Пегилирование рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кучумова, Анастасия Владимировна

• Кучумова, Анастасия Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кучумова, Анастасия Владимировна

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Бактериальные аспарагиназы и их свойства.

1.1.1. Распространение и противоопухолевая активность.

1.1.2. Механизм ферментативной реакции.

1.1.3. Физико-химическая характеристика бактериальных L-аспарагиназ.

1.1.4. Свойства терапевтически значимых L-аспарагиназ.

1.2. Бактериальные аспарагиназы как противоопухолевые препараты, проблемы и перспективы их применения.

1.3. Модификация белков полиэтиленгликолем.

1.3.1. Пегилирование и его преимущества.

1.3.2.Структура и свойства полиэтиленгликоля.

1.3.3. Биохимия пегилирования.

1.3.4. Производные полиэтиленгликоля, применяемые для модификации белков.

1.3.5. Влияние пегилирования на фармакокинетические и фармакодинамические свойства белка.

2. Материалы и методы.

2.1. Экспрессия рекомбинантной L-аспарагиназы и ее выделение.

2.1.1. Культивирование штамма-продуцента и экспрессия фермента.

2.1.2. Очистка и выделение L-аспарагиназы.

2.2. Физико-химическая и кинетическая характеристика белка.

2.2.1 .Электрофорез в ПААГ/ДСН геле.

2.2.2. Изоэлектрофокусирование.

2.2.3. Определение аспарагиназной активности.

2.2.4.0пределение концентрации белка.

2.2.5. Определение кинетических параметров аспарагиназы.

2.3. Модификация аспарагиназы производными полиэтиленгликоля.

2.3.1.Модификация белка 2,4-бис (о-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-Б-триазином.

2.3.2. Модификация аспарагиназы метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонатом.

2.3.3. Масс-спектрометрический анализ.

2.4. Определение цитотоксической активности аспарагиназы in vitro.

2.5. Определение иммуногенности аспарагиназы.

2.5.1. Получение специфических поликлональных антител.

2.5.2. Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

З.Результаты и обсуждение.

3.1. Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы

Erwinia carotovora.

3.2. Подбор модифицирующего реагента.

3.2.1. Получение 2,4-бис (О-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-Б-триазина.

3.2.2. Получение метоксиполиэтиленгликоль- п-нитрофенилкарбоната.

3.3. Получение пегилированной рекомбинантной L-аспарагиназы

Erwinia carotovora и оптимизация процесса модификации.

3.4. Физико-химическая и кинетическая характеристика модифицированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.

3.5. Стабильность модифицированного фермента.

3.7. Оценка цитотоксической активности ПЭГ-аспарагиназы in vitro.

3.6. Характеристика иммуногенности пегилированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.

4. Выводы.

5.Литератур а.

Список сокращений

АГ - аспарагиназа-глутаминаза

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОНВ - 6-диазо-5-оксо-Ь-норвалин

ИПТГ - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

ИФА - иммуноферментный анализ мПЭГ - монометиловый эфир полиэтиленгликоля

МТТ- 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ПАА - полиакриламид

ПААГ/ДСН - полиакриламидный гель с добавлением додецилсульфата натрия

ПЭГ - полиэтиленгликоль ТХУ - трихлоруксусная кислота

ABTS - 2,2-азино-бис-[3-этилбензотиазол-6-сульфонат]-аммония ECARJLANS - рекомбинантная L-аспарагиназа Erw. carotovora ErA - L-аспарагиназа Erw. crysanthemi EcA2 - L-аспарагиназа E.coli

Medac - коммерческий препарат L-аспарагиназы E. coli mPEG-pNP - метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонат PEG-ECARJLANS- модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинантная L-аспарагиназа Erw. carotovora pi - изоэлектрическая точка

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пегилирование рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств»

Биологические катализаторы, каковыми являются ферменты, обладают чрезвычайно высокой специфичностью и мощным каталитическим воздействием на различные стороны метаболизма в организме. Поэтому они представляют собой уникальные лекарственные средства, используемые в медицине для лечения заболеваний различной этиологии [43,34].

