Фармакологические свойства и клинические эффекты белково-полимерных лекарственных средств, созданных электронно-лучевым синтезом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, доктор медицинских наук Мадонов, Павел Геннадьевич

• Мадонов, Павел Геннадьевич
• доктор медицинских наук
• 2012

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Мадонов, Павел Геннадьевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1 .Полиэтиленгликоль и его применение в фармакологии.

2.Способы пегилирования.

3.Ускорители заряженных частиц.

4.Пегилированные лекарственные препараты.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакологические свойства и клинические эффекты белково-полимерных лекарственных средств, созданных электронно-лучевым синтезом»

Развитие мировой фармацевтической индустрии в основном зависит от двух составляющих: достижений фармакологии в части поиска и обоснования применения новых лекарственных компонентов и второе-внедрение новых технологических решений на фармацевтических производствах. Бизнес-акселерация фармацевтических компаний из числа мировой «биг-фармы» обеспечивается сочетанием в каждой из них этих двух ключевых компетенций. Успехи мировых лидеров фармацевтической индустрии с одной стороны позволяют рассчитывать на ощутимые успехи в лечении сложных заболеваний человека, с другой стороны ставят государства, не имеющие у себя мировых фармгигантов, в зависимое положение от импорта дорогостоящих лекарственных средств.

В 2010 году Правительство Российской Федерации приняло концепцию развития отечественной фармацевтической отрасли «Стратегия развития фармацевтической промышленности России на период до 2020 года». Как указано в этом документе: «Основной целью государственной политики Российской Федерации по развитию национальной фармацевтической промышленности на период до 2020 года является создание условий для ее перехода на инновационную модель развития, что должно привести к росту обеспеченности населения, учреждений здравоохранения, лекарственными средствами отечественного производства.». Одной из основных задач Стратегии обозначено стимулирование разработки и производства отечественных инновационных лекарственных средств. Стратегия развития национальной фармацевтической промышленности основывается на следующих приоритетах:

• приоритет инновационной модели развития отрасли;

• приоритет качества, эффективности и безопасности лекарственных средств;

• приоритет национальной фармацевтической отрасли в реализации государственных программ в области обеспечения лекарственными средствами;

• приоритет производства высокотехнологичных фармацевтических субстанций на территории РФ;

• приоритет развития экспортоспособных производств и новых разработок;

• приоритет замещения импортных лекарственных средств отечественными, полный цикл производства которых находится на территории РФ;

Тенденции развития мировой экономики диктуют необходимость создания собственных фармацевтических производств, ориентированных на импортозамещение и лекарственную безопасность России. Политические и экономические решения правительства Российской Федерации создают условия для государственных и частных бизнес структур по инвестированию больших денежных средств в разработку новых лекарственных препаратов и техническое перевооружение фармацевтических предприятий.

Совершенно очевидно, что поиск новых технологических решений по синтезу или модификации лекарственных препаратов должен иметь главную задачу - их высокую эффективность и безопасность. Особенно это актуально для фармацевтических препаратов белковой природы. В клинической практике лекарственные препараты этой группы имеют очень широкое применение. Между тем, известно, что белковые молекулы массой более 7 ООО Да приобретают аллергогенные и иммунотоксические свойства при попадании в организм человека. Белковые фармацевтические препараты не всегда имеют выгодный фармакокинетический профиль, а при энтеральном приёме их биодоступность не превышает 1,5 %. Таким образом, главное противоречие применения белковых фармацевтических препаратов заключено в их высокой клинической эффективности и ограничении применения парентерально ввиду высокой токсичности, а энтерально ввиду низкой биодоступности. Ликвидация этого противоречия возможно путём производства модифицированных лекарственных форм посредством создания полимер-белковых конъюгатов для парентерального и энтерального введения, микрокапсулирования, включения активного фармацевтического ингредиента в липосомы для перорального приёма.

Создание конъюгатов ПЭГ-белок, ПЭГ-пептид, ПЭГ-олигонуклеотид в последнее десятилетие стало часто использоваться для улучшения фармакокинетических свойств и токсикологических характеристик данных лекарственных препаратов. Для этих целей в подавляющем большинстве случаев используется химическая пегиляция.

В настоящей работе представлены материалы по внедрению новой технологии пегилирования белковых молекул - электронно-лучевой пегиляции (ЭЛТТ). В качестве исследуемых веществ были взяты две белковые молекулы -рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и протеолитический фермент субтилизин, существенно отличающиеся друг от друга по физико-химическим свойствам, механизму фармакологического воздействия, по параметрам фармакокинетики и токсичности. Посредством ЭЛП созданы пэгилированные модификации данных фармакологически активных белковых молекул. Исследованы их фармакодинамические, фармакокинетические параметры, оценена токсичность на лабораторных животных. Пегилированная форма субтилизина изготовлена в двух лекарственных формах - энтеральной и инъекционной. На обеих лекарственных формах проведен полный комплекс регистрационных клинических исследований. Получена Государственная регистрация под торговым названием Тромбовазим. Инъекционная форма предложена в качестве тромболитического препарата для лечения острого инфаркта миокарда, твёрдая лекарственная форма для лечения нарушений периферического кровообращения. Пегилированный ГКСФ прошёл весь комплекс доклинических исследований и подготовлен для клинических исследований.

На основании представленных материалов можно заявить о создании нового класса лекарственных препаратов — радиационных конъюгатов ПЭГ-Белок. Это новое отечественное направление в фармакологии. Технология ЭЛЛ основана на фундаментальных разработках отечественных учёных - физиков, химиков, биологов СО АН Российской Федерации. В настоящий момент нет сведений о подобного рода разработках за рубежом. Отладка технологических приёмов электронно-лучевой пегиляции, изучение фармакологических свойств белковых молекул, модифицированных по технологии ЭЛЛ, позволили заявить данную методику, как оригинальную отечественную технологию создания инновационных лекарственных препаратов.

Цель исследования: Изучить возможности электронно-лучевого синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем для создания новых фармакологических средств с оценкой их токсичности, переносимости, специфической активности и фармакокинетики.

Задачи исследования:

1. На примере двух различающихся по химическим и фармакологическим свойствам белковых молекул показать возможности электроннолучевого синтеза с полиэтиленгликолем для создания пегилированных фармакологически активных лекарственных средств;

2. Изучить физико-химические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

3. Изучить фармакодинамические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

4. Изучить параметры фармакокинетики созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

5. Оценить токсические эффекты созданных посредством электроннолучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

6. На примере лекарственного средства - пегилированиого субтилизина, созданного посредством электронно-лучевого синтеза, показать терапевтические возможности по соотношению клиническая эффективность/безопасность;

7. Обосновать возможности технологии электронно-лучевого синтеза для создания новых, инновационных лекарственных препаратов, обладающих оптимальным соотношением польза/риск.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые показана возможность радиационного синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем при использовании пучка ускоренных электронов. Определена ключевая роль дозы излучения, концентрации ПЭГ, нативного белка в растворе и его температуры в образовании белково-полимерных соединений за счёт карбонильной связи полимера и аминной связи белка, водородных связей, оснований Шиффа. Впервые доказана возможность, варьируя дозой облучения, концентрацией и молекулярной массой одного и того же полимера и белка, создавать композиции от единичных молекул полимера на белке до включения белка в полимерный кросслинкинг, изменяя фармакокинетические характеристики вещества. Результатом исследования явилось подтверждение стабильности соединений белок-полимер в течение 2 лет при температуре 8-10°С.

При оценке фармакодинамики полученных соединений в эксперименте in vitro и на моделях патологических состояний показано, что белково-полимерные препараты, созданные по технологии электроннолучевого синтеза, обладают специфической фармакологической активностью свойственной нативным белкам. Так, на модели миелосупрессии, продемонстрировано, что пегилированный по технологии электроннолучевого синтеза Г-КСФ и нативный Г-КСФ обладают идентичной специфической активностью, отличаясь лишь профилем достижения терапевтических эффектов: при применении пегилированиого Г-КСФ достижение максимальной гемостимулирующей активности запаздывает на 1 сутки, но эффект сохраняется более продолжительно (до 13 суток). Для фармакологического препарата на основе пегилированного, посредством электронно-лучевого синтеза, фермента-субтилизина молекулярной массой 30 кДа, продемонстрирован, свойственный нативному белку, выраженный фибринолитический эффект как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Тромболитический эффект лекарственного средства на основе пегилированного субтилизина подтвержден в клинических исследованиях при лечении венозной недостаточности и инфаркта миокарда.

