Факторы патогенности Cryptococcus Neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.24, доктор биологических наук Васильева, Наталья Всеволодовна

• Васильева, Наталья Всеволодовна
• доктор биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор биологических наук Васильева, Наталья Всеволодовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Морфолого-биологические особенности рода Cryptococcus.

1.1. Род Cryptococcus

1.2. Ультраструктура клеток С. neoformans.

1.3. Молекулярно-генетическая характеристика

Cryptococcus neoformans.

Глава II. Патогенность криптококков.

2.1. Базовые характеристики патогенных свойств криптококков.

2.2. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микроорганизмами.

2.3. Современные представления о патогенезе криптококкоза.

2.4. Факторы патогенности криптококков.

2.4.1. Капсула.

2.4.2. Уреаза.

2.4.3. Лакказа и меланиногенез.

2.4.4. Фосфолипаза.

2.4.5. Типы спаривания.

2.4.6. Рост при повышенных температурах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 111. Объекты и методы исследования.

3.1. Объекты исследования. ф 3.2. Методы исследования

3.2.1. Морфологические характеристики изолятов

С. neoformans.

3.2.2. Изучение патогенности криптококков в опытах на лабораторных животных.

3.2.3. Сравнительная ультраструктура клеток криптококков.

3.2.4. Способность клеток С. neoformans расти при повышенных температурах.

3.2.5. Ассимиляция источников углерода и азота тест-культурами криптококков.

3.2.6. Ферментативная активность криптококков (фосфолипазная, уреазная, фенолоксидазная).

3.2.7. Исследование чувствительности криптококков к флуконазолу и вориконазолу.

3.2.8. Молекулярно-генетическая характеристика

С. neoformans.

3.2.9. Особенности патоморфогенеза криптококкоза.

3.2.9.1. Патоморфогенез криптококкоза у человека.

3.2.9.2. Патоморфогенез экспериментального криптококкоза головного мозга и легких у белых мышей, вызванного различными по патогенности штаммами криптококков.

3.2.10. Иммуногистохимическое изучение локализации капсульного гетерогликана в тканях головного мозга мышей при криптококкозе.

3.2.11. Получение экзогликанов, образуемых Cryptococcus neoformans С. РКПГ 719 и humicolus ИБФМ 984.

3.2.12. Изучение влияния криптококковых экзогликанов на выживаемость зараженных мышей.

3.2.13. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микромицетами и бактериями in vitro.

3.2.13.1. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими грибами in vitro.

3.2.13.2. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с бактериями in vitro.

3.3. Статистические методы.

Глава IV. Морфолого-биологические свойства клинических изолятов криптококков.

4.1. Происхождение изучаемых штаммов криптококков.

4.2. Морфология штаммов С. neoformans, выращенных на питательных средах in vitro.

4.3. Определение.патогенности криптококков при внутривенном введении мышам.

4.4. Ассимиляция различных источников углерода и азота.

4.5. Ультраструктура клеток штаммов С. neoformans, выращенных in vitro.

4.6. Генетическая характеристика 17 штаммов С. neoformans, выделенных от больных в России.

Глава V. Морфо-биологические особенности С. neoformans in vivo.

5.1. Патоморфология криптококкоза у человека.

5.2. Экспериментальный криптококкоз.

5.2.1. Экспериментальный криптококкоз, вызванный различными по патогенности штаммами Cryptococcus spp.

5.2.2. Экспериментальный криптококкоз головного мозга при внутривенном заражении мышей высоко патогенным штаммом С. neoformans 1166.

5.2.3. Экспериментальный криптококкоз головного мозга при внутривенном заражении мышей менее патогенным штаммом С. neoformans 1067.

5.3. Экспериментальный криптококкоз. Ультраструктура клеток С. neoformans.

5.3.1. Ультраструктура клеточных стенок и капсул штаммов С. neoformans в легких и мозге белых мышей через 7 дней после внутривенного заражения.

5.3.2. Ультраструктура клеточной стенки и капсулы зрелых клеток С. neoformans штаммов 1166 и 1067 в мозге белых мышей через 14 дней после их заражения.

5.4. Выявление антигена криптококка в головном мозге мышей, внутривенно зараженных различными штаммами.

Глава VI. Сравнительное изучение гомологичных экзогликанов в экспериментах in vivo.

6.1. Влияние криптококковых экзогликанов из патогенных и непатогенных криптококков на выживаемость мышей при экспериментальном криптококкозе.

6.2. Патоморфологическое и иммуногистохимическое исследование головного мозга мышей после введения полисахаридов из патогенного и непатогенного криптококков.