Бактериальная L-аспарагиназа (L-аспарагинамидогидролаза КФ 3.5.1.1), являющаяся представителем ферментов класса треониновых амидо-гидролаз, катализирует превращение L-аспарагина до L-аспарагиновой кислоты и аммиака. Длительное время бактериальные аспарагиназы применяются в онкологической практике при комбинированной химиотерапии различных видов лейкозов. В последние годы появились сообщения о положительном эффекте аспарагиназы при лечении болезни Ходжкина, хронической лимфоцитарной лейкемии и меланосаркомы [78,53,89].

Механизм противоопухолевого действия аспарагиназы заключается в расщеплении аминокислоты аспарагин, находящейся во внеклеточном пространстве. Для опухолевых лимфобластов аспарагин является незаменимой аминокислотой, без поступления которой в клетку извне нарушается синтез белков и клетка становится неспособной к дальнейшему делению. Таким образом, реализация цитотоксичности аспарагиназы не подразумевает контакта или проникновения активного вещества в опухолевую клетку, что принципиально отличает этот фермент по механизму действия от других ци-тостатиков [121].

Сниженная или полностью отсутствующая активность аспарагинсин-тетазы - фермента, синтезирующего L-аспарагин, является отличительной чертой не только лейкемических лимфобластов, но и миелобластов, и целого ряда клеток других опухолей. Большинство здоровых, в том числе гемо-поэтических, клеток способно синтезировать собственный аспарагин. Это определяет вторую, крайне важную характеристику фермента, а именно минимальное миелотоксическое действие.

Целый ряд аспарагиназ из различных бактериальных штаммов обладает противоопухолевым действием. Так противолейкозную активность проявляют L-аспарагиназы Escherichia coli, Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Vibrio succinogenes, Proteus vulgaris и некоторые другие. Однако использование препаратов аспарагиназы в противоопухолевой терапии ограничено различными побочными эффектами, поэтому только два наименее токсичных фермента, а именно L-аспарагиназы из Esherichia coli (ЕсА2) и Erwinia chrysanthemi (ErA), нашли применение в онкотерапии [25]. Причем, наименее токсичными признаны препараты, полученные из Erwinia chrysanthemi, что указывает на важность исследования аспарагиназ рода Erwinia. Тем не менее, даже аспарагиназы штаммов Erwinia вызывают развитие иммунологической гиперчувствительности к L-аспарагиназе, проявляющееся в диапазоне от слабых аллергических реакций до анафилактического шока [72]. Помимо этого, эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой терапии ограничена довольно низкой стабильностью фермента в физиологических условиях.

Таким образом, актуальным является получение модифицированных форм L-аспарагиназ штаммов Erwinia устойчивых к протеолитической деградации в крови, обладающих низкой иммунологической активностью при сохранении высокой ферментативной активности.

В настоящее время существует ряд различных методов модификации терапевтически значимых ферментов. Одним из наиболее эффективных является химическая модификация белка полиэтиленгликолем (ПЭГ), т.н. пегилирование [97]. Она заключается в физико-химической трансформации, достигаемой соединением нативной молекулы белка с ПЭГ. Применение этого метода позволяет значительно повысить терапевтическую эффективность фармакологических препаратов пептидной структуры.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в получении модифицированной полиэтилен гликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora, обладающей повышенной стабильностью и пониженной иммуногенностью.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. модификация полиэтиленгликолем L-аспарагиназы Erw. carotovora и оптимизация процесса пегилирования;

2. детальная характеристика физико-химических свойств пегилированной L-аспарагиназы Erw. carotovora (pi, каталитические параметры, термодинамическая стабильность);

3. определение цитотоксичности пегилированной аспарагиназы на чувствительных к ней клетках лейкоза человека;

4. оценка иммуногенности модифицированной полиэтиленгликолем аспарагиназы Erw. carotovora.

