Фармакотерапевтические стратегии коррекции эндотелиальной дисфункции с использованием статинов при эндотоксин-индуцированной патологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, доктор наук Денисюк Татьяна Алексеевна

• Денисюк Татьяна Алексеевна
• доктор наук
• 2019

Оглавление диссертации доктор наук Денисюк Татьяна Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Эндотелиальная дисфункция при синдроме системного 21 воспалительного ответа

1.2 Метаболическое превращение «^-аргинин - оксид азота»

1.3 Эритропоэтин и феномен прекондиционирования

1.4 Статины и эндотелиальная дисфункция

1.5 Ингибиторы аргиназ 64 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы исследования

2.1.1 Соответствие работы правилам и рекомендациям к проведению 76 экспериментальных исследований

2.1.2 Перечень используемых реактивов и веществ

2.1.3 Список использованного программного обеспечения

2.1.4 Экспериментальные животные

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика исследования противовоспалительного действия на 79 модели формалинового отека стопы мышей

2.2.2 Исследование противовоспалительного действия по методу И.А. 81 Ойвина

2.2.3 Моделирование коронароокклюзионного инфаркта миокарда у 82 крыс и оценка величины зоны некроза

2.2.4 Моделирование эндотоксин-индуцированной эндотелиальной 86 дисфункции

2.2.5 Моделирование L-NAME-индуцированной эндотелиальной 88 дисфункции и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций

2.2.6 Исследование сократимости миокарда

2.2.7 Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции

2.2.8 Обоснование доз и дизайн эксперимента

2.2.9 Статистическая обработка результатов исследования 96 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. Исследование противовоспалительного действия ингибиторов 98 ГМГ-КоА-редуктазы

3.1 Исследование противовоспалительного действия ингибиторов 98 ГМГ-КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и нанопартикулированного розувастатина на модели формалинового отека стопы мышей

3.2 Исследование противовоспалительного действия ингибиторов 100 ГМГ-КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и нанопартикулированного розувастатина у кроликов по методу И.А. Ойвина

Глава 4. Исследование кардиопротективного действия ингибиторов ГМГ- 105 КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и нанопартикулированного розувастатина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у крыс Глава 5. Исследование эндотелиопротективных эффектов ингибиторов 109 ГМГ-КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина,

розувастатина и нанопартикулированного розувастатина при моделировании эндотоксин-индуцированной и Ь-КАМБ-индуцированной эндотелиальной дисфункции

5.1 Разработка модели эндотоксин-индуцированной эндотелиальной 110 дисфункции у экспериментальных животных и ее количественное описание по результатам эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых проб, нагрузочных проб, биохимических маркеров и морфометрических исследований

внутренних органов

5.2 Оценка эндотелиопротективных эффектов ингибиторов ГМГ- 117 КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и нанопартикулированного розувастатина при моделировании эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции

5.3 Оценка эндотелиопротективных эффектов ингибиторов ГМГ- 129 КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и нанопартикулированного розувастатина в режиме монотерапии при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции

Глава 6. Исследование эндотелиопротективных эффектов монотерапии 148 донатором N0 L-аргинином, ингибиторами аргиназ ВЕС, аргиназином и дарбэпоэтином при эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции Глава 7. Исследование влияния сочетанной терапии донатором N0 L- 153 аргинином с ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином при экспериментальной эндотелиальной дисфункции

7.1 Исследование эффективности терапии эндотоксин- 153 индуцированной эндотелиальной дисфункции донатором N0 L-аргинином в сочетании с ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином

7.2 Исследование эффективности терапии L-NAME-индуцированной 163 эндотелиальной дисфункции донатором N0 L-аргинином в сочетании с ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином

Глава 8. Исследование эффективности терапии экспериментальной 170 эндотелиальной дисфункции неселективным ингибитором аргиназы ВЕС в сочетании с ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином

8.1 Исследование эффективности терапии эндотоксин- 170 индуцированной эндотелиальной дисфункции неселективным ингибитором аргиназы ВЕС в сочетании с ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы симвастатином, аторвастатином, розувастатином

