Формирование изомеров металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a при про-зависимом фолдинге тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Сафина, Дина Рашидовна

• Сафина, Дина Рашидовна
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сафина, Дина Рашидовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Про-зависимый фолдинг белков

1.1.1. Про-зависимы фолдинг протеолитических ферментов.

1.2. Термолизин-подобные металлопротеиназы

1.2.1. Структурно-функциональная организация термолизин-подобных металлопротеиназ бацилл

1.2.2. Организация активного центра молекулы термолизина

1.2.3. Организация субстрат-связывающего кармана

1.2.4. Организация сайтов связывания ионов кальция.

1.2.5. Про-последователыюсти термолизин-подобных металлопротеиназ

1.3. Термолизин-подобная металлопротеиназа

Thermoactinomyces sp. 27а

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЕДОВАНИЯ

2.1. Микробные штаммы и плазмиды

2.2. Культивирование микроорганизмов

2.3. Выделение плазмидной ДНК

2.4. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот

2.5. Ферментативный гидролиз.

2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.7. Получение конструкций, обеспечивающих экспрессию модифицированных генов металлопротеиназ в клетках штамма Bacillus subtilis AJ73.

2.8. Обработка амплификационных фрагментов полинуклеотидкиназой.

2.9. Трансформация клеток Bacillus subtilis AJ73.

2.10. Трансформация клеток Escherichia coli штаммы XL-1 (Blue) и

BL-21 (DE3-A.).

2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.12. Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммов-продуцентов В. subtilis AJ73.

2.13. Анализ динамики накопления целевых белков в клетках Е. coli BL-21, несущих экспрессионные плазмиды.

2.14. Экстракция нерастворимых целевых белков из мембранных фракций рекомбинантных штаммов-продуцентов, несущих экспрессионные плазмиды.

2.15. Очистка целевых белков из биомассы штаммов-продуцентов, несущих экспрессионные плазмиды.

2.16. Очистка металлопротеиназы на аффинном сорбенте.

2.17. Электрофоретический анализ белков.

2.18. Количественное определение белка.

2.19. Фолдинг в системе in cis.

2.20. Фолдинг в системе in trans.

2.21. Определение протеолитической активности ферментов.

2.22. Влияние температуры на стабильность фермента.

2.23. Статистическая обработка данных.

2.24. Представление молекул.

2.25. Компьютерный анализ результатов электрофорезов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.2. Конструирование мутантных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, с делетированной дополнительной С-концевой последовательностью.

3.3. Характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.4. Конструирование изолированных фрагментов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.5. Биосинтез мутантных вариантов металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27а, В. brevis, В. amyloliquefaciens в клетках Е. coli BL-21.

3.6. Анализ внутриклеточной локализации модифицированных вариантов металлопротеиназ в клетках Е. coll BL-21.

3.7. Очистка изолированных частей металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27 и В. amyloliquefaciens.

3.8. Фолдинг металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3.9. Фолдинг металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в присутствии чужеродной про-последовательности.

3.10. Очистка вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, полученных при проведении фолдинга в системах in cis и in trans

3.11. Характеристика металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27а, реактивированных в системах in cis и in trans—.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование изомеров металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a при про-зависимом фолдинге»

Актуальность работы.

Современная биотехнология включает в себя целый ряд разнообразных, быстро развивающихся социально ориентированных направлений исследований. Сюда входит создание новейших лекарственных препаратов, диагностикумов, разработка новых способов утилизации промышленных отходов и многое другое. При этом успехи современной биотехнологии во многом связаны с использованием разнообразных ферментов или ферментативных систем, позволяющих, с одной стороны, оптимизировать традиционные производства (на основе замены химических подходов энзиматическими или за счет повышения эффективности уже существующих ферментативных процессов), а с другой - развивать совершенно новые направления. Уровень современной белковой инженерии и ее успехи в области, направленной на оптимизацию биотехнологического производства, дают основания предпологать, что уже в достаточно скором времени конструирование оптимизированных ферментов de novo или на основе имеющихся полимерных молекул станет реальной лабораторной практикой и позволит существенно повысить эффективность биотехнологических процессов, основанных на использовании биокатализаторов. Тем ни менее, на настоящее время наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, ещё не достаточны для направленного создания ферментов с заданными свойствами. Широкое применение в современной биотехнологии получили протеолитические ферменты (в частности, продуцируемые микроорганизмами, обитающими в уникальных природных и искусственных экосистемах), которые являются перспективными для практического использования, а также весьма интересными с научной точки зрения. Так одним из интригующих и мало изученных вопросов является механизм образования ферментами корректной пространственной структуры, а так же способность на базе одной и той же аминокислотной последовательности формировать функционально-активные белковые молекулы с различными свойствами.