Научная новизна работы

Впервые в качестве объекта для получения пегилированной формы аспарагиназы использован генно-инженерный фермент Erw. carotovora, на основе которого в настоящее время в лаборатории медицинской биотехнологии ГУ НИИ БМХ РАМН проводятся работы по созданию отечественного лекарственного препарата рекомбинантной аспарагиназы.

В настоящем исследовании впервые разработана и оптимизирована методика модификации полиэтиленгликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Erw. carotovora. Получены экспериментальные данные для пегилированной формы рекомбинантной аспарагиназы Erw. carotovora о ее физико-химических и каталитических свойствах, иммуногенности и цитотоксичес-ком действии на опухолевые клетки различных линий.

Показано, что модифицированная аспарагиназа оказывает более выраженное цитотоксическое действие на опухолевые клетки лимфобластной Т-клеточной лимфомы и лимфомы Беркитта по сравнению с нативным ферментом. Выявлено возрастание устойчивости пегилированной аспарагиназы к протеолизу и повышение термостабильности по сравнению с исходным белком. Установлено, что пегилированная форма рекомбинантной L-acnapa-гиназы Erw. carotovora обладает пониженной иммуногенностью.

Практическая значимость исследования

В настоящее время в клинической практике используется лишь единственный пегилированный препарат бактериальной аспарагиназы - «Онкас-пар», получаемый на основе фермента Е. coli. Наличие нескольких препаратов аспарагиназ со сниженной иммуногенностью позволит проводить заместительную терапию различных видов лейкозов у пациентов, в особенности детей, обладающих повышенной аллергенностью к существующим препаратам бактериальных аспарагиназ. В этом отношении не вызывает сомнения высокая практическая значимость получения пегилированной формы аспарагиназы Erw. carotovora.

Результаты данной работы могут быть использованы в качестве основы для создания нового лекарственного препарата пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erw. carotovora для лечения ряда форм лейкозов, и в первую очередь острого лимфобластного лейкоза.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих конференциях: II научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2005), «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006), Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярные основы и клинические проблемы резистентности к лекарственным средствам» (Киев, 2006). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов. Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 21 декабря 2006 года.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3-х глав обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 7-и глав раздела «Результаты исследования и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 122 источника. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 4 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кучумова, Анастасия Владимировна

Выводы

1. Впервые получена модифицированная полиэтиленгликолем ре-комбинантная аспарагиназа Erw. carotovora. Разработанный метод пегилирования с использованием в качестве модифицирующего реагента метоксиполиэтиленгликоль-я-нитрофенилкарбоната с молекулярной массой 5000 позволяет сохранить около 80% активности модифицированного фермента.

2. Установлено, что пегилированная аспарагиназа обладает более высокой стабильностью к протеолизу под действием трипсина и трип-синоподобных протеаз плазмы крови, а также к воздействию температуры по сравнению с нативным ферментом.

3. В опытах in vitro показано, что модифицированная рекомбинантная аспарагиназа Erw.carotovora проявляет более высокую противоопухолевую активность в отношении клеток линий MOLT-4 и Raji, по сравнению с нативным ферментом. Значение LC50 пегилированной аспарагиназы для этих клеточных линий примерно на треть ниже LC50 немодифицированного фермента.

4. В опытах на лабораторных животных установлено, что препарат пегилированной аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообразования по сравнению с нативным ферментом и, таким образом, обладает пониженной иммуногенностью.

5. Полученные в ходе изучения пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erwinia carotovora результаты - повышение устойчивости к протеолизу и температурному воздействию, снижение иммуногенности и высокая противоопухолевая активность позволяют рассматривать модифицированный фермент в качестве перспективной основы для создания лекарственного препарата, более эффективного по сравнению с нативной аспарагиназой.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кучумова, Анастасия Владимировна, 2007 год

1. Abuchowski A., Palczuk N.C., Davis F. F. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252. - P. 3578-3581.

2. Adams G.D., Ramsay J.R. Optimizing the lyophilization cycle and the consequences of collapse on the pharmaceutical acceptability of Erwinia L-asparaginase.//J. Pharm. Sci.- 1996. V. 85 (12).-P. 1301-1305.

