Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27a: Структура и свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Заболотская, Мария Васильевна

• Заболотская, Мария Васильевна
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Заболотская, Мария Васильевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная организация термолизин-подобных протеиназ.

1.1.1. Общая характеристика молекул термолизин-подобных протеиназ.

1.1.2. Организация активного центра.

1.1.3. Организация субстрат-связывающего кармана.

1.1.4. Организация сайтов связывания ионов Са2+.

1.2. Про-зависимый фолдинг термолизин-подобных протеиназ.

1.3. Молекулярные основы стабилизации термолизин-подобных протеиназ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Микробные штаммы и плазмиды.

2.2. Культивирование микроорганизмов.

2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.4. Выделение бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а.

2.5. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.6. Ферментативный гидролиз ДНК.

2.7. Конструирование библиотеки генов Thermoactinomyces species 27а.

2.8. Трансформация клеток Bacillus subtilis AJ73.

2.9. Трансформация клеток Escherichia coli TGI.

2.10. По л имеразная цепная реакция.

2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.12. Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммов-продуцентов.

2.13. Выделение рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а

2.14. Электрофоретический анализ белков.

2.15. Количественное определение белка.

2.16. Определение молекулярной массы белка.

2.17. Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

2.18. Определение протеолитической активности ферментов.

2.19. Влияние рН на стабильность фермента.

2.20. рН-Оптимум протеолитической активности.

2.21. Влияние температуры на стабильность фермента.

2.22. Температурный оптимум протеолитической активности.

2.23. Влияние ионов кальция на стабильность фермента.

2.24. Влияние ингибиторов.

2.25. Определение энзиматических констант фермента.

2.26. Локализация лидерного пептида.

2.27. Статистическая обработка данных.

2.28. Представление молекул.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

3.2. Характеристика клонированного фрагмента бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а, несущего ген металлопротеиназы.

3.3. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

3.4. Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

3.5. Характеристика рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27a: Структура и свойства»

Актуальность работы.

Протеолитические ферменты широко используются в современной биотехнологии. При этом физико-химические и энзиматические свойства даже тщательно подобранных биокатализаторов часто не оптимальны для конкретных технологических процессов. Успехи современной белковой инженерии позволяют рассчитывать на то, что в ближайшем будущем стандартным подходом станет конструирование ферментов с направленно модифицированными свойствами. Однако на настоящий момент наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, явно недостаточны. Для проведения исследований структурно-функциональной организации белков удобно использовать семейства родственных ферментов, отличающихся по своим физико-химическим свойствам. Такие наборы детально охарактеризованных белков с соответствующими клонированными генами позволяют проводить разнообразные эксперименты, направленные на анализ структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В этом плане актуален поиск новых природных ферментов с заданной специфичностью и конкретными характеристиками. С этой целью в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН проводится скрининг коллекций различных микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников. В результате анализа отобран ряд штаммов, которые являются продуцентами ферментов, интересных с научной точки зрения и перспективных для практического использования. Одним из таких штаммов является штамм Thermoactinomyces species 27а, который продуцирует термостабильные секреторные протеиназы, в том числе и металлопротеиназы. На данный момент протеолитические ферменты термоактиномицетов охарактеризованы недостаточно. Всё это определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и детальной характеристике металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-48281 и № 03-04-48755.

Цель работы.

Целью данной работы является клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а, установление нуклеотидной последовательности гена, выделение и очистка рекомбинантного фермента, физико-химическая и энзиматическая характеристика металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

Научная новизна.

Клонирован и экспрессирован в клетках Bacillus subtilis ген новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. Установлена нуклеотидная последовательность клонированного гена Thermoactinomyces sp. 27а. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а относится к семейству термолизин-подобных протеиназ. При этом фермент Thermoactinomyces sp. 27а обладает рядом специфических особенностей, таких как наличие уникальной протяженной

С-концевой аминокислотной последовательности и присутствие аминокислотных замен в

2+ сайтах связывания ионов Са . Выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния рекомбинантная металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а. Установлены физико-химические и энзиматические характеристики нового фермента Thermoactinomyces sp. 27а.

Показано протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в клетках Bacillus subtilis.

Практическая значимость.

Детально изученная новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а может быть использована в ряде биотехнологических процессов, например, при получении олигопептидов заданной структуры, а также является удобным объектом для исследования структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В настоящее время металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а применяется в качестве экспериментальной модели для изучения про-зависимого фолдинга термолизин-подобных протеиназ методами белковой инженерии в Институте молекулярной генетики РАН.

Положения, выносимые на защиту.

1. Клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, установление его нуклеотидной последовательности.

2. Выделение и очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3. Определение физико-химических и энзиматических характеристик новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

4. Протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы в клетках Bacillus subtilis.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Заболотская, Мария Васильевна

-83 -ВЫВОДЫ

1. Клонирован и экспрессирован в клетках бацилл ген новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, а также ряд генов сериновых протеиназ.