Данная работа посвящена изучению возможности образования функционально различающихся изомеров протеолитических ферментов в ходе про-зависимого фолдинга на модели термолизин-подобной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-48280, № 00-04-48281, № 03-04-48755.

Цель работы.

Целью данной работы являлось выяснение возможности конструирования различающихся по специфичности действия протеолитических ферментов на базе единой аминокислотной последовательности без внесения замен в функционально существенные области молекулы.

Научная новизна.

Впервые сконструированы разнообразные модифицированные варианты гена металлопротеиназы Thermoactmomyces sp., осуществлена их экспрессия в клетках Bacillus subtilis и Escherihia coli и охарактеризованы соответствующие белки. Показано, что данный фермент формирует свою пространственную структуру по про-зависимому механизму и продемонстрирована возможность получения стабильных, отличных по своей субстратной специфичности, протеиназ на базе одной аминокислотной последовательности.

Практическая значимость.

Полученные результаты открывают новый подход для конструирования протеолитических ферментов с модифицированными свойствами, в частности, измененной субстратной специфичностью. Поскольку протеиназы занимают лидирующее место среди ферментов, используемых в практических целях, то этот подход может быть использован при оптимизации целого ряда биотехнологических производств.

Положения, выносимые на защиту.

1. Конструирование и характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp.

2. Доказательство протекания фолдинга металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. по про-зависимому механизму.

3. Изучение возможности использования гетерологичных про-последовательностей в качестве фолдинг-ассистентов.

4. Конструирование на базе одной полипептидной цепи протеолитических ферментов, отличающихся по своей субстратной специфичности.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Сафина, Дина Рашидовна

ВЫВОДЫ

1. Дополнительная С-концевая область металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. не оказывает существенного влияния на протекание процесса фолдинга белковой молекулы и ее отсутствие не препятствует секреции протеиназы в клетках Bacillus subtilis AJ73.

2. Металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. формирует свою пространственную структуру по про-зависимому механизму, при этом не требуется наличия ковалентной связи между про-последовательностью и зрелой частью.

3. Гетерологичная про-последовательность металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens способна направлять фолдинг фермента Thermoactinomyces sp.

4. Варианты металлопротеиназы Thermoactinomyces sp., полученные на базе одной аминокислотной последовательности, отличаются по субстратной специфичности.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признательность своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору Кострову Сергею Викторовичу и благодарит за поддержку, внимание, доброжелательное отношение и всестороннюю помощь, проявленные в ходе выполнения работы. Автор выражает благодарность кандидату химических наук Демидюку Илье Валерьевичу за помощь в работе и за участие в обсуждении полученных результатов, а также кандидату химических наук Акимкиной Татьяне Викторовне, кандидату биологических наук Носовской Елене Алексеевне, кандидату химических наук Заболотской Марии Васильевне, кандидату химических наук Романовой Дарье Викторовне, всем аспирантам и студентам лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН за помощь, ценные советы в работе и дружеское отношение. Автор благодарит сотрудников ИМГ РАН за внимание и содействие, оказанное ими. Автор благодарит доктора биологических наук, профессора Честухину Галину Георгиевну (ГНИИ Генетика), а также сотрудников ИМБ РАН, ИБХ РАН, ценра "Биоинженерия" за помощь в выполнении экспериментальной части работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сафина, Дина Рашидовна, 2005 год

1. Simonen М., Pavla I. Protein secretion in Bacillus species. // 1993. Microboil. Rev. 57(1): 109-137.

2. Shinde U., Inouye M. Intramolecular chaperones: polypeptide extensions that modulate protein folding. // 2000. Semin. Cell Dev. Biol. 11(200): 35-44.

3. Ikemura H, Takagi H, Inouye M. Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli. II 1987. J. Biol. Chem. 262:7859-7864.

4. Silen J.L., Agard D.A. The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. // 1989. Nature. 341: 362-264.

5. Winther J.R., Sorensen P. Propeptide of carboxypeptidase Y provides a chaperone-like function as well as inhibition of the enzymatic activity. // 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9330-9334.