и нанопартикулированным розувастатином

8.2 Исследование эффективности терапии L-NAME-индуцированной 179 эндотелиальной дисфункции неселективным ингибитором аргиназы ВЕС в сочетании с ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином

Глава 9. Исследование эффективности сочетанной терапии селективным 186 ингибитором аргиназы 2 аргиназина с симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином при экспериментальной эндотелиальной дисфункции

9.1 Исследование эффективности сочетанной терапии селективным 186 ингибитором аргиназы 2 аргиназина с симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином при эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции

9.2 Исследование эффективности сочетанной терапии селективным 195 ингибитором аргиназы-2 аргиназина с симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином при L-NAME-индуцированной эндотелиальной

дисфункции

Глава 10. Исследование эффективности сочетанной терапии 201 дарбэпоэтином с симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином при экспериментальной эндотелиальной дисфункции

10.1 Исследование эффективности сочетанной терапии 201 рекомбинантным дарбэпоэтином с симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином при эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции

10.2 Исследование влияния сочетанной терапии рекомбинантным 210 дарбэпоэтином с симвастатином, аторвастатином, розувастатином и нанопартикулированным розувастатином при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-МТГФ - 5-метил тетрагидрофолат

+dp/dt - максимальная скорость увеличения левожелудочкового давления

-dp/dt - максимальная скорость снижения левожелудочкового давления

АГ - артериальная гипертензия

АХ - ацетилхолин

АТФ - аденозинтрифосфат

АТ - ангиотензин

АД - артериальное давление

АФК - активные формы кислорода

ГМК - гладкомышечная клетка

ДАД - диастолическое артериальное давление

ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование

ИАПФ - ингибитор ангиотензинпревращающего фермента

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ-1 - интерлейкин

ИЛ-4 - интерлейкин

ИЛ-6 - интерлейкин

ИП - ишемическое прекондиционирование

ИПК - ишемическое посткондиционирование

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление

ЛДС - липидный дистресс-синдром

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидифосфат

охЛПНП - окисленные липопротеиды низкой плотности

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РААС - ренинангиотензинальдостероновая система

САД - систолическое артериальное давление

ССВО - синдром системного воспалительного ответа

ФАД - флавинаденин динуклеотид

ФМН - флавинаденин мононуклеотид

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа

ФП - фармакологическое прекондиционирование

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЦОГ - циклооксигеназа

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭД - эндотелиальная дисфункция

ЭИЭД - эндотоксин-индуцированная эндотелиальная дисфункция

ЭК - эндотелиальная клетка

ЭПО - эритропоэтин

NO - оксид азота

ВН4 - тетрагидробиоптерин

Hb - гемоглобин

L-NAME - N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир NOS - NO-синтаза

ADMA - асимметричный диметиларгинин

L-NMMA - монометиларгинин

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

AP-1 - протеин-1

GSH - глутатион

GSH-Px - глутатионпероксидаза

GSSG - дисульфид глутатиона

SOD - супероксиддисмутаза

VCAM-1 - васкулярная молекула клеточной адгезии-1 ICAM-1 - молекула межклеточной адгезии-1

ROCK - Rho-зависимые протеинкиназы ПГ-Ь - простациклин

20-HETE - 20-гидроксиэйкозатетраеновая кислота VEGF - фактор роста эндотелия сосудов SDMA - симметричный диметиларгинин L-NMMA - №монометил-Ь-аргинин PRMT - L-аргинин метилтрансфераза

ГМГ-КоА-редуктаза - 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктаза

G-PCR - рецептор G-белка

BH4 - тетрагидробиоптерин FAD

FPP - фарнезилпирофосфат

GGPP - геранил-геранилпирофосфат

ВЕС - S-(2-боро-этил)-L-цистеин

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакотерапевтические стратегии коррекции эндотелиальной дисфункции с использованием статинов при эндотоксин-индуцированной патологии»

