v.63. - p.107-111.

42. Deficiency in virion secretion and decreased stability of the hepatitis В virus immune escape mutant G145R / T.Kalinina, A.Iwanski, H.Will et al. / Hepatology. 2003. - v.38. - p. 1274-1281.

43. Distribution of HBV genotypes, subgenotypes and HBsAg subtypes among chronically infected patients in Serbia / I.Lazarevic, M.Cupic, D.Delic, et al.// Arch. Virol. 2007. - v. 152. - p.2017-2025.

44. The dominant hepatitis В virus genotype identified in Tibet is a C/D hybrid / C.Cui, J.Shi, L.Hui et al.// J. Gen. Virol. 2002. - v.83. - p.2773-2777.

45. Echevarria J.M., Avellon A. Hepatitis В virus genetic diversity // J. Med. Virol. 2006. - v.78. - S36-S42

46. Effect of variation in the common "a" determinant on the antigenicity of hepatitis В surface antigen / S.Seddigh-Tonekaboni, J.A.Waters, S.Jeffers et al. / J. Med. Virol. 2000. - v.60. - p.l 13-121.

47. Emergence of vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus with multiple surface gene mutations in a Korean Child / K.M.Lee, Y.S.Kim, Y.Y.Ko et al. / J. Korean Med. Sci. 2001. - v. 16. -p.359-362.

48. Evaluation of sensitivity for wild type and mutant forms of hepatitis В surface antigen by four commercial HBsAg assays / B.Moerman,V. Moons, H.Sommer et al. / Clin. Lab. 2004. - v.50. - p. 159-162.

49. Evaluation of two new automated assays for hepatitis В virus antigen (HbsAg) detection: IMMULATE HbsAg and IMMULATE 2000 HbsAg / B.Weber, T.Dengler, A.Berger et al. / J. Clin. Microbiol. 2003. - v.41. - p. 13 5-143.

50. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis В virus infection natural history and clinical consequences // N.Engl. J. Med. - 2004. - v.350. - p.l 118-1129.

51. Genetic diversity of hepatitis В virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HBsAg subtypes / H.Norder, A.M.Courouce, P.Coursaget et al. // Intervirology. 2004. - v.47. - p.289-309.

52. Genetic relatedness of hepatitis В viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen / H.Norder, B.Hammas, S.-D.Lee et al. // J. General Virol. 1993. - v.74. -p.1341-1348.

53. Genomic variability in the PreSl region and determination routes of transmission of hepatitis В virus / A.Uy, G.Wunderlich, D.B.Olsen et al. // J. General Virol. 1992. - v.73. - p.3005-3009.

54. Glebe D., Urban S. Viral and cellular determinants involved in hepadnaviral entry // World J. Gastroenterol. 2007. - v. 13. - p.22-38.

55. HBsAg as the antigen component of circulating immune complexes in HIV-infected patients / M.Stanojevic, S.Zerjav, D.JJevtovic et al. // Biomed & Pharmacother. 2000. - v.54. - p. 163-167.

56. Hepatitis В virus genotype D strains from Estonia share sequence similarity with strains from Serbia and may specify ayw4 / T.Tallo, H.Norder, V.Tefanova et al. // J. Med. Virol. 2004. - v.74. - p.221-227.

57. Hepatitis В virus genotype E surface antigen detection with different immunoassays and diagnostic impact of mutations in the preS/S gene / C.M.Olinger, B.Weber, J.A.Otegbayo et al. // Med. Microbiol. Immunol. 2007. -v.196. - p.247-252.

58. Hepatitis В virus markers in anti-HBc only positive individuals / B.Weber, W.Melchior, R.Gehrke et al. // J. Med. Virol. 2001. - v.64. - p.312-319.

59. Hepatitis В virus S mutants in liver transplant recipients who were reinfected despite hepatitis В immune globulin prophylaxis // M.G.Ghany, B.Ayola, F.G.Villamil et al. Hepatology. 1998. - v.27. - p.213-222.

60. Hepatitis В virus is sensitive to changes in the cytosolic S loop of the envelope proteins / H.Loffler-Mary, J.Dumortier, C.Klentsch-Zimmer et al. // J. Virol. -2000. — v.270. — p.358-367.