6.3. Влияние криптококкового экзогликана, продуцируемого патогенным криптококком, на выживаемость мышей при экспериментальном криптококкозе.

Глава VII. Факторы патогенности С. neoformans.

7.1. Рост и развитие С. neoformans при повышенных температурах.

7.2. Определение меланинообразующей способности

Ф криптококков.

7.3. Определение уреазной активности.

7.4. Определение фосфолипазной активности криптококков.

Глава \/111.Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с другими грибами и бактериями in vitro.

8.1. Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с другими грибами in vitro.

8.2. Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с некоторыми бактериями in vitro.

Глава IX. Чувствительность изолятов криптококков к флуконазолу и вориконазолу.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Факторы патогенности Cryptococcus Neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза»

Актуальность проблемы

Cryptococcus neoformans - один из наиболее важных патогенных для человека микромицетов, встречающихся в клинической практике; он вызывает тяжелый менингоэнцефалит и диссеминированные инфекции преимущественно у больных СПИД и иммунодефицитами другого генеза.

Частота криптококкоза в развитых странах мира после введения высоко эффективной антиретровирусной терапии составляет 0,3-0,5/100.000 населения. Однако, в развивающихся странах ситуация остается по-прежнему тревожной; по данным конференции по инвазивным микозам в 2002 г среди ВИЧ-инфицированных лиц от криптококкоза умерло 200 000 человек. Сведения о заболеваемости криптококкозом в России в целом отсутствуют, равно как и информация о молекулярных типах, серотипах, вариантах и вирулентности изолятов криптококков.

В настоящее время Россия по темпам прироста числа ВИЧ-инфицированных лиц занимает одно из первых мест в мире и ухудшение данной ситуации в ближайшие годы вполне очевидно [22, 24, 26, 27]. Поскольку криптококкоз является маркерной инфекцией при СПИД, частота его также будет возрастать.

Род Cryptococcus включает 38 видов и только два из них (С. neoformans и С. gattii) являются патогенными. Вместе с тем, биологические особенности этих двух видов изучены недостаточно, включая и факторы патогенности. Наиболее явные из них (рост патогенов при 37° С, продукция меланинов, типы спаривания, активность фосфолипазы и уреазы, капсулообразование), стали известными в последние годы, но простое их перечисление не обеспечивает возможности дифференцировать патогенные криптококки по вирулентности, что могло бы иметь прогностическое значение. Очень мало информации имеется в отношении морфологии тканевых форм возбудителя в процессе инфекции, а также реакции организма больного на различные изоляты С. neoformans, которые могут заметно варьировать по вирулентности.

Несмотря на актуальность проблемы о правомочности отнесения кап-сульного полисахарида различных серотипов и вариантов С. neoformans в разряд факторов агрессии, до сих пор нет четкости в понимании разграничения роли капсулы криптококка и ее главного компонента-глюкуроноксиломаннана, в результате чего и капсульный полисахарид и капсулу обычно относят к факторам патогенности.

В последнее время усилился интерес к проблеме ассоциативных взаимодействий грибов с другими микроорганизмами. Однако данные о криптокок-ке - ассоцианте немногочисленны и противоречивы и, как правило, эти данные получены при аутопсиях с констатацией лишь факта наличия микст-инфекций.

В этой связи давно возникла необходимость более глубокого исследования биологии криптококков, в том числе их «поведенческих» характеристик в ассоциациях.

С учетом недостаточной изученности криптококков, как возбудителей угрожающих жизни инфекций, проблема всестороннего исследования биологии названных микроорганизмов является весьма актуальной. Цель исследования

Изучение биологических особенностей патогенных криптококков - изоля-тов от пациентов в России. Задачи исследования

1. Провести генотипирование криптококков - изолятов в России.

2. Идентифицировать криптококки, выделенные от больных, по основным морфо-физиологическим характеристикам для определения их соответствия типовым культурам.

3. Изучить цитологическую вариабельность патогенных криптококков, полученных в культурах in vitro и от экспериментальных животных, зараженных тест-организмами, с использованием современной световой и электронной микроскопии.

4. Изучить вирулентность и факторы патогенности изолятов криптококков от больных и некоторых коллекционных штаммов.

5. Провести сравнительное изучение морфологии возбудителя и патоморфо-логических изменений в аутопсийном материале и при экспериментальном криптококкозе, обусловленном штаммами различной вирулентности.

6. Изучить влияние капсульного полисахарида на течение экспериментального криптококкоза.

