Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Шутова, Мария Владимировна

• Шутова, Мария Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шутова, Мария Владимировна

Введение.

Обзор литературы.

1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

1.1. Общая характеристика.

1.2. Поддержание плюрипотентности: молекулярные механизмы.

1.2.1. Транскрипционные факторы, связанные с поддержанием плюрипотентности в ЭСК.

1.3. Поддержание плюрипотентности: эпигенетические механинизмы.

2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

2.1 Способы получения.

2.2 Общая характеристика индуцированных плюрипотентных клеток.

2.3 Индукция плюрипотентности: молекулярные и эпигенетические механизмы.

2.3.1 Транскрипционные факторы, участвующие в репрограммировании.

2.3.2 Взаимодействие транскрипционных факторов во время репрограммировании.

2.3.3 Изменение эпигенетического статуса при репрограммировании.

2.4 Сравнение ]Р8 клеток и ЭСК.

2.5 Практическая значимость технологии получения 1Р8 клеток.

Материалы и методы.

Ферменты и реактивы.

Клеточные линии.

Культивирование клеток НЦУЕС.

Приготовление фидерного слоя мышиных эмбриональных фибробластов.

Приготовление покрытых матриксом культуральных чашек и планшетов.

Культивирование ЭСК человека.

Формирование и культивирование эмбриоидных телец.

Дифференцировка ЭСК человека в клетки нейронального пути.

Тест на образование тератом.

Протокол по получению вирусных частиц для репрограммирования клеток.

Репрограммирование клеток HUVEC.

Иммуномагнитная сепарация - MACS (Magnetic cell sorting).

Тест на матригеле (Matrigel Assay).

Иммуноцитохимический анализ.

Окраска антителами клеточных культур.

Окраска антителами срезов эмбриоидных телец.

Видеомикроскопия.

Компьютерный анализ (определение сайтов рестрикции, выбор зондов, выбор праймеров).

Агарозный гель-электрофорез ДНК.

Выделение хромосомной и плазмидной ДНК.

Выделение тотальной РНК из клеточных культур.

Реакция обратной транскрипции.

Полимеразная цепная реакция.

Анализ кариотипа и STR анализ.

Полногеномный анализ метилирования ДНК.

Получение клонов ЭСК человека, устойчивых к неомицину.

Индукция трансгенов в клонах ЭСК с помощью доксициклина.

Бисульфитное секвенирование.

Анализ протеома.

Результаты и обсуждение.

1. Репрограммирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).

1.1. Характеристика endo-iPS клеток.

1.2. Анализ кариотипа и уровня пролиферации линий endo-iPS.

1.3. Дифференцировочный потенциал endo-iPS клонов.

1.4. Анализ CpG метилирования endo-iPS.

2. Создание модельной системы для изучения процесса репрограммирования.

2.1. Получение генетически модифицированной линии ЭСК, содержащей ТФ

Ой4, $ох2, К1Л?4, с-Мус под индуцируемыми промоторами.

2.2. Дифференцировка линии ЪЕ$М05пео2 в нейросферы.

2.3. Использование индуцибельной системы для репрограммирования нейральных клеток.

2.4. Характеристика пеиго-1Р82.0.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека»

В процессе индивидуального развития организма млекопитающих, клетки эмбриона проходят через множество стадий, постепенно теряя способность к дифференцировке: от тотипотентной зиготы через стадию плюрипотентных клеток ВКМ бластоцисты, к мультипотентным региональным стволовым клеткам и, наконец, к терминально дифференцированным клеткам. На молекулярном уровне процесс дифференцировки клеток и обретение ими определенного фенотипа сопровождается изменением экспрессии генов, статуса метилирования генома, модификацией гистоновых белков и т.д. При нормальном развитии этот процесс необратим. Первые попытки провести де-дифференцировку клеток />; vitro были предприняты еще в середине прошлого века: сначала эксперименты проводились на амфибиях, а потом и на млекопитающих. Оказалось, что при переносе ядра соматической клетки в энуклеированный ооцит с низкой эффективностью происходит восстановление дифференцировочного потенциала соматической клетки до плюрипотетного состояния in vivo (Gurdon and Wilmut, 2011). В экспериментах по слиянию ЭСК (выведенные в культуру клетки ВКМ блистоцисты), с соматическими клетками получаются плюрипотентные гибридные клетки, способные принимать участие в формировании организма химерных животных (Sanges et al., 2011). Эти исследования доказали принципиальную возможность репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотентного состояния in vitro, более того, из них стало очевидно, что в ЭСК содержатся все необходимые факторы для репрограммирования. Однако, еще некоторое время набор этих факторов, необходимых для де-дифференцировки клеток, оставался неизвестным.