6. Smith S.M., Gottesman M.M. Activity and deletion analysis of recombinant human cathepsin L expressed in Escherichia coli. // 1989. J. Biol. Chem. 264: 20487-20495.

7. Lee Y.C., Miyata Y., Terada I., Ohta Т., Matsuzawa H. Involvement of NH2-terminal pro-sequence in the production of active aqualysin I a thermophilic serine protease in Escherichia coli. // 1991. Agric. Biol. Chem. 55: 3027-3032.

8. Van den Hazel H.B., Kielland-Brandt M.C., Winther J.R. The propeptide is required for in vivo formation of stable active yeast proteinase A and can function even when not covalently linked to the mature region. // 1993. J. Biol. Chem. 268: 18002-18007.

9. Marie-Claire S., Ruffet E., Beaumont A., Roques B.P. The prosequence of thermolysin acts as a intramolekular shaperone when expressed in trans with the mature sequence in Escherichia coli. II 1999. J. Mol. Biol. 285(5): 1911-1915.

10. Zhu X., Ohta Y., Jordan F., Inouye M. Pro-sequence of subtilisin can guide the folding of denatured subtilisin in an intermolecular process. //1989. Nature. 339: 483-484.

11. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M. Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as a intramolecular chaperone for protein folding. Refolding and inhibitiry abilities of propeptide mutants. // 1995. J. Biol. Chem. 270(42): 25127-25132.

12. RuanB., HoskinsJ., Bryan P. Rapid folding of calcium-free subtilisin by a stabilized pro-domen mutant. // 1999. Biochemistry. 38(26): 8562-8571.

13. ShindeU.P., Liu J.J., InouyeM. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. // 1997. Nature. 389(6650): 520-522.

14. Wang L., Ruan В., RuvinovS., Bryan P. Engineering the independent folding of the subtilisin BPN' pro-domen: correlation of pro-domen stability with the rate of subtilisin folding. // 1998. Biochemistry. 37(9): 3165-3171.

15. OhtaY., InouyeM. Pro-subtilisin E: purification and characterization of its autoprocessing to active subtilisin E in vitro. // 1990. Mol. Microbiol. 4(2): 295-304.

16. IkemuraH., InouyeM. In vitro processing of pro-subtilisin in Escherichia coli. II 1988.

17. Biol. Chem. 263: 12959-12963.

18. ДемидюкИ.В., Заболотская M.B., Велишаева H.C., Сафина Д.Р., Костров С.В.

19. Про-зависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // 2003.

20. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 4: 11-15.

21. Buevich A., Shinde U., Inouye M., Baum J. Backbone dynamics of the natively unfolded pro-peptide of subtilisin by heteronuclear NMR relaxation studies. // 2001. J. Biomol. NMR. 20(3): 233-49.

22. Strausberg S., Alexander P., WangL., Schwarz F., Bryan P. Catalysis of a protein folding reaction: thermodynamic and kinetic analysis of subtilisin BPN' interactions with its propeptide fragment. // 1993. Biochemistry. 32(32): 8112-8119.

23. Cunningham E.L., Jaswal S.S., Sohl J.L., Agard D.A. Kinetic stability as a mechanism for protease longevity. // 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 1108-11014.

24. Cunningham E.L., Agard D.A. Interdependet folding of the N- and C-terminal domains defines the cooperative folding of a-lytic protease. // 2003. Biochemisrty. 42: 1321213219.

25. Eader J., Fersht A. Pro-sequence-assisted protein folding. I1 1995. Mol. Microbiol. 16(4): 609-614.

26. Matsubara M., Kurimoto E., Kojima S., Miura K., Sakai T. Achivement of renaturation of subtilisin BPN' by a novel procedure using organic salts and a digestible mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor. // 1994. FEBSLett. 342(2): 193-196.

27. Ваганова Т.И., Медведева Н.П., Степанов B.M. Ренатурация бактериальных металлопротеиназ. // 1993. Биохимия. 58(6): 913-920.

28. Eader J., Rheinnecker M., Fersht A. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence.// 1993. J. Mol Biol. 233(2): 293-304.

29. Bryan P., Alexander P., Strausberg S., Schwarz F., Lan W., Gilliland G., Gallagher D.T. Energetics of folding subtilisin BPN'. // 1992. Biochemistry. 31: 4937-4945.

