Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Шевелев, Алексей Борисович

• Шевелев, Алексей Борисович
• доктор биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации доктор биологических наук Шевелев, Алексей Борисович

Список сокращений

1. Введение. Цели и задачи исследования

2. Обзор литературы. Секреция белков у Bacillus subtilis. Свойства 10 секреторных белков

2.1. Введение

2.2. Какие белки секретируются?

2.3. Структура сигнального пептида в целом

2.4. Классификация сигнальных пептидов

2.4.1. Идентификация сигнальных пептидов методом 17 компьютерного предсказания

2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся по 22 главному секреторному пути (Бес-система)

2.4.3. Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя 23 аргининовыми остатками (RR-мотив)

2.4.4. Сигнальные пептиды липопротеинов

2.4.5. Сигнальные пептиды препилин-подобных белков

2.4.6. Сигнальные пептиды бактериоцинов и феромонов

2.5. Количество транспортируемых белков

2.6. See-зависимая секреторная система

2.6.1. Цитозольные шапероны

2.6.1.1. Шапероны, специфически участвующие в секреции

2.6.1.2. Шапероны широкого спектра действия

2.6.2. Транслоказа

2.6.3. Сигнальные пептидазы типа I

2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой типа II

2.6.5. Пептидазы сигнальных пептидов

2.6.6. Внецитоплазматические катализаторы фолдинга белков 52 2.6.6.1 .Петидил-пролил цис-транс изомеразы

2.6.6.2. Тиол-дисульфид оксидоредуктазы

2.6.6.3. Пропептиды

2.6.6.4. Другие катализаторы фолдинга (небелковой природы)

2.7. Контроль качества транспортируемых белков

2.8. Бес-независимый экспорт белков

2.8.1. Tat-система транспорта

2.8.2. Система экспорта препилин-подобных белков 64 ' 2.8.3. ABC-система транспорта

2.9. Роль пропептида в секреции белков

2.10. Экспорт белков, локализованных в клеточной стенке

2.10.1. Сигналы для удержания белков в клеточной стенке

2.10.2. Белки, ковалентно связыванные с клеточной стенкой

2.11. Транспорт белков во время споруляции

2.11.1. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции

2.11.2. Факторы, участвующие в споруляционно-зависимом 77 транспорте белков

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Методы

3.2.1. Выделение плазмидной ДНК по модифицированному 81 методу Бирнбойма- Долли

3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3.2.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля методом 82 Gene clean

3.2.4. Трансформация L-форм

3.2.5. Адаптация культур L-форм к росту в жидкой среде

3.2.6. Ферментация рекомбинантных штаммов L-форм- 83 продуцентов GseBL и СрТ

3.2.7. Анализ экспрессии рекомбинантных генов gseBL и cpt в 83 клетках L-форм P. mirabilis

3.2.8. SDS-электрофорез в ПААГ

3.2.9. Иммуноферментный анализ методом Вестерн-блоттинга

3.2.10. Анализ аминокислотных последовательностей

3.2.11. Определение активности глутамилэндопептидазы GseBL

3.2.12. Определение активности карбоксипептидазы Т

3.2.13. Протеолитическая активация предшественника GseBL

3.2.14. Выделение предшественника GseBL из культуральной 85 жидкости L-форм

3.2.15. Выделение СрТ из культуральной жидкости L-форм 86 P. mirabilis

3.2.16. Процессинг секреторной формы СрТ in vitro

3.2.17. Трансформация клеток Е. coll Ферментация $6 рекомбинантных штаммов Е. coli - продуцентов предшественников GseBL и СрТ в виде тел включения

3.2.18. Ренатурация предшественников протеиназ, полученных в 87 виде тел включения

3.2.19. Трансформация клеток В. subtilis методом Спицайзена

3.2.20. Ферментация рекомбинантных штаммов В. subtilis - 88 продуцентов GseBL и СрТ

3.2.21. Выделение геномной ДНК из клеток В. subtilis и Т. vulgaris

3.2.22. Разработка нового вектора pLF для экспрессии генов 88 протеиназ в В. subtilis

3.2.23. Экспрессия генов глутамилэндопептидаз в В. subtilis на 91 основе разработанного вектора pLF

3.2.24. Использование мини-гена, кодирующего пентапептид 93 устойчивости к эритромицину, в качестве транскрипционного репортера в клетках В. subtilis и L-формах P. mirabilis

4. Результаты и обсуждение

4.1. Разработка векторных систем для клонирования в бациллах

4.2. Гены 8-эндотоксинов В. thuringiensis

4.3. Исследование генов новых секреторных ферментов бацилл

4.4. Изучение структуры и механизма процессинга 154 предшественников секреторных протеиназ бацилл in vitro