Впервые прямое репрограммирование соматических клеток с помощью набора определенных факторов было осуществлено в 2006 году японскими исследователями Такаши и Яманака, что явило собой начало отдельного направления исследований в области биологии развития (Takahashi et al., 2006). В элегантном эксперименте было показано, что вполне достаточно экспрессии четырех генов, кодирующих транскрипционные факторы Oct3/4, Sox2, KLF4, и с-Мус для того чтобы фибробласты кожи мыши перешли в плюрипотентное состояние. Самое интересное заключалось в том, что транскрипционные факторы индуцировали работу своих эндогенных ортологов, которые, потом поддерживали плюрипотентное состояние репрограммированной клетки. Полученные клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, iPS. По своим свойствам они оказались практически идентичны другим плюрипотентным клеткам - ЭСК. Как и ЭСК, iPS клетки в отсутствии сигналов дифференцировки и в присутствии факторов, обеспечивающих самоподдержание, продолжают симметрично делиться. В то же время, сменив условия культивирования, можно получить контролируемую дифференцировку ЭСК и ¡РБ клеток в клетки-производные трех зародышевых листков.

РБ клетки можно получить для каждого человека персонально, именно поэтому им пророчат большое будущее в практической медицине. Получив соматические клетки пациента (например, клетки кожи), можно из них сделать 1РБ клетки, получить пораженный патологическим процессом тип клеток или тканей, исследовать молекулярные механизмы возникновения патологии и попытаться подобрать лекарственные средства для устранения причин патологии. Более того, можно устранить генетическую причину заболевания и использовать клетки для трансплантации. Все это открывает новые возможности для персонализированной медицины.

Однако, до сих пор остается нерешенным целый ряд вопросов фундаментального характера: как именно происходит репрограммирование, какие процессы обеспечивают возвращение клетки в плюрипотентное состояние, и насколько похожи «искусственные» плюрипотентные клетки ¡РБС на их «природные» аналоги — ЭСК?

Настоящая диссертационная работа посвящена актуальным вопросам репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотентного состояния, а именно, разработке модели репрограммирования и поиску наиболее оптимальных для репрораммирования соматических клеток, анализу эпигенома репрограммированных клеток, а также сравнению ¡РБ клеток с генетически идентичными им ЭСК человека.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Шутова, Мария Владимировна

Выводы.

1. Впервые было проведено генетическое репрограммирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека до плюрипотентного состояния. Показано, что полученные линии полностью репрограммированных endo-iPS клонов по морфологическим, генетическим, эпигенетическим и функциональным свойствам соответствуют эмбриональным стволовым клеткам человека.

2. Был проведен полногеномный анализ изменения уровня метилирования промоторов 14 тысяч генов человека при приобретении соматическими клетками плюрипотентного состояния. В результате анализа впервые продемонстрировано репрограммирование соматических клеток на эпигенетическом уровне.

3. Впервые продемонстрировано, что in vitro уровень полногеномного метилирования плюрипотентных клеток выше, чем соматических.

4. В результате полногеномного анализа метилирования промоторных участков 14 тысяч генов плюрипотентных и соматических клеток была подтверждена ключевая роль гена Oct4 в приобретении и поддержании плюрипотентного состояния.

5. Впервые создана и опробована модельная система индукции плюрипотентного состояния в дифференцированных клетках человека, позволяющая изучать генетические и эпигенетические характеристики процесса репрограммирования различных типов соматических клеток до плюрипотентного состояния.

Заключение.

С первого эксперимента по прямому репрограммированию прошло около пяти лет. За это время было проведено множество работ, посвященных повышению эффективности репрограммирования, варьированию состава ТФ и методов их введения, а также типов клеток, используемых для экспериментов. Также были предприняты многочисленные попытки использовать полученные iPS клетки в качестве модельной системы для поиска причин наследственных заболеваний и возможных путей их лечения. Огромные надежды возлагают на применение пациент-специфичных iPS клеток в персональной медицине как на возможный материал для трансплантологии. Однако, до сих пор в этой области остается множество вопросов. Точно неизвестно, какие молекулярные механизмы направляют соматическую клетку по пшорипотентному пути, насколько направленно действие ТФ «коктейля Яманака», можно ли заменить их все, и почему до конца путь репрограммирования проходит только очень маленькая часть клеточной популяции. До сих пор не разработаны критерии, которые позволили бы унифицировать получаемые в разных лабораториях iPS клетки, но уже понятно, что существующие критерии плюрипотентности, хорошо применимые к ЭСК, не до конца характеризуют индуцированные плюрипотентные клетки. Без ответа на эти вопросы невозможно понять, что из себя представляет процесс прямого репрограммирования, и, соответственно, нельзя будет говорить о биомедицинском применении iPS клеток.