Актуальность темы исследования

Сердечно-сосудистые заболевания продолжают оставаться ведущей причиной смертности и инвалидизации, что диктует необходимость углубленного изучения патогенеза и разработки мер лечения и профилактики. При этом в качестве одного из факторов риска кардиоваскулярной патологии в настоящее время рассматривается синдром системного воспалительного ответа (ССВО), поскольку была выявлена тесная связь между атеросклерозом сосудов и предшествующей абдоминальной катастрофой [1, 2], сепсисом [3, 4] и инфекционной патологией [5-8]. Патогенез данного явления может быть описан через следующую последовательность событий: выброс эндотоксинов и стимуляция врожденного звена иммунной системы, синтез и выделение провоспалительных цитокинов, развитие полиорганной патологии, системный васкулит, повышение проницаемости стенки сосудов для лимфоцитов и их миграция через эндотелий, гиперлипопротеинемия, формирование эндотелиальной дисфункции, запуск атеросклеротического процесса [9].

Подобного рода континум ставит под собой важность проблемы эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, и с учетом описанного патогенеза представленный выше алгоритм может быть принят для любой её формы. [10, 11].

В то же время, при всей стройности патогенетических схем и включения множества факторов (интерлейкины, факторы роста, эйкозаноиды, активные формы кислорода и т.д.), очевидной является неотработанность фармакотерапевтических стратегий, направленных на коррекцию ЭД при ССВО.

Предположительно, одним из путей подхода к разработке фармакологических мер коррекции полиорганной дисфункции, возникшей как следствие эндотоксин-индуцированной патологии, может быть целеноправленное фармакологическое воздействие на указанные патогенентические звенья, а также на пути реализации феномена прекондиционирования [12-28].

Степень разработанности темы исследования

За последние годы проведено множество изысканий, посвященных изучению плейотропных свойств ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы [29-31], включая кардиопротективные [32, 33], противовоспалительные [34-36] и эндотелиопротективные; [37], что сделало их препаратами выбора при разнообразной сердечно-сосудистой патологии [38-46], в том числе при использовании принципов персонализированной [47-50], профилактической [51] и доказательной медицины [50-54].

«ADMA-еNOS» как фармакологическая мишень представляет несомненный интерес и явилась объектом исследования курских затем и белгородских фармакологов [55-79], а также значительных работ коллег из Волгограда [80-85].

Раскрыта роль метилированных производных L-аргинина -монометиларгинина (L-NMMA) и асимметричного диметиларгинина (ADMA) как эндогенных ингибиторов эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Последние исследования в этой области продемонстрировали, что эндотоксиновый шок сопровождается возрастанием концентрации ADMA, и это является предпосылкой для отнесения возрастающих его уровней к ключевым факторам риска сердечно-сосудистого континуума [86].

Следовательно, предупреждение накопления и преодоление ингибирования eNOS уже выделившимся ADMA претендует на роль одного из путей фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции при системном воспалении. Эндотелиопротективные свойства, реализуемые посредством снижения угнетающего влияния ADMA на eNOS таких агентов, как L-аргинин [56], тетрагидробиоптерин [60], неселективный ингибитор аргиназы L-норвалин [66], селективные ингибиторы аргиназы II [78] и пр., были экспериментально подтверждены.

На наш взгляд, экспериментальной и клинической проверки требуют несколько подходов. Во-первых, это применение ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы в комбинации с эндотелиопротекторами: 1) L-аргинином; 2) неселективным ингибитором аргиназы S-(2-боро-этил)-L-цистеином (BEC); 3)

селективным ингибитором аргиназы II аргиназином. Статинам, как известно, присущи противовоспалительные эффекты, в т.ч. и в отношении эндотелия; совместный прием с L-аргинином предположительно может оказать более эффективное сдерживающее влияние на ингибирование eNOS диметиларгинином. Во-вторых, комбинированное использование статинов с дарбэпоэтином. Выбор дарбэпоэтина как претендента на роль компонента комбинированной терапии статинами может быть обусловлен его выраженными противовоспалительными, противоишемическими и иммуностимулирующим эффектами.

Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы, исходя из вышесказанного, являются базовым компонентом предполагаемой фармакотерапевтической стратегии. Препараты данной фармакологической группы в последние годы обрели всё нарастающую популярность, объемы их продаж доходят до 5-7 млрд долларов в год и более. Представленные на рынке препараты имеют отличия по липофильности и гидрофильности: к липофильным можно отнести симвастатин и аторвастатин - они же являются и наиболее часто назначаемыми препаратами, к гидрофильным - розувастатин - на сегодняшний день самый современный препарат.