4.5. Разработка промышленных продуцентов секреторных 166 ферментов на базе бацилл с использованием генов-регуляторов секреторного аппарата

5. Выводы

6. Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов»

Достигнутый в последние десятилетия стремительный прогресс биотехнологии, в частности, микробиологического производства промышленных ферментов сделал бациллы одним из наиболее значимых для человека объектов живой природы, поставив их в один ряд с сельскохозяйственными животными и растениями, пекарскими дрожжами, мицелиальными грибами и актиномицетами. Иллюстрируя экономическую значимость бацилл, достаточно сказать, что объем мирового производства только препаратов а-амилазы, синтезируемых штаммами Bacillus amyloliquefaciens, в 2003 г достиг 800 тыс. тонн. Рыночная стоимость этого продукта составляет около 20 млрд. долл. Этот фермент, бесспорно, играет ключевую роль в решении проблемы разработки экономически оправданного способа синтеза топливного этанола, что в свою очередь, способно снизить зависимость экономически развитых стран от импорта нефти, решить множество глобальных социально-экономических, политических и экологических проблем. Наряду с а-амилазой, бациллы являются основными продуцентами щелочной и нейтральной протеаз, которые служат основой десятков наиболее современных технологий глубокой переработки сырья в пищевой промышленности, при синтезе моющих средств и получении новых материалов.

Уникальной особенностью бацилл с точки зрения биотехнологии является их непревзойденная способность к секреции белка во внешнюю среду в сочетании с эффективной утилизацией дешевых низкоочищенных полимерных субстратов, таких, как зерновая мука, растительная и дрожжевая биомасса в сочетании с минеральными источниками азота. Бациллы обладают мощным потенциалом аэробного метаболизма в сочетании с экзогидролазной активностью, позволяющим им стремительно расти, без потерь конвертируя субстраты в целевой продукт. Биотехнология не знает других объектов, способных в течение 30 часовой ферментации накапливать в среде до 40 г/л целевого белка.

По мере развития технологии рекомбинантных продуцентов различных белков высокая способность бацилл к секреции белка стимулировала попытки конструирования на их основе продуцентов ценных биоактивных белков и пептидов: проинсулина, интерферонов, соматотропина, сывороточного альбумина, вакцинирующих вирусных антигенов и других. Однако, все эти попытки закончились неудачно. Более того, было установлено, что бациллярные клетки неспособны к секреции даже собственных секреторных белков, подвергнутых более или менее значительным модификациям. В частности, не удалось заставить бациллы секретировать экзогидролазы, неспособные к естественному фолдингу, или лишенные ферментативной активности. Таким образом, можно сделать вывод о способности секреторного аппарата бацилл, в отличие от секреторного аппарата дрожжей, мицелиальпых грибов и клеток высших эукариот, избирательно распознавать дефектные неактивные молекулы и не допускать их транспорта во внешнюю среду.

Еще одной уникальной особенностью бацилл, важной в технологическом отношении, является их способность к образованию эпдоспор. С одной стороны, это делает бациллярные культуры неприхотливыми при культивировании и хранении, с другой - осложняет процесс управления ферментацией. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что синтез секреторных ферментов бациллярными клетками жестко сопряжен со стадией, предшествующей переходу к спорообразованию. Таким образом, функционирование аппарата синтеза целевого белка в ходе ферментации бациллярного штамма-продуцента происходит в течение короткого периода, соответствующего переходу от стадии вегетативного роста культуры к формированию спор.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение молекулярно-генетических особенностей бактерий рода Bacillus, обусловливающих их принципиальную с технологической точки зрения черту: способность к сверхэффективному синтезу и секреции собственных секреторных гидролаз, но не гетерологичных или дефектных гомологичных белков.

В ходе исследований решались следующие задачи:

- Разработка экспериментального метода, позволяющего направленно вносить в геном бациллярных штаммов необходимые стабильно наследуемые перестройки, инактивируя или вводя в него дополнительные копии различных генов.

- Изучение организации сопряженной со спорообразованием высокоэффективной экспрессии генов на примере параспоральных кристаллических белков Bacillus thuringiensis.

- Исследование распространенности в природных штаммах бацилл генов различных секреторных экзогидролаз, сопоставление особенностей их структуры и регуляции экспрессии.

- Разработка метода получения интактных предшественников секреторных протеаз бацилл, изучение механизма их косекреторной активации.