В этой работе перед нами стояло несколько задач. В момент планирования работы было репрограммировано всего три типа клеток человека, поэтому, во-первых, было необходимо провести прямое репрограммирование выбранного типа соматических клеток человека Мы выбрали клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) из-за их легкой доступности неинвазивными методами, а также безопасности (вероятность обнаружения в их геноме спонтанных мутаций сводится к минимому благодаря отсутствию влияния внешних мутагенов и небольшому количеству пассажей in vitro перед репрограммированием). Для индукции плюрипотентности мы инфицировали выделенные и охарактеризованные клетки HUVEC лентивирусами, содержащими гены ТФ «коктейля Яманаки». Такой метод был выбран из-за своей максимальной эффективности, которая ранее была продемонстрирована на других типах клеток мыши и человека. Нами было получено 14 репрограммированных клонов, которые были охарактеризованы морфологически, по молекулярным маркерам, кариотипически, а также функционально. Характеристика полученных endo-iPS клонов показала, что среди них всего два (10 и 12) удовлетворяют всем условиям плюрипотентности. STR анализ подтвердил происхождение endo-iPS клеток из клеток

72

НиУЕС. Сравнение епс!сйР8 клеток, ЭСК человека, клеток НЛУЕС, а также клеток РВМС, взятых в качестве контрольного типа соматических клеток, выявило несколько закономерностей. Во-первых, было показано, что репрограммирование ведет к полногеномным эпигенетическим изменениям, которые в целом характеризуются гиперметилированием генов, характерных для клеток ХШУЕС, и уменьшением уровня метилирования генов, связанных с плюрипотентным состоянием. Полногеномное метилирование ДНК плюрипотентных клеток оказалось выше, чем у соматических клеток. Можно предположить, что в плюрипотентных клетках происходит более строгий контроль работы генов, контролируюемых метилированием, который в процессе развития ослабевает. На основе анализа метилирования промоторных районов генов, связанных с плюрипотентностью, была подтверждена ключевая роль гена 0&4 в поддержании и индукции плюрипотентности. При сравнении эпигеномов епскмРБ клеток и ЭСК было показано, что они очень близки друг к другу, и степень сходства между ними (около 97%) соответствует сходству между разными линиями ЭСК. Полученные результаты могут говорить о том, что различия между ЭСК и ¡РЭ могут быть связаны с разницей в их геномах. Для того чтобы изучить возможный вклад индивидуальных генетических и эпигенетических различий между различными типами клеток и иметь возможность сравнивать полученные ¿РБ клетки с изогенными им ЭСК, нами была создана модельная система. Для этого мы получили и охарактеризовали клон линии ЭСК человека НЕ8М05, который содержал в своем составе гены ТФ «коктейля Яманака» под промоторами, индуцируемыми доксициклином. Для проверки работы разработанной модельной системы мы дифференцировали полученный' клон Е8пео2 по нейрональному пути. В полученных нейрональных клетках с помощью доксициклина была индуцирована экспрессия четырех ТФ «коктейля Яманака». С помощью двух различных методик были получены пешхыР8 клоны; которые были охарактеризованы морфологически, на соответствующие молекулярные маркеры, а также функционально. Проведенный сравнительный анализ пешхмРЗ и изогенных ЭСК показал высокое сходство репрограммированных клеток, однако, были обнаружены и различия, которые требуют дальнейшего изучения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шутова, Мария Владимировна, 2011 год

1. Aasen T, Raya A, Barrero MJ, Garreta E, Consiglio A, Gonzalez F, et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratino- cytes. Nat Biotechnol 2008;26:1276-84.

2. Akao, Y., Nakagawa, Y., Naoe, T., 2006. let-7 microRNA functions as a potential growth, suppressor in human colon cancer cells. Biol Pharm Bull 29(5), 903-6.

3. Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T., Yamanaka, S., 2008. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 321(5889), 699-702.

4. Araki R, Jincho Y, Hoki Y, Nakamura M, Tamura C, Ando S, Kasama Y, Abe M., 2010. Conversion of ancestral fibroblasts to induced* pluripotent stem cells. Stem Cells. 2010 Feb;28(2):213-20.

5. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K., 2007. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129(4), 823-37.

6. Baudino TA, McKay C, Pendeville-Samain H, Nilsson JA, Maclean KH, White EL, Davis AC, Ihle JN, Cleveland JL. , 2002. c-Myc is essential for vasculogenesis and angiogenesis during development and tumor progression. Genes Dev. 2002 Oct l;16(19):2530-43.

7. Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J, et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 2006; 125:315-26

8. Bhutani, N., Brady, J.J., Damian, M., Sacco, A., Corbel, S.Y., Blau, H.M., 2010. Reprogramming towards pluripotency requires AID-dependent DNA demethylation. Nature 463(7284), 1042-7.

9. Bleiloch R, Venere M, Yen J, Ramalho-Santos M. Generation of induced pluripotent stem cells in the absence of drug selection. Cell Stem Cell 2007; 1:245- 7.

10. Boiani M, Schöler HR., 2005. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 Nov;6(ll):872-84. Review.

11. Borowiak M, Melton DA., 2009. How to make beta cells? Curr Opin Cell Biol. 2009 Dec;21(6):727-32. Epub 2009 Sep 24. Review.

12. Brambrink, T., Foreman, R., Wei stead, G.G., Lengner, C.J., Wernig, M., Suh, H., Jaenisch, R., 2008. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell 2(2), 151-9.

13. Brandenberger, R., Khrebtukova, I., Thies, R.S., Miura, T., Jingli, C., Puri, R., Vasicek, T., Lebkowski, J., Rao, M., 2004. Mpss profiling of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 4, 10 (2004).

14. Buchholz, D.E., Hikita, S.T., Rowland, T.J., Friedrich, A.M., Hinman, C.R., Johnson, L.V., Clegg, D.O., 2009. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27(10), 2427-34.

15. Carey, B.W., Markoulaki, S., Beard, C., Hanna, J., Jaeniseh, R., 2010. Single-gene transgenic mouse strains for reprogramming adult somatic cells. Nat Methods 7(1), 56-9.

16. Cedar, H., Bergman, Y., 2009. Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms. Nat Rev Genet. 10(5), 295-304.

17. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A., 2003. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 2003 May 30;113(5):643-55.

18. Chang TC, Yu D, Lee YS, Wentzel EA, Arking DE, West KM, Dang CV, Thomas-Tikhonenko A, Mendell JT. , 2007. Widespread microRNA repression by Myc contributes to tumorigenesis. Nat Genet. 2008 Jan;40(l):43-50. Epub 2007 Dec 9.

19. Chen, Y., Li, X., Eswarakumar, V.P., Seger, R., Lonai, P., 2000. Fibroblast growth factor (FGF) signaling through» PI 3-kinase and Akt/PKB is required for embryo id body differentiation. Oncogene 19(33), 3750-6.

20. Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, Zucker JP, Wang S, Morton CC, McMahon AP, Powers D, Melton DA, 2004. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 2004 Mar 25; 350(13): 1353-6.

21. Dang CV, O'Donnell KA, Zeller KI, Nguyen T, Osthus RC, Li F. , 2006. The c-Myc target gene network. Semin Cancer Biol. 2006 Aug;16(4):253-64. Epub 2006 Jul 25.

22. Dang, D. T., Pevsner, J., & Yang, V. W., 2000. The biology of the mammalian Kruppel-like family of transcription factors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 32, 1103-1121. doi: 10.1016/S1357-2725(00)00059-5.

23. Davis AC, Wims M, Spotts GD, Hann SR, Bradley A., 1993. A null c-myc mutation causes lethality before 10.5 days of gestation in homozygotes and reduced fertility in heterozygous female mice. Genes Dev. 1993 Apr;7(4):671-82.

24. De Felici, M., Farini, D., Dolci, S., 2009. In or out sternness: comparing growth factor signalling in mouse embryonic stem cells and primordial germ cells. Curr Stem Cell Res Ther. 4(2), 87-97.

