Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Рафиева, Лола Маратовна

• Рафиева, Лола Маратовна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Рафиева, Лола Маратовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Факторы роста нервной ткани.

1.1.1. Понятие о факторах роста.

Классификация факторов роста нервной ткани.

1.1.2. Открытие фактора роста нервов.

1.1.3. Природные источники фактора роста нервов.

1.2. Семейство нейротрофинов.

1.2.1. Экспрессия нейротрофинов в центральной и периферической нервной системе.

1.2.2. Структура генов нейротрофинов человека.

1.2.3. Внутриклеточный процессинг нейротрофинов.

Влияние продомена на эффективность процессинга.

1.2.4. Секреция нейротрофинов.

1.2.5. Структурная организация зрелых нейротрофинов.

1.2.6. Структурные особенности пронейротрофина NGF и его пропептида.

1.3. Рецепторы нейротрофических факторов.

1.3.1. Структурная организация рецепторов.

1.3.1.1. Тирозинкиназные рецепторы.

1.3.1.2. Рецептор р75.

1.3.1.3. Сортилин.

1.3.2. Структурные особенности взаимодействия нейротрофинов и их предшественников с рецепторами.

1.3.2.1. Взаимодействие нейротрофинов с тирозинкиназными рецепторами.

1.3.2.2. Взаимодействие нейротрофинов с рецептором р75.

1.3.2.3. Взаимодействие нейротрофинов с рецепторами Trk и р75.

1.3.2.4. Взаимодействие пронейротрофинов с сортилином.

1.3.3. Сигнальные каскады, запускаемые при взаимодействии нейротрофических факторов с рецепторами.

1.3.3.1. Сигнальные каскады Trk-рецепторов.

1.3.3.2. Сигнальные каскады рецептора р75.

1.3.3.3. Взаимодействие каскадов, запускаемых рецепторами Trk и р75.

1.3.3.4. Участие сортилина в сортировке и сигнализации нейротрофических факторов.

1.4. Пропоследовательности нейротрофинов.

1.4.1. Роль пропоследовательностей в фолдинге нейротрофинов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека»

Актуальность исследования

Нейротрофины - семейство факторов роста, играющих важную роль в регуляции развития и функционирования центральной и периферической нервной системы. Они влияют на пролиферацию и дифференцировку нейрональных и глиальных клеток, необходимы для поддержания жизнеспособности и функционирования нейронов, обладают нейропротекторным действием, влияют на передачу и изменение синаптического сигнала (синаптическая пластичность).

На сегодняшний день для человека описано четыре представителя данного семейства - фактор роста нервов NGF, нейротрофический фактор головного мозга BDNF, а также нейротрофические факторы NT-3 и NT-4/5. При этом наиболее значимыми для развития нервной системы являются первые три нейротрофических фактора, что делает их важными объектами различных биомедицинских исследований.

Нейротрофины синтезируются в клетках в виде предшественников — препронейротрофинов, имеющих в своем составе сигнальный пептид, N-концевую пропоследовательность и, собственно, зрелую часть, которая, как полагали долгое время, и обладает всеми свойствами, описанными для данных факторов роста. Препептид, считается, участвует в транспорте синтезированного белка из эндоплазматического ретикулума в транс-отдел аппарата Гольджи. Роль пропептида не установлена и активно исследуется во многих лабораториях. Есть основания полагать, что про-часть нейротрофинов может служить внутримолекулярным шапероном и определять фолдинг молекулы нейротрофина.

Недавно было показано, что клетками секретируются не только зрелые, процессированные, нейротрофины, но и их предшественники. При этом пронейротрофины, как было показано, обладают биологической активностью. Известно, что в некоторых случаях проформы нейротрофинов могут запускать механизм клеточной смерти. Таким образом, пронейротрофины и зрелые белки способны оказывать противоположные эффекты на клетки, а процессинг в таком случае может служить своего рода механизмом регуляции функциональной активности нейротрофических факторов.

Имеющаяся на данный момент совокупность данных свидетельствует о том, что изучение предшественников нейротрофинов необходимо для понимания механизмов функционирования нервной системы человека в норме и при патологии и является важным направлением в современных биологических науках.

Цели исследования

Целью данной работы являлось изучение вовлеченности прогтоследовательностей в формирование биологически активных молекул нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное сравнительное исследование фолдинга нейротрофических факторов человека с использованием предшественников нейротрофинов NGF и BDNF, их индивидуальных зрелых форм и пропоследовательностей. При этом в данной работе впервые осуществлен фолдинг зрелого NGF в присутствии несвязанного ковалентной связью пропептида NGF (фолдинг в системе in trans). Показано, что пропептид NGF способен существенно повышать эффективность образования биологически активного нейротрофина NGF, причем наличие ковалентной связи между зрелым белком и пропептидом не является необходимым. Таким образом, в данной работе получены доказательства про-зависимого фолдинга нейротрофина NGF. Впервые осуществлен фолдинг нейротрофина NGF в присутствии не связанной ковалентной связью чужеродной пропоследовательности (пропептида BDNF) и показано, что пропептид BDNF способен направлять фолдинг зрелого NGF. Впервые показано, что пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на образование биологически активного нейротрофина BDNF и, по-видимому, фолдинг данного нейротрофина не является про-зависимьтм. Показано, что индивидуальные пропоследовательности нейротрофинов NGF и BDNF в растворе образуют стабильную димерную форму. Также показано отсутствие дифференцирующего и пролиферативного действия пропептидов на культуры клеток феохромоцитомы крысы PC 12 и эритролейкемии человека TF-1.