30. JainS.C., ShindeU., LiY., InouyeM., BermanH.M. The crystal structure of an autoprocessed Ser22ICys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. // 1998. J. Mol. Biol. 284: 137-144.

31. Barret A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. // 1998. Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press. Inc. New York. 1033-1064.

32. FujinagaM., Delbaere L.T., BrayerG.D., James M.N. Refined structure of alpha-lytic protease at 1.7 A resolution. Analysis of hydrogen bonding and solvent structure. // 1985. J. Mol. Biol 184: 479-502.

33. Lesk A.M., Fordham W.D. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family. // 1996. J. Mol. Biol. 258(3): 501-537.

34. Baker D., Sohl J.L., AgardD.A. A protein-folding reaction under kinetic control. // 1992. Nature. 356: 263-265.

35. AndersonD.E., PetersR.J., WilkB., AgardD.A. Alpha-lytic protease precursor: characterization of a sructured folding intermediate. // 1999. Biochemistry. 38: 47284735.

36. Серкина A.B., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ. // 2001. Биоорган, хим. 27(5): 3 23346.

37. Baardsnes J., SidhuS., MacLeod A., Elliott J., MordenD., Watson J., Borgford T. Streptomyces griseus protease В: secretion correlates with the length of propeptide. // 1998. J. Bacteriol. 180: 3241-3244.

38. Takagi H., Koga M., Katsurada S., Yabuta Y., Shinde U., Inouye M., Nakamori S. Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones. //2001. FEBS Lett. 508(2): 210-214.

39. ShindeU., InouyeM. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: characterization of the structural changes in pro-subtilisin E coincident with autoprocessing. // 1995. J. Mol. Biol. 252(l):25-30.

40. Li Y., Inouye M. Autoprocessing of prothiolsubtilisin E in wich active-site Serine 221 is altered to cysteine. // 1994. J. Biol. Chem. 269: 4169-4174.

41. Wandersman C. Secretion, processing and activation of bacterial extracellular proteases. // 1989. Mol Microbiol. 3(12): 1825-1831.

42. Agard D.A. To fold or not to fold. // 1993. Science. 260: 1903-1904.

43. Eader J., Fersht A. Pro-sequence-assisted protein folding. // 1995. Mol. Microbiol. 16(4): 609-614.

44. Stennicke H.R., Birktoft J.J., BreddamK. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus. II 1996. Prot. Sci. 5: 22662275.

45. Gallagher Т., Gilhland G., Wang L., Bryan P. The prosegment-subtilisin BPN1 complex: crystal structure of a specific 'foldase'. // 1995. Structure. 3(9): 907-914.

46. Jain S.C., ShindeU., Li Y., Inouye M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. // 1998. J. Mol. Biol. 284(1): 137-144.

47. Li Y., Inouye M. Mechanism of autoprocessing of the propeptide of subtilisin E: intramolecular or intermolecular event? //1996. J. Mol. Biol. 262: 591-594.

48. Fu H., Inouye M., Shinde U. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: the inhibitory and chaperone functions of the subtilisin propeptide are not obligatorily linced. // 2000. J. Biol. Chem. 275(22): 16871-16878.

49. Yabuta Y., Takagi H., Inouye M., Shinde U. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: propeptide release modulates activation precision of pro-subtilisin. // 2001. J. Biol. Chem. 276(48): 44427-44434.

50. Takagi H., Takahashi M. A new approach for alteratoin of protease functions: pro-sequence engineering. // 2003. Appl. Microbiol. Biothecnol. 63: 1-9.

51. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M., Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as an intramolecular chaperone for protein folding. // 1995. J. Biol. Chem. 270: 2512725132.

52. Kettner C.A., Bone R., Agard D.A., Bachovchin W.W. Kinetic properties of the binding of a-lytic protease to peptide boronic acids.// 1988. Biochemistry. 27: 7682-7688.

53. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. // 1992. Eur. J. Biochem. 204: 433-451.

54. Sohl J.L., Shiau A.K., Rader S.D., Wilk B.J., Agard D.A. Inhibition of alpha-lytic protease by pro region C-terminal steric occlusion of the active site. // 1997. Biochemistry. 36: 3894-3902.

55. Shinde U.P., Liu J.J., Inouye M. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. // 1997. Nature. 389:520-522.

56. Shinde U.P., Fu X., Inouye M. // A pathway for conformational diversity in proteins mediated by intramolecular chaperones. 1999. J Biol Chem. 274:15615-15621.

