Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Мурина, Марина Алексеевна

• Мурина, Марина Алексеевна
• доктор биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации доктор биологических наук Мурина, Марина Алексеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Физико-химические свойства продуктов реакции, катализируемой миелопероксидазой: гипохлорита и хлораминовых производных аминокислот

2. Структура и функции тромбоцитов.

2 Л. Строение тромбоцитов.

2.2. Механизм активации, агрегация и секреция тромбоцитов.

2.3. Система трансдукции сигнала в тромбоцитах.

2.4. Роль тромбоцитов в патогенезе сосудистых заболеваний и противотромбоцитарные препараты

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реактивы.

1.1. Получение хлораминовых производных аминокислот и таурина

2. Объекты исследования.

2.1 .Получение образцов тромбоцитов кролика.

2.2. Приготовление образцов тромбоцитов человека.

2.3. Выделение мононуклеарных клеток, нейтрофилов и суммарной фракции лейкоцитов.

2.4. Выделение эритроцитов.

3. Методы исследования.

3.1. Регистрация агрегации тромбоцитов и лейкоцитов

3.2. Регистрация дезагрегации тромбоцитов.

3.3. Регистрация изменения формы тромбоцитов.

3.4. Регистрация продуктов пероксидации липидов.

3.5. Исследование реакции выброса цитоплазматических гранул и транспорта в гранулярный аппарат в тромбоцитах.

3.6. Флуориметрическое определение модификации аминогрупп

3.7. Спектрофотометрическое определение сульфгидрильных групп

3.8. Регистрация агрегации эритроцитов

3.9. Кинетический гемолиз эритроцитов

3.10. УФ-облучение исследуемых образцов

3.11. Статистическая обработка полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Действие гипохлорита натрия на функциональную активность тромбоцитов.

1.1 .Действие гипохлорита натрия на изолированные тромбоциты

1.2. Действие гипохлорита на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы

1.3.Прямое и косвенное действие гипохлорита натрия на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы.

1.4. Восстановление плазмой и ее компанентами агрегации тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия

1.5. Влияние компонентов плазмы, модифицированных гипохлоритом натрия, на агрегацию нативных тромбоцитов

Г ЛАВА 2. Действие хлораминовых производных биогенных соединений на различные функциональные процессы в тромбоцитах

2.1. Противотромбоцитарное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина.

2.2. Действие N-хлораминокислот на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в присутствии серосодержащих соединений.

2.3. Влияние N-хлораминокислот на изменение формы тромбоцитов

2.4. Влияние N-хлораминокислот на транспорт, приводящий к накоплению акридинового оранжевого в гранулярном аппарате тромбоцитов.

2.5. Зависимость противоагрегационного действия N-хлораминокислот от состояния тромбоцитов кролика.

ГЛАВА 3. Ингибирование агрегации тромбоцитов в зависимости от физико-химических свойств хлораминовых производных аминокислот.

3.1. Концентрационная зависимость антиагрегационного действия N-хлораминокислот на тромбоциты

3.2. Зависимость ингибирования агрегации тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазмы от молекулярной массы

N-хлораминокислот

3.3. Зависимость антиагрегационного действия N-хлораминокислот от положения в молекуле хлораминовой группы.

3.4. Ингибирование N-хлораминокислотами агрегации тромбоцитов в составе цельной крови в зависимости от молекулярной массы.

ГЛАВА 4. Взаимодействие гипохлорита натрия и хлораминовых соединений с биологически важными веществами и компонентами тромбоцитов

4.1. Исследование относительных констант скорости взаимодействия гипохлорита натрия с аминокислотами и пептидами

4.2.Сравнительная эффективность взаимодействия К^-дихлортаурина с различными серосодержащими группами

4.3. Стехиометрия взаимодействия гипохлорита натрия и 1Ч,М-дихлортаурина с серосодержащими соединениями

4.4. Модификация сульфгидрильных и аминогрупп тромбоцитов при изменении их агрегационной активности гипохлоритом и хлораминовыми соединениями.

4.5. Особенности ингибирования начальной агрегации тромбоцитов исследуемыми соединениями при действии разных агонистов.

ГЛАВА 5 . Действие И^-дихлортаурина на тромбоциты.

5.1. Получение твердого стабильного препарата 1М,Ы-дихлортаурина.

5.2. Антиагрегационное действие хлораминовых производных таурина и аминокислот на нативные и предстимулированные тромбоциты человека.

5.3. Подавление хлораминовыми производными аминокислот и таурина секреции АТФ в тромбоцитах человека

5.4. Действие 1Ч,1Ч-дихлортаурина на циклооксигеназную пероксидацию и агрегацию изолированных тромбоцитов

5.5. Ингибирование начальной агрегации и дезагрегация тромбоцитов человека при действии М,1Ч-дихлортаурина

5.6. Сравнительная оценка эффективности противотромбоцитарного действия аспирина, тиклопидина и Ы^-дихлортаурина

5.7. Антиагрегационное действие ]Ч[,Ы-дихлортаурина in vivo на тромбоциты кролика

ГЛАВА 6. Действие хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия на эритроциты и лейкоциты.

6.1. Гемолиз и агрегация эритроцитов при действии N-хлораминокислот.

6.2. Действие гипохлорита натрия и М,]М-дихлортаурина на лейкоциты.

6.3. Избирательность действия хлораминовых соединений при их введении в кровь и обогащенную тромбоцитами плазму.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия»

Изучение физико-химических механизмов модуляции активности клеток крови биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия является актуальным по ряду причин.

Во-первых, хлорноватистая кислота (ионизированная форма - гипохлорит-анион) продуцируется в организме фагоцитирующими клетками в реакции, катализируемой миелопероксидазой. Как вторичные продукты этой реакции, при взаимодействии гипохлорита с биогенными аминами образуются хлораминовые производные аминокислот и родственных соединений [156, 248, 265]. Поскольку и гипохлорит и хлораминовые соединения могут образоваться в местах скопления активированных моноцитов-макрофагов или нейтрофилов в достаточно высоких количествах до 0,1 мМ [200], то кроме взаимодействия с чужеродными агентами, роль этих соединений в модификации самих нейтрофилов и других клеток крови представляется вполне реальной in vivo. Таким образом, в организме возможно межклеточное взаимодействие, заключающееся в изменении функций клеток крови под влиянием фагоцитов.

Механизм действия хлораминовых соединений и гипохлорита натрия на клетки крови мало изучен. Известно, что хлораминовые производные биогенных соединений по сравнению с гипохлоритом гораздо слабее модифицируют эритроциты и лейкоциты [125, 275]. В последнее время получены сведения о том, что N-монохлортаурин способен снижать образование тканеиовреждающих медиаторов воспаления макрофагами (оксида азота, альфа-фактора некроза опухоли, простагландина Е2), тем самым защищая ткани от повреждения [153, 194, 195]. Показано [103], что N-монохлортаурин способен ингибировать коллагеназу, причем этот эффект специфичен по отношению к N-монохлортаурину, так как хлораминовые производные аланина и лейцина не обладают таким свойством. Таким образом, N-монохлортаурин, снижая уровень медиаторов воспаления, повреждающих ткани, может выступать в качестве физиологического регулятора функций макрофагов.

К началу работы в литературе практически отсутствовали данные о молекулярно-клеточных механизмах действия гипохлорита и хлорамининовых соединений на тромбоциты.

Во-вторых, в последнее время гипохлорит натрия, получаемый электрохимическим способом, предложен Сергиенко В.И. с соавторами (19851996) как детоксицирующее средство при эндо- и экзотоксикозах, находит применение в клинике. При внутривенном введении гипохлорита натрия могут образовываться хлораминовые производные биогенных соединений. В связи с этим возникает необходимость изучения модифицирующего действия как гипохлорита, так и хлораминов на компоненты крови; это действие может выступать в качестве побочного эффекта.

В-третьих, важно, что биогенные хлорамины, как установлено нами, оказывают выраженное противоагрегационное действие на тромбоциты. Повышенная функциональная активность тромбоцитов играет ведущую роль в патогенезе артериальных тромбозов и синдрома диссеминированного внутрисосудисгого свертывания крови [1, 15, 16, 27, 56, 57, 277]. Для предотвращения и лечения таких состояний может требоваться генерализованное ингибирование тромбоцитов. Предотвращение активации тромбоцитов представляет интерес и с точки зрения усовершенствования способов хранения тромбоцитарного концентрата, так как известно, что его срок хранения в обычных условиях во многом ограничивается постепенной активацией клеток. Поэтому актуальной проблемой является поиск и разработка новых эффективных препаратов противогромбоцитарного типа действия. Хлораминовые производные биогенных соединений были предложены в качестве основы для разработки нового противотромбоцитарного средства. N-Хлораминокислоты, также как и ацетилсалициловая кислота (аспирин), химически модифицируют плазматическую мембрану тромбоцитов. Это ведет к генерализованному ингибированию функциональной активности тромбоцитов, то есть ингибированию их активации независимо от природы агониста.

Целью настоящей работы было выяснение молекулярно-клеточных основ модификации структуры и функций тромбоцитов биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия; выявление свойств хлораминовых соединений, существенных для их использования в качестве противотромбоцитарного средства.

Работа состоит из 3 основных разделов, в первом из которых представлен обзор литературы. В нем содержатся данные по физико-химическим свойствам гипохлорита натрия и хлораминовых производных аминокислот. Также рассмотрены структура и функции тромбоцитов, механизмы их активации и агрегации, роль тромбоцитов в патогенезе сосудистых заболеваний. Во втором разделе представлены материалы и методы, использованные в работе. Далее идут 6 основных глав, содержащие экспериментальные результаты работы: проведено систематическое исследование молекулярно-клеточных механизмов действия гипохлорита и хлораминовых соединений на свойства тромбоцитов, изучены механизмы действия гипохлорита натрия и хлораминов на лейкоциты и эритроциты.

В результате проведенных исследований обнаружено явление ингибирования гипохлоритом натрия и хлораминовыми соединениями функциональных процессов в тромбоцитах, включая рецептор-зависимую агрегацию, секрецию плотных гранул, циклооксигеназную пероксидацию липидов. Получены сведения в пользу эффективного нарушения гипохлоритом системы внутриклеточной трансдукции сигнала в тромбоцитах. В результате проведенных исследований был установлен один из возможных первичных механизмов действия гипохлорита и хлораминов на клетки крови, а именно модификация поверхностных сульфгидрильных и аминогрупп мембран этих клеток.

Показано, что изменение функций тромбоцитов происходит в результате прямого взаимодействия гипохлорита с тромбоцитами и за счет модификаций компонентов плазмы. К числу этих компонентов относятся главным образом белки и аминокислоты. Обнаружено явление восстановления нативной плазмой функциональной активности тромбоцитов, инактивированных гипохлоритом натрия. Основным восстанавливающим компонентом является фибриноген.

Предложено использовать гипохлорит натрия с целью генерализованного подавления активности тромбоцитов в качестве консерванта при хранении тромбоцитарного концентрата.