3. Aghaiypour K., Wlodawer A, Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-Asparaginase. // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 5655-5664

4. Aslanian A.M., Fletcher B.S., Kilberg M.S. // J. Biochem. 2001. - V. 357. -P. 321-328.

5. Bagert U., Rohm K.H. On the role of histidine and tyrosine residues in E. coli asparaginase. Chemical modification and lH-nuclear magnetic resonance studies. // Biochem. Biophys. Acta. 1989. - V. 999. - P. 36-41.

6. Barbara M., Martins A.F., Cruz M. Biochemical characterization of an L-asparaginase bioconjugate. // Bioconjugate Chem. 1995. - V. 7. -P. 430-435.

7. Billett A.L., Carls A., Gelber R.D. et al. Allergic reactions to Erwinia asparaginase in children with acute lymphoblastic leukemia who had previous allergic reactions to Escherichia coli asparaginase. // Cancer. 1992. - V. 70.-P. 201-206.

8. Burnham N.L. Polymers for delivering peptides and proteins. // Am. J.Hosp.Pharm. 1994. - V .51 (2). - P. 210-218.

9. Cammack K.A., Marlborough D.I., Miller D.S. Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora // Biochem J. 1972. - V. 126 (2). - P. 361-79.

10. Cao L. Immobilised enzymes: science or art? // Current Opinion in Chemical Biology. 2005. - V. 9. - P. 217-226.

11. Carter M.C., Meyerhoff M.E. Instability of succinyl ester linkages in 02-monosuccinyl cyclic AMP-protein conjugates at neutral pH. // J. Immunol. Methods. 1985. - V. 81. - P. 245-257.

12. Carlsson, H., Stockelberg, D., Tengborn, L., Braide, I., Carneskog, J. and Kutti, J. // Eur. J. Haematol. 1995. - V. 55. - P. 289-293.

13. Chabner B.A. Cancer Chemotherapy: Principles and practice. // Chabner B.A. and Collins J.M. eds. Philadelphia. Lippincote. - 1990. - P. 545.

14. Clavell L.A., Gelber R.D., Cohen H.J. et al. Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. // N. Engl. J. Med. 1986. - V. 315 (11). - P. 657-663.

15. Clark R. et al. Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 21969-21977.

16. Davis F.F. The origin of pegnology. // Advanced Drug Delivery Reviews. -2002.-V. 54.-P. 457-458.

17. Derst C., Henseling J., Rohm K.H. Probing the role of threonine and serine residues of E. coli asparaginase II by site-specific mutagenesis. // Protein Eng. 1992.-V. 5.-P. 785-789.

18. Derst C., Henseling J., Rohm KH. Engeneering the substrate specificity of Escherichia coli asparaginase II. Selective reduction of glutamiase activity by amino acid replacements at position 248. // Protein Science. 2000. - V. 9 (10).-P. 2009-2017.

19. DeSantis G., Jones J.B. Chemical modification of enzymes for enhanced functionality. // Current Opinion in Biotechnology. 1999. - V. 10. -P. 324-330.

20. DoIence E.K., Tsang C. Hu, R, Sanders C.G., Osaki S. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces. // 1997. US Patent 5,650,234.

21. Duval M., Suciu S., Ferster A., Rialland X., Nelken В., Lutz P., Benoit Y., Robert A., Manel A.M., Vilmer E., Otten J., Philippe N. // Blood. 2002. -V. 99.-P. 2734-2739.

22. Eden O.B., Shaw M.P., Lilleyman J.S., Richards S. Non-randomised study comparing toxicity of Escherichia coli and Erwinia asparaginase in children with leukaemia. // Med Pediatr Oncol. 1990. - V. 18 (6). - P. 497-502.