В своем прикладном аспекте в работе предполагается провести полномасштабные доклинические исследования препарата «Акорта» (розувастатин) производства ОАО «Фармстандарт-Томскхимфарм» с целью формирования регистрационного досье и представления материалов в Фармакологический комитет МЗ РФ.

В инновационно-технологическом аспекте в работе предполагается исследование нового нанопартикулированного розувастатина производства НИИ физической химии им. Ореховича, представляющего собой инъекционный раствор наночастиц розувастатина в фосфолипидной оболочке размерами от 40 до 80 нм. Предполагается, что нанопартикулированная субстанция будет обладать существенно лучшей биодоступностью, меньшим объемом распределения и принципиально лучшей фармакодинамикой. Технологическая часть разработки

включена в перечень проектов, поддержанных государством в рамках реализации программы «Фарма 2020».

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2011-2015 гг. (номер гос. регистрации 0120.0710379).

Цель: повышение эффективности фармакотерапии эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции с помощью ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы, а также комбинированного использования статинов с эндотелиопротекторами L-аргинином, неселективным ингибитором аргиназ -ВЕС, селективным ингибитором аргиназы II аргиназином и с дарбэпоэтином.

Задачи исследования:

1. Разработка модели эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции с количественной оценкой результатов функциональных сосудистых проб, динамики уровней биохимических маркеров воспаления (Тотал N0, С-реактивный белок, ИЛ-6, ФНО-а и т.д.) и морфометрического анализа внутренних органов.

2. Исследование дозозависимых противовоспалительных свойств статинов на моделях воспаления (формалиновый отек лапы мышей, экссудативное воспаление у кроликов по Ойвину).

3. Изучение кардиопротективного действия статинов на модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда и оценка возможности реализации защитного действия посредством активации К+-АТФ-азных каналов и N0-зависимых механизмов.

4. Сравнительная оценка эндотелиопротективного действия статинов (симвастатин, аторвастатин, розувастатин, нанопартикулированный розувастатин)

в монотерапии на модели эндотоксин- и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

5. Оценка эффективности эндотелиопротекторов (Ь-аргинин, ВЕС, аргиназин) и дарбэпоэтина в режиме монотерапии на модели эндотоксин- и Ь-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

6. Исследование эндотелиопротективного действия Ь-аргинина в комбинации со статинами (симвастатин, аторвастатин, розувастатин, нанопартикулированный розувастатин) на модели эндотоксин- и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

7. Изучение эндотелиопротективного действия неселективного ингибитора аргиназы II ВЕС в комбинации со статинами (симвастатин, аторвастатин, розувастатин, нанопартикулированный розувастатин) в модели эндотоксин- и Ь-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

8. Исследование эндотелиопротективного действия селективного ингибитора аргиназы II аргиназина в комбинации со статинами (симвастатин, аторвастатин, розувастатин, нанорозувастатин) в модели эндотоксин- и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

9. Оценка эндотелиопротективного действия дарбэпоэтина в комбинации со статинами (симвастатин, аторвастатин, розувастатин, нанорозувастатин) в модели эндотоксин- и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

10. Анализ аддитивных эффектов сочетанного использования ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и нанопартикулированного розувастатина с Ь-аргинином, ингибиторами аргиназ -неселективным ингибитором аргиназ ВЕС, селективным ингибитором аргиназы II аргиназином и дарбэпоэтином.

Научная новизна исследования

Впервые в работе представлены морфофункциональные нарушения, вызванные моделированием эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, где показано, что наиболее выраженное эндотелиопротективное

действие оказало применение розувастатина и его нанопартикулированной формы по сравнению с симвастатином и аторвастатином.

Продемонстрировано, что применение ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и нанопартикулированного розувастатина в терапевтическом диапазоне доз проявляет противовоспалительный дозозависимый эффект на моделях формалинового отека стопы у мышей и экссудативного воспаления у кроликов по Ойвину.

На модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда у крыс выявлено, что кардиопротективный эффект статинов реализуется за счет вклада митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов и iNOS. При этом у разных препаратов различалась точка приложения: так, блокада митохондриальных К+-АТФ-азных каналов глибенкламидом в большей степени снимает эффект симвастатина, а применение блокатора iNOS аминогуанидина нивелирует эффект розувастатина.

Впервые выявлено и рассчитано аддитивное действие комбинированного применения ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы с эндотелиопротекторами. Розувастатин и его нанопартикулированная форма оказались наиболее эффективны при эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, а симвастатин и аторвастатин - при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Аддитивный эффект при комбинировании статинов с L-аргинином был наиболее выражен при применении нанорозувастатина. В случае комбинации ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы с неселективным ингибитором аргиназы BEC в обеих моделях дисфункции эндотелия аддитивный эффект обнаружен не был. При использовании совместной терапии статинами и аргиназином выраженная аддиция наблюдалась и при эндотоксин- и при L-NAME-индуцированной ЭД. Наконец, дарбэпоэтин также продемонстрировал аддитивный эффект в комбинации со статинами. При эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции наибольший вероятностный процент аддиции оказался при сочетании розувастатина с аргиназином и дарбэпоэтином.

Научно-практическая значимость

Обоснована эффективность использования ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы в монотерапии и в комбинации с эндотелиопротекторами при эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Доказано, что применение статинов и средств, влияющих на продукцию оксида азота, позволяет нормализовать артериальное давление, микроциркуляцию, эндотелийзависимую вазодилатацию, снизить уровень биохимических маркеров воспаления (тотал N0, С-рективный белок, ИЛ-6, ФНО-а), улучшить морфологическую картину миокарда.

Полученные данные позволяют обосновать новое перспективное направление использования ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы в сочетании с эндотелиопротекторами для реализации стратегий коррекции патологических процессов в сердечно-сосудистой системе индуцированных эндотоксиновой интоксикацией, в основе реализации механизма действия которых будет лежать патогенетическое воздействие на различные ADMA-eN0S-детерминированные механизмы.

На основании результатов проведенной исследовательской работы разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение в развитии перспективных направлений в фармакологии, клинической фармакологии, состоящее в экспериментальном обосновании новых патогенетических подходов к лечению эндотоксин-индуцированной патологии.

Внедрение результатов научных исследований

На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований розувастатина и его нанопартикулированной формы, а также их комбинаций с препаратами, воздействующими на систему ADMA-eN0S, фармакотерапию эндотоксин-индуцированной дисфункции эндотелия.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препарата «Акорта% производства ОАО «Фармстандарт-Томскхимфарм» (РУ № ЛСР-008560/10) включены в состав документов, поданных на регистрацию в М3 РФ.

Полученные результаты используются в учебных программах кафедр фармакологии Курского государственного медицинского университета, Орловского государственного университета, Белгородского государственного национального исследовательского университета и Воронежского государственного медицинского университета.

Материалы исследования селективного ингибитора аргиназы II ZB49-0010 (аргиназина) получены в рамках Госконтракта по программе Минпромторга РФ «ФАРМА 2020» №13411.1008799.13.129 «Доклинические исследования лекарственного средства на основе низкомолекулярных ингибиторов аргиназы 2 для лечения артериальной и легочной гипертензии».

Методология и методы исследования

Методология диссертационного исследования базируется на методических подходах экспериментальных изысканий зарубежных и российских авторов. Расчеты доз и режимы введения лекарственных средств приняты с учетом их эффективности в экспериментальных исследованиях, основаны на эффективных терапевтических дозах для человека с перерасчетом на животных с помощью межвидовых коэффициентов или подобраны эмпирически. Дизайн исследования строился с учетом рекомендаций по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств и одобрен локальным биоэтическим комитетом.

Исследование выполнено на сертифицированном оборудовании на кафедре фармакологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России и в НИИ Фармакологии живых систем НИУ «БелГУ».