- Построение обобщенной модели регуляции синтеза и секреции ферментов клетками бацилл. Применение разработанной модели для получения промышленных 8 продуцентов ферментов: нейтральных протеаз Bacillus megaterium и Bacillus amyloliquefaciens, щелочной протеазы Bacillus licheniformis и мезофильной ос-амилазы В. amyloliquefaciens.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Шевелев, Алексей Борисович

4. В Ы В О Д Ы

1. Разработан методический аппарат, позволяющий комплексно исследовать роль отдельных генов и их продуктов в секреции белков у бацилл. Доказано преимущество однокопийных векторов сайт-направленной интеграции перед плазмидными при исследовании регуляторных механизмов и создании штаммов-продуцентов промышленного назначения.

2. Клонировано 6 новых генов белков бацилл, вовлеченных в секрецию и споруляцию: глутамилэндопептидазы В. licheniformis, В. intermedins, В. cereus, 5-эндотоксины сгу9Аа и сгу9Ва, гены wprA В. licheniformis и

В. amyloliquefaciens.

3. С использованием размножающихся бактериальных L-форм впервые показана необходимость клеточной стенки для запуска аутопроцессинга предшественников глутамилэндопептидаз и карбоксипептидазы Т.

4. Показана способность предшественников секереторных протеиназ бацилл к мультимеризации. Выдвинута гипотеза о взаимодействии клеточной стенки бацилл с предшественниками секреторных белков в форме линейных полимеров.

5. Показано существование отрицательной обратной связи, запускающей механизм генерализованного ответа типа heat-shock в результате инактивации гена WprA, кодирующего субтилизиноподобную протеиназу, прочно связанную с клеточной стенкой. Разработана векторная система для замещения природного гена wprA интегративными кассетами, несущими регуляторные гены.

6. Сконструированы новые высокостабильные бесплазмидные штаммы продуценты нейтральных протеаз на базе Bacillus megaterium и Bacillus amyloliquefaciens, в 3-5 раз превышающие по продуктивности лучшие отечественные аналоги.

6. Благодарности

Автор выражает благодарность за предоставленные материалы сотрудниками, аспирантами и студентами Лаборатории химии белка им. В.М. Степанова ФГУП ГосНИИгенетика А.В. Серкиной, A.M. Савиловой, Г.Е. Константиновой, С.И. Новиковой, Д.В. Ребрикову, А.Э. Грановскому и Я.Н. Когану. При исследовании предшественника металлоэндопептидазы Brevibacillus brevis использованы результаты, предоставленные д.б.н. Г.Г. Честухиной, д.б.н. А.В. Сорокиным и к.б.н. Т.Ф. Горожанкиной. При разработке системы экспрессии на основе L-форм использованы лабораторные технологии, созданные в секторе клеточной биологии прокариот института Молекулярной биологии (г. Йена, Германия) под руководством проф. Й. Гумперта. Цикл работ по разработке маркерной системы на основе мини-гена устойчивости к эритромицину проведен в сотрудничестве с лабораторией под руководством проф. А. Манькина (Университет Иллинойса, Чикаго, США). Исходный материал для конструирования вектора pLF14 и вектор рСВ20 получен автором от к.б.н. В.В. Лившица и д.б.н. В.В. Алешина. Исходные материалы для проведения экспериментов по изучению карбоксипептидазы Т предоставлены А.Л. Остерманом, О.П. Загнитько и М.В. Матцем. Эксперименты по культивированию штамма В. licheniformis 103 проводились совместно с сотрудниками лаборатории генетики актиномицетов (д.б.н. Т.А. Воейкова). Работы по клонированию и секвенированию гена глутамтлэндопептидазы выполнены совместно с сотрудниками Института Молекулярной Генетики РАН д.х.н. С.В. Костровым, K.6.H. Демидюком И.В. и к.б.н. Т.А. Акимкиной, а также проф. И.П. Кураповой (Институт Кристаллографии им. В.В. Шубникова РАН). Эксперименты по тестированию биологической активности эндотоксинов В. thuringiensis выполнены на базе университета г. Падуи (Италия) совместно с проф. А. Баттисти.

Работа поддерживалась грантами РФФИ №93-04-20263-а, 96-04-50886-а, 97-04-50162-а, 98-04-48168-а, 99-04-48812-а, 00-04-48280-а, 00-04-48320-а, 02-04-48755-а, 02-04-48760-а, 03-04-48433-а, а также грантами Минэкономики и Минпромнауки РФ.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Шевелев, Алексей Борисович, 2006 год

1. Akita М., Sasaki S., Matsuyama S. and MizushimaS. 1990. SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino terminus of the signal peptide in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265: 8162-8169.

2. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 15: 3389-3402.

3. Asai K., Kawamura F., Sadaie Y. and Takahashi H.J. 1997. Isolation and characterization of a sporulation initiation mutation in the Bacillus subtilis secA gene. J. Bacteriol. 179: 544-547.

4. Baardsnes J., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J. and Borgford T. 1998. Streptomyces griseus protease В: secretion correlates with the length of the propeptide. J. Bacteriol. 180:3241-3244.

5. Baba T. and Schneewind O. 1998. Targeting of muralytic enzymes to the sell division site of gram-positive bacteria: repeat domains direct autolysin to the equatorial surface ring of Staphylococcus aureus. EMBO J. 17:4639-4646.

6. Banerjee S. and Hansen J.N. 1988. Structure and expression of a gene encoding the precursor of subtilin, a small protein antibiotic. J. Biol. Chem. 263:9508-9514.

7. Beaman T.C., Hitchins A.D., OchiK., VasanthaN., EndoT. and FreeseE.I. 1983. Specificity and control of uptake of purines and other compounds in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 156: 1107-1117.

8. Beck K., Wu L.F., Brunner J. and Muller M. 2000. Discrimination between SRP- and SecA/SecB-dependent substrates involves selective recognition of nascent chains by SRP and trigger factor. EMBO J. 19: 134-143.

9. Berks B.C., Sargent F. and Palmer T. 2000. The Tat protein export pathway. Mol. Microbiol. 5:260-274.

10. Bolhius A., Broekhuizen C.P., Sorokin A., van Roosmalen M.L., Venema G., Bron S., QuaxWJ. and vanDijlJ.M. 1998. SecDF of Bacillus subtilis, a molecular Siamese twin required for the efficient secretion of proteins. J. Biol. Chem. 273: 21217-21224.

11. Bolhuis A., Tjalsma H., Smith H.E., deJongA., MeimaR., Venema G., BronS. and van Dijl J.M. 1999a. Evaluation of bottlenecks in the late stages of protein secretion in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2934-2941.

12. Bolhuis A., Venema G., Quax J., BronS., vanDijlJ.M. 1999c. Functional analysis of paralogous thiol-disulfide oxidoreductases in Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 274:24531-24538.

13. Bolhuis A., Koetje E., Dubois J.-Y., Vehmaanpera J., Venema G., Bron S. and van Dijl J.M. 2000. Did the mitochondrial processing peptidase evolve from a eubacterial regulator of gene expression? Mol. Microbiol. Evol. 17: 198-201.

14. Bowie J.U. 1997. Helix packing in membrane proteins. J. Mol. Biol. 272: 780-789.

15. Boyd D., Schierle C. and Beckwith J. 1998. How many membrane proteins are there? Protein Sci. 7:201-205.

16. Braun P., Gerritse G., van Dijl J.M. and Quax W.J. 1999. Improving protein secretion by engineering components of the bacterial translocation machinery. Curr. Opin. Biotechnol. 10: 376-381.

17. Braun P., Tommassen J. and Filloux A. 1996. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 19:297-306.

18. Briggs M.S., Cornell D.J., Dluhy R.A. and Gierasch L.M. 1986. Conformations of signal peptides induced by lipids suggest initial steps in protein export. Science 233: 206-208.

19. Bron S., Bolhuis A., Tjalsma H., Holsappel S., Venema G. and van Dijl J.M. 1998. Protein secretion and possible roles for multiple signal peptidases for precursor processing in bacilli. J. Biotechnol. 64:3-13.

20. Chambcrt R. and Petit-Glatron M.F. 1999. Anionic polymers of Bacillus subtilis cell wall modulate the folding rate of secreted proteins. FEMS Microbiol. Lett. 179:43-47.

21. Chen M. and Nagarajan V. 1994. Effect of alteration of charged residues at the N termini of signal peptides on protein export in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 176: 5796-5801.

22. Chung Y.S. and Dubnau D. 1995. ComC is required for the processing and translocation of ComGC, a pilin-like competence protein of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 15: 543-551.

23. Chung Y.S. and Dubnau D. 1998. All seven comC open reading frames are required for DNA binding during transformation of competent Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180: 41-45.

24. Chung Y.S., Breidt F. and Dubnau D. 1998. Cell surface localization and processing of the ComG proteins, required for DNA binding during transformation of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 29: 905-913.

25. Cristobal S., de Gier J.W., Nielsen H. and von Heijne G. 1999. Competition between Sec- and Tat-dependent protein translocation in Escherichia coli. EMBO J. 18: 2982-2990.