2. Определена нуклеотидная последовательность гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а и проведен анализ соответствующего белка. Показано, что фермент относится к семейству термолизин-подобных протеиназ, синтезируется в виде препробелка и состоит из лидерного пептида, N-концевой про-последовательности, зрелой части и дополнительной С-концевой аминокислотной последовательности. Локализован сайт N-концевого процессинга при созревании фермента.

3. Показано протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в клетках бацилл.

4. Получен высокоочшценный препарат рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. Установлены молекулярная масса, N-концевая аминокислотная последовательность, рН- и температурный оптимумы активности, рНи температурная стабильности фермента, отношение констант кса,/Кт по гидролизу

2+ субстрата ФАГЛА. Показано стабилизирующее действие ионов Са на металлопротеиназу Thermoactinomyces sp. 27а.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю доктору химических наук, профессору Кострову Сергею Викторовичу, за поддержку и внимание, оказанные в ходе выполнения работы. Автор выражает благодарность кандидату химических наук Акимкиной Татьяне Викторовне, кандидату химических наук Демидюку Илье Валерьевичу, кандидату биологических наук Носовской Елене Николаевне за помощь в работе и за участие в обсуждении полученных результатов, всем сотрудникам лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН за поддержку и дружеское отношение, а также своим родителям за всестороннюю помощь и понимание.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Заболотская, Мария Васильевна, 2004 год

1. Webb Е.С. // 1992. Enzyme nomenclature. 1st, 1 -862.

2. Hartley B.S. Proteolytic enzymes. // 1960. Annu. Rev. Biochem. 29: 45-72.

3. Matsubara H., Feder J. Other bacterial, mold, and yeast proteases. // 1971. The Enzymes. 3rd ed. (Boyer P.D., eds.) Academic Press. New York. 3: 721-792.

4. Barret A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. // 1998. Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press. Inc. New York. 1033-1064.

5. Latt S.A.,Holmquist В., Vallee B.L. Thermolysin: a zinc metalloenzyme. // 1969. Biochem. Biophys. Res. Comm. 37: 333-339.

6. Feder J., Garrett L.R., Wildi B.S. Studies on the role of calcium in thermolysin. // 1971. Biochemistry. 10: 4552-4556.

7. Veltman O.R., Vriend G., van den Burg В., Hardy F., Venema G., Eijsink V.G. Engineering thermolysin-like proteases whose stability is largely independent of calcium. // 1997. FEBSLett. 405(2): 241-244.

8. Feder J., Keay L., Garrett L.R., Cirulis N., Moseley M.H., Wildi B.S. Bacillus cereus neutral protease. //1971. Biochim. Biophys. Acta. 251(1): 74-78.

9. Feder J. Studies on the specificity of Bacillus subtilis neutral protease with synthetic substrates. // 1967. Biochemistry. 6(7): 2088-2093.

10. Feder J., Schuck J.M. Studies on the Bacillus subtilis neutral-protease- and Bacillus thermoproteolyticus thermolysin-catalyzed hydrolysis of dipeptide substrates. // 1970. Biochemistry. 9(14): 2784-2791.

11. O'Donohue M.J., Roques B.P., Beaumont A. Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin. // 1994. Biochem. J. 300: 599-603.

12. Titani K., Hermodson M.A., Ericsson L.H., Walsh K.A., Neurath H. Amino-acid sequence of thermolysin. // 1972. Nature New Biol. 238: 35-37.

13. Wetmore D.R., Wong S.L., Roche R.S. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. II 1992. Mol. Microbiol. 6(12): 1593-1604.

14. Kuhn S., Fortnagel P. Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding a calcium-dependent exoproteinase from Bacillus megaterium ATCC 14581. // 1993. J. Gen. Microbiol. 139(1): 39-47.

15. Abakov A.S., Bolotin A.P., Sorokin A.V. Structure of the Bacillus brevis metalloprotease gene. // 1990. Mol. Biol. (Mosk). 24(5): 1363-1372.

16. Takekawa S., Uozumi N., Tsukagoshi N., Udaka S. Proteases involved in generation of beta- and alpha-amylases from a large amylase precursor in Bacillus polymyxa. // 1991. J. Bacteriol. 173(21): 6820-6825.

17. Tran L., Wu X.C., Wong S.L. Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis. II 1991. J. Bacteriol. 173(20): 6364-6372.

18. Yang M.Y., Ferrari E., Henner D.J. Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation. II 1984. J. Bacteriol. 160(1): 15-21.

19. Weaver L.H., Kester W.R., Matthews B.W. A crystallographic study of the complex of phosphoramidon with thermolysin. A model for the presumed catalytic transition state and for the binding of extended substrates. // 1977. J. Mol. Biol. 114: 119-132.

20. Holmes M.A., Matthews B.W. Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution. // 1982. J. Mol. Biol. 160: 623-639.