25. Deaton AM, Bird A., 2011. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 2011 May 15;25(10):1010-22. Review.

26. Deb-Rinker, P., Ly, D., Jezierski, A., Sikorska, M., Walker, P.R., 2005. Sequential DNA methylation of the Nanog and Oct-4 upstream regions in human NT2 cells during neuronal differentiation. J Biol Chem. 280(8), 6257-60.

27. Doi, A., Park, I.H., Wen, B., Murakami, P., Aryee, M.J., Irizarry, R., Herb, B., Ladd-Acosta,

28. Duinsbergen, D., Eriksson, M., 't Hoen, P.A., Frisén, J., Mikkers, H., 2008. Induced pluripotency with endogenous and inducible genes. Exp Cell Res. 314(17), 3255-63.

29. Efroni, S., Duttagupta, R., Cheng, J., Dehghani, H., Hoeppner, D.J., Dash, C., Bazett-Jones,

30. D.P., Le Grice, S., McKay, R.D., Buetow, K.H., Gingeras, T.R., Misteli, T., Meshorer, E., 2008. Global transcription in pluripotent embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2(5), 437-47.

31. Eminli, S., Utikal, J., Arnold, K., Jaenisch, R., Hochedlinger, K., 2008. Reprogramming of neural progenitor cells into induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2 expression. Stem Cells 26(10), 2467-74.

32. Evans, M.J., Kaufman, M.H., 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292(5819), 154-6.

33. Evans, P.M., Zhang, W., Chen, X., Yang, J., Bhakat, K.K., Liu, C., 2007. Kruppel-like factor 4 is acetylated by p300 and regulates gene transcription via modulation of histone acetylation. J Biol Chem. 282(47), 33994-4002.

34. Ghosh, Z., Wilson, K.D., Wu, Y., Hu, S., Quertermous, T., Wu, J.C., 2010. Persistent donor cell gene expression among human induced pluripotent stem cells contributes to differences with human embryonic stem cells. PLoS One 5(2), e8975.

35. Gidekel, S., Bergman, Y., 2002. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element. J Biol Chem. 277(37), 34521-30.

36. Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J., 2007. Silencing of core transcription factors in human EC cells highlights the importance of autocrine FGF signaling for self-renewal. BMC Dev Biol. 7, 46.

37. Guenther, G., Arauz, A., 2010. Cerebral venous thrombosis: a diagnostic and treatment update.. Neurologia. [Epub ahead of print] Spanish.

38. Hajkova, P., Jeffries, S.J., Lee, C., Miller, N., Jackson, S.P., Surani, M.A., 2010. Genome-wide reprogramming in the mouse germ line entails the base excision repair pathway. Science 329(5987), 78-82.

39. Han J, Sachdev PS, Sidhu KS., 2010. A combined epigenetic and non-genetic approach for reprogramming human somatic cells. PLoS One. 2010 Aug 19;5(8):el2297.

40. Ho, L., Jothi, R., Rouan, J.L., Cui, K., Zhao, K., Crabtree, G.R., 2009a. An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is an essential component of the core pluripotency transcriptional network. Proc Natl Acad Sci USA. 106(13), 5187-91.

41. Hochedlinger K, Plath K., 2009. Epigenetic reprogramming and induced pluripotency. Development. 2009 Feb;136(4):509-23. Review.

42. Huangfu, D., Maehr, R., Guo, W., Eijkelenboom, A., Snitow, M., Chen, A.E., Melton, D.A., 2008a. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26(7), 795-7.

43. Huangfu, D., Osafune, K., Maehr, R., Guo, W., Eijkelenboom, A., Chen, S., Muhlestein, W., Melton, D.A., 2008b. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26(11), 1269-75.

44. Humphrey, R.K., Beattie, G.M., Lopez, A.D., Bucay, N., King, C.C., Firpo, M.T., RoseJohn, S., Hayek, A., 2004. Maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells is STAT3 independent. Stem Cells 22(4), 522-30.

45. Kaji, K., Norrby, K., Paca, A., Mileikovsky, M., Mohseni, P., Woltjen, K., 2009. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 458(7239), 771-5.

46. Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z:, Gao, S., 2009. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell 5(2), 135-8.

47. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S.H., 2008a. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell 132(6), 1049-61.

48. Kim, J.B., Zaehres, H., Araûzo-Bravo, M.J., Schôler, H.R., 2009. Generation of induced pluripotent stem cells from neural stem cells. Nat Protoc. 4(10), 1464-70.