Установлено, что ингибирование агрегационной способности тромбоцитов хлораминами не зависит от природы агониста, но при действии гипохлорита природа агониста существенна. Наибольшее ингибирование гипохлоритом наблюдается в случае агонистов ионов кальция и адреналина. Такой же результат получен при действии реагента на сульфгидрильные группы -дитионитробензойной кислоты. Возможно, что сильный эффект гипохлорита обусловлен модификацией тиолов кальциевых каналов.

Для выяснения взаимодействия гипохлорита и хлораминов с различными химическими группами определены относительные константы скорости реакции гипохлорита натрия с активными группами некоторых аминокислот и пептидов, а также проведена оценка эффективности взаимодействия Ы,Ы-дихлортаурина с серосодержащими соединениями. Получено, что наибольшая константа скорости характерна для реакции исследуемых соединний с сульфгидрильными группами.

Обнаружено, что действие хлораминов аминокислот на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы зависит от их структуры, молекулярной массы. Соединения с пониженной молекулярной массой (N-хлорсерин, N-хлораланин, N-хлорглицин) оказывают более сильный противоагрегационный эффект, чем соединения с повышенной молекулярной массой (от N-хлорфенилаланина до N-хлотреонина). Вероятно, соединения с пониженной молекулярной массой взаимодействуют с химическими группами в углублениях мембран тромбоцитов, куда ограничен доступ более крупных молекул.

Показано, что в качестве возможного противотромбоцитарного средства перспективен М,К-дихлортаурин. Он получен в твердом состоянии, характеризутся высокой стабильностью. N.N-Дихлортаурип оказывает генерализованное противотромбоцитное действие: угнетает агрегационную акивность тромбоцитов и секрецию плотных гранул, вызывает дезагрегацию агрегированных тромбоцитов. На кроликах in vivo показано, что 1Ч,М-дихлортаурин оказывает выраженное угнетение агрегационной активности тромбоцитов в тесте с рядом таких агонистов, как коллаген, АДФ, адреналин. Показано, что 1Ч,Тч1-дихлортаурин и общепринятые антитромбоцитарные препараты аспирин и тиклопидин при введении в кровь человека одинаково эффективно подавляют агрегацию

11 тромбоцитов. При введении ]Ч,1Ч-дихлортаурина в цельную кровь человека значительное ингибирование агрегации тромбоцитов не сопровождается заметным повреждением эритроцитов.

Представляемая работа выполнялась в лаборатории физико-химических методов исследования и анализа отдела биофизики (руководитель отдела -академик РАМН, профессор Владимиров Ю.А.) в НИИ физико-химической медицины (директор - академик РАМН, профессор Лопухин Ю.М.). Часть исследования была проведена на кафедре биофизики Российского государственного медицинского университета.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Мурина, Марина Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Гипохлорит натрия ингибирует функциональные процессы в тромбоцитах: начальную агрегацию (образование мелких агрегатов), обнаруживаемую нефелометрическим методом, конечную агрегацию, реакцию выброса цитоплазматических гранул, контролируемую по выходу акридинового оранжевого, циклооксигеназную пероксидацию липидов.

В изолированных клетках ингибирование процессов на 50 % наступает при концентрациях гипохлорита от 10 до 40 мкМ в зависимости от вида процесса и природы агониста. В интервале небольших концентраций гипохлорита натрия начальная агрегация, реакция выброса и циклооксигеназная пероксидация липидов в тромбоцитах ингибируются сильнее конечной агрегации.

2. В случае обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) агрегация тромбоцитов ингибируется гипохлоритом натрия в концентрациях 1-2 мМ. При этом гипохлорит не оказывает влияния, судя по турбидиметрическим показателям, на форму исходных клеток и процесс перехода клеток из дискоидной в сфероидную форму при их активации. Экзогенные аминокислоты и таурин вызывают необычный эффект: антиагрегационное действие гипохлорита резко усиливается.

3. В ОТП антиагрегационное действие гипохлорита носит преимущественно косвенный характер - обусловлено первичной модификацией компонентов плазмы. Предварительно модифицированные гипохлоритом плазма, сывороточный альбумин, фибриноген ослабляют агрегацию изолированных тромбоцитов.

Нативная плазма и фибриноген восстанавливают агрегационную способность тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом.

4. Обнаружено сильное антиагрегационное действие на тромбоциты в изолированном состоянии и ОТП хлораминовых производных аминокислот и родственных им соединений. Образование хлораминов обусловливает усиление действия гипохлорита на тромбоциты в ОТП экзогенными аминокислотами. N-Хлораминокислоты также ингибируют реакцию выброса АТФ из тромбоцитов.

5. Антиагрегационное действие N-хлораминокислот на тромбоциты проявляется при их активации различными агонистами (АДФ, коллагеном, адреналином, тромбином), то есть носит генерализованный характер. Для ингибирования агрегации изолированных клеток на 50 % требуется концентрация хлораминокислот 20-30 мкМ, а в случае ОТП и наиболее эффективных соединений

- около 0,5 мМ.

Степень подавления N-хлорглицином и N-хлорлейцином АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов описывается степенной функцией от концентрации хлораминов; показатель степени близок к двум. Вероятно, необходимы по крайней мере две модификации мембраны тромбоцита для угнетения его агрегационной активности.

Транспорт флуоресцентного зонда акридинового оранжевого в цитоплазмагические гранулы тромбоцитов не ингибируется N-хлораминокислотами. Можно предполагать, что хлорамины в исследуемых условиях существенно не проникают внутрь тромбоцитов.

6. Ингибирование агрегации тромбоцитов зависит от строения и физико-химических характеристик (молекулярной массы, ван-дер-ваальсового объема молекулы) N-хлораминокислот. В обогащенной тромбоцитами плазме антиагрегационный эффект в ряду: N-хлортреонин - N-хлорсерин - N-хлораланин

- N-хлорглицин, резко возрастает с уменьшением молекулярной массы. Это, вероятно, обусловлено их взаимодействием с химическими группами, находящимися в узком кармане тромбоцитов. Зависимость ингибирующего действия соединений указанного ряда от молекулярной массы (т) эмпирически описывается формулой вида /я(АТк /AT) = G ехр(-1т), где АТК и AT - степень агрегации в контроле и опыте, a G и / - константы; / > 0.

N-Хлораминокислоты с повышенной молекулярной массой от N-хлорфенилаланина до N-хлорлейцина включительно (198,5-164,5 дальтон; ван-деру ваальсовый объем 0,169-0,151 нм) оказывают одинаковое и пониженное антиагрегационное действие на тромбоциты.

7. При сравнении антиагрегационной активности соединений с различным расположением хлораминовой группы в молекуле показано, что более эффективны хлорамины с удаленной от карбоксильной хлораминовой группой (на 3-5 атомов углерода). Можно предположить наличие отрицательного заряженной группы в месте взаимодействия хлораминов с мембраной тромбоцитов.

8. В цельной крови все исследуемые N-хлораминокислоты, за исключением N-хлорфенилаланина, оказывают приблизительно одинаковый антиагрегационный эффект на тромбоциты. Наблюдаемое при этом ослабление действия N-хлораминокислот с пониженной молекулярной массой обусловлено их большей реакционной способностью по отношению к эритроцитам; взаимодействие с лейкоцитами не существенно.

9. Данные по ингибирующему действию ряда аминокислот и пептидов на окисление билирубина или иодида калия показывают, что наиболее эффективно с гипохлоритом натрия и хлораминами взаимодействуют сульфгидрильные группы. Соотношение констант скоростей реакции гипохлорита с активными химическими группами восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, аланина и серина, оцененное на основании интегральных кинетических формул, приближенно составляет соответственно 48 : 6,9 : 5,5 : 2,4.

Взаимодействие гипохлорита и N,N-дихлортаурина с серосодержащими группами осуществляется по различным механизмам. С одной тиометильной группой метионина, с сульфгидрильной или дисульфидной группой глутатиона в расчете на активный хлор реагируют соответственно 3,3±0.1. 3,1±0,1, 6,0±0.1 молекул гипохлорита, тогда как в случае N.N-д ихл ортаур и на - соответственно 1,4±0,1, 2,6±0,2, 4,1±0,2 хлораминовых групп.

10. В плазматической мембране тромбоцитов уже при низких концентрациях гипохлорита натрия (менее 20 мкМ) наблюдается заметное разрушение периферийных сульфгидрильных групп. Аминогруппы плазматической мембраны тромбоцитов, как установлено с помощью флуоресцентной метки флуорескамина, также модифицируются при действии гипохлорита. Одинаковая с сульфгидрильными группами степень модификации аминогрупп проявляется при концентрациях гипохлорита примерно в два раза более высоких. Можно полагать, что функциональное действие гипохлорита сопряжено с модификацией мембранных тиолов и аминогрупп, причем первые наиболее существенны при его малых концентрациях.

11. N-Хлораминокислоты при введении в кровь проявляют значительную избирательность действия на тромбоциты. Это следует из результатов сравнения

199 величин концентраций хлораминов, вызывающих 50 % ингибирование агрегации тромбоцитов в изолированном состоянии и крови.

В крови хлорамины в концентрациях, приводящих к подавлению агрегации тромбоцитов на 50 %, не вызывают существенной модификации эритроцитов по критерию их гемолиза за период примерно 10 часов и агрегации. Гемолитическое повреждение эритроцитов вызывается хлораминами в количествах, на 2-3 порядка выше необходимых для угнетения агрегации тромбоцитов.

12. Впервые получен Н>1-дихлортаурин в виде твердого стабильного препарата. Показана его антитромбоцитарная активность при введении in vitro в кровь человека, in vitro и in vivo на животных. Существует перспектива использования N, N - д и хл opi ay ри на как антитромбоцитарного средства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гипохлорит натрия оказывает свое действие на клетки крови в концентрациях 1-100 мкМ. Встает вопрос, насколько эти концентрации соизмеримы с концентрациями гипохлорита, образующимися при активации нейтрофилов. По данным Slivka [240], стимулированные форболмеристатом нейтрофилы (2 105 клеток) могут синтезировать около 10 наномолей хлорноватистой кислоты, и в очаге воспаления концентрация гипохлорита может достигать 0,1 мМ [200]. Интересно отметить, что в клинической практике используется 0,8 мМ раствор гипохлорита натрия при его введении в кровь в объеме, не превышающем 1/10 объема циркулирующей крови. Таким образом, используемые нами концентрации гипохлорита натрия являются вполне физиологическими.