26. Dalbey R.E. and Robinson С. 1999. Protein translocation into and across the bacterial plasma membrane and the plant thylacoid membrane. Trends Biochem. Sci. 24: 17-22.

27. Dalbey R.E., Lively M.O., Bron S. and van Dijl J.M. 1997. The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases. Protein Sci. 6:1129-1138.

28. Debabov D.V., Heaton M.P., Zhang Q., Stewart K.D., Lambalot R.H., Neuhaus F.C. 1996. The D-Alanyl carrier protein in Lactobacillus casei: cloning, sequencing, and expression of dltC. J. Bacteriol. 178(13): 3869-3876.

29. Deuerling E., Mogk A., Richter C., Purucker M. and Schumann W. 1997. The ftsH gene of Bacillus subtilis is involved in major cellular processes such as sporulation, stress adaptation and secretion. Mol. Microbiol. 23: 921-933.

30. Errington J. 1993. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis. Microbiol. Rev. 57:1-33.

31. Fahnestock S.R. and Fisher K.E. 1986. Expression of staphylococcal protein A gene in Bacillus subtilis by gene fusions utilizing the promoter from Bacillus amyloliquefaciens a-amylase gene. J. Bacteriol. 165:796-804.

32. Fekkes P. and Driessen A.J.M. 1999. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 161-173.

33. Fekkes P., van dcr Does C. and Driessen A.J. 1997. The molecular chaperone SecB is released from the carboxyl terminus of SecA during initiation of precursor protein translocation. EMBO J. 16:6105-6113.

34. Franke C.M., Tiemersma J., Venema G. and KokJ. 1999. Membrane topology of the lactococcal bacteriocin ATP-binding cassette transporter protein LcnC. Involvement of LcnC in lactococcin maturation. J. Biol. Chem. 274: 8484-8490.

35. Gruss A. and Ehrlich D. 1988. Insertion of foreign DNA into plasmids from gram-positive bacteria induces formation of high-molecular-weight plasmid multimers. J Bacteriol. 170(3): 1183-1190.

36. Gumpert J. and Taubeneck U. 1983. Characteristic properties and biological significance of stable protoplast type L-forms. Experientia Suppl. 46:227-241.

37. Hartl F.U., Lccker S., Schiebel E., Hcndrick J.P. and Wickncr W. 1990. The binding cascade of SecB to SecA to SecY/E mediates pre-protein targeting to the E. coli plasma membrane. Cell 63:269-279.

38. Havarstein L.S., Diep D.B. and Nes I.F. 1995. A family of bacteriocin ABC transporters carry out proteolytic processing of their substrates concominant with export. Mol. Microbiol. 16:229-240.

39. Hell K., Herrmann J.M., Pratje E., Ncupert W. and Stuart R.A. 1998. Oxalp, an essential component of the N-tail protein export machinery in mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2250-2255.

40. Ilirose I., Sano K., Shioda I., Kumano M., Nakamura K. and Yamane K. 2000. Proteome analysis of Bacillus subtilis extracellular proteins: a two-dimensional protein electrophoretic study. Microbiology 146:65-75

41. Hofmcister A. 1998. Activation of the proprotein transcription factor pro-sigma E is associated with its progression through three patterns of subcellular localization during sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180:2426-2433.

42. Hynds P.J., Robinson D. and Robinson C. 1998. The sec-independent twin-arginine translocation system can transport both tightly folded and malfolded proteins across the thylakoid membrane. J. Biol. Chem. 273: 34868-34874.

43. Jensen C.L., Stephenson K., Jorgensen S.T. and Harwood C. 2000. Cell-associated degradation affects the yield of secreted engineered and heterologous proteins in the Bacillus subtilis expression system. Microbiology 146:2583-2594.

44. Jiang M., Grau R. and Perego M. 2000. Differential processing of propeptide inhibitors of Rap phosphatases in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 182:303-310.

45. Jungnickel B*, Rapoport T.A. and Hartmann E. 1994. Protein translocation: common themes from bacteria to man. FEBS Lett. 346: 73-77.

46. Keiler K.C., Waller P.R. and Sauer R.T. 1996. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science 271:990-993.

47. Kessler E. 1995. Beta-lytic endopeptidases. Methods Enzymol. 248: 740-756.

48. Kessler E. and Safrin M. 1988. Partial purification and characterization of an inactive precursor of Pseudomonas aeruginosa elastase. J. Bacteriol. 170: 1215-1219.

49. Kessler E., Safrin M., Gustin J.K. and Ohman D.E. 1998. Elastase and the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa are secreted with their propeptides. J. Biol. Chem. 273: 30225-30231.