Впервые изучено и показано, что одноступенчатый электроннолучевой синтез нативного белка с полиэтиленгликолем модифицирует фармакокинетические характеристики нативного белка и обеспечивает новые, терапевтически значимые пути его введения в организм. На примере пегилированного Г-КСФ показано, что препарат быстро проникает в системный кровоток и достигает максимальных концентраций при подкожном и ректальном введении в течение 1 часа, а при внутрижелудочном введении через 10 мин. Значения максимальных концентраций лежат в диапазоне 1700-2500 пг. Препарат пегилированного субтилизина всасывается из кишечника с биодоступностыо 16-18% и имеет пик концентрации в плазме через 4 часа после энтерального введения.

Электронно-лучевое пегилирование белковых молекул обеспечивает низкую токсичность созданных на их основе лекарственных препаратов. При определении параметров острой токсичности ПЭГ-ГКСФ выявлено, что достигнутые дозы препарата многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз. Изучение хронической токсичности показало отсутствие поражений органов при длительном приёме, отсутствие аллергизирующего и иммунотоксического действия, не выявлены мутагенные свойства и генотоксичность, препарат не обладает местнораздражающим действием. Пегилированный субтилизин при парентеральном и энтеральном введении не оказывает выраженных токсических эффектов и относится к классу малотоксичные вещества.

В результате проведённых клинических исследований установлено, что электронно-лучевое пегилирование субтилизина обеспечивает тромболитическое, цитопротективное, противовоспалительное действие в организме человека при энтеральном и парентеральном путях его введения. На основе данного исследования фармакологический препарат пегилированного субтилизина создан в двух лекарственных формах. Продемонстрирована его эффективность как прямого тромболитика при остром инфаркте миокарда с более благоприятным соотношением эффективность/безопасность по сравнению с активаторами плазминогена. Таблетированная форма является эффективным средством для лечения венозной недостаточности и тромбозов венозной системы.

Практическая значимость.

Технология электронно-лучевого пегилирования демонстрирует возможности создания инновационных высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов белковой природы для лечения различных заболеваний. Электронно-лучевое пегилирование белковой молекулы способно изменить фармакокинетические показатели, особенно в части повышения энтеральной биодоступности, снизить токсичность, обеспечить невысокую стоимость конечного продукта. Данный способ позволяет синтезировать фармакологически активные белковые молекулы для лечения конкретной нозологии с требуемыми параметрами фармакокинетики и оптимальным способом введения в организм. Лекарственные препараты на основе пегилированных белков, созданные по технологии ЭЛП комплаентны для пациентов за счёт возможности использовать твёрдые лекарственные формы (капсулы, таблетки, суппозитории), безопасны с точки зрения иммунотоксичности и аллергогенности. Эти лекарственные препараты могут использоваться человеком достаточно долгое время и несколькими курсами для лечения тяжёлых хронических дегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем позволяет создавать соединения ПЭГ-Белок со стабильными физико-химическими свойствами, обладающие фармакодинамикой, присущей нативному белку;

2. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем различной молекулярной массы позволяет модифицировать фармакокинетические характеристики соединения ПЭГ-Белок. Позволяет создавать лекарственные препараты белковой природы с высокой терапевтической активностью и низкой токсичностью.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Мадонов, Павел Геннадьевич

выводы

1. Электронно-лучевая пегиляция белковых молекул может быть использована для создания пегилированных фармакологических препаратов белковой природы. Под действием пучка ускоренных электронов в одну технологическую стадию удаётся получить фармакологически активный белково-полимерный комплекс ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа.

2. В результате электронно-лучевого пегилирования исследованных фармакологически активных белковых молекул изменяются их физико-химические свойства. Увеличивается их молекулярная масса, они обладают хорошей растворимостью в воде и не выпадают в осадок. Созданные посредством ЭЛП белково-полимерные комплексы обладают хорошими показателями по стабильности при различных условиях хранения.

3. В процессе электронно-лучевой пегиляции специфическая фармакологическая активность нативной белковой молекулы не утрачивается. Созданные белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа сохраняют необходимые фармакодинамические характеристики.

4. В результате электронно-лучевого пегилирования изменяются параметры фармакокинетики исходных фармакологически активных белковых молекул. Белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа приобретают увеличенную энтеральную биодоступность с созданием терапевтически значимых концентраций препарата в кровотоке.

5. Белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа, созданные посредством ЭЛП обладают низкой токсичностью при различных способах применения. Пегилированная протеиназа классифицируется как малоопасное вещество. Токсические дозы ПЭГ-Г-КСФ многократно превышают терапевтические.

6. Фармакологический препарат на основе ПЭГ-Протеиназы в твёрдой лекарственной форме демонстрирует высокую клиническую эффективность при венозной недостаточности. При внутривенном способе введения данный препарат как прямой тромболитик используется при остром инфаркте миокарда. Наряду с высокой клинической эффективностью фармакологический препарат на основе ПЭГ-Протеиназы хорошо переносится больными и не имеет выраженных побочных эффектов.

7. Технология электронно-лучевой пегиляции белковых молекул позволяет создавать оригинальные, инновационные лекарственные препараты, в том числе и на основе известных ранее субстанций. ЭЛП позволяет синтезировать лекарственные препараты с заданными параметрами фармакокинетики: от ускоренного достижения пиковых концентраций до создания тканевых депо с пролонгированным клиническим эффектом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены материалы изучению возможностей и по практическому использованию электронно-лучевой пегиляции для создания пегилированных фармакологических средств белковой природы. В доступном для нас массиве литературных источников, отражающих технологические приёмы синтеза и использования в клинической практике пегилированных лекарственных препаратов, нами не найдено аналогичных примеров. Несмотря на то, что электронно-лучевая конъюгация белков (иммобилизация) процесс в науке известный, не было попыток масштабных экспериментальных работ с целью глубокого анализа возможностей данного метода для синтеза фармацевтических субстанций. Принимая во внимание известные преимущества пегилированных лекарственных препаратов, автором работы была поставлена перед собой цель продемонстрировать возможности технологии электронно-лучевой пегиляции фармакологически активных белковых молекул на примере двух молекул, отличающихся друг от друга, как по химическим, так и фармакологическим характеристикам. В работе показана химическая аналитика полученных конъюгатов, отражены выполненные доклинические исследования, представлен созданный лекарственный препарат, его клинические исследования и вывод на фармацевтический рынок.

Актуальность использования известных пегилированных лекарственных препаратов, полученных посредством химического синтеза, их значимые клинические преимущества явились своего рода вызовом для представленной работы. Необходимо было показать не только адекватность технологии ЭЛП с точки зрения пегиляции белковых молекул против традиционного химического способа, но и определить преимущества данного метода. Сопоставляя масштаб выполненных исследований и достигнутую конечную цель можно смело утверждать, что в данной работе представлена новая технология производства лекарственных препаратов. Электроннолучевая пегиляция это не просто альтернатива химической, она в отличие от ззо неё, предоставляет дополнительные технологические возможности для модификации фармакокинетических свойств лекарственных препаратов. Особо хочется отметить тот факт, что это оригинальная отечественная разработка, как с позиции технологических решений, так и позиции научного обоснования.

Как было указано в обзоре литературных источников, попытки применять ковалентное присоединение полимеров с целью совершенствования безопасности и эффективности различных протеинов для использования в фармацевтическом производстве предпринимались с 70-х годов прошлого века. Конъюгаты Белок-ПЭГ преимущественно синтезируются с единственной нитью ПЭГа имеющей высокий молекулярный вес - до 30 кДа. Возможно конъюгирование с несколькими (до 10) нитями одного или нескольких ПЭГов. ПЭГ соединяется с целевым протеином через аминогруппы (эпсилон-аминогруппы радикалов лизина и альфа-аминогруппа 1Ч-концевой аминокислоты). С увеличением количества нитей ПЭГа, увеличивается вероятность того, что аминогруппа в активной части белка будет модифицирована, ослабляя его биологическую функцию (например, ферментативный катализ или рецепторное связывание цитокином). Для больших протеинов, содержащих много аминогрупп, и для ферментов с субстратами низкого молекулярного веса, данный компромисс между повышенной продолжительностью действия и пониженной удельной активностью может быть приемлемым, так как он дает чистое увеличение биологической активности ПЭГ-содержащих конъюгатов в живом организме.