49. Knoepfler, P.S., 2008. Why myc? An unexpected ingredient in the stem cell cocktail. Cell Stem Cell 2(1), 18-21.

50. Lagarkova MA, Volchkov PY, Lyakisheva AV, Philonenko ES, Kiselev SL, 2006. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. Cell Cycle; 5:416-20.

51. Lagarkova MA, Volchkov PY, Philonenko ES, Pfannkuchc K, Prokhorovich MA, Zabotina T, Kiselev SL, 2008a. CD30 is a marker of undifferentiated human embry- onic stem cells rather than a biomarker of transformed hESCs. Cell Cycle; 7:3610-2.

52. Lagarkova MA, Volchkov PY, Philonenko ES, Kiselev SL, 2008b. Efficient differentiation of hESCs into endothelial cells in vitro is secured by epigenetic changes. Cell Cycle; 7:2929-35.

53. Lebofsky R, Walter JC., 2007. New Myc-anisms for DNA replication and tumorigenesis? Cancer Cell. 2007 Aug; 12(2): 102-3.

54. Levenstein, M.E., Ludwig, T.E., Xu, R.H., Llanas, R.A., VanDenHeuvel-Kramer, K., Manning, D., Thomson, J.A., 2006. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells 24(3), 568-74.

55. Liang J, Wan M, Zhang Y, Gu P, Xin H, Jung SY, Qin J, Wong J, Cooney AJ, Liu D, Songyang Z., 2008. Nanog and Oct4 associate with unique transcriptional repression complexes in embryonic stem cells. Nat Cell Biol. 2008 Jun;10(6):731-9. Epub 2008 May 4.

56. Liu, L., Luo, G.Z., Yang, W., Zhao, X., Zheng, Q., Lv, Z., Li, W., Wu, H.J., Wang, L., Wang, X.J., Zhou, Q., 2010. Activation of the imprinted Dlkl-Dio3 region correlates with pluripotency levels of mouse stem cells. J Biol Chem. 285(25), 19483-90.

57. Loh, Y.H., Zhang, W., Chen, X., George, J., Ng, H.H., 2007. Jmjdla and Jmjd2c histone H3 Lys 9 demethylases regulate self-renewal in embryonic stem cells. Genes Dev. 21(20):2545-57.

58. Ludwig TE, Levenstein ME, Jones JM, Berggren WT, Mitchen ER, Frane JL, Crandall LJ, Daigh CA, Conard KR, Piekarczyk MS. Lianas RA, Thomson JA, 2006. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotcchnol. 24(2): 185-7.

59. Maherali N, Sridharan.R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Hochedlinger K, 2007. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution; Cell Stem Cell; 1:55-70.

60. Maherali, N., Ahfeldt, T., Rigamonti, A., Utikal, J:, Cowan, C., Hochedlinger, K., 2008. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 3(3), 340-5.

61. Marchetto, M.C., Yeo, G.W., Kainohana, O., Marsala, M., Gage, F.H., Muotri, A.R., 2009. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PLoS One 4(9), e7076.

62. Matoba, R., Niwa, H., Masui, S., Ohtsuka, S., Carter, M.G., Sharov, A.A., Ко, M.S., 2006. Dissecting Oct3/4-regulated gene networks in embryonic stem cells by expression profiling. PLoS One 1, e26.

63. Mattout, A., Meshorer, E., 2010. Chromatin plasticity and genome organization in pluripotent embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 22(3), 334-41.

64. McConnell BB, Ghaleb AM, Nandan MO, Yang VW, 2007. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 2007 Jun;29(6):549-57. Review. Erratum in: Bioessays. 2007 Sep;29(9):946.

65. Mikkola, M., Olsson, C., Palgi, J., Ustinov, J., Palomaki, Т., Horelli-Kuitunen, N., Knuutila, S., Lundin, K., Otonkoski, Т., Tuuri, Т., 2006. Distinct differentiation characteristics of individual human embryonic stem cell lines. BMC Dev Biol. 6, 40.

66. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A., 1998. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12(13), 2048-60.

67. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S., 2007. Generation of germline-competent induced pluripotent stem'cells.Nature 448(7151), 313-7.

68. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S., 2008. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 322(5903), 949-53.

69. Pan, G., Tian, S., Nie, J., Yang, C., Ruotti, V., Wei, H., Jonsdottir, G.A., Stewart, R., Thomson, J.A., 2007. Whole-genome analysis of histone H3 lysine 4 and lysine 27 methylation in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 1(3), 299-312.