При изучении действия гипохлорита на изолированные тромбоциты, было показано, что в концентрациях 10-100 мкМ гипохлорит натрия ингибирует агрегацию, реакцию выброса и циклооксигеназную пероксидацию в этих клетках, индуцированные тромбином. Наблюдалось различие в действии низких (около 10 мкМ) и высоких концентраций гипохлорита: циклооксигеназная пероксидация и реакция выброса в тромбоцитах ингибировались гипохлоритом натрия в концентрации 10 мкМ гораздо сильнее, чем их агрегация. Получено, что константа скорости реакции гипохлорита с сульфгидрильной группой примерно на порядок выше константы скорости реакции с аминогруппой. Возможно, для низких концентраций начальным этапом действия гипохлорита может быть некоторая модификация мембран клеток вследствие его взаимодействия с поверхностными сульфгидрильными группами, в результате чего происходит изменение механизмов внутриклеточной передачи сигнала. При увеличении концентрации гипохлорита его ингибирующее действие, по-видимому, связано с более существенной перестройкой мембраны, вследствие чего может происходить инактивация поверхностных рецепторов. При увеличении концентрации гипохлорита натрия функциональные процессы в тромбоцитах (агрегация и реакция выброса) ингибировались сходным образом. Существенную роль в подобной инактивации может играть модификация под действием гипохлорита доступных периферических сульфгидрильных и аминогрупп. Получено, что при действии гипохлорита (40 мкМ) происходит модификация примерно 40 и 15 % соответственно периферических сульфгидрильных и аминогрупп тромбоцитов.

Кроме прямого ингибирующего действия на тромбоциты гипохлорит оказывает косвенное действие - через модификацию компонентов плазмы. Было показано, что сывороточный альбумин, фибриноген и аланин, модифицированные гипохлоритом натрия, ослабляют агрегацию тромбоцитов, индуцированную тромбином. Это свидетельствует о том, что косвенное антиагрегационное действие гипохлорита натрия при его введении в обогащенную тромбоцитами плазму является результатом первоначальной модификации многих белков и аминокислот. В случае соединений, содержащих аминогруппы, эта модификация представляет собой образование хлораминовой группы. Именно эти группы существенны для антиагрегационных свойств модифицированных белков и аминокислот.

Нативная плазма и фибриноген эффективно устраняют модификации тромбоцитов, возникающие при прямом действии гипохлорита. Все это позволяет считать, что прямое действие гипохлорита натрия на тромбоцит ы сопряжено с его взаимодействием с плазматической мембраной, а не с компонентами цитоплазмы. В данных, касающихся участия фибриногена в косвенном действии гипохлорита и восстановлении модифицированных тромбоцитов, можно усмотреть некоторое противоречие. Допустим, что восстановление модифицированных тромбоцитов (Тц*) происходит в химической реакции с образованием модифицированного фибриногена (ФГ*). Но такой модифицированный фибриноген инакгивирует клетки. Противоречие снимается, если рассматриваемые процессы являются взаимно обратимыми, по схеме:

Тц* + ФГ^Тц + ФГ* Здесь Тц и ФГ - нативные тромбоциты и фибриноген.

В опытах с восстановлением равновесие сдвинуто вправо вследствие высокой концентрации нативного фибриногена. Антиагрегационное действие предварительно модифицированного фибриногена проявляется за счет сдвига равновесия влево. Конечно, не исключено, что процессы восстановления и инактивации тромбоцитов с участием фибриногена различны по физикохимической природе. Тогда они могут и не быть взаимно обратимыми. Как бы то ни было, важно, что в изученной системе наблюдается восстановление плазмой инактивированных тромбоцитов и дальнейшее изучение этой системы будет полезно для разработки способов хранения тромбоцитарной массы.

Согласно полученным результатам, хлораминовые производные аминокислот обладают сильным антиагрегационным действием на тромбоциты в составе ОТП в концентрациях 0,5-1 мМ. Эффект ингибирования агрегации тромбоцитов N-хлораминокислотами зависит от молекулярной массы (молекулярного объема) этих соединений. Хлораминовые производные фенилаланина, глютамина и лейцина, имеющие значительную молекулярную массу (199,45-153,45 Да) и, соответственно, большой молекулярный ван-дер-ваальсовый объем (0,169-0,151 нм3), оказывают приблизительно одинаковый антиагрегационный эффект. Это может быть результатом того, что данные соединения взаимодействуют одновременно с однотипными химическими группами тромбоцитов и компонентов плазмы. Антиагрегационный эффект других N-хлораминокислот резко возрастает с уменьшением молекулярной массы соединений. Более сильное ингибирующее действие N-хлораминокислот с пониженной молекулярной массой (вторая группа) можно объяснить их взаимодействием с химическими группами в плазматической мембране тромбоцита, стерически недоступными для соединений с повышенной молекулярной массой.

Зависимость антиагрегационного эффекта N-хлораминокислот второй группы от их молекулярной массы аппроксимируется уравнением, в котором отношение константы скорости реакции N-хлораминокислоты с тромбоцитами к константе ее взаимодействия с плазмой увеличивается с уменьшением молекулярной массы по экспоненциальному закону.

Проведено исследование зависимости антиагрегационного эффекта от концентрации отдельно взятых хлораминовых производных глицина и лейцина. Выяснено, что эту зависимость можно аппроксимировать степенной функцией, показатель степени которой, близкий к 2 для этих соединений, указывает, что необходимо по крайней мере две модификации мембраны тромбоцита для утраты клеткой агрегационной активности.

Показано, что при снижении концентрации тромбоцитов в ОТП хлораминовые производные аминокислот с повышенной молекулярной массой ингибируют агрегацию тромбоцитов несколько слабее, чем в случае неразведенной ОТП, что является следствием повышенного расходования соединений в реакциях с компонентами плазмы. Кроме того, на примере метионина показано, что введение в ОТП серосодержащих соединений приводит к снижению антиагрегационного эффекта всех исследованных N-хлораминокислот.

Влияние хлораминовых производных глицина и лейцина в конечной концентрации 1 мМ на трансформацию формы АДФ-активированных тромбоцитов слабо выражено по сравнению с их антиагрегационным действием в ОТП; не выявлено изменения процесса транспорта флуоресцентного зонда акридинового оранжевого в клетки под действием этих соединений.

Обнаружено, что эффективность действия N-хлораминокислот на агрегацию тромбоцитов при их введении в кровь меняется. Все исследуемые соединения, за исключением N-хлорфенилаланина, оказывают приблизительно одинаковый антиагрегационный эффект. Это является следствием ослабления действия на тромбоциты соединений с пониженной молекулярной массой. Полученные нами данные свидетельствуют, что лейкоциты в количестве, соответствующем их содержанию в крови, не оказывают влияния на антиагрегационный эффект всех N-хлораминокислот. Следовательно, можно полагать, что в крови N-хлораминокислоты с пониженной молекулярной массой конкурентно больше расходуются в реакциях взаимодействия с эритроцитами, чем с плазмой и тромбоцитами.

Заметно повышенную антиагрегационную активность в составе цельной крови при активации тромбоцитов агонистами АДФ и коллагеном проявляет N-хлорфенилаланин. Возможно, это обусловлено его более медленным взаимодействием с эритроцитами, в результате чего большее количество соединения взаимодействует с тромбоцитами.

При изучении действия N-хлораминокислот и ^^дихлортаурина на изолированные эритроциты было показано, что данные соединения взаимодействуют с эритроцитами. Однако важно отметить, что в крови в результате такого взаимодействия не происходит заметного повреждения эритроцитов по критерию гемолиза. В условиях, соответствующих сильному угнетению активности тромбоцитов (при введении в цельную кровь человека N,N-дихлортаурина в концентрации 1 мМ), на эритроциты приходится около 0,2 нмоль на 1 миллион клеток. Добавление в суспензию изолированных эритроцитов N,N-дихлортаурина из расчета 0,2 нмоль на 1 миллион клеток не вызывало гемолиза даже за длительный промежуток времени (12 часов) (рис. 69). Гемолиз эритроцитов регистрировался при использовании Ы,1\Г-дихлортаурина в концентрациях примерно в 1000 раз более высоких. Экстраполяция данных на низкие концентрации дихлортаурина при условии постоянства механизма модификации мембран показывает, что гемолиз эритроцитов в крови с 1 мМ N,N-дихлортаурина следует ожидать через сроки, превышающие время их жизни в организме.

Получены аргументы в пользу того, что в крови и ОТП имеет место избирательность действия хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты, то есть тромбоциты в сравнении с другими составляющими крови характеризуются повышенной способностью к взаимодействию с хлораминами. Возможно, это обусловлено тем, что плазматическая мембрана тромбоцитов, с которой прежде всего взаимодействуют хлорамины, имеет особое происхождение, формируется из плазматического ретикулума мегакариоцитов. Избирательность действия хлораминовых производных аминокислот и таурина на тромбоциты в составе ОТП и крови, по-видимому, определяется большим количеством серосодержащих групп рецепторных белков плазматической мембраны тромбоцита, с которыми эффективно реагируют хлорамины. Например, согласно данным литературы, молекула фибриногенового рецептора GP ПЬ-Ша содержит в своем составе 29 дисульфидных связей, 21 из которых определяет четвертичную структуру гликопротеина GP Ша, и 8 дисульфидных групп входят в состав GP lib [73,74]. Эти группы имеются также в структуре коллагенового (содержит 35 полуцистиновых остатков), аг-адренергического рецепторов плазматической мембраны тромбоцитов [181].

Хлораминовые соединения эффективно реагируют с серосодержащими соединениями. Мембранные сульфгидрильные группы играют важную роль в процессах адгезии и агрегации тромбоцитов. Химическая модификация сульфгидрильиых плазматических мембран приводит к угнетению агрегационной активности тромбоцитов. В наших экспериментах введение в цельную кровь N-метилмалеимида (модификатора SH-групп, проникающего внутрь мембраны и в цитоплазму) в конечной концентрации 300 мкМ снижало на 50 % АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека в составе ОТП. В суспензии изолированных тромбоцитов подавление агрегации в два раза наблюдали при действии N-метилмалеимида в конечной концентрации около 3 мкМ. Таким образом, тромбоциты (по критерию агрегации) проявляют высокую чувствительность к химической трансформации сульфгидрильиых групп. Концентрация мембранных периферических сульфгидрильиых групп всех тромбоцитов составляет приблизительно 20 мкМ (рис. 32-33) [280]. Указанный очень сильный антиагрегационный эффект N-метилмалеимида, вероятно, обусловлен его взаимодействием с внутримембранными сульфгидрильными группами.

N-Хлораминовые соединения окисляют в пределе только примерно 50 % периферических сульфгидрильиых групп тромбоцитов (рис. 33) при концентрациях 80-100 мкМ, вызывающих сильное ингибирование агрегации изолированных клеток (см., например, рис. 43). Вероятно, взаимодействие хлораминокислот с другими химическими группами (дисульфидными и др.) вносит дополнительный вклад в противотромбоцитарный эффект N-хлораминов.

Секреторная активность тромбоцитов, отражающая выброс во внеклеточную среду содержимого плотных гранул и приводящая к каскадной активации клеток крови, подавлялась хлораминовыми производными аминокислот и таурина в большей степени, чем агрегация: в одинаковых условиях снижение степени секреции тромбоцитов на 60-70 % сопровождалось угнетением их агрегации на 2535 %. Таким образом, мембранные структуры тромбоцитов, обеспечивающие реакцию выброса гранулярного аппарата, сильно модифицируются хлораминами. В этой связи необходимо вспомнить, что коллаген- и адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов кролика, сопровождающаяся реакцией выброса, подавлялась N-хлораминокислотами в большей степени, чем агрегация, вызванная АДФ и протекающая без стимуляции реакции выброса.