Для осуществления ковалентного присоединения ПЭГа к протеину одна из гидроксильных концевых групп полимера должна быть вначале преобразована в химически активную функциональную группу (радикал). Этот процесс часто называется "активацией", а получаемый продукт называется "активированным ПЭГ". Монометоксильный ПЭГ, который с одного конца закрыт инертным, химически устойчивым диметиловым эфиром ("метоксильной группой"), а с другого конца - функциональной группой (радикалом), химически активной по отношению к аминогруппам на молекуле протеина, наиболее часто используется в подобных методиках. ПЭГи, которые содержат две и более метоксильные группы, наиболее удаленные от единственной активированной функциональной группы, используются не так часто. Активированные полимеры вступают в реакцию с терапевтическим средством, имеющим функциональные группы, которые служат местом присоединения. Одна функциональная группа, обычно используемая в качестве места присоединения, является эпсилон-аминогруппой радикалов лизина. Гидроксильная группа ПЭГа активируется хлорангидридом циануровой кислоты. Использование данного метода имеет свои недостатки, такие как токсичность хлорангидрида циануровой кислоты и её неспецифическая химическая активность для протеинов, имеющих функциональные группы, отличные от аминов, такие как растворимые радикалы цистеина или тирозина, которые могут быть существенными для выполнения фармакологических функций.

Для преодоления этих и других недостатков применяются альтернативные активированные ПЭГи, такие как сукцинимидилсукцинатные производные С^З-РЕС - СС-ПЭГ). СС-ПЭГ быстро вступает в реакцию с протеинами, давая активные, хотя и широко модифицированные конъюгаты. Известен ещё один вид активированного ПЭГа - полиэтиленгликоль 14-сукцинимидилкарбонат. Данная форма полимера ("БС-РЕО" СК-ПЭГ) легко вступает в реакцию с аминогруппами протеинов, а также с пептидами, имеющими низкий молекулярный вес, и другими материалами, которые содержат свободные аминогруппы, с которыми она образует уретановые связи. Также известны конъюгаты ПЭГ-белок посредством амидных связей, сложноэфирных связей, вторичных аминов и тиоэфирных связей.

Очевидно, что химическая пегиляция белковых молекул представляет из себя многостадийный процесс сопровождающийся использованием токсических соединений. Автор не располагает сведениями о материальном балансе производства пегилированных белков по технологии химического синтеза, но вне всяких сомнений этот процесс дорогостоящий. Это подтверждается анализом стоимости конечного продукта. Например, цена одного флакона нативного ГКСФ производства компании Хоффманн-ля-Рош - «Нейпогена» составляет примерно 300 долларов США, а пегилированный ГКСФ того же производителя - «Неуластим» уже 2 ООО долларов. Маловероятно, что столь значимое увеличение стоимости пегилированного ГКСФ всего лишь коммерческий ход. В итоге высокая цена «Неуластима» при всех его фармакологических преимуществах не позволяет иметь значимый положительный тренд реализации препарата в натуральном выражении - в 2009 году в России «Нейпогена» было продано 3 736 упаковок, а «Неуластима» всего 312 (база данных «Фармэксперт»). При этом необходимо учитывать, что «Неуластим» монопродукт в рынке, а в структуре продаж всех препаратов ГКСФ у него более чем скромная позиция, в том же 2009 году препаратов ГКСФ в России было продано 46 188 упаковок, из них «Неуластима» всего 312. Схожая ситуация и у пегилированных интерферонов, пегилированный интерферон-альфа2а в 10 раз дороже, чем нативный интерферон-альфа2а. В результате стоимость одного курса терапии вирусного гепатита С пегилированным интерфероном-альфа 2а («Пегасис», Хоффманн-ля-Рош) составляет примерно 450 тыс. рублей. Если представить себе общую стоимость лечения больных вирусным гепатитом С в России за один год, а их зарегистрировано около 4 млн. человек, то сложится очевидная картина необходимости иметь в арсенале инфекционистов доступного, недорого пегилированного интерферон-альфа2а.

Собственно говоря, подобного рода бескомпромиссные ситуации для государственного бюджета России и явились главной идеологической концепцией программы «Фарма 2020». Импортозамещение недорогими высокоэффективными лекарственными препаратами отечественного производства составляет концепцию лекарственной безопасности России, озвученную в программных государственных документах.

Автором работы упоминалось выше, что разработка технологии электронно-лучевого пегилирования белковых препаратов это не только амбициозная научная задача, но и конкретные практические предложения для фармацевтической промышленности. Механизм радиационной пегиляции белковых молекул был представлен в предшествующих главах и, анализируя факты, становится совершенно очевидно, что образование конъюгатов Белок-ПЭГ обусловлено исключительно воздействием потока ускоренных электронов, поскольку образцы, содержащие белок и ПЭГ до облучения идентичны исходной субстанции. Конъюгаты после облучения могут иметь не только ковалентный характер связи, прочность образовавшейся связи, зависит от дозы облучения. Дозы в 0,5 МРад и 0,75 МРад в выбранной модельной смеси белка, где используется ПЭГ 20 ООО Да не обеспечивают достаточно прочной связи, а в образцах с ПЭГ 10 ООО Да наблюдается полное включение белка в образовавшихся конъюгатах. Выявлена зависимость между молекулярной массой образующихся Белок-ПЭГ комплексов и дозой облучения. Наиболее выражено этот эффект проявляется с низкомолекулярными полимерами - ПЭГ 400 Да и ПЭГ 1 500 Да, когда наблюдалось увеличение диапазона молекулярной массы Белок-ПЭГ комплекса в зависимости от дозы облучения. Для образцов с высокомолекулярными ПЭГами, подобной картины не отмечается, поскольку возникает эффект кросслинкинга.

Таким образом, метод электронно-лучевой пегиляции позволяет синтезировать различные конструкции целевого белка с полимером. В зависимости от необходимых фармакокинетических, фармакодинамических и токсикологических характеристик перспективного лекарственного препарата можно воспользоваться той или иной технологической схемой производства посредством подбора дозы облучения, концентраций, молекулярной массы, агрегатного состояния композиции. Например:

1. Поставлена задача создать лекарственный препарат в форме тканевого депо с пролонгированным высвобождением фармацевтически активного

334 белкового компонента в нативном виде, пренебрегая возможной аллергогенностыо вследствие его малой молекулярной массы. Здесь следует воспользоваться технологическим приёмом электронно-лучевого кросслинкинга. Предварительно создаётся смесь белка и крупномолекулярного ПЭГа с нужной концентрацией и молекулярным весом, допустим, 20 кДа. Под потоком ускоренных электронов происходит одномоментная структурная перекрёстная полимеризация ПЭГа с включением в его каркас белка. Доза облучения подбирается с учётом необходимой степени структурирования ПЭГа (предгель или гель) и сохранности белковой молекулы. Возможности созданной фармацевтической . композиции будут иметь широкий диапазон использования - от парентеральных до наружных лекарственных форм. Это направление в настоящий момент выглядит весьма перспективным ввиду возможного применения других, кроме обычного ПЭГа, полимеров, которые, в свою очередь, имеют уникальные особенности деградации в организме человека. Это, так называемые, блок-сополимеры типа АВА, ВАВ; где А - ПЭГ, а В - различные вещества способные к биодеградации. Блок-сополимеры разрушаются по блоку В, который может быть рН-чувствительным или термолабильным. Экскреция из организма происходит молекулами малой молекулярной массы. Метаболизм конъюгатов Белок-ПЭГ в котором участвует низкомолекулярный ПЭГ сводится к окислению этанольной группы ПЭГа до карбоновой кислоты, где посредником служит алкогольдегидрогеназа. Затем, как неоднократно указывалось (Drug Metabolism and Disposition Vol.35, No.l, 2007, стр. 916.), низкомолекулярный ПЭГ выводится преимущественно (до 96%) почечной фильтрацией в течение 12 часов, а белковая составляющая конъюгата гидролизуется в печени.