21. Stark W., Pauptit R.A., Wilson K.S., Jansonius J.N. The structure of neutral protease from Bacillus cereus at 0.2-nm resolution. // 1992. Eur. J. Biochem. 207(2): 781-791.

22. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5 A resolution. // 1991. J. Biol. Chem. 266: 2864-2871.

23. Banbula A., Potempa J., Travis J., Fernandez-Catalan C., Mann K., Huber R., Bode W., Medrano F.J. Amino-acid sequence and three-dimensional structure of the Staphylococcus aureus metalloproteinase at 1.72 A resolution. // 1998. Structure. 6:1185-1193.

24. Vriend G., Eijsink V. Prediction and analysis of structure, stability and unfolding ofthermolysin-like proteases. // 1993. J. Comput. Aided Mol. Des. 7(4): 367-396.

25. Eijsink V.G., Vriend G., van den Burg В., Venema G., Stulp B.K. Contribution of the C-terminal amino acid to the stability of Bacillus subtilis neutral protease. // 1990. Protein Eng. 4(1): 99-104.

26. Tsuru D., Imajo S., Morikawa S., Yoshimoto Т., Ishiguro M. Zinc protease of Bacillus subtilis var. amylosacchariticus: construction of a three-dimensional model and comparison with thermolysin.// 1993. J. Biochem. (Tokyo). 113(1): 101-105.

27. Jin Y., Kim D.H. Inhibition stereochemistry of hydroxamate inhibitors for thermolysin. // 1998. Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(24): 3515-3518.

28. Kester W.R., Matthews B.W. Crystallographic study of the binding of dipeptide inhibitors to thermolysin: implications for the mechanism of catalysis. // 1977. Biochemistry. 16(11): 2506-2516.

29. Monzingo A.F., Matthews B.W. Structure of a mercaptan-thermolysin complex illustrates mode of inhibition of zinc proteases by substrate-analogue mercaptans. // 1982. Biochemistry. 21(14): 3390-3394.

30. Argos P., Garavito R.M., Eventoff W., Rossmann M.G., Branden C.I. Similarities in active center geometries of zinc-containing enzymes, proteases and dehydrogenases. // 1978. J. Mol. Biol. Dec. 126(2): 141-158.

31. Vallee B.L., Auld D.S. Zinc coordination, function, and structure of zinc enzymes and other proteins. //1990. Biochemistry. 29(24): 5647-5659.

32. Hausrath A.C., Matthews B.W. Redetermination and refinement of the complex of benzylsuccinic acid with thermolysin and its relation to the complex with carboxypeptidase A. // 1994.J.Biol. Chem. 269(29): 18839-18842.

33. Антонов B.K. Химия протеолиза. //1991. Москва. "Наука"

34. Beaumont A., O'Donohue M.J., Paredes N., Rousselet N., Assicot M., Bohuon C., Fournie-Zaluski M.C., Roques B.P. The role of histidine 231 in thermolysin-like enzymes. A site-directed mutagenesis study. // 1995. J. Biol. Chem. 270(28): 16803-16808.

35. Toma S., Campagnoli S., De Gregoriis E., Gianna R., Margarit I., Zamai M., Grandi G. Effect of Glu-143 and His-231 substitutions on the catalytic activity and secretion of Bacillus subtilis neutral protease. // 1989. Protein Eng. 2(5): 359-364.

36. Matthews B.W. Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. // 1988. Acc. Chem. Res. 21: 333-340.

37. Hangauer D.G., Monzingo A.F., Matthews B.W. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. // 1984. Biochemistry. 23(24): 5730-5741.

38. Степанов И.М. Структура и функции белков. // 1996. Москва. "Высшая школа"

39. Voordouw G., Milo C., Roche R.S. Role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ion contributions to the kinetic thermal stability. //1976. Biochemistry. 15(17): 3716-3724.

40. Corbett R.J., Ahmad F., Roche R.S. Domain unfolding and the stability of thermolysin in guanidine hydrochloride. // 1986. Biochem. Cell. Biol. 64(10): 953-961.

41. СеркинаА.В., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериаьных протеиназ. // 2001. Биоорг. хим. 27(5): 323-346.

42. Shinde U., Inouye М. Intramolecular chaperones: polypeptide extensions that modulate protein folding. // 2000. Semin. Cell Dev. Biol. 11(1): 35-44.

43. Eder J., Fersht A.R. Pro-sequence-assisted protein folding. // 1995. Mol. Microbiol. 16(4): 609-614.

44. Ikemura H., Takagi H., Inouye M. Requirement of pro-sequence for the production ofactive subtilisin E in Escherichia coli. II 1987. J. Biol. Chem. 262(16): 7859-7864.

45. Shinde U., Inouye M. Propeptide-mediated folding in subtilisin: the intramolecular chaperone concept. // 1996. Adv. Exp. Med. Biol. 379: 147-154.