57. Pruisner S.B., Scott M.R., DeArmond S.J., Cohen F.E. Prion protein biology. // 1998. Cell. 93:337-348.

58. Ellis R.J. Steric chaperones. // 1998. Trends Biochem. Sci. 23: 43-45.

59. Prusiner S.B. Prions. // 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13363-13383.

60. Bross P., Corydon T.J., Andresen B.S., Jorgensen M.M., Bolund L., Gregersen N. Protein misfolding and degradation in genetic diseases. // 1999. Hum. Mutat. 14(3): 186198.

61. Schulz J., Dichgans J. // Molecular pathogenesis of movement disorders: are protein aggregates a common link in neuronal degeneration? // 1999. Curr. Opin. Neurol. 12(4): 433-439.

62. Rehemtulla A., Dorner A.J., Kaufman R.J. Regulation of PACE propeptide-processing activity: requirement for a post-endoplasmic reticulum compartment and autoproteolytic activation. // 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8235-8239.

63. Van de Ven W.J., Roebroek A.J., Van Duijnhoven H.L. Structure and function of eukaryotic proprotein processing enzymes of the subtilisin family of serine proteases. // 1993. Crit. Rev. Oncog. 4:115-136.

64. Thomas G., Molly S.S., Anderson E.D., Thomas L. Multistep activation of Furin: a model for eukaryotic pro-protein convertases, in Iintramolecular Chaperones (Shinde U., Inouye M.) // 1995. RGLandes Company, Austin TX. 157-179.

65. Seidah N.G. The mammalian family of subtilisin/kexin-like pro-protein convertases, in Intramolecular Chaperones (Shinde U., Inouye M.) // 1995. RGLandes Company, Austin TX. 181-203.

66. Taubes G. Misfolding the way to disease. // 1996. Science. 271:1493-1495.

67. Thomas P.J., Qu B.H., Pedersen P.L. Defective protein folding as a basis of human disease. // 1995. Trends Biochem. Sci. 20:456-459.

68. Qu B.H., Strickland E., Thomas P.J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. // 1997. J. Bioenerg. Biomembr. 29:483-490.

69. Matsubara H., Feder J. Other bacterial, mold and yeast proteases. // 1971. The Enzymes. 3rd ed. (Boyer P.D., eds.) Academic Press. New York. 3: 721-792.

70. LattS.A., HolmquistB., ValleeB.L. Thermolysin: a zinc metalloenzyme. II 1969. Biochem. Biophys. Res. Comm. 37: 333-339.

71. Feder J., Garrett L.R., Wildi B.S. Studies on the role of calcium in thermolysin. // 1971. Biochemistry. 10: 4552-4556.

72. Veltman O.R., VriendG., van den Burg В., Hardy F., VenemaG., EijsinkV.G. Engineering thermolysin-like proteases whose stability is largely independent of calcium. // 1997. FEBSLett. 405(2): 241-244.

73. FederJ., KeayL., GarettL.R., CirulisN. MoseleyM.N., Wildi B.S. Bacillus cereus neutral protease. // 1971. Biochim. Biophys. Acta. 251(1): 74-78.

74. Feder J. Studies on the specificity of Bacillus subtilis neutral protease with synthetic substrates.// 1967. Biochemistry. 6(7): 2088-2093.

75. Feder J., Schuck J.M. Studies on the Bacillus subtilis neutral-protease-and Bacillus thermoproteolyticus thermolysine-catalyzed hydrolysis of dipeptide substrates. // 1970. Biochemistry. 9(14): 2784-2791.

76. Weaver L.H., KesterW.R., Matthews B.W. A crystallographic study of the complex of phosphoramidon w ith t hermolysin. A m odel f or the p resumed с atalytic t ransition s tate and for the binding of structures. // 1977. J. Mol. Biol. 114: 119-132.

77. Titani K., Hermodson M.A., Ericsson L.H., Walsh K.A., Neurath H. Amino-acid sequence of thermolysin. // 1972. Nature New Biol. 238: 35-37.

78. Holmes M.A., Matthews B.W. Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution 8TLN. // 1982. J.Mol.Biol. 160: 623-639.

79. Monzingo A.F., Matthews B.W. Structure of a mercaptan-thermolysin complex illustrates mode of inhibition of zinc proteases by substrate-analogue mercaptans. // 1982. Biochemistry. 21: 3390-3394.