Итак, химическая модификации плазматической мембраны тромбоцитов может привести к инактивации рецепторов к тромбоцитарным агонистам и генерализованному подавлению агрегации и секреции тромбоцитов.

Работы многих исследователей направлены на поиск и создание лекарственных средств, способных предотвращать аретериальные тромбозы путем ингибирования активности тромбоцитов [56, 57, 227]. Химическая модификация плазматической мембраны тромбоцита в целом может обеспечить генерализованное ингибирование тромбоцитов, т.е. ингибирование их активации в ответ на действие любого агониста. Хлораминовые соединения, которые химически модифицируют серосодержащие группы плазматических мембран тромбоцитов, могут оказаться эффективными для этих целей. В результате этого могут образовываться дисульфиды тиолов, а также сульфеновые и сульфоновые группы. Ожидается, что эти продукты являются безвредными, так как они образуются и при обычном метаболизме серосодержащих аминокислот. Следует подчеркнуть, что аспирин, широко используемый в клинике для предотвращения тромбозов (раздел "Обзор литературы"), также подавляет активность тромбоцитов путем их химической модификации, ацетилируя по гидроксильной группе серина циклооксигеназу тромбоцитов [216].

Известно, что гиперактивность тромбоцитов играет важную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Способность тромбоцитов к спонтанной агрегации в клинике является показателем риска развития острого инфаркта миокарда, в организме лишь часть тромбоцитов активируется субэндотелием в месте повреждения сосудистой стенки, остальные тромбоциты активируют друг друга [277]. Поэтому важным достоинством изученных хлораминов, как возможных антитромбоцитарных препаратов, является их способность подавлять агрегацию активированных тромбоцитов (рис. 51).

В ряду исследованных нами биогенных хлораминов лишь 1Ч,1Ч-дихлортаурин характеризуется химической устойчивостью и может считаться потенциально возможным кандидатом на роль противотромбоцитарного средства. N,N-Дихлортаурин нам удалось получить в виде твердого препарата. Важным достоинством КШ-дихлортаурина. наряду с антиагрегационной и антисекреторной активностью, следует считать его способность подавлять начальную агрегацию

195 тромбоцитов и вызывать распад уже образовавшихся агрегатов (дезагрегацию). Кроме того, сравнение эффективности антиагрегационного действия N,N-дихлортаурина с такими антитромбоцитарными препаратами, как аспирин и тиклопидин показало, что исследуемый М,1Ч-дихлортаурин при введении в кровь подавляет агрегацию тромбоцитов в составе ОТП не слабее препаратов сравнения (рис. 55, 56).

Таким образом, хлораминовые производные аминокислот и таурина способны подавлять агрегацию тромбоцитов человека, находящихся на разных этапах активации, угнетать секреторную активность тромбоцитов, циклооксигеназную пероксидацию и вызывать их дезагрегацию на фоне отсутствия заметного повреждения эритроцитов. Всё это позволяет рекомендовать данный класс соединений в качестве потенциальных тромбоцитарных ингибиторов для дальнейших исследований.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Мурина, Марина Алексеевна, 2000 год

1. Балашова Т.С., Кубатиев А.А.О возможности регуляции блокаторов S2 -рецепторов нафтидофурилом агрегационной способности тромбоцитов больных инсулин-зависимым сахарным диабетом.//Вопросы мед.химии.-1996-Т.4 -С.337-344.

2. Булегенов К.Е., Балмуханов Б.С. Агрегация эритроцитов в присутствии Альцианового голубого.// Кардиология,- 1993.- Т. 33.- № 4,- С. 42-44.

3. Ван де Хюлст Г. Рассеяние света малыми частицами. М., ИЛ, 1961

4. Ваншинкель Н.М., Петров Н.Н. Ультраструктура и функции тромбоцитов человека. Л.: Наука. - 1982.

5. Варфоломеев С.Д., Мевх АХ Простагландины молекулярные биорегуляторы.- Изд-во МГУ,- 1985.

6. Васильев Ю.Б., Сергиенко В.И., Гринберг В.А., Мартынов А.К. Электрохимические методы детоксикации в медцине. Моделирование монооксидаз печени и молекулярных механизмов фагоцитоза. -В кн.: Итоги науки и техники. Электрохимия .-Изд-во ВИНИТИ-1990- Т.31.

7. Васильев С.А., Жердева Л.В., Мазуров А.В. Наследственные дефекты мембранных гликопротеинов тромбоцитов. // Гематол. и трансфузиол. 1994. -Т. 39. -№ 1. - С. 34-38.

8. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран,- М.: Наука.- 1980.

9. Владимиров Ю.А., Оленев В.И., Суслова Т.Б., Потапенко А.Я. Механизм перекисного окисления липидов и его действие на биологические мембраны.- В кн.: Итоги науки и техники. Биофизика, Т.5.- М.: Изд-во ВИНИТИ,- 1975.

10. Ю.Гасилин B.C., Сидоренко Б.А. Стенокардия. М.: Медицина. - 1987.

11. П.Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Влияние низкомолекулярных соединений на хемилюминесценцию люминола, обусловленную действием продуктов миелопероксидазного катализа и экзогенного гипохлорита. // Биохимия,-1988,- Т.53,- Вып.12. С.2025-2032.

12. Горюнов А.В., Рощупкнн Д.И. Перекнсное окисление липидов в тромбоцитах, индуцированное УФ-облучением. // Биол. мембр.- 1989,- Т.6.- N 5.- С. 551 -554.

13. Духанин А.С., Губаева Ф.Р. Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов. // Эксперим. и клинич. фармакология. 1998. - Т. 61. - № 4. - С. 66-71.

14. Журавлёва И.А., Мухпелентьев И.А., Виноградов Н.А. Роль окиси азота в кардиологии и гастроэнтерологии.// Клинич. Мед. 1997,- Т. 75,- № 4.- С. 18-22.

15. Кубатиев А.А., Ядигарова З.Т., Рудько И.А., Быков В.А., Тюкавкина Н.А. Влияние диквертина на содержание циклических нуклеотидов в тромбоцитах.// Бюлл.экспериметальной биологии и медицины,-1999-Т. 128- С.267-270.

16. Кубатиев А. А., Андреев С.В. Эндогенные простагландины в динамике индуцированной агрегации тромбоцитов. // В кн.:Актуальные проблемы гемостазиологии. (Под редакцией Петровского Б.В., Чазова Е.И., Андреева С.В.). Изд-во «Наука» -М.- 1979- С. 115-118.

17. Кудрявцев Н.Т., Вячеславов П.М. Прикладная электрохимия,- JL: Медицина,-1980.

18. Лакин Г.Ф. Биометрия,- М.: Высшая школа.- 1990.

19. Мазуров А.В., Васильев С.А. Структура и функции мембранных гликопротеинов тромбоцитов. // Гематол. и трансфузиол. 1994. - Т. 39. - № 1. -С. 29-34.

20. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге.-Новосибирск: Наука.- 1989.

21. Межлумян А.Г., Гаврилов И.Ю., Попов Е.Г. Количественная оценка аккумулирующей способности интактных тромбоцитов с помощью флуоресцентных красителей. // Бюл. эксп. биол. и мед.- 1987,- N 7,- С. 119121.

22. Метелица В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии. М.: Медицина. - 1987.

23. Натвиг Д.Б. (ред.) Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика.- М.: Медицина.- 1980.

24. НикулинВ.А., Шура-БураБ.Л. //Врач, дело.- 1977,-N2,-С. 135 138.

25. Панасенко О.М. Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека. Дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук,- 1998 - М.

26. Панченков Г.М., Лебедев В.П. Химическая кинетика и катализ.// -1961- Изд. Московского университета 550 с.

27. Перцев С.С., Сосновский А.С., Кубатиев А.А., Пирогова Г.В.Влияние интерлейкина -1 р на агрегацию тромбоцитов у крыс Август, Вистар и ВЭГ при остром эмоциональном стрессе. Бюл. эксп. биол. и мед.- 1997- №8- С. 144-148.

28. Пеленицын А.Б., Потапенко А.Я., Рощупкин Д.И О механизме фотохимического окисления липидов в мембранах эритроцитов,- В кн.: Биоантиокислители.- М.: Наука.- 1975.

29. Пол У. Иммунология,- М.: Мир,- 1987.

30. Попов Е.Г., Габбасов Э.А., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Межлумян А.Г. Аккумуляция аминопроизводных акридина электронноилогными гранулами тромбоцитов. // Бюл. эксп. биол. и мед.- 1987,- N 10,- С. 435 438.

31. Попов Е.Г., Габбасов Э.А., Гаврилов И.Ю., Межлумян А.Г., Позин Е.Я. Способ исследования молекулярного переноса в клетках крови. // АС N 1363071.- Бюл. изобр. и откр,- 1987.- N 48.

32. Рощупкин Д.И. Молекулярные механизмы повреждения биомембран, липидов и белков под действием УФ-излучения.- Дисс. д.б.н.-М.- 1979.

33. Рощупкин Д.И. . Молекулярные механизмы фотоповреждения биологических мембран,- В кн.: Фотобиология животной клетки.- Л.: Наука.- 1977,- С. 23 34.

34. Рощупкин Д.И., Бержицкая В.В., Соколов А.Я. Изменение малоуглового рассеяния света тромбоцитами при их активации и агрегации.// Биофизика.-1998 -Т.43- С.503-510.

35. Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю. Способ исследования начальной агрегации тромбоцитов (варианты) и устройство для его осуществления (варианты). -Патент РФ. № 2067764.

36. Сидоренко Б.А., Преображенский Д.В. Антитромботические препараты, применяемые при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.// Кардиология. -1996,-№1,-С. 37-51.

37. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина. - 1985.

38. Чирков Ю.Ю., Белушкина Н.Н., Тыщук И. А., Северина И.С. Роль гуанилатциклазы в регуляции агрегации тромбоцитов человека. // Вестник АМН СССР, 1991.-С. 51.

39. Шаронов Б.П., Говорова Н.Ю., Лызлова С.Н. Антиокислительные свойства и деградация белков сыворотки активными формами кислорода (02\ ОСГ), генерируемыми стимулированными нейтрофилами. // Биохимия,- 1988,- т.53, вын.5,- С. 816 825.

40. Шаронов Б.П., Чурилова И.В. Окисление супероксиддисмутазы гипохлоритом. Появление изомеров, обладающих каталитической активностью.// Докл. АН СССР.-1990- Т.314-С.1500-1502.

41. Эмануэль Н.М., Сергеев Г.Б. (ред.). Экспериментальные методы химической кинетики,- М.: Высшая школа.- 1980.

42. Affolter PI., Pletscher A. Rheo-optical shape analysis of human blood platelets. // Thromb. Haemost. 1982. - V. 48. - P. 204-207.