46. Baardsnes J., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J., Borgford T. Streptomyces griseus protease B: secretion correlates with the length of the propeptide. // 1998. J. Bacteriol. 180(12): 3241-3244.

47. Braun P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. II 1996. Mol. Microbiol. 19(2): 297-306.

48. Silen J.L., Agard D.A. The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. II 1989. Nature. 341(6241): 462-464.

49. Takagi H., Koga M., Katsurada S., Yabuta Y., Shinde U., Inouye M., Nakamori S. Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones. // 2001. FEBS Lett. 508(2): 210-214.

50. Winther J.R., Sorensen P. Propeptide of carboxypeptidase Y provides a chaperone-like function as well as inhibition of the enzymatic activity. //1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88(20): 9330-9334.

51. Koelsch G., Mares M., Metcalf P., Fusek M. Multiple functions of pro-parts of aspartic proteinase zymogens. // 1994. FEBS Lett. 343(1): 6-10.

52. Van den Hazel H.B., Kielland-Brandt M.C., Winther J.R. The propeptide is required for in vivo formation of stable active yeast proteinase A and can function even when not covalently linked to the mature region. // 1993. 268(24): 18002-18007.

53. Zhu X.L., Ohta Y., Jordan F., Inouye M. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. // 1989. Nature. 339(6224): 483-484.

54. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M. Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as an intramolecular chaperone for protein folding. Refolding and inhibitory abilities of propeptide mutants. // 1995. J. Biol. Chem. 270(42): 25127-25132.

55. Ruan В., Hoskins J., Bryan P.N. Rapid folding of calcium-free subtilisin by a stabilized pro-domain mutant. // 1999. Biochemistry. 38(26): 8562-8571.

56. Shinde U.P., Liu J.J., Inouye M. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. //1997. Nature. 389(6650): 520-522.

57. Wang L., Ruan В., Ruvinov S., Bryan P.N. Engineering the independent folding of the subtilisin BPN' pro-domain: correlation of pro-domain stability with the rate of subtilisin folding. // 1998. Biochemistry. 37(9): 3165-3171.

58. Buevich A.V., Shinde U.P., Inouye M., Baum J. Backbone dynamics of the natively unfolded pro-peptide of subtilisin by heteronuclear NMR relaxation studies. // 2001. J. Biomol. NMR. 20(3): 233-249.

59. Strausberg S., Alexander P., Wang L., Schwarz F., Bryan P. Catalysis of a protein folding reaction: thermodynamic and kinetic analysis of subtilisin BPN' interactions with its propeptide fragment. // 1993. Biochemistry. 32(32): 8112-8119.

60. Bryan P., Alexander P., Strausberg S., Schwarz F., Lan W., Gilliland G., Gallagher D.T. Energetics of folding subtilisin BPN'. // 1992. Biochemistry. 31(21): 4937-4945.

61. Ваганова Т.И., Медведева Н.П., Степанов В.М. Ренатурация бактериальных металлопротеиназ. // 1993. Биохимия. 58(6): 913-920.

62. Matsubara М., Kurimoto Е., Kojima S., Miura К., Sakai Т. Achievement of renaturation of subtilisin BPN' by a novel procedure using organic salts and a digestible mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor. // 1994. FEBS Lett. 342(2): 193-196.

63. Ohta Y., Hojo H., Aimoto S., Kobayashi Т., Zhu X., Jordan F., Inouye M. Pro-peptide as an intramolecular chaperone: renaturation of denatured subtilisin E with a synthetic pro-peptide. //1991. Mol. Microbiol. 5(6): 1507-1510.

64. Птицын О.Б. Сворачивание белков: нуклеация и компактные интермедиаты. // 1998. Биохимия. 63(4): 435-443.

65. Egnell P., Flock J.I. The autocatalytic processing of the subtilisin Carlsberg pro-region is independent of the primary structure of the cleavage site. // 1992. Mol. Microbiol. 6(9): 1115-1119.

66. Kobayashi Т., Inouye M. Functional analysis of the intramolecular chaperone. Mutational hot spots in the subtilisin pro-peptide and a second-site suppressor mutation within the subtilisin molecule. //1992. J. Mol. Biol. 226(4): 931-933.

67. Shinde U., Fu X., Inouye M. A pathway for conformational diversity in proteins mediated by intramolecular chaperones.// 1999. J. Biol. Chem. 274(22): 15615-15621.

68. Agard D. To fold or not to fold. // 1993. Science. 260(5116): 1903-1904.

69. Wandersman C. Secretion, processing and activation of bacterial extracellular proteases. // 1989. Mol. Microbiol. 3(12): 1825-1831.

70. Gallagher Т., Gilliland G., Wang L., Bryan P. The prosegment-subtilisin BPN' complex: crystal structure of a specific "foldase". // 1995. Structure. 3(9): 907-914.