7. Определить «поведенческие» . реакции криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами.

8. Исследовать чувствительность криптококков к антимикотикам. Научная новизна исследования

Впервые:

- проведен молекулярный анализ российских изолятов криптококков, собранных и изученных в ходе исследования, получена первая информация о различных субпопуляциях С. neoformans;

- экспериментально обнаружены штаммовые различия российских изолятов криптококков по морфо-физиологическим свойствам, в том числе - на ультраструктурном уровне;

- установлена возможность формирования оригинальных фенотипов крип-тококка у одного и того же больного в процессе инфекции на фоне лечения;

- обоснована опосредованная роль капсульного экзогликана как возможного фактора агрессии патогена;

- оценены ассоциативные взаимоотношения криптококков с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами;

- выявлена корреляция между чувствительностью криптококков к антимикотикам азолового ряда (флуконазолу, вориконазолу) и вирулентностью.

- выявлена и определена архитектоника типов капсул у криптококков in vitro и in vivo, наряду с пластичностью нативного капсульного материала;

- оценены и изучены тканевые формы криптококка в зависимости от вирулентности.

Практическая значимость и внедрение в практику

Полученные данные о внутривидовых штаммных различиях по чувствительности к антимикотикам, вирулентности, особенностям тканевых форм, ферментативной активности С. neoformans, выделяемых из патологического материала, необходимо учитывать в клинической практике постановки диагноза и выбора средств лечения соответствующих больных.

Результаты патоморфологических и электронно-микроскопических исследований являются основой для постановки диагноза криптококкоза в ходе инфекции с учетом дифференциации клеток криптококков на инкапсулированные, бескапсульные и дегенеративные формы.

Результаты изучения взаимоотношения криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами следует экстраполировать на оценку микст-инфекций in vivo и в природных ассоциациях, в которых участником является С. neoformans.

Установлена необходимость определения чувствительности С. neoformans к флуконазолу и вориконазолу in vitro, а также мониторирования чувствительности в ходе лечения.

Основные руководства и пособия, в которых в порядке внедрения использованы результаты исследования:

1. Руководство для врачей «Перечень основных методов и критериев диагностики микозов», 2001. Рекомендовано к использованию ученым советом НИИ медицинской микологии СПб МАПО.

2. Учебное пособие «Диагностика микозов», 2004. Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей.

3. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.

4. Типовая программа повышения квалификации по специальности «Лабораторная микология», 2004.

5. Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности «Лабораторная микология», 2004.

6. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интернатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.

7. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Клиническая микология», 2004.

8. Типовая программа повышения квалификации по специальности «Клиническая микология», 2004.

9. Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности

Клиническая микология», 2004.

10. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интернатуре по специальности «Клиническая микология», 2004.

Материалы диссертации внедрены в работу микологической клиники, лаборатории диагностики микозов, микологического мониторинга и биологии грибов, «Российской коллекции патогенных грибов», лаборатории патомор-фологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО, НИИ детских инфекций, Городского патологоанатомического бюро, инфекционной больницы № 30 им. С.П.Боткина г. Санкт-Петербурга; Республиканской клинической инфекционной больницы (Научно-практический центр профилактики и лечения ВИЧ-инфекции у беременных женщин и детей); Центра по профилактике и борьбе со СПИД г.Санкт-Петербурга.

Материалы диссертации внедрены в педагогический процесс ряда кафедр Санкт-Петербургской Медицинской академии последипломного образования (клинической микологии, аллергологии и иммунологии, курса лабораторной микологии, педиатрии с курсом неонатологии, патологической анатомии с курсом цитологии). Положения, выносимые на защиту

1. Возбудители криптококкоза гетерогенны по биологическим свойствам.

2. Важнейшими в дифференциации штаммов криптококков по вирулентности являются фосфолипаза, уреаза и фенолоксидаза.

3. При криптококкозе морфология клеток С. neoformans в тканях взаимосвязана с вирулентностью.

4. Штаммы патогенных криптококков формируют разные по архитектонике капсулы.

5. Полисахариды криптококков проявляют защитное действие применительно к клеткам-продуцентам и не являются непосредственным фактором агрессии или патогенности для макроорганизма.

6. Установленные различные типы взаимоотношений криптококков в ассоциациях с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами имеют важное клиническое значение при экстраполяции результатов на микробиоту in vivo.