50. Kihara A., Akiyama Y. and Ito K. 1999. Dislocation of membrane proteins in FtsH-mediated proteolysis. EMBO J. 18:2970-2981.

51. Knoblauch N.T., Rudiger S., Schonfeld H.J., Driesscn A.J.M., Schneider-Mcrgener J. and Bukau B. 1999. Substrate specificity of the SecB chaperone. J. Biol. Chem. 274: 34219-34225.

52. Kontinen V.P. and Sarvas M. 1993. The PrsA lipoprotein is essential for protein secretion in Bacillus subtilis and sets a limit for high-level secretion. Mol. Microbiol. 8: 727-737.

53. Kopito R.R. 1997. ER quality control: the cytoplasmic connection. Cell 88:427-430.

54. Kumamoto C.A. and Francetic O. 1993. Highly selective binding of nascent polypeptides by an Escherichia coli chaperone protein in vivo. J. Bacteriol. 175: 2184-2188.

55. Kunst F., Ogasavara N., Moszer I., Albertini A.M., AHoni G., Azevedo V., Bertero M.G., Bessieres P., Bolotin A., Borchert S. et al. 1997. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390: 249-256.

56. LaPointe C.F. and Taylor R.K. 2000. The tipe IV prepilin peptidases comprise a novel family of aspartic acid proteases. J. Biol. Chem. 275: 1502-1510.

57. Lee S.J., Kim D.M., Bae K.Il., Byun S.M. and Chung J.II. 2000. Enhancement of secretion and extracellular stability of staphylokinase in Bacillus subtilis by wprA gene disruption. Appl. Environ. Microbiol. 66: 476-480.

58. Le Loir Y., Gruss A., Ehrlich S.D. and Langella P. 1998. A nine-residue synthetic propeptide enhances secretion efficiency of heterologous proteins in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 180:1895-1903.

59. Le Loir Y., Nouaillc S., Commissaire J., Bretigny L., Gruss A. and Langella P. 2001. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 67:4119-4127.

60. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovich E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N. and StepanovV.M. 1997. Glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius, strain 3-19. FEBS Lett. 404: 241-244.

61. Lill R., Crooke E., Guthrie B. and Wickner W. 1988. The "trigger factor cycle" includes ribisomes, presecretory proteins and the plasma membrane. Cell 54: 1013-1018.

62. Magnuson R., Solomon J. and Grossman A.D. 1994. Biochemical and genetic characterization of a competence pheromone from Bacillus subtilis. Cell 77: 207-216.

63. MansfeId J., Vriend G., Dijkstra B.W., Veltman O.R., van den Burg O.R., Venema G., Uibrich-Hofmann R. and EijsinkV.G. 1997. Extreme stabilization of a thermophlysin-like protease by an engeneered disulfide bond. J. Biol. Chem. 272:11152-11156.

64. Maguin E., Duwat P., Hege Т., Ehrlich D., Gruss A. 1992. New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 174(17): 5633-5638.

65. Margot P., Wahlen M., Gholamhoscinian A., PiggotP. and Karamata D. 1998. The lytE gene of Bacillus subtilis 168 encodes a cell wall hydrolase. J. Bacteriol. 180: 749-752.

66. Matsumoto G., Mori H. and Ito K. 1998. Roles of SecG in ATP- and SecA- dependent protein translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13567-13572.

67. Matsuyama S., Tajima T. and Tokuda II. 1995. A novel periplasmic carrier protein involved in the sorting and transport of Escherichia coli lipoproteins destined for the outer membrane. EMBO J. 14:3365-3372.

68. Matsuyama S., Yokota N. and Tokuda H. 1997. A novel outer membrane lipoprotein, LolB (HemM), involved in the LolA (p20)-dependent localization of lipoproteins to the outer membrane of Escherichia coli. EMBO J. 16: 6947-6955.

69. Mazmanian S.K., Liu G., Ton-That H. and Schneewind O. 1999. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Science 285: 760-763.

70. Mclver K.S., Olson J.C. and Ohman D.E. 1993. Pseudomonas aeruginosa lasBl mutants produce an elastase, substituted at active-site His-223, that is defective in activity, processing, and secretion. J. Bacteriol. 175:4008-4015.

71. Miller J.R., Kovacevic S. and Veal L.E. 1987. Secretion and processing of staphylococcal nuclease by Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 169: 3508-3514.

72. Miiller J., OzegowskiJ., Vettermann S., SwavingJ., vanWelyK.II. and Driessen A.J.M. 2000. Interaction of Bacillus subtilis CsaA with SecA and precursor proteins. Biochem. J. 348: 367-373.