71. Jain S.C., Shinde U., Li Y., Inouye M., Berman H.M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221 Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. // 1998. J. Mol. Biol. 284(1): 137-144.

72. Power S.D., Adams R.M., Wells J.A. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin. // 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83(10): 3096-3100.

73. Серкина A.B., Бушуева A.M., Честухина Г.Г., Гумперт Й., Хойшен К., Куяу М., Шевелев А.Б. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. licheniformis и изучение его процессинга in vitro. II2001. Вопр. мед. хим. 47(1): 111-122.

74. Chang S.C., Chang P.C., Lee Y.H. The roles of propeptide in maturation and secretion of Npr protease from Streptomyces. II1994. J. Biol. Chem. 269(5): 3548-3554.

75. Takagi M., Imanaka T. Role of the pre-pro-region of neutral protease for the secretion in Bacillus subtilis. И 1989. J. Ferment. Bioeng. 67(2): 71-76.

76. O'Donohue M.J., Beaumont A. The role of the prosequense of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. II1996. J. Biol. Chem. 271(43): 26477-26481.

77. Marie-Claire C., Roques B.R., Beaumont A. Intramolecular processing of prothermolysin. //1998. J. Biol.Chem. 273(10): 5697-5701.

78. Schlechter Т., Berger A. On the size of the active site in proteases. // 1967. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27(2): 157-162.

79. Nosoh Y., Sekiguchi T. Protein engineering for thermostability. // 1990. Trends Biotechnol. 8(1): 16-20.

80. Branden C., Tooze J. Introduction to Protein Structure. // 1999. 2nd Edition. Garland Publishing. Inc. New York.

81. Tucker P.W., Perutz M.F. Mechanism of charge compensation and impairment of co-operative functions in haemoglobin Tacoma (Arg B12(30)beta leads to Ser). // 1977. J. Mol. Biol. 114(3): 415-420.

82. Serrano L., FershtA.R. Capping and alpha-helix stability. // 1989. Nature. 342(6247): 296-299.

83. Matthews B.W., Nicholson H., Becktel W.J. Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. // 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84(19): 6663-6667.

84. Matsumura M., Signor G., Matthews B.W. Substantial increase of protein stability by multiple disulphide bonds. // 1989. Nature. 342(6247): 291-293.

85. Matsumura M., Becktel W.J., Levitt M., Matthews B.W. Stabilization of phage T4 lysozyme by engineered disulfide bonds. // 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86(17): 6562-6566.

86. Mitchinson C., Wells J.A. Protein engineering of disulfide bonds in subtilisin BPN'. // 1989. Biochemistry. 28(11): 4807-4815.

87. Cunningham B.C., Wells J.A. Improvement in the alkaline stability of subtilisin using an efficient random mutagenesis and screening procedure. // 1987. Protein Eng. 1(4): 319-325.

88. Pantoliano M.W., Whitlow M., Wood J.F., Dodd S.W., Hardman K.D., Rollence M.L., Bryan P.N. Large increases in general stability for subtilisin BPN' through incremental changes in the free energy of unfolding. // 1989. Biochemistry. 28(18): 7205-7213.

89. Argos P., Rossman M.G., Grau U.M., Zuber H., Frank G., Tratschin J.D. Thermal stability and protein structure. // 1979. Biochemistry. 18(25): 5698-5703.

90. Olsen K.W. Structural basis for the thermal stability of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases. // 1983. Int. J. Pept. Protein Res. 22(4): 469-475.

91. Imanaka Т., Shibazaki M., Takagi M. A new way of enhancing the thermostability of proteases. // 1986. Nature. 324(6098): 695-697.

92. Menendez-Arias L., Argos P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics point to residue substitutions in alpha-helices. // 1989. J. Mol. Biol. 206(2): 397-406.

93. Mrabet N.T., van den Broeck A., van den Brande I., Stanssens P., Laroche Y., Lambeir A.M., Matthijssens G., Jenkins J., Chiadmi M., van Tilbeurgh H., et al. Arginine residues as stabilizing elements in proteins. //1992. Biochemistry. 31(8): 2239-2253.

94. Perutz M.F., Raidt H. Stereochemical basis of heat stability in bacterial ferredoxins and in haemoglobin A2. // 1975. Nature. 255(5505): 256-259.

95. Ruegg C., Ammer D., Lerch K. Comparison of amino acid sequence and thermostability of tyrosinase from three wild type strains of Neurospora crassa. II 1982. J. Biol. Chem. 257(11): 6420-6426.

96. Zuber H. Temperature adaptation of lactate dehydrogenase. Structural, functional and genetic aspects. // 1988. Biophys. Chem. 29(1-2): 171-179.

97. Fontana A. Structure and stability of thermophilic enzymes. Studies on thermolysin. // 1988. Biophys. Chem. 29(1-2): 181-193.