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальная эндотоксин-индуцированная патология сердечнососудистой системы характеризуется развитием эндотелиальной дисфункции с увеличением КЭД до 3,7, повышением адренореактивности, снижением миокардиального резерва и повышением значений маркеров воспаления (С-реактивный белок, ИЛ-6, ФНО-а и т.д).

2. Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин и нанопартикулированный розувастатин оказывают дозозависимое противовоспалительное действие и кардиопротективное действие, реализующиеся посредством активации АТФ-зависимых К+ каналов и iNOS.

3. Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы симвастатин, аторвастатин, розувастатин и нанопартикулированный розувастатин, на модели эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции проявляют дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие. Наибольшей активностью обладают розувастатин и его нанопартикулированная форма в дозе 8,5 мг/кг и 11,6 мг/кг, соответственно.

4. Монотерапия L-аргинином, ингибиторами аргиназ - BEC и аргиназином, а также дарбэпоэтином на модели эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции оказывает эндотелиопротективное действие, проявляющееся снижением КЭД, адренореактивности и маркеров воспаления (С-реактивный белок, ИЛ-6, ФНО-а и т.д).

5. Сочетанное использование ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы и эндотелиопротекторов проявляет выраженное аддитивное действие. Розувастатин и, особенно, его нанопартикулированная форма, существенно увеличивают эффективность фармакотерапии при эндотоксин-индуцированной патологии, а симвастатин и аторвастатин на модели L-NAME- индуцированной эндотелиальной дисфункции. Рекомбинантный дарбэпоэтин и ингибиторы аргиназ BEC и аргиназин обладают равной эффективностью сочетанного воздействия на обеих моделях эндотелиальной дисфункции.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Высокая степень достоверности обусловлена достаточным количеством наблюдений в эксперименте с использованием адекватных методических подходов, отвечающих задачам эксперимента, и оборудования, имеющего соответствующие сертификаты. Для всех данных применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения критерием Шапиро-Уилка. Межгрупповые различия анализировались параметрическими (^ критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами, в зависимости от типа распределения.

Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2010, 2011, 2012, 2013, 2014 и 2015 гг., V и XIV национальных конгрессах «Человек и лекарство» 27 ргштсй 2012 - 05 Ьёт 2013 го^, Praha (Чехия), V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2015), X итоговой научно-практической конференции клинических ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» НИУ БелГУ, конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Франция, Париж, 2015), конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Россия, Сочи, 2015).

Личный вклад автора

Автору принадлежит основная роль при определении направления исследования, постановке цели и поиске путей ее достижения. Лично автором проведен анализ отечественных и зарубежных источников по теме выполняемой диссертации. На основании анализа литературных данных выдвинуты рабочие гипотезы о возможных путях фармакологической коррекции эндотоксин-индуцированной патологии сердечно-сосудистой системы с помощью статинов и нанопартикулированной формы розувастатина, а также их комбинаций с L-

аргинином, ингибиторами аргиназ, дарбэпоэтином. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования.

В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены ключевые критерии оценки морфофункциональных нарушений при моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых тестируемых препаратов. При непосредственном участии автора осуществлялось выведение животных из эксперимента с регистрацией физиологических показателей и проведением функциональных проб on-line с помощью программного комплекса Asqknowledge 3.8.1, забор тканей и органов для биохимического и морфологического исследований, биохимические и морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 64 печатные работы, из них 20 статей -в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций, отражающих полностью содержание работы, включая 6 статей в изданиях, входящих в базы данных Scopus и Web of Science. Получено 17 патентов на изобретения РФ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, заключения, выводов, приложений и списка литературы, включающего 625 источников, из них 113 отечественных и 512 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, содержит 59 таблиц, 34 рисунка.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Эндотелиальная дисфункция при синдроме системного воспалительного