Как показал литературный поиск, интерес могут представлять блоксополимеры на основе молочной, полимолочной, янтарной кислоты.

Межмолекулярный электронно-лучевой кросслинкинг блок-сополимера и

335 включение в его структуру фармацевтически активного белка обеспечит создание такой фармацевтической композиции, которая будет проявлять свои фармакологические свойства только при определённых условиях. Например, высвобождение активного вещества будет только при повышении температуры тела, или высвобождение вазоактивного препарата при ацидотическом состоянии, возникшем вследствие ишемии/гипоксии в том числе и локальной.

2. Известно, что при облучении водных растворов ПЭГа потоком ускоренных электронов, наряду с межмолекулярным кросслинкингом, формирующим в конечном итоге гидрогели, в зависимости от выбранных условий, возможен также внутримолекулярный кросслинкинг, приводящий к синтезу по радикальному механизму индивидуальных полимерных клубков, так называемых наногелей http://www.mitr.р.lodz.pl/biomat/raport/33radiatio nhydrogels.html). Схематически, межмолекулярный и внутримолекулярный кросслинкинг представлен на рисунке 63.

Рис. 63 Схематическое изображение межмолекулярного (а) и внутримолекулярного (б) кросслинкинга, возникающего в водных растворах полимеров в процессе облучения потоком ускоренных электронов (точки на молекулах изображают формирование радикальных сайтов в процессе облучения ускоренными электронами) (http://www.mitr.p.lodz.pl/biomat/raport/ 33radiationhydrogels.html).

На основе представленного феномена возможно создание фармацевтического препарата на основе белка с высокой молекулярной массой, который будет пегилирован по типу наногеля с целью снижения токсических свойств низкомолекулярным ПЭГом и посредством межмолекулярного кросслинкинга депонирован для создания пролонгированной лекарственной формы.

3. Если поставлена задача обеспечить низкую иммунологическую токсичность и отсутствие аллергогенности крупной белкой молекулы без ослабления её специфических химических свойств, следует произвести конъюгацию с низкомолекулярным ПЭГом в невысокой концентрации и в низкой дозе облучения. В результате вокруг глобулы белка появляется «рыхлое» гидрофильное облако полимера, которое не инактивирует специфические свойства белка. Увеличенный гидродинамический радиус полученного конъюгата изменяет его фармакокинетические свойства и улучшает его токсикологические характеристики.

Внутримолекулярный кросслинкинг возникает при облучении водных растворов с низкой концентрацией полимера, из-за значительного удаления молекул последнего в объеме раствора. Нами была предположена возможность формирования подобных структур в облученных растворах ПЭГа с молекулярной массой 1500, образующим в отличие от высокомолекулярных ПЭГов гидрогель при повышенных дозах облучения. Был проведен эксперимент по совместному облучению бычьей тестикулярной гиалуронидазы (БТГ) и 5% водного раствора ПЭГа 1500 в дозе заведомо ниже дозы гелирования Взаимодействие БТГ на матрице ПЭГа оценивали по изменению его профиля элюции методом эксклюзионной ВЭЖХ хроматографии. Детекцию проводили на проточном ВЭЖХ-спектрофотометре (БУКАМ) при длине волны 220нм, Результаты анализов представлены на следующем рисунке.

Рисунок 64. Профиль элюции БТГ после совместного облучения с ПЭГом 1500 в дозе 1,5Мрад Как видно из представленного на рисунке 65 сравнительного профиля элюции в результате облучения ускоренными электронами субстанции БТГ в 5% водном растворе ПЭГа1500 в дозе 1,5 Мрад не наблюдается принципиального изменения во времени выхода фракций, входящих в состав фермента. Это наглядно демонстрирует факт того, что процесс межмолекулярного кросслинкинга, приводящего к формированию водорастворимого предгеля в данном случае не произошел. Для доказательства взаимодействия между ПЭГом и белком, хроматографические фракции, отвечающие за специфическую активность, были собраны и подвергнуты центрифугированию в ультрафильтрационных пробирках (Агшсоп Шга-0,5 10К МПНроге) с пределом отсечения молекулярных масс до ЮкДа. Собранные после ультрафильтрации концентрат и пермеат были протестированы на специфическую активность и наличие ПЭГа (качественная реакция по ТУ 9154-027-59230155-10). Результаты анализа продемонстрировали наличие фермента и ПЭГа в концентрате, что может свидетельствовать о формировании комплексов БТГ с ПЭГом 1500 при их совместном облучении потоком ускоренных электронов.

Конкретным примером использования последнего технологического приёма является пегилированная протеиназа ПЭГ-П - Тромбовазим.

Выше было детально показано, что достаточно крупная белковая молекула фермента субтилизина (=30 кДа), существенно превышающая порог иммуногенностп (=7 кДа) после пегилирования с ПЭГом 1 500 Да имеет токсикологические характеристики присущие малоопасным веществам по ГОСТ 12.1.007 - 76 (IV класс - малоопасные вещества) и обладает энтеральной биодоступностыо. По сведениям уполномоченного по фармаконадзору компании-производителя Тромбовазима («Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», г.Новосибирск) (ПОБ от 06.2011г.) в 11 700 случаях приёма препарата не отмечалось ни одного случая серьёзных нежелательных явлений. Очевидно, что профиль безопасности является одной из позитивных отличительных черт данного лекарственного препарата.

Другим преимуществом ПЭГ-П является достаточно выраженная энтеральная биодоступность. Известно, что в кишечнике человека возможна транслокация белковой молекулы в нативном виде через энтеральную стенку. Однако биодоступность при этом не превышает 1-1,5 % от количества введённого белка. Пегилированная посредством ЭЛП молекула субтилизина имеет иные характеристики в отличие от нативной. При подобранной технологии облучения образуется такой характер связи фермента с ПЭГом, который увеличивает его солюбилизацию, он становится защищённым от конкурентных гидролаз кишечника, при этом, что особенно важно, не блокируется активный центр фермента. В результате пегилированный субтилизин имеет весьма впечатляющую энтеральную биодоступность в 18%.

Наряду с этим ПЭГ-П сохраняет свои специфические протеолитические (фибринолитические и тромболитические) свойства как в экспериментах in vitro и in vivo, так и в организме человека. Тромболитический эффект демонстративен в случае острого инфаркта миокарда и венозного тромбоза мозговых синусов.

Представленную на примере Тромбовазима фармакологическую модель можно считать оптимальной для лекарственного препарата с болюсным режимом введения, когда в ограниченный (короткий) период времени создаётся высокая пиковая концентрация терапевтического белка, разворачивается его искомый фармакодинамический профиль без токсических побочных явлений и наступает быстрая экскреция через почки. Благоприятные токсикологические характеристики позволяют проводить эскалацию терапевтической дозы пегилированного белкового препарата посредством увеличения кратности введений без риска развития анафилактического состояния.

Электронно-лучевое пегилирование второй представленной в данной работе белковой молекулы - рчГ-КСФ также демонстрирует изменение фармакологических показателей, особенно в части повышения энтеральной биодоступности. Возможно, биодоступность ПЭГ-ГКСФ в тонком кишечнике не является впечатляющей с точки зрения перспективы создания пероральной лекарственной формы для лечения миелосупрессивных состояний в противовес парентеральной. Однако сам факт увеличения данного показателя в 4 раза достаточно демонстративен. При этом особенного внимания заслуживает биодоступность ПЭГ-ГКСФ через кишечную стенку прямой кишки. В экспериментах установлено, что биодоступность при введении препарата per rectum достигает 32 %.

Изучение транслокации пегилированных белков через эндотелиальную стенку посредством прямого детектирования в рамках данной работы не было предусмотрено. Однако автор, ссылаясь на выполненные и опубликованные работы по изучению действия пегилированной гиалуронидазы и пегилированных олигонуклеотидов, считает, что этот процесс имеет место быть. На рис. 65 и 66 представлены снимки конфокальной микроскопии участка тонкой кишки крысы, в котором детектируется накопление пегилированных белковых препаратов

ПЭГ-БП), меченных ИТС. На рис.65 отображено накопление в крипте кишечника пегилированного белкового препарата с молекулярной массой 5,5 кДа. На рис.66 этот же процесс с белковым препаратом молекулярной массой 30 кДа.