23. Esposito P., Barbero L., Caccia P., Caliceti P., D'Antonio M., Piquet G, Veronese F.M. PEGylation of growth hormone-releasing hormone (GRF) analogues. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. - V. 55. - P. 1279— 1291.

24. Feinberg W.M., Swenson M.R. Cerebrovascular complications of L-asparaginase therapy. // Neurology. 1988. - V. 38. - P. 127-133.

25. Fernandes A., G. Gregoriadis. The effect of polysialation on the immunogencity of asparaginase. // Int. J. Pharm. 2001. - V. 217 (1-2). - P. 215-224.

26. Fiere D., Danaila C. Treatment of acute lymphoid leukemia in adults // Rev. Prat.- 1996.-V. 46.-P. 55-61.

27. Frokjaer S., Otzen D.E. Protein drug stability: a formulation challenge. // Nature Reviews / Drug Discovery. 2005. - V. 4. - P 298-306.|

28. Froncois J., Fortier G. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. - V. 23. - P. 221-226.

29. Goldberg D.M. Enzymes as agents for the treatment of disease. // Clin. Chim. Acta. 1992. - V. 206. - P. 45-76.

30. Goodson R.J., Katre N.V. Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site. // Biotechnology. 1990. - V. 8. - P. 343-346.

31. Goward C.R., Tattersall R., Atkinson T. Bioseparation. 1992. V. 2 (6). P. 335-341.

32. Graham M.L. Pegaspargase: a review of clinical studies. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. - V. 55. - P. 1293-1302.

33. Gregoriadis G., Fernandes A., Mital M., McCormack B. Polysialic acids. // Cell. Mol. Life. Sci. 2000. - V. 57. - P. 1964-1969.

34. Haskell C.M. // ed. Cancer Treatment 3 rd ed. Philadelphia: W.B Saunders Co. 1980.-P. 130.

35. Harris J.M., Chess R.B. Effect of pegylation on pharmaceuticals. // Nature Reviews / Drug Discovery. 2003. - V. 2. - P. 214-221.

36. Harris J.M., Martin N.E., Modi M. Pegylation. // Clin Pharmacokinet. -2001.-V. 40 (7). P. 539-551.

37. Hartree E.F. // Anal. Biochem. 1991. - V. 192. - P. 215-218.

38. Holcenberg J.S. Enzyme therapy: problems and solutions. // Ann. Rev. Biochem. 1982. - V. 51. - P. 795-812.

39. Howard J.B., Carpenter F.H. L-asparaginase from Erwinia carotovora. Substrate specificity and enzymatic properties. // J. Biol. Chem. 1972. - V. 247.-P. 1020-1030.

40. Hubeek et al. In vitro sensitivity and cross-resistance to deoxynucleoside analogs in childhood acute leukemia. // Haematologica / the hematology journal.-2006.-V. 91 (l).-P. 17-23.

41. Jameel F, Bogner R, Mauri F, Kalonia D. Investigation of physicochemical changes to L-asparaginase during freeze-thaw cycling. // J Pharm Pharmacol. 1997. - V. 49 (5). - P. 472-477.

42. Kamisaki Y., Wada H., InadaY. Reduction in immunogenicity and clearance rate of Escherichia coli L-Asparaginase by modification with monomethoxypolyethylene glycol. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1981. - V. 216. - P. 410-414.

43. Kawamura K., et al. // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1985. - V. 764. -P. 324-330.

44. Kantarjian H.M. Adult acute lymphocytic leukemia: critical review of current knowledge // Am. J. Med. 1994. - V. 97. - P. 176-184.

45. Kitto G.B., Smith G., Theit Т.О. et al. Tumor inhibitory and non-inhibitory L-asparaginase from Ps. Geniculata. // J. Bacteriol. 1979. - V. 137 (1). - P. 204-212.