43. Agbanyo F.R., Sixma J.J., Degroot P.O., Languino L.R., Plow E.F. Thrombospondin platelet interactions role of divalent cations, wall shear rate, and platelet membrane glycoproteins. // J. Clin. Invest. - 1993,- V. 92.- No. 1. - P. 288-296.

44. Aledort Г.М., Troup S.B., Weed R.I. Inhibition of sulfhydryl-dependent platelet functions by penetrating and non-penetrating analogues of parachloromercuribenzene. // Blood. 1968. - V.31. - No.3. - P.471-477.

45. Altman R., Scazziota A. Synergistic interactions of PAF-acether and sodium arachidonate in human platelet aggregation: unexpected results after aspirin intake. // Thromb. Res. 1986. - V. 43. - P. 113 - 120.

46. Ardlie N.G., Bell L.K., MeGuiness J.A. Synergistic potentiation by epinephrine of collagen or thrombin-induced calcium mobilization in human platelets. // Thromb. Res. 1987.-V. 46. - P.519 - 526.

47. Arnhold J., Wiegel D., Richter O., Hammerschmidt S.,Arnold K., Krumbiegel M. Modification of low density lipoproteins by sodium hypochlorite. // Biomed. Biochim. Acta.- 1991.- V. 50,- No. 3.- P. 967 973.

48. Arnhold J., Hammerschmidt S., Wagner M. , Muller S., Arnold K., Grimm E. On the action of Hypochlorite on human serum albumin. // Biomed. Biochim. Acta.- 1990-V.49-P.991-997.

49. Arnhold J., Herold W., Deev A.I. Reduction of amino groups and changes of the surface charge of liposomes on methylation and peroxidation. // Studia biophysica.- 1988.- V. 128.- No. 1,- P. 45 50.

50. Arnhold J., Mueller S., Arnold K., Sonntag K. Mechanisms of inhibition of chemiluminescence in the oxidation of luminol by sodium hypochlorite. // J. Biolumin. Chemilumin. 1993. - V. 6. - P. 307 - 313.

51. Aruoma O.I., Halliwell В., Holy B.N., Butler J. The antioxidant action of taurine hypotaurine and their metabolic precursors. // Biochim. J. -1988- V.256-P. 251-255.

52. Asakawa J., Matsushita S. // Lipids.- 1980,- V. 15,- No. 6,- P. 137 140.

53. Becker R.C. Thrombin antagonists and antiplatelet agents. // Am. J. Cardiol. 1992.-V. 69. P. 39A- 51A.

54. Becker R.C. Antiplatelet therapy in coronary heart disease. Emerging strategies for the treatment and prevention of acute myocardial infarction. // Arch. Pathol. Lab. Med. 1993.-V. 117.-.P. 89- 96.

55. Berliner S., Fishelson Z., Bruhis S., Kaufman H., Pinhas J., Aronson M. The phenomenon of leukergy: induction and detection of leukocyte aggregation in whole human blood. // J.Lab. and Clinic. Med. 1987. - V. 109. - P. 575 - 582.

56. Berkels R., Stockklauser K., Rosen P., Rosen R. Current status of platelet NO synthases.// Thromb. Reseach. 1997,- V. 87,- No. 1,- P.51-55.

57. Bertolino G., Noris P., Previtali M., et al. Platelet function after in vivo and in vitro treatment with thrombolytic agents. // Am. J. Cardiol. 1992. - V. 69. - P. 457 - 461.

58. Beukers M.W., Pirovano I.M., van Weert A., Kerkhof C.J., Ijzerman A.P., Soudijn W. Characterization of ecto-ATPase on human blood cells. A physiological role in platelet aggregation? // Biochem. Pharmacol. 1993. - V. 46. - No. 11. - P. 1959-66.

59. Bills N.K., Smith J.B., Silver M.J. Selective release of arachidonic acid from the phospholipids of human platelets in response to thrombin.// J. Clin. Invest.- 1977-V.6O-N0 l-P.1-6.

60. Blockmans D., Deckmyn H., Vermylen J. Platelet activation.// Blood Reviews. -1995,- V. 9,-P. 143-156.

61. Bondi A. Van der Waals volumes and radii. // J. Phys. Chem. 1964. - V. 68. - No. 3. -P. 441 -451.

62. Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. // Nature.- 1962,- V. 194.- No. 4832,- P. 927 929.

63. Born G.V.R. Observations on the change in shape of blood platelets brought about by adenosine diphosphate. // J. Physiol. Lond. 1970. - V. 209. - P. 487-511.

64. Bourguignon L.Y.W., Walker G., Bourguignon G.J. Phorbol ester-induced phosphorilation of a transmembrane glycoprotein (GP 180) in human blood platelets. // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 11775-11780.

65. Bracht F., Schror K. Isolation and identification of aptamers from defibrotide that act as thrombin antagonists in vitro. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 200. - P. 933 - 937.

66. Brass F., Ahuja M., Belmonte E., Pisarro S., Tarver A., Hoxie J. The human platalet thrombin receptor: turning it on and turning it off.// Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1994.- V. 714,-P. 1-12.

67. Braun M., Kramann J., Strobach H., et al. Incomplete inhibition of platelet secretion by low-dose aspirin. // Platelets. 1994. - V. 5. - P. 325 - 331.

68. Bredt D.S. Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule. /V Annu. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 175 - 195.

69. Bushfield M., McNicol A., Macintyre D.E. Possible mechanisms of the potentiation of blood-platelet activation by adrenaline. // Biochem. J. 1987. - V. 241. - P. 671 -676.

70. Calvete J.J Clues for understanding the structure and function of a prototypic human integrin: the platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 72. - P. 1 - 15.

71. Calvete J.J. On the structure and function of platelet integrin alpha lib beta 3, the fibrinogen receptor. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995. - V. 208. - No. 4. - P. 346 -360.

72. Carr C., van den Berg J.J.M., Winterbourn C.C. Chlorination of cholesterol in cell membranes by hypochlorous acid. // Arch. Bioch.Biophys.- 1996- No 1- P.63-69.

73. Carrol R.C., Butler R.G., Morris P.A., Gerrard J.M. Separable assembly of platelet pseudopodal and contractil cytoskeletons. // Cell. 1982. - V. 30. - P. 385-393.

74. Cattaneo M., Akkawat В., Kinlough-Rathbone R.L. Ticlopidine facilitates the deaggregation of human platelets aggregated by thrombin. // Thromb. Haemost. -1994. V. 71. - P. 91 -94.

75. Cattaneo M., Lombardi R., Bettega D. Shear-induced platelet aggregation is potentiated by desmopressin and inhibited by ticlopidine. // Arterioscler. Thromb. -1993,-V. 13.-P. 393 397.

76. Chesney J.A., Eaton J.W., Mahoney J.R. Bacterial glutathione: a sacrificial defense against chlorine compounds.// J. Bacteriol. 1996.- V. 178.- P. 2131-2135.

77. Chignard M., Le Couedic J.P., Vargaftig B.B., Benveniste J. Platelet-activating factor (PAF-acether) secretion from platelets: effects of aggregating agents. // Br. J. Haematol. 1980,- V. 46. - P. 455 - 464.

78. Chilton F.H., Cluzel M., Triggiani M. Recent advances in our understanding of the biochemical interactions between PAF and arachidonic acid. // Lipids. 1991,- V. 26,-No. 12,-P. 1021 -1027.

79. Chow T.W, Heliums J.D., Moake J.L., Kroll M.H. Shear-stress-induced von Willebrand factor binding to glycoprotein lb initiates calcium influx associated with aggregation. // Blood. 1992. - V. 80. - P. 113 - 120.

80. Chronos N.A.F., Wilson D.J., Janes S.L., et al. Aspirin does not affect the flow cytometric detection of fibrinogen binding to, or release of a-granules from, human platelets. // Clin. Sci. 1994,- V. 87. - P. 575 - 580.

81. Clark R.A., Klebanoff S.J., Einstein A.B., Fever A. Peroxidase H202 - halide system: Cytotoxic effect on mammalian tumor cells. // Blood. - 1975.- V. 45.- P. 161 - 170.

82. Clark R.A., Olsson I., Klebanoff S.J. Cytotoxicity for tumor cells of cationic proteins from human neutrophil granules. // J. Cell Biol.- 1976.- V. 70,- P. 719 723.

83. Clark R.A., Klebanoff S.J. Role of the myeloperoxidase H202 - halide system in concanavalin A - induced tumor cell killing by human neutrophils. // J. Immunol.-1979,- V. 122,- No. 6,- P. 2605 - 2610.

84. Clark R.A., Szot S. Chemotactic factor inactivation by stimulated human neutrophils mediated by myeloperoxidase-catalyzed metionine oxidation. // J. Immunol.-1981-V.128- P.1507-1513.

85. Clemetson K.J. Platelet activation: signal transduction via membrane receptors. // Thromb. Haemost. 1995. - V. 74. - No. 1. - P. 111 - 116.

86. Collen D., Lijnen H.R. Strategies for improvement of thrombolytic agents. // Thromb. Haemost. 1991. - V. 66. - P. 88 - 110.

87. Collen D., Lijnen H.R. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis. // Blood. 1991.-V. 78.-P. 3114-3124.

88. Coller B.S. Platelets and thrombolytic therapy. // N. Engl. J. Med. 1990. - V. 323. -P.33 - 42.

89. Coller B.S., Anderson K., Weisman H.F. New antiplatelet agents: platelet GP Ilbllla antagonists. // Thromb. Haemost. 1995. - V. 74. - No. 1. - P. 302 - 308.

90. Colman R.W. Platelet activation: role of an ADP receptor. // Semin. Haematol. -1986.-V. 23.-P. 119- 128.

91. Cook N.S., Kottirsch G., Zerwes H.G. Platelet glycoprotein Ilbllla antagonists. // Drugs Future 1994. - V. 19. - P. 135 - 159.

92. Coutre S., Leung L. Novel antithrombotic therapeutics targeted against platelet glycoprotein Ilbllla. // Annu. Rev. Med. 1995. - V. 46. - P. 257 - 265.

93. Cristalli G., Mills D.C.B. Identification of a receptor for ADP on blood platelets by phytoaffinity labelling. // Biochem. J. 1993. - V. 291,- P. 875 - 881.

94. Cuperus R.A., Muijsers A.O., Wever R. The superoxide dismutase activity of myleoperoxidase fornation of compound III.// Bioch.Biophys.Acta -1986- V.871-P.78-84.

95. Da Prada M., Richards J.G., Kettler R. Amine storage organells in platelets.- In: J.L.Gordon (ed.). Platelets in Biology and Pathology. Elsevier.- North Holland Biomedical Press.- 1981,- P. 321 348.

96. Dallegri F., Ballestero A., Otonello L., Patrone F. Platelets as inhibitory cells in neutrophyil mediated cytolisis.// J.Lab. Clin. Med. - 1989- V. 114- P. 502-509.

97. Dandona P., Thusu K., Khurata U., Love J., Aljada A., Mousa Sh. Calcium, calmodulin and protein kinase С dependence of platelet shape change.// Thromb. Res each. 1996,- V. 81,- No. 2,- P. 163-175.