98. Marino G., Nitti G., Arnone M.I., Sannia G., Gambacorta A., DeRosaM. Purification and characterization of aspartate aminotransferase from the thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus. // 1988. J. Biol. Chem. 263(25): 12305-12309.

99. Querol E., Perez-Pons J.A., Mozo-Villarias A. Analysis of protein conformational characteristics related to thermostability. // 1996. Protein Eng. 9(3): 265-271.

100. Leatherbarrow R.J., Fersht A.R. Protein engineering. // 1986. Protein Eng. 1(1): 7-16.

101. Knowles J.R. Tinkering with enzymes: what are we learning? // 1987. Science. 236(4806): 1252-1258.

102. Ohmura Т., Ueda Т., Ootsuka K., Saito M., Imoto T. Stabilization of hen egg white lysozyme by a cavity-filling mutation. // 2001. Protein Sci. 10(2): 313-320.

103. Mark A.E., van Gunsteren W.F. Simulation of the thermal denaturation of hen egg white lysozyme: trapping the molten globule state. // 1992. Biochemistry. 31(34): 7745-7748.

104. Caflisch A., Karplus M. Molecular dynamics simulation of protein denaturation: solvation of the hydrophobic cores and secondary structure of barnase. // 1994. Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 91(5): 1746-1750.

105. Schwartz R.M., Dayhoff M.O. Matrices for detecting distant relationships. // 1978. Atlas of Protein Sequence and Structure. Ed. M.O. Dayhoff. Natl. Biomed. Res. Found. Washington. DC. 5(3): 353-358.

106. Arnold F.H., Zhang J.H. Metal-mediated protein stabilization. // 1994. Trends Biotechnol. 12(5): 189-192.

107. Dahlquist F.W., Long J.W., Bigbee W.L. Role of Calcium in the thermal stability of thermolysin. //1976. Biochemistry. 15(5): 1103-1 111.

108. Wells J.A., Powers D.B. In vivo formation and stability of engineered disulfide bonds in subtilisin. // 1986. J. Biol. Chem. 261(14): 6564-6570.

109. Van den Burg В., Eijsink V.G., Stulp B.K., Venema G. Identification of autodigestion target sites in Bacillus subtilis neutral proteinase. // 1990. Biochem. J. 272(1): 93-97.

110. Eijsink V.G., van den Burg В., Vriend G., Berendsen H.J., Venema G. Thermostability of Bacillus subtilis neutral protease. //1991. Biochem Int. 24(3): 517-525.

111. Pace C.N., Shaw K.L. Linear extrapolation method of analyzing solvent denaturation curves. // 2000. Proteins. 4: 1-7.

112. Creighton Т.Е. Protein folding. // 1990. Biochem J. 270(1): 1-16.

113. Pace C.N. Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. // 1986. Methods Enzymol. 131: 266-280.

114. Pace C.N. Measuring and increasing protein stability. // 1990. Trends Biotechnol. 8(4): 93-98.-95138. Becktel W.J., Baase W.A. Thermal denaturation of bacteriophage T4 lysozyme at neutral pH. // 1987. Biopolymers. 26(5): 619-623.

115. Becktel W.J., Schellman J.A. Protein stability curves. // 1987. Biopolymers. 26(11): 1859-1877.

116. Kidokoro S., Miki Y., Endo K., Wada A., Nagao H., Miyake Т., Aoyama A., YoneyaT., Kai K., Ooe S. Remarkable activity enhancement of thermolysin mutants. // 1995. FEBSLett. 367(1): 73-76.

117. Braxton S., Wells J.A. Incorporation of a stabilizing Ca(2+)-binding loop into subtilisin BPN'. // 1992. Biochemistry. 31(34): 7796-7801.

118. Eijsink V.G., Vriend G., van der Vinne В., Hazes В., van den Burg В., Venema G. Effects of changing the interaction between subdomains on the thermostability of Bacillus neutral proteases. //1992. Proteins. 14(2): 224-236.

119. Rashin A.A., Iofin M., Honig B. Internal cavities and buried waters in globular proteins. // 1986. Biochemistry. 25(12): 3619-3625.

120. Voorintholt R., Kosters M.T., Vegter G., Vriend G., Hoi W.G. A very fast program for visualizing protein surfaces, channels and cavities. //1989. J. Mol. Graph. 7(4): 243-245.

121. Shortle D., Stites W.E., Meeker A.K. Contributions of the large hydrophobic amino acids to the stability of staphylococcal nuclease. // 1990. Biochemistry. 29(35): 8033-8041.

122. Kellis J.T. Jr., Nyberg K., Sali D., Fersht A.R. Contribution of hydrophobic interactions to protein stability. // 1988. Nature. 333(6175): 784-786.

123. Eriksson A.E., Baase W.A., Zhang X.J., Heinz D.W., Blaber M., Baldwin E.P., Matthews B.W. Response of a protein structure to cavity-creating mutations and its relation to the hydrophobic effect. // 1992. Science. 255(5041): 178-183.