46. Kodera Y., Sekine Т., Inada Y. Stabilization of L-asparaginase modified with comb-shaped poly (ethylene glycol) derivatives, in vivo and in vitro. // Bioconjugate Chem. 1994. - V. 5 (4). - P. 283-286.

47. Kodera Y., Tanaka H., Matsushima A., Inada Y. Chemical modification of L-asparaginase with a comb-shaped polyethylene glycol derivative and maleic anhydride. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 184. -P. 144-148.

48. Kogan T.P. The synthesis of substituted methoxy-poly(ethylene glycol) derivatives suitable for selective protein modification. // Synth. Commun. -1992.-V. 22.-P. 2417-2424.

49. Krasotkina J., Borisova A., Gervaziev Y., Sokolov N. One step purification and kinetic properties of the recombinant L-asparaginase from Erwinia carotovora. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2004. - V. 39 (2). - P.215-221.

50. Laboureur P., Langlois C., Labrousse M. et al. L-asparaginases d' Escherichia coli. 1. Proprietes des formes natives. // Biochimie. 1971. - V. 53 (11/12).-P. 1147-1156.

51. Lubkowski J., Wlodawer A., Ammon H.L., Copeland T.D., Swain A.L. Structural characterization of Pseudomonas 7 A glutaminase-asparaginase // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 10257-10265.

52. Lee S.M., Wroble М.Н., Ross J.T. Large-scale recovery and purification of L-asparaginase from Erwinia carotovora. II Appl. Biochem. Biotechnol. -1986.-V. 12.-P. 229-246.

53. Lee S.M., Wroble M.H., Ross J.T. L-asparaginase from Erwinia carotovora. An improved recovery and purification process using affinity chromatography. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1989. - V. 1. - P. 1-11.

54. Martins M., Jorge J., Cruz M. Acylation of L-asparaginase with total retention of enzymatic activity. // Biochimie. 1990. - V.72. - P. 671-675.

55. Mateo, C. et al. Removal of amphipathic epitopes from genetically-engineered antibodies: production of modified immmunoglobulins with reduced immunogenicity. // Hybridoma. 2000. - V. 19. - P. 436-471.

56. Meister A., Levintow L., Greenfield R.E., Abendschein P.A. Hidrolysis and transfer reaction catalyzed by omega-amidase preparation // J. Biol. Chem. -1955.-V. 215.-P. 441-447.

57. Mehvar R. Modulation of the pharmacokinetics and pharmacodynamics pf proteins by polyethylene glycol conjugation. // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. -2000.-V. 3(1).-P. 125-136.

58. Miron Т., Wilchek M. A simplified method for the preparation of succinimidyl carbonates polyethylene glycol for coupling to proteins. // Bioconjug. Chem. 1993. - V. 4. - P. 568-569.

59. Molineux G. Pegylation: Engineering improved biopharmaceuticals for oncology. // Pharmacotherapy. 2003. - V. 23 (8 Pt 2). - P. 3S-8S.

60. Monfardini С, Harris J.M., Veronese F.M. A branched monomethoxypoly(ethylene glycol) for protein modification. // Bioconjugate Chem. 1995. - V. 6. - P. 62-69.

61. Moreadith R.W., Collen D. Clinical development of PEGylated recombinant staphylokinase (PEG-Sak) for bolus thrombolytic treatment of patients with acute myocardial infarction. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. -V. 55.-P. 1337-1345.

62. Morpurgo M., Veronese F.M., Kachensky D., Harris J.M. Preparation and characterization of poIy(ethylene glycol) vinyl sulfone. // Bioconjug. Chem. 1996. -V. 7.-P. 363-368.

63. Muller H.J., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1998. - V. 28. - P. 97-113.

64. Nektar Catalog. 2005-2006. - P. 30.

65. Palm G.J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Rohm K.H., Wlodawer A. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: crystal structure of a Thr-89-Val mutant // FEBS Lett. 1996. - V. 390. - P. 211-216.