61. Hepatitis В virus with antigenically altered hepatitis В surface antigen is selected by high-dose hepatitis В immune globulin after liver transplantation / U.Protzer-Knolle, U.Naumann, R.Bartenschlager et al. // Hepatology. 1998. — v.27. - p.254-263.

62. High level of genetic heterogeneity in S and P genes of genotype D hepatitis В vims / C.Maddalena, C.Giambelli, E.Tanzi et al. // J. Virol. 2007. - v.365. -p.113-124.

63. Identification and chemical synthesis of a host cell receptor binding site on hepatitis В virus / A.R.Neurath, S.B.Kent, N.Strick et al. // Cell. 1986. - v.6. -p.429-436.

64. Identification of hepatitis В surface antigen variants with alterations outside the "a" determinant in immunized Singapore infants / C.J.Oon, C.W.Ning, K.Shiuan et al. // J. Infect. Dis. 1999. - v. 179. - p.259-263.

65. Identification of a novel surface mutant of hepatitis В virus in a seronegative chronic liver disease patient / K.Banerjee, R.C.Guptan, R.Bisht et al. // Virus Res. -1999. v.65. - p.103-109.

66. Improved detection of hepatitis В virus surface antigen by a new rapid automated assay / B.Weber, A.Bayer, P.Kirch et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. -v.37. — p.2639-2647.

67. Infectious hepatitis В virus variant defective in pre-S2 protein expression in a chronic carrier / D.Fernholz, P.R.Galle, M.Stemler, et al. // J. Virol. 1993. -v.194. - p.137-148.

68. Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis В vims surface antigen mutant G145R / C.J.Oon, W.N.Chen, K.S.Goo et al. // J. Infect. 2000. -v.41. - p.260-264.

69. Is a function of the secreted hepatitis В e antigen to induce immunologic tolerance in utero? / D.R.Milich, J.E.Jones, J.L.Hughes et al. // Proc. Acad. Sci. USA. 1990. - v.87. - p.6599-6603.

70. Karayiannis P. Hepatitis В virus: old, new and future approaches to antiviral treatment // J. Antimicrob. Chemother. 2003. - v.51. - p.761-785.

71. Kato H., Orito E., Gish R.G. Characteristics of hepatitis В virus isolates of genotype G and their phylogenetic differences from the other six genotypes (A through F) // J. Virol. 2002. - v.76. - p.6131-6137.

72. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y., Kidd A.H. Genetic variability in hepatitis В viruses//J. Gen. Virol. 2002. - v.83. - p. 1267-1280.

73. Klingmuller U., Schaller H. Hepadnavirus infection requires interaction between the viral pre-S domain and a specific hepatocellular receptor // J. Virol. 1993. - v.67. - p.7414-7422.

74. Kramvis A., Kew M., Francois G. Hepatitis В virus genotypes // Vaccine. 2005. - v.23. — p.2409-2423.

75. Leistner C.M., Gruen-Bernhard S., Glebe D. Role of glycosaminoglycans for binding and infection of hepatitis В virus // Cellular Microbiol. — 2008. — v. 10. -p.122-133.

76. Mangold C.T.M., Streeck R.E. Mutational analysis of the cysteine residues in the hepatitis В virus small envelope protein // J. Virol. 1993. - v.73. - p.2052-2057.

77. Melegari M., Scaglioni P.P., Wands J.R. The small envelope protein required for secretion of a naturally occurring hepatitis В virus mutant with Pre-S 1 deleted // J. Virol. 1997. - v.71. - p.5449-5454.

78. Modulation of hepatitis В virus secretion by naturally occurring mutations in the S gene / N.Khan, M.Guarnieri, S.H.Ahn et al. // J. Virol. 2004. - v.78. - p.3262-3270.

79. Molecular epidemiology of hepatitis В virus vaccine variants in Singapore / C.J.Oon, G.K.Lim, Z.Ye et al. / Vaccine. 1995. - v. 13. - p.699-702.

80. Molecular evolution of hepatitis В virus over 25 years / C.Osiowy, E.Giles, Y.Tanaka et al. // J. Virol. -2006. -v.80. p. 10307-10314.