Рис. 65. Конфокальные снимки ткани тонкой кишки после инкубации пегилированного белкового препарата (ПЭГ-БП) ММ - 5,5 кДа (in vivo)

Рис. 66. Конфокальные снимки ткани тонкой кишки после инкубации ПЭГ-БП ММ - 30 к Да (in vivo).

Очевидно, что наряду с транслокацией пегилированных белковых препаратов из просвета кишечника в сосудистое русло, происходит накопление их в интерстиции кишечника. Причём конъюгаты ПЭГ-Белок, созданные по технологии электронно-лучевого синтеза, способны к накоплению в интерстиции в достаточно большом диапазоне молекулярных масс нативного белка.

Принимая во внимание возрастающий интерес к терапии цитокинами в регенераторной медицине, можно смело считать, что электронно-лучевое пегилирование белков-цитокинов позволит сформировать новый класс препаратов данной группы - это будут адресные регенеративные препараты. Преодоление энтерального барьера демонстрирует потенциальные возможности пегилированной молекулы, имеющей вокруг себя гидрофильное облако, проникать в интерстициальное пространство.

Лекарственные препараты на основе пегилированных цитокинов будут комплаентны для пациентов за счёт возможности использовать твёрдые лекарственные формы (капсулы, таблетки, суппозитории), безопасны с точки зрения иммунотоксичности и аллергогенности. Таким образом, эти лекарственные препараты могут использоваться человеком достаточно долгое время и несколькими курсами для лечения тяжёлых хронических дегенеративных заболеваний. Принимая во внимание указанные выше экономические преимущества электронно-лучевой пегиляции против химической, можно пренебречь не высокой энтеральной биодоступностыо против инъекционных форм. Увеличение дозы активного вещества не будет главным ценообразующим фактором конечного продукта. Эти лекарственные препараты будут относительно не дорогими как для частных покупок больными, так и для государственного бюджета в формате госзакупок.

В разное время автор участвовал в работах по созданию и изучению фармакологических свойств пегилированных препаратов ферментной природы, цитокинов, гормонов, олигонуклеотидов. Некоторые материалы и результаты опубликованы, другие материалы находятся на стадии доработки и патентования. Накоплен большой научный и практический опыт не только по созданию и исследованию пегилированных фармацевтических продуктов, но и по их внедрению в клиническую практику начиная с этапа регистрационных клинических исследований и заканчивая выводом лекарственного препарата на фармацевтический рынок. Автор имеет все основания считать технологию электроннолучевого пегилирования белковых молекул перспективной и значимой как для фармацевтической отрасли экономики, так и для здравоохранения Российской Федерации.

Производственный процесс электронно-лучевого пегилирования достаточно простой. Конъюгация белка и полимера осуществляется за один технологический этап, который по времени занимает менее одного часа, начиная с момента доставки исходного материала на производственный участок радиационного синтеза. Однако, это не значит, что электронно-лучевое пегилирование представляет собой универсальный приём для большинства белковых молекул. Каждая композиция - кандидат в лекарственный препарат на этапе отработки лабораторного регламента проходит несколько стадий испытаний и химической аналитики. По нашему опыту для создания фармацевтической субстанции пегилированного белка требуется от 50 до 250 экспериментов по подбору концентрации белка и ПЭГа, молекулярной массы полимера, дозы облучения, агрегатного состояния.

Наряду с процессом пегилирования происходит стерилизация фармацевтической субстанции, что, безусловно, является дополнительным положительным свойством технологии. Отдельно стоит остановиться на последствиях радиационного облучения исходных субстанций с точки зрения образования токсических метаболитов вследствие денатурации и источников остаточной радиации. Первое и второе являются потенциально опасными для организма человека, и упустить этот аспект электроннолучевого пегилирования не представляется возможным. Технология электронно-лучевого пегилирования фармацевтических субстанций предусматривает использование доз радиации в диапазоне от 0,25 до 2,5 Мрад. Для промышленной стерилизации пищевых продуктов, изделий медицинского назначения используются дозы от 1 до 3 Мрад, что предполагает отсутствие образования радиационных токсических метаболитов и продуктов деградации белка. Также стоит добавить, что технологический процесс производства лекарственных препаратов предусматривает контроль хроматографическим способом сохранности белковой молекулы, что в свою очередь подтверждает соблюдение безопасных параметров облучения и качество конечного продукта.

Подводя итог над изложенным в диссертации материалом, её автор считает поставленные цели и задачи выполненными. Наглядно представлена новая оригинальная отечественная технология создания лекарственных препаратов белковой природы. На примере двух лекарственных препаратов продемонстрированы возможности электроннолучевого пегилирования белковых молекул. Показано, что электроннолучевая пегиляция фармацевтически активной белковой молекулы обеспечивает ей выгодное соотношение терапевтической эффективности и безопасности. Материалы диссертации убедительно доказывают, что в настоящий момент отечественная фармакология и фармацевтическая промышленности не страдают от кризиса идей. Сочетание огромного потенциала Российской науки и возможностей отечественной фармацевтической промышленности позволяют создавать собственные уникальные промышленные технологии производства лекарственных препаратов, не уступающие зарубежным производителям.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Мадонов, Павел Геннадьевич, 2012 год

1. Аверков А.В.Тромболитическая терапия инфаркта миокарда. //Лечебное дело.- 2003.-№1. С. 21-26.

2. Андреенко Г.В., Бессолицина Л.А., Саргин К.Б. Состояние систем фибринолиза у больных инфарктом миокарда при тромболитической и антикоагулянтной терапии. Клиническая медицина. -1976.-№ 5.- С. 3338.

3. Андреенко Г.В./Фибринолиз. Химия и физиология процесса. Клиническое применение фибринолиза.-М., 1967. С.248.

4. Ауслендер В. Л., Безуглов В. В., Брязгин А. А. и др. Ускорители электронов серии ИЛУ и их использование в радиационнотехнологических процессах // Вопр. атомной науки и техники. Серия: Техническая физика и автоматизация. 2004.- Вып. 58.-С. 78-85.

5. Ю.Бакумов П.А., Богачева Е.В., Шагина Е.С., Назаров О.С., Попова Л.А., Новый отечественный вазопротектор Тромбовазим. / Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М. - 2010. С. 39.

6. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963.-С. 81-117.

7. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1968.-С.151.

8. Березин И.В и др./ Иммобилизованные ферменты. Книга 7.М.:Высшая школа, 1987.-С.159.

9. Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Хим. -фарм. Журн. 2003. - Т.37, №3. - С. 32-34.

10. Берхин Е.Б., Иванов Ю.И. Методы экспериментального исследования почек и водно-солевого обмена. Барнаул, 1972. - С.200.

11. Бокарев И.Н., Довголис С.А. Тромболитическая терапия инфаркта миокарда. Русский медицинский журнал 1998; т. 6, № 3.-С.56.

12. Буевич Е.И., Котовщикова Е.Ф., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Попова JI.A. О состоянии эндотелия при остром инфаркте миокарда до и после приема Тромбовазима // Тромбоз, гемостаз и реология. 2009. №3 С.ЗЗ-37

13. Верещагин Е.И., Киншт Д.Н., Мадонов П.Г., Марков В.А., Вышлов Е.В. Клиническая эффективность нового отечественного тромболитического препарата Тромбовазим // XVI Российский конгресс «Человек и лекарство». Москва. -2009.- С. 629

14. Верещагин Е.И., Плотников М.Б., Любарский М.С., Марков В.А., Мадонов П.Г. Вазопротектор с тромболитическими свойствами Тромбовазим в терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Новосибирск , 2008 ISBN987-5-9747-0105-4.

15. Верещагин Е.И., Мадонов П.Г. инновационные технологии в лечении тромбофилий // Материалы Объединенный съезд кардиологии и кардиохирургии СФО. Томск, 2009г.

16. Верещагин Е.И., Киншт Д.Н., Мадонов П.Г. Оценка эффективности и безопасности инъекционной формы Тромбовазима // Сибирский медицинский журнал. 2009. Т. 24. — №1. - С. 38.

17. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. 1998, № 4. - С. 80-84.

18. Вышлов Е.В., Новый способ лечения больных с фибрилляцией или трепетанием предсердий и наличием тромбов в полости предсердий перед восстановлением синусового ритма / Сибирский медицинский журнал.-2009. Т. 24. -№1 (выпуск 1). - С. 43

19. Вышлов Е.В., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Киншт Д.Ы., Эффективный тромболизис у пациентов с фибрилляцией и трепетанием предсердий. / Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М. - 2010. С. 70.

20. Гавриленко A.B. Диагностика и лечение хронической венозной недостаточности нижних конечностей. Москва, 1999.- С.34, 45.

21. Гершанович M.JI. Осложнения при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. М.: Медицина, 1982. - С.224.

22. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.1999. Дисперсионный анализ. С. 47-81.

23. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Механизмы цитостатического повреждения и регенерации кроветворной системы // Вестник РАМН. -1998.-№ 10.-С. 6-10.

24. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.272.

25. Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В. Противоопухолевые антибиотики антрациклинового ряда и система крови. Томск: Изд-во ТГУ, 1986. -С.236.

26. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.272.

27. Думпе Э.П., Ухов Ю.И., Швальб П.Г. Физиология и патология венозного кровообращения нижних конечностей. Москва, 1982. С.78, 90.

28. Дыгай A.M., Артамонов A.B., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г. Создание нового класса лекарственных препаратов на основе нанотехнологий // Международный форум по нанотехнологиям. Москва, 2009. С.607

29. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Хричкова352

30. Дыгай A.M., Верещагин Е.И., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Ермакова

31. H.H., Мадонов П.Г., Мирошниченко Л.А., Минакова М.Ю., Симанина

32. Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., Фирсова Т.В., Хричкова T.IO.

33. Механизмы гранулоцитопоэзстимулирующей активности353иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при цитостатической миелосупрессии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т. 150. - № 7. - С. 418-421.

34. Дыгай A.M., Верещагин E.H., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Ермакова H.H.,: Мадонов П.Г., Мирошниченко Л.А., Минакова М.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., // Вестник РАМН. 2009. - № 11. - С. 69.

35. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Верещагин Е.И. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. 2009. - № 11. - С. 6-9.

36. Дыгай A.M., Голосов О.С., Агафонов В.И. Возрастная характеристика кроветворной ткани белых крыс //Механизмы патологических реакций. -Томск, 1981.-С. 32-37.

37. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Удут В.В. «Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (фармакологические свойства и перспективы использования)». Томск, 2011, ISBN978-5-94476-239-9.

38. Дыгай A.M., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мадонов П.Г., Удут В.В. «Нанотехнологии в фармакологии», Издательство РАМН, Москва, 2011 ISBN 978-5-7901-0111-3.

39. Иммобилизованные протеолитичеекие ферменты в лечении гнойно-некротических процессов.// (Сб.на учн.тр. / ин-т цитологии и генетики СО АН СССР).- Новосибирск, 1981. С. 9-23.

40. Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Фисенко В.П. Основные принципы метаболизма лекарств и безопасное применение парацетамола // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1999. №2. С. 86-87.

41. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. М., Медицина, 1987. - С.472.

42. Исследование системы крови в клинической практике (под ред. Г.И. Козинца тВ.А. Макарова). М.: Триада-Х, 1997.- С.480.

43. Исследование функции печени в эксперименте на лабораторных животных. / Уланова И.П., Авилова Г.Г., Тугаринова В.Н. и соавт. // Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М., 1970. С.189-199.

44. Кайдориы А.Г., Караськов A.M., Руденко B.C., Чегошев М.Г., Стародубцев В.Б.Пятилетний опыт возможностей ультразвукового триплексного ангиосканирования при варикозно болезни. Флеболимфология 1999; №10.- С.18-21;

45. Киншт Д.Н., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Дыгай A.M., Плотников М.Б. Эффективность препарата Тромбовазим в лечении хронической венозной недостаточности // XVI Российский конгресс «Человек и лекарство». Москва. 2009,- С. 127

46. Киншт Д.Н., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г. Оценка эффективности и безопасности инъекционной формы Тромбовазима // Материалы Объединенный съезд кардиологии и кардиохирургии СФО. Томск, 2009г.

47. Кириенко А.И. Амбулаторная ангиология. Москва,2007.-С.76-79.

48. КириенкоА.И., Матюшенко A.A., Андрияшкин В.В. Острый тромбофлебит. Москва,2006. С. 104-107.

49. Клекинг Ф.П., Фогель Г. Фармакологическое и клиническое изучение тромболитической эффективности окразы. Кардиология 1981.№5. С. 36-38.

50. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск, 1982. С.366.

51. Константинова Г.В., Зубарев А.Р., Градусов Е.Г. Флебология. Москва, 2000.-Cc.59, 78, 165.

52. Коршак В.В., Штильман М. И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1984. С.261.

53. Кошевой А.П., И.О. Гибадулина, Л.Ю. Колесова, Применение препарата Тромбовазим у больных с посттромботической болезнью / Всероссийская научно-практическая конференция «Посттромботическая болезнь». Тезисы докладов. СПб, Россия. 2009. - С. 35 - 38.

54. Кошевой А.П., И.О. Гибадулина, Л.Ю. Колесова, Тромболитическая терапия при острых тромбозах магистральных вен нижних конечностей / Материалы III съезда хирургов Сибири и Дальнего Востока. 2009. - С. 202.

55. Кошевой А.П., И.О. Гибадулина, Л.Ю. Колесова, Применение препарата Тромбовазим при посттромботической болезни / Материалы III съезда хирургов Сибири и Дальнего Востока. 2009. - С. 201.

56. Инфекции в хирургии. Т. 8, №1. - 2010. - С. 21.

57. Крупаткин А.И., Сидоров В.В. Лазерная доплеровская флоуметрия микроциркуляции крови. Руководство для врачей, ОАО «Издательство «Медицина», 2005.- С.256;

58. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - С. 368.

59. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1980, С.344.

60. Любарский М. С., Шевела А. И., Колпаков М. А., Хапаев Р. С., Нимаев В. В., Егоров В. А. Диагностические методы объективизации и визуализации лимфатических отёков. Обзор литературных данных. Флеболимфология 2003; 17. С.8-14;

61. Любарский М.С., А.Ю. Летягин, А.И. Шевела. Пат. № 2126226 (РФ) Способ реолимфовазографии (электроимпедансометрический способ определения параметров регионарного лимфотока). // Бюлл. Сибирского отделения РАМН.-1999.-С.65.

62. Мазур H.A. Сравнительная оценка действия различных фибринолитических препаратов при инфаркт миокарда. М. 1966. 20 с.

63. Мазур H.A., Чазов Е.И., Руда М.Я. Фибринолитические ферменты (фибринолизин, стрептокиназа) в терапии тромбозов и эмболий. Гормоны и ферменты в кардиологии. XVI годичная сессия Института терапии АМН СССР. М., 1964. С. 26-27.

64. Масчан A.A. Современные методы профилактики нейтропении в онкологии. Фарматека.- 2011.- С.6

65. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Медицина, Ленинградское отд., 1969. -С. 405.

66. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Медицина, Ленинградское отд., 1969. С.422.

67. Милинчук В.К. /Радиационная химия. 2000. С. 187.

68. Никитин И. Г., Сторожаков Т.Н. / Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние проблемы и перспективы. // Вирусные гепатиты, достижения и перспективы, 2001.-Сс. 23-28.

69. Никитин И.Г.Пегилированные интерфероны-альфа: новые возможности в лечении гепатита С. //Фарматека, №7, 2011. С.76-79.

70. Патент на изобретение МПК6 G01 N33/48 от 6 марта 1995 г. «Способ оценки функционального состояния системы гемостаза».

71. Павликова Е.П., Караваева И.П., Мерай И., Моисеев B.C. Эффективность тромболитической терапии стрептокиназой, альтеплазой и саруплазой у больных острым инфарктом миокарда. Клиническая фармакология и терапия 2003; 12: С.83-87.

72. Пикаев А.К./Современная радиационная химия: Основные положения. Экспериментальная техника и методы М.:Наука 1985. 385 с.