70. Park, S.H., Park, S.H., Kook, M.C., Kim, E.Y., Park, S., Lim, J.H., 2004. Ultrastructure of human embryonic stem cells and spontaneous and retinoic acid-induced differentiating cells. Ultrastruct Pathol. 28(4), 229-38.

71. Patel JH, Loboda AP, Showe MK, Showe LC, McMahon SB., 2004. Analysis of genomic targets reveals complex functions of MYC. Nat Rev Cancer. 2004 Jul;4(7):562-8.

72. Pfannkuche K, Fatima A, Gupta MK, Dieterich R, Hescheler J., 2010. Initial colony morphology-based selection for iPS cells derived from adult fibroblasts is substantially improved by temporaryUTFl-based selection: PEoS One. 2010 Mar8;5(3):e9580.

73. Popp, C., Dean, W., Feng, S., Cokus, S.J., Andrews, S., Pellegrini, M., Jacobsen, S.E., Rcik, W., 2010. Genome-wide erasure of DNA methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID deficiency. Nature 463(7284), 1101-5.

74. Prigione A, Adjaye J., 2010. Modulation of mitochondrial biogenesis and bioenergetic metabolism upon in vitro and in vivo differentiation of human ES and iPS cells. Int J Dev Biol. 2010;54(11-12): 1729-41.

75. Reik, W., Dean, W., Walter, J., 2001. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science 293(5532), 1089-93.

76. Richards, M., Tan, S., Fong, C.Y., Biswas, A., Chan, W.K., Bongso, A., 2003. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 21, 546-56.

77. Richards, M., Tan, S.P., Tan, J.H., Chan, W.K., Bongso, A., 2004. The transcriptome profile of human embryonic stem cells as defined by SAGE Stem Cells 22, 51-64.

78. Santos, A.P., Abranches, R., Stoger, E., Beven, A., Viegas, W., Shaw, P.J., 2002. The architecture of interphase chromosomes and gene positioning are altered by changes in DNA methylation and histone acetylation. J Cell Sci. 115, 4597-605.

79. Scheper W, Copray S. , 2009. The molecular mechanism of induced pluripotency: a two-stage switch. Stem Cell Rev. 2009 Sep;5(3):204-23. Epub 2009 Jun 24.

80. Scholer, H.R., Hatzopoulos, A.K., Balling, R., Suzuki, N., Grass, P., 1989. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J. 8(9), 2543-50.

81. Shi, Y., Desponts, C., Do, J.T., Hahm, H.S., Scholer, H.R., Ding, S., 2008. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds. Cell Stem Cell 3(5), 568-74.

82. Shields JM, Christy RJ, Yang VW., 1996. Identification and characterization of a gene encoding a gut-enriched Kriippel-like factor expressed during growth arrest. J Biol Chem. 1996 Aug 16;271(33):20009-17.

83. Simonsson, S., Gurdon, J., 2004. DNA demethylation is necessary for the epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Nat Cell Biol. 6(10), 984-90;

84. Singhal, N., Graumann, J., Wu, G., Arauzo-Bravo, M.J., Han, D.W., Greber, B., Gentile, L., Mann, M., Scholer, H.R., 2010. Chromatin-Remodeling Components of the BAF Complex Facilitate Reprogramming. Cell 141(6), 943-55.

85. Smith, A.G., Hooper, M.L., 1987. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121(1), 1-9.

86. Smyth GK, 2004. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 2004;3:Article3. Epub 2004 Feb 12.

87. Sridharan, R., Tchieu, J., Mason, M.J., Yachechko, R., Kuoy, E., Horvath, S., Zhou, Q., Plath, K., 2009. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell 136(2), 364-77.

88. Stadtfcld, M., Apostolou, E., Akutsu, H., Fukuda, A., Follett, P., Natesan, S., Kono, T., Shioda, T., Hochcdlinger, K., 2010. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qFl in mouse induced pluripotent stem cells. Nature 465(7295), 175-81.

89. Stadtfcld, M., Brcnnand, K., Hochedlinger, K., 2008a. Reprogramming of pancreatic beta cells into induccd pluripotent stem cells. Curr Biol. 18(12), 890-4.

90. Stadtfcld, M., Hochedlinger, K., 2010. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24(20), 2239-63.

91. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K., 2008b. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 322(5903), 945-9.

92. Sumi, T., Fujimoto, Y., Nakatsuji, N., Suemori, H., 2004. STAT3 is dispensable for maintenance of self-renewal in nonhuman primate embryonic stem cells. Stem Cells 22(5), 861-72.