80. Holmes M.A, Matthews B.W. Binding of hydroxamic acid inhibitors to crystalline thermolysin suggests a pentacoordinate 3 zinc intermediate in catalysis. // 1981. Biochemistry. 20: 6912-6920.

81. Bolognesi M.C., Matthews B.W. Binding of the biproduct analog 1-benzylsuccinic acid to thermolysin determined by x-ray crystallography. // 1979. J.Biol. Chem. 254: 634-639.

82. Kester W.R., Matthews B.W. Comparison of the structures of carboxypeptidase A and thermolysin. // 1977. J.Biol.Chem. 252: 7704-7710.

83. Kester W.R., Matthews B.W. Crystallographic study of the binding of dipeptide inhibitors to thermolysin. Implications for the mechanism of catalysis. // 1977. Biochemistry. 16: 2506-2516.

84. Dahlquist F.W., Long J.W., Bigbee W.L. Role of calcium in the thermal stability of thermolysin. // 1976. Biochemistry. 15: 1103-1111.

85. LevyP.L., Pangburn M.K., BursteinY., Ericsson L.H., NeurathH., Walsh K.A. Evidence of homologous relationship between thermolysin and neutral protease A of Bacillus subtilis. II 1975. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72: 4341-4345.

86. Matthews B.W., Weaver L.H., К ester W.R. The с onformation of thermolysin. // 1974. J. Biol. Chem. 249: 8030-8044.

87. Matthews B.W., Weaver L.H. Binding of lanthanide ions to thermolysin. // 1974 Biochemistry. 13(8): 1719-1725.

88. Colman P.M., Jansonius J.N., Matthews B.W. The structure of thermolysin, an electron density map at 2.3 A resolution. // 1972. J. Mol.Biol. 70: 701-724.

89. Matthews B.W., Jansonius J.N., Colman P.M., Schoenborn B.P., DuporqueD. Three dimensional structure of thermolysin.// 1972. Nature New Biol. 238: 37-40.

90. Matthews B.W., Colman P.M., Jansonius J.N., TitaniK., Walsh K.A, NeurathH. Structure of thermolysin. // 1972. Nature New Biol. 238: 41-43.

91. Dayhoff M.O. Atlas of protein sequence and structure. // 1976. Publ National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, MD. SBN 0-912466-05-7 V.5: 98

92. Stark W., Pauptit R.A., Wilson K.S., Jansonius J.N. The structure of neutral protease from Bacillus cereus at 0.2-nm. // 1992. Eur. J.Biochem. 207: 781-791.

93. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-donensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5 A resolution. // 1991. J. Biol. Chem. 266: 2864-2871.

94. Vriend G., Eijsmk V.G. Prediction and analysis of structure, stability and unfolding of thermolysin-like proteases. // 1993. J. Comput. Aided. Mol. Des. 7: 367-396.

95. Eijsink V.G., Vriend G., van den Burg В., Venema G., Stulp B.K. Contribution of the C-terminal amino acid to the stability of Bacillus subtilis neutral protease. // 1990. Protein Eng. 4: 99-104.

96. Tsuru D., Imajo S., Morikawa S., Yoshimoto Т., Ishiguro M. Zinc protease of Bacillus subtilis var. amylosacchariticus: construction of a three-dimensional model and comparison with thermolysin. // 1993. J. Biochem. (Tokyo) 113: 101-105.

97. O'Donohue M.J., Roques B.P., Beaumont A. Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostabile metalloprotease thermolysin. // 1994. Biochem. J. 300: 599-603.

98. De Kreij A, Venema G., van den Burg B. Substrate specificity in the highly heterogeneous M4 peptidase family is determined by a small subset of amino acids. // 2000. J. Biol. Chem. 275(40): 31115-31120.

99. Schlechter Т., BergerA. On the size of the active site in proteases. // 1967. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27(2): 157-162.

100. De Kreij A., Van den Burg B, Veltman O.R., Vriend G., Venema G., Eijsink V.G. The effect of changing the hydrophobic SI' subsite of thermolysin-like proteases on substrate specificity. // 2001. Eur. J. Biochem. 268: 4985-4991.

101. Eakin A.E., McGrath M.E., McKerrow J.H., Fletterick R.J., Craik C.S. Production of crystallizable cruzain, the major cysteine protease from Trypanosoma cruzi. // 1993. J.Biol.Chem. 268: 6115-6118.