ответа

Воспаление является тонко скоординированной системной реакцией организма, направленной на элиминацию повреждающего агента. Однако зачастую воспалительная реакция наносит организму больший ущерб, нежели этиологический фактор, который ее индуцировал. Более 100 лет назад Уильям Ослер в своих рассуждениях касательно сепсиса верно предположил, что, за исключением редких случаев, причиной смерти при септическом процессе является не инфекция, а реакция организма на нее. Современная патофизиология объясняет данное явление через понятие синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), рассматриваемого как ответ организма на различные флогогенные воздействия инфекционной и неинфекционной природы. Научные изыскания последнего десятилетия привели к формированию целостной картины, описывающей ССВО через каскад нейрогуморальных реакций, сформированный сложными медиаторными и цитокиновыми сетями. Описывая патогенез системного воспаления, можно обозначить несколько ключевых этапов: 1) презентация липополисахарида на поверхности эндотелия, массивная стимуляция паттерн-распознающих рецепторов клеток иммунной и ретикулоэндотелиальной систем; 2) выброс последними медиаторов воспаления (брадикинин, простагландины, гистамин, провоспалительные цитокины) и изменение профиля экспрессии молекул межклеточных взаимодействий (интегрины, селектины) с последующей адгезией лейкоцитов и активацией индуцибельной NOS; 3) нарастание цитотоксических концентраций NO с образованием активных форм азота, нарушение межклеточных контактов и окисление ЛПНП, смена антитромботических свойств эндотелия на протромботические и миграция лейкоцитов через стенку микрососудов с дальнейшей инфильтрацией тканей и поглощением окисленных ЛПНП;

4) гиперпродукция АФК, вазодилатация, микротромбозы и системные проявления ССВО; 5) смерть вследствие постепенной декомпенсации процессов жизнеобеспечения на системном уровне или формирование дисфункции эндотелия (рисунок 1.1).

Подобного рода патологические каскады отражены в концепции липидного дистресс-синдрома (ЛДС), сформулированной В.С. Савельевым, В.А. Петуховым и соавторами в последние годы [87-92]. Фундаментом концепции послужили данные исследований о том, что в отдаленный период (10-20 лет) после абдоминальной катастрофы у пациентов развивается атеросклероз с драматическими последствиями, исходом которых становится сердечнососудистый континуум [89]. Причиной столь серьезных поражений у лиц, перенесших абдоминальную катастрофу, сопровождаемую перитонитом, кроме эндотоксиновой агрессии, является вытекающая из нее эндотелиальная дисфункция, влекущая за собой развитие атеросклероза и его осложнений [89-96]. Авторы утверждают, что, несмотря на то, что эндотоксиновая агрессия постоянно присутствует в организме с раннего возраста, к развитию клинически значимой патологии может привести только повреждение эндотоксин-связывающих и эндотоксин-лимитирующих систем организма [92, 97]. Абдоминальная катастрофа сопровождается избыточным выбросом в кровоток эндотоксинов, что приводит к срыву адаптационных возможностей организма и, как следствие, полиорганной недостаточности [98-100].

Примечание: TLR - То11-подобные рецепторы; ОКОО- - пероксинитрит; N000 -нитрозилхлорид; iN0S - индуцибельная N0-синтаза; ИЛ-1 - интерлейкин 1; ИЛ-6 -интерлейкин 6; ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа; ЛПС - липополисахарид; ЛПНП -липопротеиды низкой плотности; ЛПНОП - липопротеиды очень низкой плотности; ЛВМЛ -

асимметричный диметиларгинин

Рисунок 1.1 - Патогенез повреждения сосудистой стенки при синдроме системной

воспалительной реакции.

Аналогичным образом, можно полагать, что инфекционные заболевания при отсутствии адекватной антибактериальной терапии истощают эндотоксин-лимитирующие системы организма, к которым относят прежде всего липопротеины высокой плотности, и приводят к развитию эндотелиальной

дисфункции с последующим атеросклерозом. Представляется, что пусковым звеном в развитии полиорганной недостаточности при ЛДС является эндотоксинемия, в дальнейшем на фоне дисбиоза желудочно-кишечного тракта способствующая прогрессированию эндотелиальной дисфункции [87, 91, 101, 102]. Роль эндотелиальной дисфункции в патогенезе многих сердечно-сосудистых заболеваний подтверждена исследованиями последних лет. Данное состояние проявляется в извращении сосудистой реакции на фармакологические и физиологические стимулы, которые в отсутствие патологии носят характер вазодилатации. Степень и тяжесть атеросклеротического процесса всегда коррелируют с эндотелиальной дисфункцией, которая не устраняется стандартной терапией сердечно-сосудистых заболеваний, и риск осложнений при этом сохраняется на высоком уровне [1, 98, 103, 104].