73. Nakamura K., Yahagi S., Yamazaki T. and Yamane K. 1999. Bacillus subtilis histone-like protein, HBsu, is an integral component of a SRP-like particle that can bind the Alu domain of small cytoplasmic RNA. J. Biol. Chem. 274:13569-13576.

74. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. and von Heijne G. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng. 10: 1-6.

75. Novak P. and DevI.K. 1988. Degradation of a signal peptide by protease IV and oligopeptidase A. J. Bacteriol. 170: 5067-5075.

76. Ogura A., Kakeshita H., Honda K., Takamatsu H., Nakamura K. and Yamane K. 1995. srb: a Bacillus subtilis gene encoding a homologue of the alpha-subunit of the mammalian signal recognition particle receptor. DNA Res. 2:95-100.

77. Paetzel M., Dalbey R.E. and Strynadka N.C. 1998. Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a beta-lactam inhibitor. Nature 396:186-190.

78. Palva I. 1982. Molecular cloning of a-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens and its expression in Bacillus subtilis. Gene 19: 81-87.

79. Perego M. 1997. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8612-8617.

80. Pohlschroder M., PrinzW.A., Hartmann E. and Beckwith J. 1997. Protein translocation in the three domains of life: variations on a theme. Cell 91: 563-566.

81. Pooley H.M., Merchante R. and Karamata D. 1996. Overall protein content and induced enzyme components of the periplasm of Bacillus subtilis. Microbiol. Drug Resist. 2:9-15.

82. Popham D.L., Helin J., Costello C.E. and SetlowP. 1996. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J. Bacteriol. 178: 6451-6458.

83. Popham D.L., Meador-Parton J., Costello C.E. and SetlowP. 1999. Spore peptidoglycan structure in cwlD dacB double mutant of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 181: 6205-6209.

84. Powers T. and Walter P. 1997. Co-translational protein targeting catalyzed by the Escherichia coli signal recognition particle and its receptor. EMBO J. 16:4880-4886.

85. Prozorov A.A., Bashkirov V.I., Khasanov F.K., Glumova E.F., Irich V.Y. 1985. Insertion of eukaryotic DNA into the Bacillus subtilis genome by means of a temperature-sensitive plasmid vector. Gene. 34(1): 39-46.

86. Pugsley A.P. 1993. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108.

87. Pugsley A.P., Francetic O., Possot O.M., SauvonnetN. and HardieK.R. 1997. Recent progress and future directions in studies of the main terminal branch of the general secretory pathway in gram-negative bacteria. Gene 192: 13-19.

88. Quax W.J. 1997. Merits of secretion of heterologous proteins from industrial microorganisms. Folia Microbiol. (Prague) 42: 99-103.

89. Rosenow C., Ryan P., Weiser J.N., Johnson S., Fontan P., Ortqvist A. and Masure H.R. 1997. Contribution of novel choline-binding proteins to adherence, colonization and immunogenecity of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 25: 819-829.

90. Sadaie Y. and Kada T. 1985. Bacillus subtilis gene involved in cell division, sporulation, and exoenzyme secretion. J. Bacteriol. 163: 648-653.

91. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. 1989. Molecular cloning; 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol.3, New York, NY.

92. Sargent F., Stanley N.R., Berks B.C. and Palmer T. 1999. Sec-independent protein translocation in Escherichia coli: a distinct and pivotal role for the TatB protein. J. Biol. Chem. 274: 36073-36082.

93. Schatz G. and Dobberstein B. 1996. Common principles of protein translocation across membranes. Science 271:1519-1526.

94. Schneewind O., Fawler A. and Faull K.F. 1995. Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus. Science 268: 103-106.

95. ScottiP.A., UrbanusM.L., BrunnerJ., deGierJ.W., von Heijne G., van der Does C., Driessen A.J.M., Oudega B. and Luirink J. 2000. YidC, the Escherichia coli homologue of mitochondrial Oxalp, is a component of the Sec translocase. EMBO J. 19: 542-549.

96. Серкипа A.B., Бушуева A.M. (Савилова), Честухина Г.Г., Гумперт Й., Хойшеп К., КуяуМ., Шевелев А.Б. 2001. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. licheniformis и изучение его процессинга in vitro. Вопр. Мед. Хим. 47: 111-122.

97. Settles A.M., Yonetani A., Baron A., Bush D.R., Clinе К. and Martienssen R. 1997. Sec-independent protein translocation by the maize Hcfl06 protein. Science 278: 1467-1470.