73. Пикаев А.К./Современная радиационная химия: Твердое тело и полимеры: Прикладные спекты. М.:Наука 1987. С.448.

74. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (современные представления и методические подходы, основные параметры и константы) / Трахтенберг И.М., Сова P.E., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А. // М.: Медицина, 1978. С. 176.

75. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте/ И.М. Трахтенберг, Р.Н. Сова, В.О. Шефтель, Ф.А. Оксиненко. -М., 1978.

76. Противоопухолевая терапия / Под ред. Н.И. Переводчиковой. М., 1996.-С.223.

77. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М., 2006. С.305.

78. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. -М., 2000. С. 18-24., 398 .

79. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева.- 2-изд., перераб. и доп.- М.:ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.832.

80. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.- М., 2000.

81. Савельев B.C. Флебология-М., 2001.

82. Савельев B.C., Кириенко А.Н., Богачев В.Ю. Венозные трофические язвы: мифы и реальность. Флеболимфология, 2000; 11. С.5-10.

83. Салганик Р.И., Коган A.C., Гончар A.M. Иммобилизованные протеолитические ферменты и раневой процесс. Новосибирск, 1983.-С.265.

84. Самохин С. П., Бикмухаметова, Пожарская Г.И.//Агрегация в водных растворах полиэтиленгликоля.

85. Своллоу/Радиационная химия органических соединений. М.: 1963.С.406.

86. Справочник лабораторных методов исследования: Под редакцией В.В. Меньшикова. М., 1987.

87. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов / Под ред. С.Г. Дзагурова и Ф.Ф. Резепова. М.:Медицина, 1975. - С.50-56.

88. Староверов И.И., Коткин K.JI. Пуролаза отечественный тромболитический препарат третьего поколения. Использование при остром инфаркте миокарда. Русский медицинский журнал 2004; 12 (9). -С.538-542.

89. Троицкий A.B. Разработка способа получения лекарственных препаратов на основе иммобилизованных протеаз Bac.subtilis. Дисс. на соискание уч. ст. канд. мед. наук Новосибирск, 1998

90. Уланова И.П., Авилова Г.Г., Тутарикова В.А. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М., 1970. - С. 189-199.

91. Черноусов А.Д. Гигиена труда и профессиональные заболевания . -1987.-№6.-С. 45-48.

92. Фирсова Т.В., Хричкова Т.Ю. Механизмы гранулоцитопоэзстимулирующей активности и 1080 иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующегофактора при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 2009. - №7. - С. 60-64.

93. Ходж П., Илррингтон Д. Реакции на молекулярных подложках в органическом синтезе. М.: Мир, 1983. С.603.

94. Шило В.Ю., Хасабов Н.Н. Анемия при хронической болезни почек// Лечащий врач, № 1. 2008. С. 56-61.

95. Шур А. М. Высокомолекулярные соединения. М.: Высшая школа, 1981. С.656.

96. Явелов И.С., Грацианский Н.А. Российский регистр острых коронарных синдромов: лечение и исходы в стационаре при остром коронарном синдроме без подъёмов сегментов ST. Кардиология 2003; №12. С. 23-26.

97. Anderson H.V., Willerson J.T. Current concept: Thrombolysis in acute myocardial infarction. N Engl J Med 1993; 329 (10): 1-10.

98. Auslender V. L. ILU-type electron accelerator for industrial technologies // Nuclear Instruments and Methods in Physical Research. 1994. № В 89. P. 4648.

99. Boyer N, Marcellin P. Pathogenesis, diagnosis and management of hepatitis C. J Hepatol 2000;32(suppl):98-l 12.

100. Bruce A. Clinical considerations in pegylated protein therapy. From Reserch to Practice 2001;3:3-9.

101. Bennet CL. Preliminary comparisons of oncologists/hematologists support for erythropoetin versus G/GM-CSF use: potential impact of direct to consumer (DTC) advertising. Blood 2000;96:847a.

102. Brady J.K., Nauta W.J.H. //J. Comporative Phisiol. 1953. - 46, N 3. - P. 339-340.

103. Christensen L.R., McLeod C.M. A proteolytic enzyme of the serum: characterization, activation, and reaction with inhibitors. J Gen Physiol 1945; 28: 559-583.

104. Clifton E.E., Grossi C.E. Investigations of intravenous plasmin (fibrinolysin) in humans; physiologic and clinical effects. Circulation 1956: 14: 919-928.

105. Gilbertson D.T., Ebben J.P., Foley R.N., Weinhandl E.D., Bradbury B.D., Collins0A. J. Hemoglobin level variability: associations with mortality// Clin J Am Soc Nephrol. 2008 Jan; 3 (1): 133-138.

106. JBiosci Bioeng. 2011 May; 111(5):564-8. Epub 2011 Feb 1.

107. Jarsch M., Brandt M., Lanzendorfer M. et al. Comparative erythropoietin receptor binding kinetics of C.E.R.A. and epoetin-beta determined by surface plasmon resonance and competition binding assay// Pharmacology. 2008, 81: 63-69.

108. Jensen-Pippo KE, Withcomb KL, DePrince RB, et al. Enteral bioavailability of human granulocyte colony stimulating factor conjugated with polyethylene glycol. Pharm Res 1996;13:2-7.

109. Johnson A.J., Tillett W.S. The lysis in rabbits of intravascular blood clots by the streptococcal fibrinolytic system (streptokinase). J. Exp Med 1952; 95: 449-464.

110. Johnson A.J., Tillett W.S. The lysis in rabbits of intravascular blood clots by the streptococcal fibrinolytic system (streptokinase). J Exp Med 1952; 95: 449-464.

111. Deitcher S.R., Jaff M.R. Pharmacological and clinical characteristics of thrombolytic agents. Rev Cardiovasc Med 2002; 3: S25-S33.

112. Delgado C, Francis GE, Fisher D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1992;9:249-304.

113. Di Bisciegli A. A new aspects of diagnosis and treatment of chronic viral hepatitis. J Hepatology 2000;34:1345-51.

114. Demetri G.D., Griffin J.D. Granulocyte colony-stimulating factor and its receptor//Blood. 1991.-Vol. 78.-P. 2791 -2808.

115. Dundar Y., Hill R., Dicson R., Walley T. Comparative efficacy of thrombolytics in acute myocardial infarction: a systematic review. Q J Med 2003; 96: 103-113.

116. Edvards CK. PEGylated recombinant human soluble tumor necrosis factor receptor type I (r-HU-sTNF-RI): novel high affinity TNF receptor designed for chronic inflammatory diseases. Ann Rheum Dis 1999;58 (suppl. I): 173-81. 167.

117. Etame AB, Smith CA, Chan WC, Rutka JT. Design and potential application of PEGylated gold nanoparticles with size-dependent permeation throughbrain microvasculature. 14. Int J Nanomedicine. 2011;6:485-94. Epub 2011 Mar 3.

118. Fleming T.R., DeMets D.L. Surrogate end points in clinical trials: are we being misled? Ann Intern Med 1996; 125: 605-613.

119. Fletcher A.P., Alkjaersing N., Smyrniotis F.E, Sherry S. The treatment of patients suffering from early myocardial infarction with massive and prolonged streptokinase therapy. Trans Assoc Am Phys 1958; 71: 287-296.

120. Fowler R, Imrie K. Thalidomide associated hepatitis: a case report. Am J Hematol 2001;66(4):300-2.

121. Gabizon A, Martin F. Polyethylene glycol-coated (pegylated) liposomal doxorubicin. -Drugs 1997;54(suppl. 4): 15-21.

122. GISSI-1. Effectiveness of intravenous thrombolytic treatment in acute myocardial infarction. Lancet 1986;.i: 397-401.

123. GUSTO III. A comparison of reteplase with alteplase for acute myocardial infarction. N Engl J Med 1997; 337: 1118-1123.

124. Hershfield MS, Buckley RH, Greenberg ML, et al. Treatment of adenosine deaminase deficiency with polyethylene glycol-modified adenosine deaminase. N Engl J Med 1987;316:589-96.

125. Indication for fibrinolytic therapy in suspected acute myocardial infarction: collaborative overview of early moertality and major morbidity results from all randomized trials of more than 1000 patients. Lancet 1994; 343: 311-322.