81. Molla N., Kew M., Arbuthnot P. Regulatory elements of hepatitis В virus transcription // J. Viral. Hepatitis. 2002. - v.9. - p.323-331.

82. Mutant hepatitis В viruses: a matter of academic interest only or a problem with far-reaching implications? / G.Francois, M.Kew, P.Van Damme et al. // Vaccine. — 2001. v.19. -p.3799-3815.

83. Nassal M. Hepatitis В virus replication: novel roles for virus-host interaction // Intervirology. 1999. - v.42. - p. 100-116.

84. Natural history of hepatitis В surface antigen mutants in children / C.J.Oon, K.-L.Tan, T.Harrison et al. //Lancet. 1996. - v.348. - p. 1524.

85. A new genotype of hepatitis В virus: complete genome and phylogenetic relatedness / L.Stuyver, S.De Gendt, C.Van Geyt et al. // J. Gen. Virol. 2000. -v.81. -p.67-74.

86. A new intertype recombinant between genotypes С and D of hepatitis В virus identified in China / Z.Wang, Z.Liu, G.Zeng et al. / J. Gen. Virol. 2005. - v.86. -p.985-990.

87. A novel stop codon mutation in HBsAg gene identified in a hepatitis В strain associated with cryptogenic cirrhosis / Xu Yang, Xiao-Peng Tang, Jian-Hua Lei et al. // World J. Gastroenterol. 2003. - v.9. - p.l516-1520.

88. Occult hepatitis В virus infection in chronic liver disease: full-length genome and analysis of mutant surface promoter / V.Chaudhuri, R.Tayal, B.Nayak et al. / Gastroenterology. 2004. - v. 127. - p. 1356-1371.

89. Occult hepatitis В virus infection in patients with chronic hepatitis С liver disease / I.Cacciola, T.Pollicino, G.Squadrito et al. // The New England J. of Medicine. -1999. v.341. — p.22-26.

90. Paran N., Geiger В., Shaul Y. HBV infection of cell culture: evidence for multivalent and cooperative attachment // EMBO J. 2001. - v.20. - p.4443-4453.

91. Patterns of circulating hepatitis В surface antigen variants among vaccinated children born to hepatitis В surface antigen carrier and non-carrier mothers / M.-S.Ho, Y.-C.Mau, C.-F.Lu et al. / J. Biomed. Sci. 1998. - v.5. -p.355-362.

92. Pawlotsky J.-M. The concept of hepatitis В virus mutant escape // J. Clin. Virol. — 2005. v.34. - S125-S129.

93. Point mutation in the S gene of hepatitis В virus for a d/y or w/r subtypic change in two blood donors carrying a surface antigen of compound subtype adyr or adwr / H.Okamoto, M.Imai, F.Tsuda et al. / J. Virol. 1987. - v.61. - p.3030-3034.

94. Pollicino Т., Campo S., Raimondo G. PreS and core gene heterogeneity in hepatitis В virus (HBV) genomes isolated from patients with long-lasting HBV chronic infection // J. Virol. 1995. - v.208. - p.672-677.

95. Presence of hepatitis В surface antigen mutant G145R DNA in the peripheral blood leukocytes of the family members of its horizontal transmission / R.Chakravarty, M.Neogi, S.Roychowdhury et al. // Virus Res. 2000. - v.90. -p.133-141.

96. Prevalence and significance of hepatitis В virus (HBV) Pre-S mutants in serum and liver at different replicative stages of chronic HBV infection / Y.-F.Fan, C.C.Lu, W.C.Chen et al. // J. Hepatol. 2000. - v.33. - p.277-286.

97. Prevalence of naturally occurring surface gene variants of hepatitis В virus nonimmunized surface antigen — negative Chinese carriers / J.Hou, Z.Wang, J.Cheng et al. // J. Hepatol. 2001. - v.34. - p.l027-1034.

98. The prevalence of surface antigen variants of hepatitis В virus in Papua New Guinea, South Africa, and Sardinia / W.F.Carman, F.J.Deursen, L.T.Mimms et al.// J. Hepatol. 1997. - v.26. - p.1658-1666.