98. Seydel A., Gounon P. and Pugsley A.P. 1999. Testing the "+2 rule" for lipoptotein sorting in the Escherichia coli cell envelope with a new genetic selection. Mol. Microbiol. 34: 810-821.

99. Siegel V. and Walter P. 1988. Each of the activities of signal recognition particle (SRP) is contained within a distinct domain: analysis of biochemical mutants of SRP. Cell 52:39-49.

100. Simonen M. and Palva I. 1993. Protein secretion in Bacillus species. Microbiol. Rev. 57:109-137.

101. Sipos L. and von Heijne G. 1993. Predicting the topology of eukaryotic membrane proteins. Eur. J. Biochem. 213: 1333-1340.

102. Solomon J.M., Magnuson R., Srivastava A. and Grossman A.D. 1995. Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes Dev. 9: 547-558.

103. Stephenson K. and Harwood C.R. 1998. Influence of a cell wall-associated protease on production of alpha-amylase by Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 64:2875-2881.

104. Stephenson K., Carter N.M., Harwood C.R., Petit-Glatron M.F. and Chambert R. 1998. The influence of protein folding on the late stages of the secretion of a-amylases from Bacillus subtilis. FEBS Lett. 430: 385-389.

105. Stover A.G. and Driks A. 1999. Secretion, localization, and antibacterial activity of TasA, a Bacillus subtilis spore-associated protein. J. Bacteriol. 181:1664-1672.

106. Stragier P. and Losick R. 1996. Molecular genetics of sporulation in Bacillus subtilis. Annu. Rev. Genet. 30: 297-341.

107. Sturmfels A., Gotz F. and PeschelA. 2001. Secretion of human growth hormone by the food-grade bacterium Staphylococcus carnosus requires a propeptide irrespective of the signal peptide used. Arch. Microbiol. 175:295-300.

108. Suciu D. and M. Inouye. 1996. The 19-residue pro-peptide of staphylococcal nuclease has a profound secretion-enhancing ability in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 21: 181-195.

109. Sutcliffe I.C. and Russell R.R.B. 1995. Lipoproteins of gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 177:1123-1128.

110. Svendsen I. and Breddam K. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase iromBacillus licheniformis. 1992. Eur. J. Biochem. 204: 165-171.

111. Swaving J., van Wely K.II. and Driessen A.J.M. 1999. Pre-protein translocation by a hybrid translocase composed of Escherichia coli and Bacillus subtilis subunits. J. Bacteriol. 181:7021-7027.

112. Taura Т., Akiyama Y. and Ito K. 1994. Genetic analysis of SecY: additional export-defective mutations and factors affecting their phenotypes. Mol. Gen. Genet. 243:261-269.

113. Tjalsma H., Zanen G., Venema G., Bron S. and van Dijl J.M. 1999c. The potential active site of the lipoprotein-specific (type II) signal peptidase of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 274:28191-28197.

114. Tjalsma H., Bolhius A., Jongbloed J.D.H., Bron S. and van Dijl J.M. 2000. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. Microbiol, and Mol. Biol. Rew. 64: 515-547.

115. Tomilin N.V. and Hofemeister J. 1982. Site-specific recA-independent recombination (fusion) of pMB8-related replicons in Escherichia coli in the region of the replication origins. Gene. 17(1): 65-73.

116. Ulbrandt N.D., Newitt J.A. and Bernstein II.D. 1997. The Escherichia coli signal recognition particle is required for the insertion of a subset of inner membrane proteins. Cell 88: 187-196.

117. Wallin E. and von Heijne G. 1997. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7: 1029-1038.

118. Weiner J.H., Bilous P.T., Shaw G.M., Lubitz S.P., Frost L., Thomas G.IL, Cole J.A. and Turner R.J. 1998. A novel and ubiquitous system for membrane targeting and secretion of cofactor-containing proteins. Cell 93: 93-101.

119. Wetmore D.R., Wong S.L. and Roche R.S. 1992. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. Mol. Microbiol. 6:1593-1604.

120. Wild J., Rossmeissl P., Walter A. and Gross C.A. 1996. Involvement of the DnaK-DnaJ-GrpE chaperone team in protein secretion in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178: 3608-3613.

121. Young E.F. Spizizcn J. 1961. Physiological and genetic factors affecting transformation of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81: 823-829.

122. Zheng G., Yan L.Z., Vederas J.C. and Zuber P.J. 1999. Genes of the sbo-alb locus of Bacillus subtilis are required for production of the antilisterial bacteriocin subtilosin. J. Bacteriol. 181:7346-7355.

123. Zhu X.L., Ohta Y., Jordan F. and Inouye M. 1989. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. Nature 339:483-484.