126. Innerfield I., Schwarz A., Angrist A. Intravenous trypsin: its anticoagulant, fibrinolytic and thrombolytic effects. J Clin Invest 1952; 31: 1049-1055.

127. Innerfield I., Schwarz A., Angrist A. The fibrinolytic and anticoagulant effects of intravenous crystalline trypsin. Bull. New York Acad. Med. 1952; 28: 537-538.

128. ISIS-2. Collaborative group. Randomised trial of intravenous streptokinase, oral aspirin, both, or neither among 17 187 cases of suspected acute myocardial infarction. Lancet 1988; ii: 349-360.

129. Karakoti AS, Das S, Thevuthasan S, Seal S. PEGylated inorganic nanoparticles. Chem Commun (Camb). 2011 Mar 28;47(12):3442-4. Epub 2011 Feb 7.

130. Knauf MJ, Bell DP, Hirtzer P, et al. Relationship of effective molecular size to systemic clearance in rats of recombinant interleukin-2 chemically modified with water-soluble polymers. J Biol Chem 1988;263:15064-70

131. Kjellander R., Florin E.//J. Chem. Soc., Faraday Trans. I. 1981. V.77. P. 2053-2077

132. Kupcova V., Sperl J., Pannier A., Jordan P., Dougherty F. C., Reigner B. The effect of severe hepatic impairment on the pharmacokinetics and haematological response of C.E.R.A.// Curr Med Res Opin. 2008 Jul; 24 (7): 1943-1950.

133. Lacson E.-Jr., Ofsthun N., Lazarus J.M. Effect of variability in anemia management on hemoglobin outcomes in ESRD// Am J Kidney Dis. 2003 Jan; 41 (1): 111—124.

134. Lemos J.A., Warner J.J. New tools for assessing microvascular obstruction in patients with ST elevation myocardial infarction. Heart 2004; 90: 119-120.

135. Macdougall I.C. Novel erythropoiesis-stimulating agents: a new era in anemia management. Clin J Am Soc Nephrol. 2008 Jan; 3 (1): 200-207.

136. Macdougall IC, Walker R, Provenzano R, et al. C.E.R.A. corrects anaemia in patients with chronic kidney disease not on dialysis: Results of a randomized clinical trial. Clin J Am Soc Nephrol. 2007 In press.

137. Miyake T., Kung C.K., Goldwasser E. Purification of human erythropoietin// J Biol Chem. 1977 Aug 10; 252 (15):5558-5564.

138. Moore M.A. Cytokine and chemokine networks influencing stem cell proliferation, differentiation, and marrow homing // J. Cell. Biochem. 2002. Vol. 38.-P. 29-38.

139. Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells // Exp. Biol. Med. 2001. - Vol. 226. - P. 507-520.

140. Muggia F. The Benefits of pegylation in cancer and antiviral therapy. From Research to Practise 2001 ;3:1 -3.

141. Noble P.W. Hyaluronan and its catabolic products in tissue injury and repair // Matrix Biol. 2002. - Vol. 21. - P. 25-29.

142. Ouriel K. Safety and efficacy of the various thrombolytic agents. Rev Cardiovasc Med 2002; 3: S17-S24.

143. Pan J;'Wan D, Gong J. PEGylated liposome coated QDs/mesoporous silica core-shell nanoparticles for molecular imaging. 10. Eur J Pharm Sci. 2011 Mar 18;42(4):423-32. Epub 2011 Feb 1.

144. Panchapakesan U., Sumual S., Pollock C. Nanomedicines in the treatment of anemia in renal disease: focus on CERA (Continuous Erythropoietin Receptor Activator)// Int J Nanomedicine. 2007; 2 (1): 33-38.

145. Pasceri V., Andreotti F., Maseri A. Clinical markers of thrombolytic success. Eur Heart J 1996; 17: 35-41.

146. Peterson E.D., Shaw L.J., Califf R.M. Translated, with permission of the American College of Physicians, from: Guidelines for risk stratification after myocardial infarction. Ann Intern Med 1997; 126: 556-560.

147. Plotnikov M.B., Dygai A.M., Aliev O.I., Chernyshova G.A., Smol'yakova

148. V.I., Vasil'ev A.S., Markov V.A., Vyshlov E.V., Vereschagin E.I., Kinsht374

149. D.N., Madonov P.G. Antithrombotic and thrombolytic effects of a new proteolytic preparation Trombovazim (Russia).Bull Exp Biol Med. 2009 Apr; 147(4):438-40. English, Russian.

150. Reddy R. Controlled-release, pegylated, liposomal formulations: new mechanisms in the delivery of injectable drugs. Ann Pharmacol 2000;34:915-23.

151. Regidor D.L., Kopple J.D., Kovesdy C.P. et al. Associations between changes in hemoglobin and administered erythropoiesis-stimulating agent and survival in hemodialysis patients//J Am Soc Nephrol. 2006, 17:1181-1191.

152. Roberts MJ, Harris M. Attachment of degradable poly(ethylene glycol) to proteins has the potential to increase therapeutic efficacy. J Pharmaceut Sci 1998;87:1440-5.

153. Ribichini F., Wijns W. Acute myocardial infarction: reperfusion treatment. Heart 2005; 88:298-305.

154. Salimov R. A., Cherepkov V. G., Golubenko J. I. et al. DC high power electron accelerators of ELV-series: status, development, applications // Radiation Physics and Chemistry. 2000. № 57. P. 661-665.

155. Scott MD, Bradley AJ, Murad KL. Camouflaged blood cells: low-technology bioengineering for transfusion medicine? Transfus Med Rev 2000;14:53-63.

156. Singh A.K., Fishbane S. The optimal hemoglobin in dialysis patients- a critical review// Semin Dial. 2008 Jan-Feb; 21 (l):l-6.

157. Singh A.K., Milford E., Fishbane S., Keithi-Reddy S.R. Managing anemia in dialysis patients: hemoglobin cycling and overshoot// Kidney Int. 2008 Sep; 74 (5): 679-683.

158. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. 2003.-Vol. 13 (12).-P. 105-115.

159. Stroncek DF, Clay ME, Petzoldt ML, et al. Treatment of normal individuals with G-CSF: Donor experiences and the effects on peripheral blood CD34+ cell counts and the collection of peripheral blood stem cells. Transfusion. -1996.-36.-601-10.

160. Sherry S., Fletcher A.P., Alkjaersig N. Fibrinolysis and Fibrinolytic activity in man. Physiol Rev 1959; 39: 343-382.

161. Tagnon H.J. Nature of the mechanism of shock produced by injection of trypsin and trombin. J Clin Invest 1945; 24: 1-10.

162. Tillett W.S., Johnson A.J., McCarty W.R. Intravenous infusion of the streptococcal fibrinolytic principle (streptokinase) into patients. J Clin Invest 1955; 34: 169-185.

163. Yang C, Lu D, Liu Z. How PEGylation enhances the stability and potency of insulin: a molecular dynamics simulation. 13. Nanomedicine. 2011 May 4. Epub ahead of print.

164. Wang YS, Youngster S, Bausch J, et al. Identification of the major positional isomer of pegylated interferon-alfa2b. Biochemistry 2000;39:10634-40.

165. Williams G., Smith C.A., Spooncer E., et. al. Haemopoietic colony stimulating factors promote cell survival by suppressing apoptosis // Nature. -1990.-Vol. 343.-P. 76-79.

166. Van de Werf F.J. The ideal thrombolytic: can drug design improve clinical results? Eur Heart J 1999; 20: 1452-1458.

167. Varas F., Bernad A., Bueren J. Granulocyte colony-stimulating factor mobilizes into peripheral blood the complete clonal repertoire of hematopoietic precursors residing in the bone marrow of mice // Blood. -1996.-Vol. 88, №7.-P. 2495-2501.

168. Zeuzem S, Feinman SV, Rasenak J, et al. Peginterferon-alfa 2a in patients with chronic hepatitis C. N Engl J Med 2000;343:1666-9.

169. Zeuzem S, Hermann E, Lee JH, et al. Viral kinetics in patients with chronic hepatitis C treated with standart or peginterferon-alfa 2a. Gastroenterology 2001;120:1438-47.