Практическая значимость

Получение новых данных о механизмах фолдинга нейротрофических факторов открывает большие перспективы в конструировании нейротрофинов с модифицированными свойствами, в том числе на базе одной аминокислотной последовательности. Это может помочь в исследовании взаимодействия нейротрофических факторов с тирозинкиназными рецепторами (TrkA, TrkB и TrkC), рецептором р75 и сортилином. Препаративное получение очищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF (предшественников, индивидуальных зрелых нейротрофинов и индивидуальных пропептидов), отработанное в данной работе, позволит 8 использовать данные белки для разработки и создания тест-систем для детектирования пронейротрофинов, нейротрофинов и, вероятно, пропептидов в различных биологических жидкостях (крови, спинномозговой жидкости и т.д.), что может быть широко использовано в диагностике и исследовании целого ряда нейродегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

Конструирование рекомбинантных продуцентов различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей.

Получение высокоочищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.

Разработка системы анализа эффективности фолдинга различных форм нейротрофинов.

Анализ биологической активности полученных нейротрофических факторов.

Исследование наличия шапероноподобной функции пропептидов при фолдинге нейротрофинов NGF и BDNF.

Исследование влияния пропептида на биологическую активность сформировавшегося зрелого нейротрофина NGF.

Исследование собственной биологической активности индивидуальных пропептидов.

Выполнение работы проводилось в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (2009), программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (2009) и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (М» грантов 06-04-48678-а, 06-04-48690-а, 09-04-00734-а, 09-04-00870-а).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Рафиева, Лола Маратовна

выводы

1. Зрелые нейротрофины NGF и BDNF способны формировать биологически активные формы без участия пропоследовательностей. При этом фолдинг нейротрофина BDNF протекает значительно эффективнее.

2. При фолдинге нейротрофического фактора NGF в системах in cis и in trans пропептид повышает эффективность образования биологически активной формы белка, причем наличие ковалентной связи между зрелым нейротрофином и пропоследовательностью не является необходимым. Таким образом, фолдинг нейротрофина NGF протекает по про-зависимому механизму.

3. Пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на процесс формирования биологически активной формы данного нейротрофина (BDNF). Следовательно, фолдинг нейротрофина BDNF не является про-зависимым. Таким образом, молекулярные механизмы функционирования пропоследовательностей нейротрофических факторов NGF и BDNF различны.

4. Пропептид BDNF способен направлять фолдинг зрелой части NGF и существенно повышать эффективность образования биологически активного белка.

5. Индивидуальный пропептид в растворе имеет стабильную димерную форму, и это свидетельствует в пользу того, что в димерной структуре предшественника пропоследовательности, по-видимому, взаимодействуют между собой.

6. Индивидуальные пропоследовательности NGF и BDNF не обладают собственной дифференцирующей либо пролиферативной активностью в рамках использованных экспериментальных моделей.

7. В условиях эксперимента пропептид NGF не влияет на биологическую активность уже сформировавшегося зрелого нейротрофина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, члену-корреспонденту РАН, доктору химических наук, профессору Кострову Сергею Викторовичу за внимание, чуткое отношение, теоретическую и практическую помощь, оказанные им в процессе выполнения данной диссертационной работы.

Автор также выражает признательность ведущему научному сотруднику Московского научно-исследовательского института медицинской экологии, кандидату химических наук Посыпановой Галине Ароновне за неоценимую помощь в выполнении экспериментальной части работы и обсуждении полученных результатов.

Автор благодарит за помощь, ценные советы и моральную поддержку всех сотрудников лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН, особенно кандидата химических наук Демидюка Илью Валерьевича, кандидата химических наук Сафину Дину Рашидовну и кандидата химических наук Гасанова Евгения Валерьевича.

Автор также благодарит всех сотрудников ИМГ РАН за внимание и содействие, оказанное ими, особенно доктора биологических наук, профессора Лимборскую Светлану Андреевну, кандидата химических наук Шрама Станислава Ивановича и доктора биологических наук Кульбачинского Андрея Владимировича.