102. Veltman O.R., Vriend G., Berendsen H.J.C., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. A single calcium binding site is crucial for the calcium-dependent thermal stability of thermolysin-like proteases. // 1998. Biochemistry 37: 5312-5319.

103. Coolbear Т., Whittaker J.M., Daniel R.M. The effect of metal on the activity and thermostability of the extracellular proteinase from a thermophilic Bacillus, strain EA.l. // 1992. Biochem. J. 287: 367-374.

104. Voordou G., Milo C., Roche R.S. Role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ion contributions to the kinetic thermal stability. // 1976. Biochemistry. 15: 3716-3724.

105. Corbett R.J.T., Ahmad F., Roche R.S. Domain unfolding and the stability of thermolysin in guanidine hydrochloride. // 1986. Biochem. Cell Biol. 64: 953-961.

106. WetmoreD., Wong S., Roche R. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus careus. II 1992. Mol. Microbiol. 6(12): 1593-1604.

107. Chang S.C., Chang P.C., Lee Y.-H.W. The roles of propeptide in maturation and secretion of Npr protease from Streptomyces. II 1994. J.Biol.Chem. 269: 3548-3554.

108. Takagi M., Imanaka T. Role of the pre-pro-region of neutral protease in secretion in Bacillus subtilis. И 1989. J. of fermentation and Bioengineering. 67(2): 71-76.

109. O'Donohue M.J., Beaumont A. The role of the prosequense of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. // 1996. J. Biol. Chem. 271(43): 26477-26481.

110. Zhang Z.Z., Nirasawa S., Nakajima Y., YoshidaM., Hayashi K. Function о f the N-terminal propeptide of an aminopeptidase from Vibrio proteolyticus. II 2000. Biochem. J. 350: 671-676.

111. Tang В., Nirasawa S., Kitaoka M., Hayashi K. The role of the N-terminal propeptide of the pro-aminopeptidase processing protease: refolding, processing, and enzyme inhibition. // 2002. Biochem. Biophys. Resear. Commun. 296: 78-84.

112. ShidhuS.S., BorgfordT.J. Selection of Streptomyces griseus protease В mutants with desired alterations in primary specificity using a library screening strategy. // 1996. J. Mol. Biol. 257(2): 233-245.

113. Silen J.L., Frank D., Fujishige A., Bone R., Agard D.A. Analysis of prepro-a-lytic protease expression in Escherichia coli reveals that the pro region is required for activity.// 1989. J. Bacteriol. 171(3): 1320-1325.

114. ShidhuS.S., KalmarG.B., Willis L.G., BorgfordT.J. Protease evolution in Streptomyces griseus. Discovery of a novel dimeric enzyme. // 1995. J. Biol. Chem. 270(13): 7594-7600.

115. TomaS., Campagnoli S., De Gregoriis E., GiannaR., MargaritL, Zamai M., Grandi G. Effect of Glu-143 and His-231 substitutions on the catalytic activity and secretion of Bacillus subtilis neutral protease. // 1989. Protein Eng. 2(5): 359-364.

116. Beaumont A., O'Donohue M.J., Paredes N., Rousselet N., Assicot M., Bohuon C., Fournie-Zaluski M.C., Roques B.P. The role of histidine 231 in thermolysin-likeenzymes. A site-directed mutagenesis study. // 1995. J. Biol. Chem. 270(28): 1680316808.

117. Чумаков B.H., ПиотухК.В., Володин A.A., Костров C.B. Характеристика гибридных генов, кодирующих функционально активные секреторные металлопротеиназы бацилл. // 1995. Молекулярная биология. 29: 756-760.

118. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Зайцев Д.А., Габриэлян А.Э., Костров С.В. Анализ структурных основ термостабильности секреторных мталлопротеиназ бацилл на модели химерных ферментов. // 1995. Молекулярная биология. 29: 9921000.

119. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Хромов И.С., Костров С.В. Изучение кинетических характеристик химерных металлопротеиназ бацилл. // 1996. Молекулярная биология. 30: 339-343.

120. SerkinaA., Gorozhankina Т., ShevelevA., Chestukhina G.G. Propeptide of metalloprotease of Brevibacillus brevis 7882 is a strong inhibitor of mature enzyme. // 1999. FEBSLett. 456: 215-219.

121. Kessler E., Safrin M., Gustin J.K., Ohman D.E. Elastase and the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa are secreted with their propeptides. // 1998. J. Biol. Chem. 273(46): 30225-30231.