98. Davies J.M.S., Horwitz D.A., Davies K.JA. Inhibition of collagenase activity by N-chlorotaurine a product of activated neutrophils. // Arthritis and Rheumatism.-1994- V. 37- No 3- P.424-427.

99. Defreyn G., Bernat A., Delebassee D., et al. Pharmacology of ticlopidine: a review. // Thromb. Haemost. 1989. - V. 15. - P. 159 - 166.

100. Deranleau D.A., Dubler D., Rothen C., Luscher E.F. Transient kinetics of the rapid shape change of unstirred human platelets stimulated with ADF. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982,- V. 79. - P. 7297 - 7301.

101. Dorn H.J.W., Dejesus A. Human platelet aggregation and shape change are coupled to separate thromboxane A2 prostaglandin H2 receptors. // Am. J. Physiol. -1991. -V. 260. - P. H327 - H334.

102. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. //Arch. Bioch.Biophys.- 1959- V.82-P.70-77.

103. Fitzgerald D.J., Fitzgerald G.A. Role of thrombin and thromboxane A2 in reocclusion following coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. - V. 86. - P. 7585 - 7589.

104. Folkes L.K, Candeias L., Wardman P. Kinetics and mechanisms of hypochlorous acid reactions.// Arch. Bioch.Biophys.- 1995- V.323- P.120-126.

105. Foote C.S., Goyne Т.Е., Lehrer R.J. Assesment of chlorination by human neutrofils. //Nature.- 1983- V.301-P.715-716.

106. Frishman W.H., Miller K.P. Platelets and antiplatelet therapy in ischemic heart disease. // Curr. Probl. Cardiol. 1986. - V. 22. - P. 73 - 136.

107. Fuster V. Mechanisms leading to myocardial infarction: insights from studies of vascular biology. // Circulation. 1994. - V. 90. - P. 2126 - 2146.

108. Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Yu., Pozin E.Ya. Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension. // Thromb. Res. 1989. - V. 54. - No. 3. - P. 215 - 223.

109. Gent M., Blakely J.A., Easton J.D. The Canadian American Ticlopidine Study (CATS) in thromboembolic stroke. // Lancet. 1989 - V. 1. - P. 1215 - 1220.

110. Gerrard J.M., White J.G., Peterson D.A. The platelets dense tubular system: its relationship to prostaglandin systesis and calcium flux. // Thromb. Haemost. 1978. -V. 40.-No. 2.-P. 224 - 231.

111. Golino P., Buja M., Ashton J.H. Effect of thromboxane and serotonin receptor antagonists on intracoronary platelet deposition in dogs with experimental stenosed coronary arteries. // Circulation. 1988. - V.78. - P. 701 - 711.

112. Goodnith S.H., Coull B.M., McAnulty J.H., Taylor L.M. (153. Antiplatelet therapy Part I. // West. J. Med. - 1993. - V. 158. - P. 385 - 392.

113. Goodnith S.H., Coull B.M., McAnulty J.H., Taylor L.M. Antiplatelet therapy -Part II.//West. J. Med. 1993.-V. 158. - P. 506 - 514.

114. Gray E.T., Margerum D.W., Huffman R.P. (45. Chloramine equilibria and the kinetics of disproportionation in aqueous solution. // Am. Chem. Soc. Symp. Ser.-1978,- No. 82,-P. 264-277.

115. Greaves M.W., Hensby C.N., Plummer N.A., Warin A.P. The effect of short wave length ultraviolet С (254 nm) irradiation on arachidonic and prostaglandins E2 and F2 concentration in human skin. //Brit. J. Pharmacol.-1977,- V. 6,- P. 445 -446.

116. Grisham M.B., Jefferson M.M., Thomas E.L. Role of monochloramine in the oxidation of erythrocyte hemoglobin by stimulated neutrophils. // J. Biol. Chem.-1984,- V. 259,- No. 11,- P. 6757 6772.

117. Hamberg M., Samuelson B. Prostaglandin endoperoxides. Novel transformation of arachidonic acid in human platelets. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. - N.12. -No. 8. - P. 3400 - 3404.

118. Hamberg M., Swenson I., Samuelson B. Thromboxanes: a new group of biologically active compounds derived from prostaglandin endoperoxides. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. - V. 72. - No. 8. - P. 2994 - 2998.

119. Han P., Boatwright C., Ardlie N.G. Verapamil and collagen-induced platelet reactions evidence for a role for intracellular calcium in platelet activation. // Thromb. Haemostas. - 1983. - V.50. - No.2. - P. 537-541.

120. Hantgan R.R. A study of the kinetics of ADP-triggered platelet shape change. // Blood. 1984. - V. 64. - P. 896 - 906.

121. Harbury С.В., Schrier S.L. Modification of platelet sulfhydryl groups. // Thromb. Diath. Haemorrh. 1974. - V.31. - No.3. - P.469.

122. Hardisty R.M., Powling M.J., Nokes T.J.C. The action of ticlopidine on human platelets: studies on aggregation, secretion, calcium mobilization and membrane glycoproteins. // Thromb. Haemost. 1990. - V. 64. - P. 150 - 155.

123. Harrison J.E. The functional mechanism of myleoperoxidase.//In : Cancer Enzymology. Eds. Schultz J., Cameron B.F. New-York , Academic Press.-1976-P.307-317.

124. Harrison J.E., Schultz J. Studies of cholorinating activity of myleoperoxidase.// J. Biol.Chem.-1976-V.251 -P. 13 71 -1374

125. Hass W.K., Easton J.D., Adams J.H.P., et al. A randomized trial comparing ticlopidine hydrochloride with aspirin for the prevention of stroke in high-risk patients. //N. Engl. J. Med. 1989. - V. 321. - P. 501 507.

126. Held A.M., Hurst J.K. Ambiguity associated with use singlet oxygen trapping agents in myeloperoxidase catalysed oxidation. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1978,- V. 81,- No. 3,- P. 878 - 885.

127. Herbert J.M., Tissinier A., Defreyn G., et al. Inhibitory effect of clopidogrel on platelet adhesion and intimal proliferation after arterial injury in rabbits. // Arterioscler. Thromb. 1993. - V. 13. - P. 1171 - 1179.

128. Holt J.C., Niewiarowski I. Biochemistry of a-granule proteins. // Semin. Haematol. 1985. - V. 22. - P. 151-163.

129. Honda Z., Nakamura M., Miki I. et al. Cloning by functional expression of platelet-activating factor receptor from guinea-pig lung. // Nature. 1991. - V. 349. -P. 342 - 346.

130. Hopkins N., Gorman R.R. Regulation of endothelial cell cyclic nucleotide metabolism by prostacyclin. // J. Clin. Invest. 1981. - V. 67. - P. 540 - 546.

131. Hourani S.M., Hall D.A. Receptors for ADP on human blood platelets. // Trends. Pharmacol. Sci. 1994. - V. 15. - No. 4. - P. 103-108.

132. Isenberg W.M., McEver R.P.,Phillips D.R., Shuman M.A., Bainton D.F. The platelet fibrinogen receptor: An immunologic-surface replica study of agonist-induced ligand binding and receptor clustering. // J. Cell Biol. 1987. - V. 104. - P. 1655 -1663.

133. ISIS-2 Collaborative Group. Randomized trial of intravenous streptokinase, oral aspirin, both, or neither among 17,187 cases of suspected acute myocardial infarction. // Tancet. 1988. - V. 2. - P. 349 - 360.

134. Jackson S.P., Yuan Y.P., Schoenwaelder S.M., Mitchell C.A. Role of the platelet integrin glycoprotein Ilb-IIIa in intracellular signaling. // Thromb. Res. 1993. - V. 71. - No. 2. - P. 159-168.

135. Kaplan K.L., Broekman M.J., Chernoff A., Lesznik G.R., Drillings M. Platelet a-granule proteins: studies on release and subceelular localization. // Blood. 1979. - V. 53. - P. 604-618.

136. Kehrel B. Platelet-collagen interactions. // Semin. Thromb. Hemost. 1995. - V. 21. - No. 2. - P. 123 - 129.

137. Kehrel B. Platelet Receptors for collagens. // Platelets. 1995. - V. 6. - P. 11 - 16.

138. Kehrel В., Kronenberg A., Rautenberg J., et al. Platelets deficient in glycoprotein Illb aggregate normally to collagens type I and III but not to collagen type V. // Blood. 1993. - V. 82. P. 3364 - 3370.

139. Kessels H., Beguin S., Andree H., et al. Measurement of thrombin generation in whole blood: the effect of heparin and aspirin. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 72. -P. 78 - 83.

140. Kimura Y., Okuda H. Effects of alpha- and beta-adrenergic antagonist on epinephrine-induced aggregation and intracellular free calcium concentration in human platelets. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 202. - No. 2. - P. 1069-1075.

141. Klebanoff S.J., Clark R.A. The neutrophil function and clinical disorders.-Amsterdam North Holland Publ. Co.- 1978,- P. 425 - 466.

142. Knudsen J.B., Kjoller E., Skagen K., et al. The effect of ticlopidine on platelet functions in acute myocardial infarction: a double blind controlled trial. // Thromb. Haemost. 1985. - V. 53. - P. 332 - 336.

143. Kotze H.F., Lamprecht S., Badenhorst P.N., et al. In vivo inhibition of acute platelet-dependent thrombosis in a baboon model by Bay U3405, a thromboxane A2-receptor antagonist. // Thromb. Haemost. 1993. - V. 70. - P. 672 - 675.

144. Koyama I., Nakamori K., Nagahama Т., Ogasawara M., Nemoto M. The reactivity of taurine with hypohlorous acid and its application for eye drops.// Adv. Exp. Med. Biol. -1996,- V. 403. P. 9-17.

145. Lanza F., Beretz A., Stierle A., Hanau D., Kubina M., Cazenave J.P. Epinephrine potentiates human platelet activation but is not an aggregating agent. // Am. J. Physiol. 1988,- V. 255,- P. H 1276 - H1288.

146. Lapetina E.G. The signal transduction induced by thrombin in human platelets. // FEBS Lett. 1990. - V. 268. - P. 400 - 404.

147. Larrimer N.R., Balcerzak S.P., Metz E.N., Lee R.E. Surface structure of normal human platelets. // Am. G. Med. Sci. 1970. - V. 259. - P. 242-256.

148. Latimer P., Wamble F. Light scattering by aggregates of large colloidal partcles. // Appl.Optics.- 1982- V.21- P.24-47.

149. Lee C.F. Kinetics of reactions between chlorine and phenolic compound.- In: Principles and applications of water chemistry (Faust S.D., Hunter J.W. editors).-1967- P. 54 72.

150. Learm. D.V., Fried W.A., Thomas E.L Taurine and hypotaurine content of human leucocytes.// J. Leukoc. Biol. 1990. - V. 48,- P. 174-182.

151. Lips J.P.M., Sixma J.J., Schiphorst M.E. Binding of adenosine di-phosphate to human blood platelets and to isolated blood platelet membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 628. - P. 451-467.