99. Prevalence vaccine-induced escape mutants of hepatitis В virus in the adult population in China: a prospective study in 176 restaurant employees / C.He, F.Nomura, S.Itoga et al. // J. Gastroenterol and Hepatol. 2001. - v. 16. - p. 13731377.

100. Pumpens P., Grens E., Nassal M. Molecular epidemiology and immunology of hepatitis В virus infection an update // Intervirology. - 2002. - v.45. - p.218-232.

101. Reactivity of 13 in vitro expressed hepatitis В surface antigen variants in 7 commercial diagnostic assays / J.H.Ireland, B.O'Donnell, A.A.Basuni et al. // J. Hepatol. 2000. - v.31. - p. 1176-1182.

102. Role of surface promoter mutations in hepatitis В surface antigen production and secretion in occult hepatitis В virus infection / S.Sengupta, S.Rehman, H.Durgapal et al. // J. Med. Virol. 2007. - v.19. - p.220-228.

103. The secreted hepatitis В precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence / D.R.Milich, M.K.Chen, J.L.Hughes et al. // J. Immunol. 1998.-v. 160.-p.2013-2021.

104. Schaefer S. Hepatitis В virus: significance of genotypes // J. Viral. Hepat. -2005. - v.l2.-p.lll-124.

105. Schaefer S. Hepatitis В virus genotypes in Europe // Hepatol. Res. 2007. v.37. - S20-S26.

106. Seeger C., Mason W.S. Hepatitis В virus biology // Microbiol. Mol. Biol. Rev.-2000.-v.64.-p.51-68.

107. Structural and functional heterogeneity of naturally occurring hepatitis В virus variants / M.R.Burda, S.Gunter, M.Dandri et al. // Antiviral Res. 2001. - v.52. -p.125-138.

108. Suppression of hepatitis В virus expression and replication by hepatitis С virus core protein in HuTI-7 cells / C.-M.Shih, J.S.Lo, T.Miyamura et al. // J. Virol. 1993. - v.67. - p.5823-5832.

109. Survey of hepatitis В surface variant infection in children 15 years after a nationwide vaccination programme in Taiwan / H.Y.Hsu, M.H.Chang, Y.H.Ni et al. // Gut. 2004. - v.53. - p.1499-1503.

110. Transmission of G145R mutant of ITBV to an unrelated contact / V.Thakur, S.N.Kazim, B.C.Guptan et al. // J. Med. Virol. 2005. - v.76. - p.40-46.

111. Unusual hepatitis В surface antigen variation in a child immunized against hepatitis В / L.Roznovsky, T.J.Harrison, Z.-L.Fang et al. // J. Med. Virol. 2000. -v.61. -p.l 1-14.

112. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus / W.F.Carman, A.R.Zanetti, P.Karayiannis et al. // Lancet. 1990. - v.336. - p.325-329.

113. Variability of the PreSl/PreS2/S regions of hepatitis В virus in Hungary / K.N.Szomor, A.Dencs, G.Toth et al. // Arch. Virol. 2007. - v. 152. - p.697-704.

114. Virus taxonomy / C.M.Fanquet, M.A.Mayo, J.Maniloff et al. // Elsevier Academic Press. 2005. - p.373-383.

115. Weber B. Diagnostic impact of the genetic variability of the hepatitis В virus surface antigen gene // J. Med. Virol. 2006. - v.78. - S59-65.

116. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis В virus: clinical and diagnostic impact // J. Clin. Virol. 2005. - v.32. - p. 102-112.

117. Weber B. The isolated anti-HBc reactivity: New developments // J. Lab. Med.- 2002.-v.26.-p.451-458.

118. Weber B. Recent developments in the diagnosis and monitoring of HBV infection and role of the genetic variability of the S gene // Expert. Rev. Mol. Diagn.- 2005. v.5. - p.75-91.

119. Yokosuka O., Arai M. Molecular biology of hepatitis В virus: effect of nucleotide substitutions on the clinical features of chronic hepatitis В // Med. Mol. Morphol. 2006. - v.39. - p.l 13-120.