66. Pasut G., Guiotto A., Veronese F.M. Protein, peptid and non-peptide drug PEGylation for therapeutic application. // Expert Opin. Ther. Patents. -2004.-V. 14 (6).-P. 859-894.

67. Pritsa A.A., Papazisis K.T., Kortsaris A.H., Geromichalos G.D., Kyriakidis D.A. Antitumor activity of L-asparaginase from Thermus thermophilus. // Anti-Cancer Drugs.-2001.-V. 12.-P. 137-142.

68. Qian G., Zhou J., Binglin H. The chemical modification of E. coli L-asparaginase by N,0 carboxymethyl chitosan. // Art.Cells, Blood Subs., and Immob. Biotech. - 1996. - V. 24 (6). - P. 567-577.

69. Roberts M.J., Bentley M.D., Harris J.M. Chemistry for peptide and protein PEGylation. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2002. - V. 54. - P. 459476.

70. Sebeni, J. The interaction of liposomes with the complement system. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998. - V. 15. - P. 57-88.

71. Soares A.L., Guimaraes G.M., Abrahao-Neto J. Effects of polyethylene glycol attachment on physicochemical and biological stability of E.coli L-asparaginase. // Int. J. Pharm. 2002. - V. 237. - P. 163-170.

72. Schmid F.A., Roberts J. Antineoplastic and toxic effects of Acinetobacter and Pseudomonas glutaminase-asparaginases. // Cancer Chemother. Repp. -1974.-V. 58.-P. 829-840.

73. Shearwater Corporation Catolog. 2001.

74. Story M.D., Voehringer D.W., Stephens L.C., Meyn R.E. L-asparaginase kills lymphoma cells by apoptosis. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1993. -V. 32.-P. 129-133.

75. Swain A.L., Jaskolski M., Housset D., Rao J.K.M., Wlodawer A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 1474-1478.

76. Taguchi T. Recent advances in L-asparaginase studies. // Gan To Kagaku Ryoho. 1988.-V. 15.-P. 1815-1825.

77. Taylor C.W., Dorr R.T., Fanta P., Hersh E.M., Salmon S.E. A phase I and pharmacodynamic evaluation of polyethylene glycol-conjugated L-asparaginase in patients with advanced solid tumors. // Cancer Chemother. Pharmacol. 2001. - V. 47 (1). - P. 83-88.

78. Thomas D.A. New agents in the treatment of acute lymphocytic leukaemia. // Best practice and research clinical haematology. 2003. - V.15 (4). - P. 771-790.

79. Ton G.N., Fineb J.P., Kwonc G.S. Methoxypoly(ethylene glycol-conjugated carboxypeptidase A for solid tumor targeting Part I: Synthesis and characterization. // Journal of Controlled Release. 2005. - V. 104. - P. 129-139.

80. Ueno Т., Ohtawa K., Mitsui K., Kodera Y., Hiroto M., Matsushima A., Inada Y., Nishimura H. Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. //Leukemia. 1997.-V. 11.-P. 1858-1861.

81. Uren J.R., Hargis B.J., Beardsley P. Immunological and pharmacological characteristics of poly-DL-alanyl-modified Erwinia carotovora L-asparaginase. // Cancer Research. 1982. - V. 42 (10). - P. 4068-4071.

82. Veronese F.M., Largajolli R., Boccu E., Benasssi C.A., Schiavon O. Activation of monomethoxy poly(ethylene glycol) by phenylchloroformate and modification of ribonuclease and superoxide dismutase. // Appl. Biochem. Biotechnol.- 1985.-V. 11.-P. 141-152.

83. Veronese F.M. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. // Biomaterials. -2001. V. 22. - P. 405-417.

84. Veronese F.M., Caliceti P. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly (ethyleneglycol) protein conjugates. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. - V. 55. - P. 1261-1277.

85. Veronese F.M., Pasut G. PEGylation, successful approach to drug delivery. //Drugdiscovery today.-2005. -V. 10.-P. 1451-1458.