152. Mahautsmith M.P., Sage S.O., Rink T.J. Rapid ADP-evoked currents in human platelets recorded with the nystatin permeabilized patch technique. // J. Biol. Chem. -1992. V. 267. - No. 5. - P. 3060-3065.

153. Marguerie G.A., Edgington T.S., Plow E.F. Interaction of fibrinogen with its platelet receptor as part of a multistep reaction in ADP-induced platelet aggregation. // J. Biol. Chem. 1980. - V. - 255. - No. 1. - P. 154 - 161.

154. Marguerie G.A., Plow E.F. The fibrinogen dependent pathway of platelet aggregation. // Ann. N.-Y. Acad. Sci. -1983. V. 408. - P. 556 - 566.

155. Marguerie G.A., Plow E.F.,Edgington T.S. Human platelets possess an inducible and saturable receptor specific for fibrinogen. // J. Biol. Chem. 1979. - V. - 254. -No. 12.-P. 5357 - 5363.

156. Marietta M., Faeehinetti F., Neri I. L-arginine infusion decreases platelet aggregation through an intraplatelet nitric oxide release. // Thromb. Reseach.- 1997,-V. 88,- No. 2,-P. 229-235.

157. Martin Caterine. Aspirin: New life for old drug.// Chem. Brit. 1996,- V.32. -No. 6.-P. 8-10.

158. Matchar D.B., McCrory Barnett J.M., Feussner et al. // Medical treatment for stroke prevention. // Ann. Intern. Med. 1994. - V. 121. - P. 41 - 53.

159. Mayne R. Collagenous proteins of blood vessels. // Arteriosclerosis 1986. - V. 6. -P.593 - 685.

160. McTavish D., Faulds D., Goa K.L. Ticlopidine: an updated review of its pharmacology and therapeutic use in platelet- dependent disorders. // Drugs 1990. -V. 40. - P. 238 - 259.

161. Meyer D., Girma J.P. Von Willebrand factor: structure and function. // Thromb. Haemost. 1993,- V. 70. - P. 99 - 104.

162. Milton J.G., Frojmovic M.M. Adrenaline and adenosine diphosphate-induced platelet aggregation require shape change. Importance of pseudopods. // J. Lab. Clin. Med. 1984. - V. 104. - P. 805 - 815.

163. Milton J.G., Frojmovic M.M. Adrenalin and adenosin diphosphate-induced platelet aggregation require shape change. Importance of pseudopodies. // J. Lab. Clin. Med. 1984. - V. 104. - P. 805-815.

164. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. // Pharmacol. Rev. 1991,- V. 43. - P. 109 - 142.

165. Moran N., Fitzgerald G.A. Mechanisms of action of antiplatelet drugs. In.: Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J., Salzman E.W., eds. Hemostasis and thrombosis:basic principles and clinical practice. 11 Philadelphia: JB Lippincott. 1994. - P. 1623 - 1637.

166. Morris J.C. Kinetics of reaction between aqueous chlorine and nitrogen compounds.- In: Principles and applications of water chemistry ( Faust S.D., Hunter J.W., ed).- 1967,-P. 23-51.

167. Mullane K.M., Farnabaio D. Thromboxane synthetase inhibitors reduce infarct size by a platelet-dependent, aspirin sensitive pathway. // Circ. Res. 1988. - V. 62. -P. 668 - 678.

168. Musial J., Radwan J. and Szczeklik A. Aspirin delays thrombin generation in vitro through interaction with platelet phospholipids.// Thromb. Reseach. 1997,- V. 85,-No. 4,-P. 367-368.

169. Nathan C.F., Silverstein S.C., Brukner L.H., Cohn Z.A. Extracellular cytolysys by activated macrophages and granulocytes. Hydrogen peroxide as a mediator of cytotoxicity. // J. Exp. Med.- 1979,- V. 149,- No. 1,- P. 100 113.

170. Nishizuka Y. The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tumor promotion. // Nature. 1984. - V. 308. - P. 693 - 698.

171. O'Brien J.R. Effects of adenosine diphosphate and adrenaline on mean platelet shape. // Nature. 1965. V. 207. - P. 306-307.

172. Packham M.A., Guccione J.P., GreenbergJ.P Release of 14C-serotonine during initial platelet changes induced by thrombin, collagen or A 23187. //Blood.-1977,- V.50.- No. 5,- P. 915 926.

173. Park E., Shuller-Levis G., Qwin M. Taurine chloramine inhibits production of nitric oxide and TNF-a in activated RAW 264.7 cell by mechanisms that involve transcriptional and translational events.// J. Immunol.-1995- V.154- P.4778-4784.

174. Park E., Schuller-Levis G., Jia J.H., Quinn M.R Preactivation exposure of RAW 264.7 cells to taurine chloramine attenuates subsequent production of nitric oxide and expression of iNOS mRNA.// J. Leukoc. Biol.- 1997,- V. 61.- No. 2,- P. 161-166.

175. Patscheke H. Role of activation in epinephrine-induced aggregation of platelets. // Thromb. Res. 1980. - V. 17. - P. 133-142.

176. Patscheke H., Womer P. Platelet activation detected by turbidimetric shape-change analysis. Differential influence of cytochalasin В and prostaglandin Е. // Tromb. Res. 1978. - V. 12. - No. 3. - P. 485 - 496.

177. Pengo V., Boschello M., Marzari A., et al. Adenosine diphosphate (ADP) induces a-granules release from platelets of native whole blood and is reduced by ticlopidine but not by aspirin or dipyridamole. // Thromb. Haemost. 1986. - V. 56. - P. 147 -150.

178. Prutz W.A. Prutz W.A. Hypochlorous acid interactions with thiols, nucleotides, DNA, and other substrates.// Arch. Biochem. Biophys.- 1996. -V.332. -No.l.- P.l 10.

179. Pero R.W., Sheng Y., Olsson A., Brungelsson C., Lung-Pero M. Hypohlorous acid/N-chloramines are naturally produced DNA repair inhibition.// Carcinogenesis. -1996,-V. 17.- P. 13-18.

180. Plow E.F., D'Souza S.E., Ginsberg M.H. (85. Consequences of the interaction of platelet membrane glycoprotein GP Ilbllla and its ligands. // J. Lab. Clin. Med.1992. V. 120. - No. 2. - P. 198 - 204.

181. Popov E.G., Gabbasov Z.A., Gavrilov I.Yu., Pozin E.Ya., Mejlumian A.G. Accumulation and release of acridine derivatives by intact platelets. // Thromb. Res.-1987,-V. 47,-P. 639 645.

182. Puri R.N., Colman R.W. Reocclusion after thrombolytic therapy: strategies for inhibiting thrombin-induced platelet aggregation. // Blood Coagul. - Fibrinolysis.1993,- V. 4.-P. 465 478.

183. Quinn M.R., Park E., Schuller-Levis G. Taurine chloramine inhibits prostaglandin E2 production in activated RAW 264.7 cells by posttranscriptional effects on iducible cuclooxigenase expression.// Immunol Lett. -1996.- V. 50.- P.185-188.

184. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. The role of nitric oxide and cGMP in platelet adhesion to vascular endothelium. // Biochem. Biophys. Res. Comm. -1987.-V. 148.-P. 1482 1489.

185. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. An L-arginine: nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 -V.87.-P 10043 - 10047.

186. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide. // Brit. J. Pharmacol. 1987. - V. 92,- P. 639 - 646.

187. Rao A.K., Mintz P.D., Lavine S.J. Coagulant activities of platelets in coronary artery disease. // Circulation. 1984. - V. 69. - P. 15 - 21.

188. Rasmussen U.B., Vouret-Craviari V., Jallat S. cDNA cloning and expression of hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca mobilisation. // FEBS Lett. 1991. -V. 288. - P. 123 - 128.

189. Rinder C.S., Student L.A., Bonan J.L. Aspirin does not inhibit adenosine diphosphate-induced platelet alpha-granule release. // Blood. 1993. - V. 82. - P. 505 -512.

190. Roald H.E., Barstad R.M., Kierulf P. Clopidogrel: a platelet inhibitor which inhibits thrombogenesis in non-anticoagulated human blood independently of the blood flow conditions. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 71. - P. 655 - 662.

191. Rote W.E., Mu D.X., Lucchesi B.R. Thromboxane antagonism in experimental canine carotid artery thrombosis. // Stroke. 1993. - V. 24. - P. 820 - 828.

192. Roth G.J., Calverley D.C. Aspirin, platelets and thrombosis: theory and practice. // Blood. 1994. - V. 83. - P. 885 - 898.

193. Roth G.J., Stanford N., Majerus P.W. Acetilation of prostaglandin synthase by aspirin. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1975. - V. 72. - P. 3073.

194. Roux S.P., Sakariassen K.S., Turitto V.T., et al. Effect of aspirin and epinephrine on experimentally induced thrombogenesis in dogs. // Arterioscler. Thromb. 1991. -V. 11. -P. 1182 - 1191.

195. Rudnick G., Fishkes H., Nelson P.J., Schuldiner S. Evidence for two distinct serotonin transport systems in platelets. // J. Biol. Chem.- 1980.- V. 255.- No. 8.-P.3638 3641.

196. Ruggeri Z.M. Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation. // Thromb. Haemost. 1993. - V. 70. - P.119 - 123.

197. Saelman E.U.M., Nieuwenhuis H.K., Hese K.M., et al. Platelet adhesion to collagen types I through VIII under conditions of stasis and flow is mediated by GP Ialla. // Blood. 1994. - V. 83. - P. 1244 - 1250.

198. Sage S.O., Merritt J.E., Hallam T.J., Rink T.J. Receptor mediated calcium entry in fura-2 loaded human platelets stimulated with ADP and thrombin. // Biochem. J. -1989.-V. 258.-P. 923 - 926.

199. Saltzman A.G., Morse В., Whitman M.M., Ivanshchenko Y., Jaye ML, Felder S. Cloning of the human serotonin 5-HT2 and 5-HT1C receptor subtypes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - V. 181.- P. 1469 - 1478.

200. Santoro S.A. Molecular basis of platelet adhesion to collagen. In: Platelet membrane receptors: molecular biology, immunology, biochemistry, and pathology.(Ed. Jamieson G.A.) New York: Alan R. Liss. - 1988. - P. 291 - 314.

201. Sato Т., Hashizume Т., Fujii T. N-Ethylmaleimide inhibits Ca2f influx induced by collagen or arachidonate on rabbit platelets. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V. 928.-No. 3,-P. 266-271.

202. Savage В., Shattil S.J., Ruggeri Z.M. Modulation of platelet function through adhesion receptors a dual role of glycoprotein Ilbllla mediated by fibrinogen and GPIb-vWF. //J. Biol. Chem. - 1992. - V. 267. - P. 11300 - 11306.

203. Schror K. Antiplatelet drugs. A comparative review. // Drugs 1995. - V. 50. -No. 1.-P. 7-28.

204. Schror К. The basic pharmacology of ticlopidine and clopidogrel. // Platelets1993.-V. 4.-P. 252 -261.

205. Schumacher W.A., Steinbacher Т.Е., Heran C.L. Effects of antithrombotic drugs in a rat model of aspirin-insensitive arterial thrombosis. // Thromb. Haemost. 1993. -V. 69.-P. 509 - 514.