Липополисахарид клеточной стенки представляется основным триггером развития эндотелиальной дисфункции. При низких его концентрациях имеет место рецепторный механизм, а при высоких - макрофагальный СЭ14 в дополнении с иными механизмами, способствующими увеличению проницаемости эндотелия [105-107]. Эндотелиальная дисфункция, развивающаяся при абдоминальной катастрофе, не может быть рассмотрена изолированно только в контексте артериолярного васкулита, здесь важная роль отводится печени как главному органу-мишени ЛДС, где стимулированные эндотоксином купферовские клетки снижают на 80-90% синтез N0, вызывая локальную дисфункцию сосудов печени, за которой следует выброс провоспалительных цитокинов в системный кровоток [108, 109]. При этом наблюдается существенное возрастание уровня С-реактивного белка, ФНО-а и пр. [110], а также окисленных липопротеинов низкой плотности, последнее является причиной снижения синтеза гепрана - составляющего компонента субэндотелиального матрикса и закономерного увеличения размеров межэндотелиальных пор [111-114]. Даже кратковременное повышение проницаемости эндотелия для макрофагов при продолжающейся эндотоксиновой атаке значительно усиливает процесс развития эндотелиальной дисфункции. При этом ослабевает защитная роль липопротеинов

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Денисюк Татьяна Алексеевна, 2019 год

ЛИТЕРАТУРА

1. lnvitrogen® Predictor™ hERG Polarization Assay -py ко вод CTBO ктест-с исте м e. Выпуск от 29.10.2009. http://www.tecan.corn/platform/content/element/508 l/AN_InfiniteF500_hERG_FP _395640_Vl%200.pdf

2. lnvitrogen SelectScreen® Biochemical P450 profiling service screening protocol and assay conditions, -lnvitrogen®, Rev 2012. -Режимдостунасвободный,1ЖЕ: http://ru-ru.invitrogen.com/ete/medialib/files/Drug-

Discoverv/PDFs.Par.45808.File.dat/20120701%20SSBP"/o20Customer%20Protoco l%20and%20Assav%20Conditions.pdf

3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств: часть первая / А. Н. Миронов, Н.Д. Бунатян и др. -М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

4. Guideline on Bioanalytical Method Validation (EMA, 2011);

Приложение 2. Копии патентов на изобретения РФ

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение хочу выразить сердечную благодарность моему глубокоуважаемому учителю - доктору медицинских наук, профессору Покровскому Михаилу Владимировичу за внимание и постоянную помощь в работе над диссертацией.

Благодарим также руководство Курского государственного медицинского университета в лице ректора, д.м.н., заслуженного врача РФ, профессора В.А. Лазаренко и руководство Белгородского государственного национального исследовательского университета, в лице ректора, д.п.н., профессора О.Н. Полухина за предоставленную возможность выполнить научную работу.

Выражаем глубокую признательность директору и сотрудникам ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины» Минздрава России, в частности, академику РАН Р.Г. Оганову и профессору В.А. Метельской за предоставленную возможность проведения биохимических исследований.

Благодарим за консультативную помощь, советы и дружеское творческое взаимодействие ректора ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, профессора, академика РАН В.И. Петрова.

Благодарим профессора кафедры анатомии и гистологии человека НИУ «БелГУ», профессора, доктора медицинских наук А.А. Должикова, профессора кафедры патологии и физиологии Орловского государственного университета, доктора медицинских наук В.С. Барсукова за помощь в проведении морфологических исследований, а также за консультативную и методическую помощь.

Выражаем глубокую признательность заведующей клинико-диагностической лабораторией ОБУЗ «Курская городская клиническая больница № 4» И.Ю. Ухановой за предоставленную возможность проведения биохимических исследований.

Благодарим коллективы НИИ Экспериментальной медицины, сотрудников кафедр фармакологии и клинической фармакологии КГМУ за теплое отношение и дружескую помощь в ходе выполнения работы.