124. Karpusas M., Baase W.A., Matsumura M., Matthews B.W. Hydrophobic packing in T4 lysozyme probed by cavity-filling mutants. // 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86(21): 8237-8241.

125. Matsumura M., Becktel W.J., Matthews B.W. Hydrophobic stabilization in T4 lysozyme determined directly by multiple substitutions of Ile3. // 1988. Nature. 334(6181): 406-410.

126. Eijsink V.G., van der Zee J.R., van den Burg В., Vriend G., Venema G. Improving the thermostability of the neutral protease of Bacillus stearothermophilus by replacing a buried asparagine by leucine. //1991. FEBS Lett. 282(1): 13-16.

127. Vriend G., Berendsen H.J., van der Zee J.R., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. Stabilization of the neutral protease of Bacillus stearothermophilus by removal of a buried water molecule. //1991. Protein Eng. 4(8): 941-945.

128. Eijsink V.G., Vriend G., van der Zee J.R., van den Burg В., Venema G. Increasing the thermostability of the neutral proteinase of Bacillus stearothermophilus by improvement of internal hydrogen-bonding. // 1992. Biochem. J. 285(2): 625-628.

129. Margarit I., Campagnoli S., Frigerio F., Grandi G., De Filippis V., Fontana A. Cumulative stabilizing effects of glycine to alanine substitutions in Bacillus subtilis neutral protease. //1992. Protein Eng. 5(6): 543-550.

130. Hardy F., Vriend G., Veltman O.R., van der Vinne В., Venema G., Eijsink V.G. Stabilization of Bacillus stearothermophilus neutral protease by introduction of prolines. //1993. FEBS Lett. 317(1-2): 89-92.

131. Nakamura S., Tanaka Т., Yada R.Y., Nakai S. Improving the thermostability of Bacillus stearothermophilus neutral protease by introducing proline into the active site helix. // 1997. Protein Eng. 10(11): 1263-1269.

132. Hardy F., Vriend G., van der Vinne В., Frigerio F., Grandi G., Venema G., Eijsink V.G. The effect of engineering surface loops on the thermal stability of Bacillus subtilis neutral protease. // 1994. Protein Eng. 7(3): 425-430.

133. Eijsink V.G., Vriend G., van den Burg В., van der Zee J.R., Veltman O.R., Stulp B.K., Venema G. Introduction of a stabilizing 10 residue beta-hairpin in Bacillus subtilis neutral protease. // 1992. Protein Eng. 5(2): 157-163.

134. Van den Burg В., Dijkstra B.W., Vriend G., van der Vinne В., Venema G., Eijsink V.G. Protein stabilization by hydrophobic interactions at the surface. // 1994. Eur. J. Biochem. 220(3): 981-985.

135. Van den Burg В., Dijkstra B.W., van der Vinne В., Stulp B.K., Eijsink V.G., Venema G. Introduction of disulfide bonds into Bacillus subtilis neutral protease. // 1993. Protein Eng. 6(5): 521-527.

136. Van den Burg В., Eijsink V.G., Vriend G., Veltman O.R., Venema G. Rendering one autolysis site in Bacillus subtilis neutral protease resistant to cleavage reveals a new fission. // 1998. Biotechnol. Appl. Biochem. 27(2): 125-132.

137. Veltman O.R., Vriend G., Hardy F., Mansfeld J., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. Mutational analysis of a surface area that is critical for the thermal stability of thermolysin-like proteases. // 1997. Eur. J. Biochem. 248(2): 433-440.

138. Mansfeld J., Vriend G., Dijkstra B.W., Veltman O.R., van den Burg В., Venema G., Ulbrich-Hofmann R., Eijsink V.G. Extreme stabilization of a thermolysin-like protease by an engineered disulfide bond. // 1997. J. Biol. Chem. 272(17): 11152-11156.

139. Vriend G., Berendsen H.J., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. Early steps in the unfolding of thermolysin-like proteases. // 1998. J. Biol. Chem. 273(52): 35074-35077.

140. Van den Burg В., Vriend G., Veltman O.R., Venema G., Eijsink V.G. Engineering an enzyme to resist boiling. // 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(5): 2056-2060.

141. Eijsink V.G., Veltman O.R., Aukema W., Vriend G., Venema G. Structural determinants of the stability of thermolysin-like proteinases. // 1995. Nat. Struct. Biol. 2(5): 374-379.

142. Marshall C.J. Cold-adapted enzymes. // 1997. Trends Biotechnol. 15(9): 359-364.

143. Danson M.J., Hough D.W., Russell R.J., Taylor G.L., Pearl L. Enzyme thermostability and thermoactivity. // 1996. Protein Eng. 9(8): 629-630.

144. Сорокин A.B., Хазак В.Э. Экспрессионная единица в области инициации репликации плазмиды pSM19035 стрептококков. // 1990. Молекулярная биология. 24(4): 993-999.