3.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно, нейротрофические факторы NGF, BDNF и NT-3 являются ключевыми регуляторами развития и функционирования нервной системы позвоночных. Несмотря на то, что данные факторы исследуются не первый год, о биологических функциях пропоследовательностей нейротрофинов известно недостаточно. В частности оставался открытым вопрос об участии пропептидов нейротрофических факторов в процессе образования биологически активной пространственной структуры зрелых молекул. Наша работа была направлена на исследование роли пропоследовательностей нейротрофических факторов NGF и BDNF в фолдинге этих белков. Для этого было необходимо получить препаративные количества различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей, и изучить процесс их созревания.

Нами сконструированы продуценты различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека. Была разработана эффективная система очистки рекомбинантных белков, подобраны условия ренатурации предшественников и зрелых форм нейротрофинов NGF и BDNF. Разработана система анализа эффективности фолдинга различных форм нейротрофинов, ключевой стадией которой являлась оценка биологической активности полученных нейротрофических факторов. С использованием этой системы было показано, что ренатурированные рекомбинантные нейротрофины в условиях эксперимента обладают профилем биологической активности, характерной для факторов роста, полученных из природных источников. Изучение биологической активности различных форм нейротрофинов, полученных нами, позволило оценить степень участия их пропоследовательностей в формировании биологически активной структуры факторов NGF и BDNF. Было показано, что фолдинг нейротрофического фактора NGF протекает по про-зависимому механизму, тогда как на образование биологически активного нейротрофина BDNF пропептид, по-видимому, влияния не оказывает. Анализ полученных экспериментальных данных позволяет заключить, что, несмотря на общее сходство всех нейротрофинов, молекулярные механизмы функционирования пропоследовательностей NGF и BDNF различны.

В то же время остается открытым вопрос о возможности введения структурных изменений в молекулу зрелого нейротрофина при взаимодействии с различными вариантами пропептида. Наши данные, полученные при сворачивании нейротрофина NGF в присутствии природной и гетерологичной пропоследовательности, позволяют предполагать наличие конформационных изомеров NGF. Дальнейшие исследования, в том числе и структурные, позволят подтвердить или опровергнуть вероятность образования различных конформеров нейротрофических факторов на базе одной аминокислотной последовательности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Рафиева, Лола Маратовна, 2009 год

1. ОдинакМ.М., Цыган Н.В. Факторы роста нервной ткани в центральной нервной системе. Монография. Санкт-Петербург: Наука, 2005. 157 с.

2. Wikipedia. http://ru.wikipedia.org

3. KorschingS. The neurotrophic factor concept: a reexamination. // The Journal of Neuroscience, 1993,13(7):2739-2748.

4. Levi-Montalcini R, Meyer H. HumburgerV. In vitro experiments on the effects of mouse sarcomas 180 and 37 on the spinal and sympathetic ganglia of the chick embryo. // Cancer Research, 1954,14(l):49-57.

5. Cohen S, Levi-Montalcini R, Hamburger V. A nerve growth-stimulating factor isolated from sarcomas 37 and 180. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1954, 40(10): 1014-1018.

6. BuekerED. Implantation of tumor into hide limb of the embryonic chick and developmental response of the lumbosacral nervous system. // The Anatomical Record, 1948,102:369-390.

7. Levi-Montalcini R, Hamburger V. Selective growth-stimulation effects of mouse sarcoma on the sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo. // The Journal of Experimental Zoology, 1951,116(2) :321-362.

8. Levi-Montalcini R. Effects of mouse tumor transplants on nervous system. II Annals of the New York Academy of Science, 1952, 55(2):330-343.

9. Cohen S. Purification and metabolic effects of a nerve growth-promoting protein from snake venom. // The Journal of Biological Chemistry, 1959, 234(5): 1129-1137.

10. Cohen S. Purification of a nerve-growth promoting protein from the mouse salivary gland and its neurocytotoxic antiserum. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1960, 46(3):302-311.

11. Hamburger V, Levi-Montalcini R. Proliferation, differentiation and degeneration in the spinal ganglia of the chick embryo under normal and experimental conditions. // The Journal of Experimental Zoology, 1949,111(3):457-501.

12. Cohen S, Levi-Montalcini R. A nerve growth-stimulating factor isolated from snake venom. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1956, 42(9):571-574.

13. Levi-Montalcini R, Cohen S. In vitro and in vivo effects of a nerve growth stimulating agent isolated from snake venom. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1956, 42(9):695-699.

14. Chretien M. Action of testosterone on the differentiation and secretory activity of a target organ: the submaxillary gland of the mouse. // International Review of Cytology, 1977, 50:333-396.

15. Thoenen H, BardeYA. Physiology of nerve growth factor. // Physiological Reviews, 1980, 60(4):1284-1335.

16. Caramia F, Angeletti PU, Levi-Montalcini R. Experimental analysis of the mouse submaxillary gland in relationship to its nerve growth factor content. // Endocrinology, 1962, 70:915-922.

17. Varon S, Nomura J, Shooter EM. The isolation of mouse nerve growth factor protein on a high molecular weight form. // Biochemistry, 1967, 6(7):2203-2209.18.