93. Szutorisz, H., Dillon, N., 2005. The epigenetic basis for embryonic stem cell pluripotency. Bioessays. 27(12), 1286-93.

94. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S, 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined fac- tors. Cell; 131:861-72.

95. Takahashi, K., Yamanaka, S., 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4), 663-76.

96. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M., 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282(5391), 1145-7.

97. Utikal, J., Maherali, N., Kulalert, W., Hochedlinger, K., 2009. Sox2 is dispensable for the reprogramming of melanocytes and melanoma cells into induced pluripotent stem cells. J Cell Sci. 122, 3502-10.

98. Vallier, L., Alexander, M., Pedersen; R.A., 2005. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J Cell Sci. 118, 4495509.

99. Viswanathan, S.R., Daley, G.Q., Gregory, R.I., 2008. Selective blockade of microRNA processing by Lin28. Science 320(5872), 97-100.

100. Wang, J., Rao, S., Chu, J., Shen, X., Levasseur, D.N., Theunissen, T.W., Orkin, S.H., 2006. A protein interaction network for pluripotency of embryonic stem cells. Nature 444(7117), 364-8.

101. Wei D, Kanai M, Huang S, Xie K., 2006. Emerging role of KLF4 in human gastrointestinal cancer. Carcinogenesis. 2006 Jan;27(l):23-31.Epub 2005 Oct 11. Review.

102. Wernig M, Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, 2007. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007; 448:318-24.

103. Wernig, M., Lengner, C.J., Hanna, J., Lodato, M.A., Steine, E., Foreman, R., Staerk, J., Markoulaki, S., Jaenisch, R., 2008. A drug-inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple somatic cell types. Nat Biotechnol. 26(8), 916-24.

104. Wilson, K.D., Venkatasubrahmanyam, S., Jia, F., Sun, N., Butte, A.J., Wu, J.C., 2009. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18(5), 749-58.

105. Wu, Q., Chen, X., Zhang, J., Loh, Y.H., Low, T.Y., Zhang, W., Zhang, W., Sze, S.K., Lim, B., Ng, H.H., 2006. Sall4 interacts with Nanog and co-occupies Nanog genomic sites in embryonic stem cells. J BioLChem. 281(34), 24090-4.

106. Xiao, L., Yuan, X., Sharkis, S.J., 2006. Activin A maintains self-renewal and regulates fibroblast growth factor, Wnt, and-bone morphogenic protein pathways in human embryonic stem cells. Stem Cells 24(6), 1476-86.

107. Xu, R.H., Peck, R.M., Li, D.S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J.A., 2005. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods 2(3), 185-90.

108. Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D., 2010; Reprogramming of human; fibroblasts to pluripotent stem cells using' mRNA of four transcription, factors. Biochem Biophys Res Commun. 394(1), 189-93.

109. Yang, J., Chai, L., Fowles, T.C., Alipio, Z., Xu, D., Fink, L.M., Ward, D.C., Ma, Y., 2008. Genome-wide analysis reveals Sall4 to be a major regulator of pluripotency in murine-embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 105(50), 19756-61.

110. Yeo S, Jeong S, Kim J, Han JS, Han YM, Kang YK. Characterization of DNA methylation change in stem cell marker genes during differentiation of human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun 2007; 359:536-42.

111. Ying, Q.L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A., 2003. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell 115(3), 281-92.

112. Yoshida Y, Yamanaka S., 2010. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 2010 Jul 6;122(l):80-7. Review.

113. Yuan H, Corbi N, Basilico C, Dailey L., 1995. Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3. Genes Dev. 1995 Nov l;9(21):2635-45.

114. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A., 2009. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat Methods 6(5), 363-9.

115. Zeng, X., Miura, T., Luo, Y., Bhattacharya, B., Condie, B., Chen, J., Ginis, I., Lyons, I., Mejido, J., Puri, R.K., Rao, M.S., Freed, W.J., 2004. Properties of pluripotent human embryonic stem cells BG01 and BG02. Stem Cells 22(3), 292-312.

116. Zhao XD, Han X, Chew JL, Liu J, Chiu KP, Choo A, et al. Whole-genome mapping of histone H3 Lys4 and 27 trimethylations reveals distinct genomic compartments in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2007; 1:286-98.

117. Zhou, W., Freed, C.R., 2009. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27(11), 2667-74.