145. MBI Fermentas. Catalog and product application guide. // 1996-1997.-98177. Anagnostopoulos С., Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. II 1961 .J. Bacteriol. 81: 741-746.

146. Маниатис Т., Фрич Э. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. // 1984. Москва. Мир.

147. Dagert М., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. // 1979. Gene. 6(1): 23-28.

148. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. // 1970. Nature. 227(5259): 680-685.

149. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. // 1976. Anal. Biochem. 72(1-2): 248-254.

150. Гаспаров B.C., Дягтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250. //1994. Биохимия. 59(6): 763-777.

151. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. // 1947. J. Biochem. 177: 501-505.

152. Feder J. A spectrophotometry assay for neutral protease. // 1968. Biochem. Biophys. Res. Commun. 32(2): 326-332.

153. Khan S.M, Darnall D.W. The hydrolysis of 3-(2-furylacryloyl)-glycyl-l-leucine amide by thermolysin. // 1978. Anal. Biochem. 86(1): 332-336.

154. Inouye K. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysin. // 1992. J. Biochem. (Tokyo). 112(3): 335-340.

155. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S., von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. // 1997. Protein Eng. 10(1): 1-6.

156. Watson M.E. Compilation of published signal sequences. // 1984. Nucleic Acids Res. 12(13): 5145-5164.

157. Smith H., de Jong A., Bron S., Venema G. Characterization of signal-sequence-coding regions selected from the Bacillus subtilis chromosome. // 1988. Gene. 70(2): 351-361.

158. David V.A., Deutch A.H., Sloma A., Pawlyk D., Ally A., Durham D.R. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the extracellular neutral protease, vibriolysin, of Vibrioproteolyticus. II 1992. Gene. 112(1): 107-112.

159. Miyoshi S., Sonoda Y., Wakiyama H., Rahman M.M., Tomochika K., Shinoda S., Yamamoto S., Tobe K. An exocellular thermolysin-like metalloprotease produced by

160. Vibrio fluvialis: purification, characterization, and gene cloning. // 2002. Microb. Pathog. 33(3): 127-134.

161. Hase C.C., Finkelstein R.A. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain. //1991./. Bacteriol. 173(11): 3311-3317.

162. Norqvist A., Norrman В., Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio anguillarum. II 1990. Infect. Immun. 58(11): 3731-3736.

163. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., Shinoda S. Functional domains of a zinc metalloprotease from Vibrio vulnificus. II 1997. J. Bacteriol. 179(23): 7606-7609.

164. Pohlner J., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. // 1987. Nature. 325(6103): 458-462.

165. Yanagida N., Uozumi Т., Beppu T. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the outer membrane of Escherichia coli. II1986. J. Bacteriol. 166(3): 937-944.

166. Gray L., Mackman N., Nicaud J.M., Holland I.B. The carboxy-terminal region of haemolysin 2001 is required for secretion of the toxin from Escherichia coli. II 1986. Mol. Gen. Genet. 205(1): 127-133.

167. Pugsley A.P. // 1988. Protein transfer and Organelle Biogenesis. (Das R.A., Robins P.W., eds). Academic Press. Orlando. FL. 607-652.

168. Шагинян К.А., Изотова JI.С., Йомантас Ю.В., Стронгин А.Я., Степанов В.М. Металлопротеиназа из Bacillus subtilis внеклеточный и внутриклеточный ферменты. // 1980. Биохимия. 45(11): 2083-2095.

169. Takii Y., Tagushi Н., Shimoto Н., Suzuki Y. Bacillus stearothermophilus KP 1236 neutral protease with strong thermostability comparable to thermolysin. // 1987. Appl. Microbiol, and Biotechnol. 27(2): 186-191.

170. Паберит Н.Ю., Панк M.C., Лийдере M.A., Ванаталу К.П. Очистка и свойства нейтральной мтеллопротеиназы из термофильной бактерии Bacillus brevis. II 1984. Биохимия. 49(2): 275-284.

171. Sidler W., Kumpf В., Peterhaus В., Zuber H. A neutral proteinase produced by Bacillus cereus with high sequence homology to thermolysin: production, isolation and characterization. // 1986. Appl. Microbiol, and Biotechnol. 25(1): 18-24.

172. Sohoni S.S., Joshi P.N. Isolation fnd characterization of a protease from Bacillus subtilis. II 1982. Indian J. Biochem. Biophys. 19(6): 399-402.

173. Морозова И.П., Юсупова М.П., Гололобов М.Ю., Королькова Н.К., Ходова О.М., Степанов В.М. Металлопротеиназа Bacillus mesentericus штамм В-313. // 1993. Биохимия. 58(9): 1420-1429.

174. Inouye К., Lee S.B, Tonomura В. Effect of amino acid residues at the cleavable site of substrates on the remarkable activation of thermolysin by salts. // 1996. Biochem. J. 315(1): 133-138.