206. Selvaraj R.I., Paul B.B., Strauss R.R., Jacobs A.A., Sbarra A.J. (18. Oxidative peptide cleavage and decarboxylation by the MPO-H202-antimicrobial system. // Infection and immunity.- 1974.- V. 9,- No. 2.- P. 255 260.

207. Sergienko V.I., Vasiliev Yu.B. Electrochemical methods of detoxication for medical use.- Harwood Academic Publishers GmbH.- 1989.- P. 54.

208. Shen Y.C., Hong C.Y. Effect of trilinolein on cyclic nucleotide formation in human platelets: relationship with its antiplatelet effect and nitric oxide synthesis. // Br. J. Pharmacol. 1995. - V. 116. - No. 1. - P. 1644-1648.

209. Siess W. Molecular mechanisms of platelet activation. // Physiol. Reviews. -1989. V. 69. - No. 1.

210. Silk S.T., Wong K.T.H., Marcus A.J. Arachidonic acid releasing activity in platelet membranes: Effects of sulfgydryl-modifying reagents. // Biochemistry 1981 -V. 20, P. 391 - 397.

211. Silverstein R.M., Hager L.P. The chloroperoxidase catalysed oxidation of thiols and disulfides to sulfenyl chlorides. // Biochemistry.- 1974.- V. 13,- No. 25.- P. 5069 - 5073.

212. Simoons M.L., de Boer M.J., van den Brand M.J.B.M., et al. Randomised trial of a GP Ilbllla platelet receptor blocker in refractory unstable angina. // Circulation1994.-V. 89.-P. 596 -603.

213. Skaer R.J. Platelet degranulation.- In: Gordon J.L.(ed.). Platelets in Biology and Pathology. Elsevier.- North Holland Biomedical Press.- 1981.- P. 321 348.

214. Slivka A., LoBuglio A.F. Weiss S.J. A potential role for hypochlorous acid in granulocyte mediated tumor cell cytotoxicity. // Blood.- 1980,- V. 55.- No. 2,- P. 347 - 350.

215. Smith I.B., Ingerman C.M., Silver M.J. Malondialdehyde formation as an indicator of prostaglandin production by human platelets. // J. Lab. Clin. Med.-1976,- V. 88,- No. 1,- P. 167 172.

216. Smith J.W., Piotrowicz R.S., Mathis D. A mechanism for divalent cation regulation of beta 3-integrins. //J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - No. 2. - P. 960-967.

217. Soslau G., Brodsky L, Parker J. Occupancy of P2 purinoceptors with unique properties modulates the function of human platelets. // Biochim. Biophys. Acta. -1993. V. 1177. - No. 2. - P. 199-207.

218. Steen V.M., Holmsen H. Synergism between thrombin and epinephrine in human platelets: different dose-response relationships for aggregation and dense granule secretion. // Thromb. Haemost. 1985. - V. 54. - P. 680 - 683.

219. Stelmaszynska Т., Zgliczynska J.M. Myeloperoxidase of human neutrophilic granulocytes as chlorinating enzyme. // Eur. J. Biochem.- 1974.- V. 45.- P. 305 312.

220. Takahara K., Murray R., Fitzgerald G.A., Fitzgerald D.J. The response to thromboxane A2 analogues in human platelets. Discrimination of two binding sites linked to distinct effector systems. // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P.6836 - 6844.

221. Thomas E.L. Myeloperoxidase, hydrogen peroxide, chloride antimicrobial system: effect of exogenous amines on antibacterial action against E. coli. // Infect. Immunity.- 1979,- V. 25.- N0. 1.- P. 110 116.

222. Thomas E.L., Grisham M.B., Jefferson M.M. Myeloperoxidase dependent effect of amines on functions of isolated neutrophiils. // J. Clin. Invest.- 1983.- V. 72.- No. 2,-P. 441 -454.

223. Thomas E.L., Jefferson M.M., Grisham M.B. Myeloperoxidase catalized incorporation of amines into proteins: role of hypochlorous acid and dichloramines. // Biochemistry. - 1982. - V. 21. - P. 6299 - 6308.

224. Thomas G., Skrinska V.A., Lucas F.V. The influence of glutathione and other thiols on human platelet aggregation. // Thromb. Res. 1986 - V. 44. - P. 859 - 866.

225. Topol E.J. Novel antithrombotic approaches to coronary artery disease. // Am. J. Cardiol. 1995. - V. 75. - P. 27B - 33B.

226. Trip M.D., Cats V.M., van Capelle F.J.L. Vreeken J. Platelet hyperactivity and prognosis in survivors of myocardial infarction. // N. Engl. J. Med. 1990. - V. 322. -P. 1549 - 1554.

227. Tsao P.W., Forsythe M.S., Mousa Sh.A. Dissotiation between the antiaggregatory and anti-secretory effects of platelet integrin ацЬРз (GP Ilb/IIIa) antagonists, C7E3 and DMP 728. // Thromb. Reseach. 1997,- V. 88,- No. 2,- P. 137146.

228. Uchiyama S., Yamazaki M., Maruyama S., et al. Shear-induced platelet aggregation in cerebral ischemia. // Stroke. 1994. - V. 25. - P. 1547 - 1551.

229. Verhoeven A.J.M., Mommersteeg M.E., Akkerman J.W.N. Comparative studies on the energetics of platelet responses induced by different agonists. // Biochem. J. -1986.-V. 236.-P. 879 887.

230. Verstraete M. Thromboxane synthase inhibition, thromboxane/endoperoxide receptor blockade and molecules with the dual property. // Drugs Today 1993. - V. 29.-P. 221 -232.

231. Verstraete M. New developments in antiplatelet and antithrombotic therapy. // Europ. Heart J. 1995. - V. 16. - Supplem. L. - P. 16 - 23.

232. Verstraete M., Zoldhelyi P. Novel antithrombotic drugs in development. // Drugs.- 1995. V. 49,- No. 6. - P. 856 - 884.

233. Villa S., Colotta F., de Gaetano G., Semeraro N. Arachidonic acid and leukotriene B4 induce aggregation of human peripheral blood mononuclear leukocytes in vitro. // Br. J. of Haematology.- 1984,- V. 58,- No. 1,- P. 137 -146.

234. Vizcaino-Salazar G. Platelet physiology. Advances in platelet reactivity. // Invest. Clin. 1994.-V. 35.-No. 1,-P. 41-62.

235. Ware J.A., Smith M., Salzman E.W. Synergism of platelet aggregating agents. Role of elevation of cytoplasmic calcium. // J. Clin. Invest. - 1987. - V. 80. - P. 267 -271.

236. Weil J.C., Morris J.C. Kinetic studies on the chloramine N-chlormethylamine and N-chlordimethylamine. //J. Amer. Chem. Soc.- 1949.- V. 71.- No. 5,- P. 1664 1671.

237. Weiss S., LoBuglio A.F. Biology of disease: phagocyte generated oxygen metabolites and cellular injury. //Lab. Invest.- 1982,- V. 47.- No. 1.- P. 5 - 18.

238. Weiss S., Slivka A. Monocyte and granulocyte mediated tumor cell destruction: a role for the hydrogen peroxide - myeloperoxidase - chloride system. // J. Clin. Invest.- 1982,- V. 69,- No. 2,- P. 255 - 262.

239. White B.P., Sullivan A.T., Lumley P. Prevention of intracoronary thrombosis in the anaesthetised dog: the importance of thromboxane A2 and thrombin. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 71,- P. 366 - 374.

240. White J. G. Electron microscopic studies of platelet secretion. // Prog. Haemost. Thromb. 1974. - V. 2. - P. 49-98.

241. White J. G. Shape change. // Thromb. Diath. Haemorrh. 1974. - V. 60. - P. 159171.

242. White J.G., Escolar G. The blood platelet open canalicular system a two-way street. //Eur. J. Cell Biol.-1991.-V. 56,-No. 2,-P. 233 - 242.

243. Wiberg N. Lehrbuch der Anorganische Chemil. // Berlin New-York: Walter de Gruyter.- 1985- P.422-425.

244. Winterbourn C.C. Comparative reactivities of various biological compounds with myeloperoxidase-hydrogen- peroxide-chloride, and similarity of oxidant to hypochlorite. // Вioch.Biophys.Acta -1985- V.840- P.204-210.

245. Winterbourn C.C., van den Berg J.J.M., Roitman E., Kuypers F.A. Chlorohydrin formation from unsaturated fatty acids reacted with hypochlorous acid. // Arch. Bioch.Biophys.- 1993- V.34- P.63-69.

246. Wright C.E., Tallan H.H., Lin Y.Y. //Ann. Rev. Biochem. 1986. V.55. P.427.

247. Wu J.-R., Zhou Z., Bittar E.E. Abolishing with chloramine-T of inactivation in barnacle muscle fibers results in stimulation of ouabain insensitive sodium efflux. // Biochim. et biophys. Acta. Biomembranes. - 1992,- V. 1112,- No. 1.- P. 99 - 104.

248. Wu K.K. Platelet activation mechanisms and markers in arterial thrombosis. // J. Int. Med. 1996. - V. 239. - P. 17-34.

249. Wuthrich C., Deranleau D., A., Dubler D., Luscher E. Human blood platelet secretion: Optical multichannel analyzer measurements using acriflavine as a release indicator.// Biochemistry.- 1984-V.23- P.1224-1229.

250. Xiao Z., Theroux P., Levesque J., et al. Platelet aggregation in response to the thrombin receptor agonist peptide in patiens with coronary artery disease. Circulation 1994. - V. 90.-P.371 - 378.

251. Yamada K, Kubo K, Shuto K, Nakamizo N. Involvment of disulfide-sulfhydryl interaction in anti-platelet actions of KF 4939. // Thromb. Res. -1985,- V. 38.- P. 6169.

252. Zaverio M. Ruggeri The role of von Willebrand factor and fibrinogen in the initiation of platelet adhesion to thrombogenic surfaces.// Thromb. Haemost. 1995. V.74. No.l. P.460-463.225

253. Zgliczynska J.M., Stelmaszynska Т., Ostrowski W., Naskalski J., Sznajd J. Myeloperoxidase of human leukemic leukocytes. Oxidation of aminoacids in the presence of hydrogen. // Eur. J. Biochem.- 1968,- V. 4.- No. 4.- P. 540 547.

254. Zgliczynska J.M., Stelmaszynska Т., Domanski., Ostrowski W. Chloramines as intermediates of oxidation reaction of aminoacids by myeloperoxidase. // Biochem. Biophys. Acta.- 1971,- V. 235,- No. 2.- P. 419 424.

255. Zhou W., Javors M.A., Olson M.S. Platelet activation factor as an intercellular signal in neutrophil-dependent platelet activation. // J. Immunol. 1992. - V. 149. -No. 5.-P. 1763-1769.