86. Walsh S, Shah A., Mond J. Improved pharmacokinetics and reduced antibody reactivity of lysostaphin conjugated to polyethylene glycol. // Aantimicrobial agents and chemotherapy. 2003. - V.47 (2). - P. 554-558.

87. Woghiren C., Sharma В., Stein S., Protected thiol-polyethylene glycol: a new activated polymer for reversible protein modification. // Bioconjug. Chem. 1993. - V .4. - P. 314-318.

88. Wolf B.A. Overview of therapeutic drug monitoring biotechnologic drugs. // Ther. Drug Monit. 1996. - V. 18 (4). - P. 402-404.

89. Wriston J.C., Yellin Т.О. L-Asparaginase. // Adv. Enzymol. 1973. -V. 39.-P. 185-248.

90. Wriston J.G. Asparaginase. // Methods Enzymol. 1985. - V. 113. -P. 608-618.

91. Xiong M.P., Kwon G.S. PEGylation of Yeast Cytosine Deaminase for Pretargeting. // Journal of Pharmaceutical Sciences. 2005. - V. 94. - P. 1249-1258.

92. Zalipsky S., Seltzer R., Menon-Rudolph S. Evaluation of a new reagent for covalent attachment of polyethylene glycol to proteins. // Biotechnol. Appl. Biochem.- 1992.- V. 15.-P. 100-114.

93. Zalipsky S. Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules. // Advanced Drug Delivery Reviews. 1995. -V. 16.-P. 157-182.

94. Zalipsky S. Functionalized poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates. // Bioconjugate Chem. 1995. - V. 6. - P. 150-165.

95. Zhang Y.Q. et al. Chemical modification of L-asparaginase from E.coli. II Biotechnology Letters. 2004. - V. 26. - P. 753-756.

96. Zhang Y. Q. et al. Immobilization of l-asparaginase on the microparticles of the natural silk sericin protein and its characters. // Biomaterials. 2004. - V. 24. - P. 3751-3759.

97. Борисова А. А. Рекомбинантная L-аспарагиназа Erwinia carotovora: разработка способа выделения гомогенного препарата фермента и его свойства. // Дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук : 03.00.04.-М., 2003.-С. 127.

98. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. // Справочник биохимика. Пер. с англ. -М.: Мир, 1981. С. 465-466.

99. Ивашкин В.Т., Маевская М.В. Новый шанс победить гепатит С. // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2002. №2.-С. 25-28.

100. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. Пер. с англ. М.: Мир, 1979. - 280 С.

101. Мардашев С.Р., Николаев А.Я., Соколов Н.Н., Козлов Е.А., Куцман М.Е Выделение и свойства гомогенного препарата L-аспарагиназы из Pseudomonas fluorescens АГ // Биохимия. 1975. - Т. 40 (5).-С. 984-989.

102. Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние, проблемы и перспективы. www.medi.ru. // Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. Инф. Бюллетень.-2003.

103. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. - С. 233-235.

104. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М : Наука, 1983. С. 304

105. Рассказова Е.А., Плешакова О.В., Садовников В.Б. Изучение роли окислительной модификации белков в нарушении иммунологической толерантности при старении организма. // сб. тезисов 9-й Пущинской конф.

106. Соколов Н.Н., Занин В.А., Александрова С.С. Бактериальные L-аспарагиназы и глутамин(аспарагин)азы: некоторые свойства, строение и противоопухолевая активность. // Вопр. мед. химии. 2000. - Т. 46 (6).-С. 531-548.

107. Тимаков A.M., Кондратчик К Л., Тиганова О. А. Пегилированная форма аспарагиназы альтернатива нативной Е. coli аспарагиназы? // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии. -2003.-Т. 2. (4).-С. 92-96.

108. Тимаков A.M., Кондратчик К.Л., Хондкарян Г.Ш., Муторова О.Ю., Ковалева O.JI. Препараты L-аспарагиназы в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии. 2003. - Т. 2. (3). - С. 90-93.