7. Чувствительность криптококков к флуконазолу и вориконазолу необходимо определять неоднократно в ходе лечения, учитывая возможность возникновения их новых фенотипов. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004 и 2005), на 6-м Российском съезде врачей-инфекционистов (СПб, 2003), на расширенном заседании Российского Общества патологоанатомов с участием инфекционистов и микологов (СПб, 2003), на Втором Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2004), на 13 и 14-м Конгрессах Международного Общества медицинских и ветеринарных микологов (Италия, 1997 , Аргентина, 2000), на 6,7-м и 9-м Конгрессах Европейской Конфедерации по медицинской микологии (Испания, 2000, Греция, 2001, Нидерланды, 2003), на 3, 4-й и 5-й Международных конференциях «Криптококк и криптококкоз» (Париж, 1996, Лондон, 1999, Аделаида, 2000, Бостон, 2005). Публикации по материалам исследования

По теме диссертации опубликовано 52 работы в научных журналах и сборниках, в том числе 20 из них в изданиях, рекомендованных ВАК. Личный вклад автора

Автор планировал, выполнял и руководил исполнением основных экспериментальных исследований по проблеме. В выборе главного направления исследований, в постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль.

Доля участия автора в сборе изолятов патогена и аутопсий - 50%; в разработке и исполнении программ разделов исследований - 90%; доля участия в обработке данных - 90%; в анализе и обобщении экспериментального материала-100%.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, 9 глав, выводов, списка цитируемой литературы (280 наименований) и приложения. Полный объем работы составляет 340 страниц, включая 94 рисунка и 45 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Микология», Васильева, Наталья Всеволодовна

выводы

Возбудители, выделенные от пациентов в России, относятся к молекулярным типам VNI, VNIII и VNIV, серотипам А, Д, АД и вариантам С. neoformans var. grubii, var. neoformas и var. grubii / var. neoformans. Штаммы различаются внутри вида С. neoformans и между видами С. gattii и С. albidus по способности к капсулообразованию, меланинообразо-ванию, росту при температуре выше 37°С, фосфолипазной и уреазной активностям, ультраструктуре, интенсивности почкования, чувствительности к антимикотикам - флуконазолу и вориконазолу, тканевым формам.

Возбудители криптококкоза различаются по вирулентности (LD50ot 102 до 1011 клеток/мышь). Патогенность штаммов криптококков зависит от комбинации следующих факторов: способности к росту при температуре 37°С, капсулообразованию, меланинообразованию, фосфолипазной и уреазной активностям; выраженность последних трех свойств соответствует различиям их по вирулентности.

На основании электронно-микроскопических исследований клеток установлено, что штаммы С. neoformans отличаются по строению и толщине капсулы и клеточной стенки, степени конденсации ядерного материала; в зависимости от вирулентности штамма наиболее выраженными признаками были только число, форма и топография митохондрий. Толщина капсулы и клеточной стенки не связана с вирулентностью штамма. Капсулообразование - видовой признак криптококков, необходимый фактор патогенности

5.1.При этом отсутствует зависимость архитектоники капсул (толщина, уровень сложности, качество и количество микрофибрилл в ней) от вирулентности штаммов. 5.2.Обнаруженные динамические изменения в ультраструктуре капсул in vivo непосредственно связаны с трансформацией капсульного полисахарида, определяющего антигенную специфичность криптококка. Капсульный полисахарид не занимает ведущего положения в определении патогенности (агрессивности) криптококка; экзогликаны капсул из патогенного С. neoformans (серотип Д) и непатогенного С. humicolus (серотип Д), обладающие сходной химической структурой, вызывают однотипные изменения в головном мозге при экспериментальном криптококкозе. Возможность инвазии тканей С. neoformans и характер течения крипто-кокковой инфекции определяются не только степенью иммунодефицита, но и вирулентностью штамма.

Морфология тканевых форм гриба изменяется по мере снижения вирулентности, более вирулентные штаммы криптококка вызывают более тяжелые поражения головного мозга и легких, при этом формируется большее число очагов лизиса («цист») на фоне подавления воспалительной реакции; менее вирулентные штаммы индуцируют гранулема-тозную реакцию при меньшем числе очагов лизиса. Установлено, что в ассоциациях с бактериями и микромицетами проявляются различные взаимоотношения криптококков:

9.1. Штаммы криптококков 1095, 1096, 852 и 856 стимулировали рост всех взятых в опыты грамотрицательных бактерий и избирательно -грамположительных бактерий; грамположительные и грамотрица-тельные бактерии не стимулировали роста криптококков, но часть из них выступала ингибиторами роста микромицетов, a Proteus vulgaris проявил себя выраженным антагонистом С. neoformans.