122. Mclver K.S., Kessler E., Olson J., Ohman D.E. The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. // 1995. Mol. Microbiol. 18(5): 877-889.

123. Braun P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa.// 1996. Mol. Microbiol. 19(2): 297306.

124. Kessler E., Safrin M. Synthesis, processing, and transport of Pseudomonas aeruginosa elastase. // 1988. J. Bacterid. 170: 1215-1219.

125. Заболотская M.B., Носовская E.A., Каплун M.A., Цаплина И.А., Акимкина Т.В. Новая термостабильная протеиназа из Thermoactinomyces sp. 27а. Клонирование и экспрессия гена. // 2001. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1: 32-34.

126. Zabolotskaya М.V., Demidyuk I.V., Akimkina T.V., Kostrov S.V. A novel neutral protease from Thermoactinomyces species 27a: sequencing of the gene, purification, and characterization of the enzyme. // 2004. Prot. J. 23(7): 483-492.

127. David V.A., Deutch A.H., Sloma A., Pawlyk D., Ally A., Durham D.R. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the extracellular neutral protease, vibriolysin, of Vibrio proteolytics. // 1992. Gene. 112(1): 107-112.

128. HaseC.C., Finkelstein R.A., Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain. //1991. J. Bacteriol. 173(11): 3311-3317.

129. NorqvistA., NorrmanB., Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio angullarum. II 1990. Infect. Immun. 58(11): 3731-3736.

130. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., S hinoda S. Functional domains о fa zinc metalloproteinase from Vibrio vulnificus. // 1997. J. Bacteriol. 179(23): 7606-7609.

131. Tang В., Nirasawa S., KitaokaM., Hayashi K. In vitro stepwise autoprocessing of the proform of pro-aminopeptidase processing protease from Aeromonas caviae T-64. II 2002. Biochim. Biophys. Acta. 1596: 16-27.

132. Сорокин A.B., ХазакВ.Э. Экспрессионная единица в области инициации репликации плазмиды pSM19035 стрептококков. // 1990. Молекулярная биология. 24(4): 993-999.

133. Mierendorf R., Yeager К., Novy R. The pET system: your choice for expression. // 1994.News Letter of Novagen. 1(1): 1-3.

134. MBI Fermentas. Catalog and product application guide. // 1996-1997.

135. Avakov A.S., Bolotin А.Р., Sorokin A.V. Strukture of the Bacillus brevis metalloprotease gene. // 1990. Mol. Biol. (Most). 24: 1363-1372.

136. Anagnostopoulos C., SpizizienJ. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. // 1961.У. Bacteriol. 81: 741-746.

137. Маниатис E., Фрич Э. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. // 1984. Москва. Мир.

138. DagertM., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. // 1979. Gene. 6(1): 23-28.

139. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. // 1970. Nature. 227(5259): 680-685.

140. BredfordM.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. // 1976. Anal. Biochem. 72(1-2): 248-254.

141. Гаспаров B.C., Дягтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250. // 1994. Биохимия. 59(6): 763-777.

142. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. //1947. J. Biochem. 177: 501-505.

143. Люблинская Л.А., Ваганова Т.И., ПасхинаТ.С., Степанов В.М. 2,4-динитрофенил-производные пептидов — субстраты нового типа для определения активности протеолитических ферментов. Определение активности карбоксипептидаз. // 1973. Биохимия. 38(4): 790-795.

144. Юсупова М.П, КотловаЕ.К., Тимохина Е.А., Степанов В.М. Ферментативный синтез пептидов аргинина хромофорных субстратов металлопротеиназ и карбоксипептидаз. // 1995. Биооргапическая химия. 21(1): 3338.

145. Pholner J., Halter R., Beyreuther К., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. // 1987. Nature. 325(6103): 458-462.

146. YanagidaN., Uozumi Т., BeppuT. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the outer membrane of Escherichia coli. II 1986. J. Bacteriol. 166(3): 937-944.

147. Gray L., Mackman N., Nicaud J.M., Holland I.B. The carboxy-terminal region of haemolysin 2001 is required for secretion of the toxin from Eshcerichia coli. // 1986. Mol. Gen. Genet. 205(1): 127-133.

148. Лопатин C.A., Варламов В.П. Новые тенденции в металлохелат аффинной хроматографии беков. // 1995. Биохимия. 31(3): 259-266.