9.2. Дрожжевые организмы - Candida albicans, С. krusei и С. zeylanoides заметно тормозили рост криптококков (С. rugosa проявляла нейтрализм); ингибирующее действие нивелировалось при снижении температуры с 37°С до 26°С. Сапротрофные штаммы С. humicolus ингибировали тест-культуры С. neoformans при 30°С.

9.3. Нитчатые микромицеты Aspergillus niger 1117 и A. flavus 954 ингибирующе действовали в отношении штаммов криптококков РКПГ 852, 856, а сапробы Penicillium nigricans 184, P. expansum 185 и P. patulum 190 - подавляли штаммы С. neoformans РКПГ 1095 и 1096. Применительно к другим изученным видам нитчатых микромицетов (сапробов) в ассоциациях отмечен нейтрализм.

-28510. 10 % возбудителей криптококкоза резистентны к флуконазолу и ворико-назолу; установлена взаимосвязь вирулентности криптококков и их чувствительности к названным препаратам. Показана возможность формирования новых фенотипов криптококка на фоне лечения этими антимикоти-ками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для изучения эпидемиологии криптококкоза в России необходимо продолжать исследования для составления карты распределения генотипов Cryptococcus neoformans в сравнении с имеющимися данными в Европе и мире.

2. Целесообразно определять вирулентность изолятов криптококков по показателям их ферментативной активности при 37° С (фосфолипазной, уреазной, фенолоксидазной); это может иметь прогностическое значение при криптококкозе.

3. При оценке тканевых форм криптококка необходимо использовать модифицированную окраску альциановым синим по Моури (целесообразно сочетание альцианового синего, PAS-реакции и гематоксилина), что приобретает особое значение для постановки диагноза криптококкоза при выявлении капсулосодержащих, бескапсульных и дегенеративных форм гриба, а также продуктов их распада.

4. В случаях обнаружения многочисленных очагов лизиса («цист») в гистологических препаратах при отсутствии воспалительной реакции можно предполагать наличие высоковирулентного возбудителя криптококкоза (слабо вирулентный штамм индуцирует «грануломатозную реакцию»).

5. При выделении криптококков из биосубстратов необходимо определять чувствительность всех штаммов к антимикотикам и контролировать ее в случаях рецидивов криптококкоза.

6. При обнаружении в патологическом материале микроорганизмов - ассо-циантов криптококка при криптококкозе необходимо определять тип их взаимоотношений (симбиоз, антибиоз).

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Васильева, Наталья Всеволодовна, 2005 год

1. Авцын А.П., Струков А.И., Фукс Б.Б. Принципы и методы гистоцитохими-ческого анализа в патологии. Л.: Медицина, 1971. - 367 с.

2. Аркадьева Г. Е. Биологическая активность некоторых микробных полисахаридов: дисс. .д-ра биол. наук. Л., 1974. -275 с.

3. Бабьева И. П., Чернова И. Ю. Биология дрожжей. М.: Товарищество научн. изд. КМ К, 2004. - 212 с.

4. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии (в 2 частях). -М.: Мир, 1989.-400 с.

5. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. 2 изд., перераб. и доп. - Л.: Гос. изд-во мед. литерат., 1963. -152 с.

6. Боровиков В.П., Боровиков И.П. STATISTICA Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. - М.: Филин, 1997.

7. Боровиков В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов. СПб.: Питер, 2001. - 656 с.

8. Васильев А.Е., Камалетдинова Ф.И. О фиброзиновых тельцах грибных клеток // Докл. АН СССР. 1988. - Т. 301. - № 4. - С. 982-984.

9. Васильева Н.В. Влияние криптококкового полиуронида на макрофаги: Дисс. канд. биол. наук. Л., 1989. - 179 с.

10. Гайер Г. Электронная гистохимия. Изд. «Мир»: Москва. - 1974.-488 с.

11. Голубев В.И. Грибы рода Cryptococcus. М.,1980. - 80 с.

12. Голубев В.И., Икеда Р., Шинода Т. Активность сапротрофных тремел-лоидных дрожжей против Cryptococcus neoformans И Проблемы медицинской микологии. 2000. - Т. 2, № 3. - С. 39-43.

13. Елинов Н.П. Криптококковые полисахариды и криптококкоз // Тезисы I Межд. микол. симпозиума, 1987, Л. С. 11-12.

14. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. Изд-во «Наука» . - 1995. - 600 с.

15. Елинов Н.П. Патогенные дрожжеподобные организмы. Л.: Медицина, 1964.-383 с.16