Экспериментальное 3D моделирование репаративного остеогенеза и васкулогенеза на границе костной ткани и тканеинженерной конструкции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.16, кандидат биологических наук Мелихова, Варвара Сергеевна

• Мелихова, Варвара Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мелихова, Варвара Сергеевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Тканевая инженерия-описание дисциплины

1.2. Использование биореакторов

1.3. Эмбриогенез костной ткани

1.4. Морфологические характеристики кости

1.5. Остеокласты

1.6. Гены, контролирующие первичный и вторичный остеогенез

1.7. Остеогенез в культуре

1.8. Трансплантационный репаративный остеогенез

1.9. Тканевая инженерия кости

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Общая характеристика материала и структура исследования

2.2. Выделение и характеристика стромальных клеток из подкожной 49 жировой ткани крыс

2.3. Проточная цитометрия

2.4. Подготовка к исследованию биобезопасности клеток и 49 получение аутологичного биотрансплантата

2.5. Молекулярные исследования клеток СКЖТ

2.6. Гистологическое и микроскопическое исследования

2.7. Сканирующая электронная микроскопия

2.8. Статистический анализ

Глава 3 Результаты 59 3.1 Характеристика клеток СКЖТ

3.2 Характеристика ткане-инженерного биотрансплантата

3.3 Результаты молекулярного исследования экспрессии генов 65 остеогенеза в клетках СЮКТ

3.4 Исследование иммунологического ответа после трансплантации 66 ксеногенных, аллогенных и аутологичных клеток

3.5 Постабразивный остеогенез в зоне дефекта. Результаты исследования на 7 сутки после пересадки материала

3.6 Результаты исследования на 21 сутки исследования

3.7 Результаты исследования на 40 сутки исследования

3.8 Результаты исследования на 120 сутки исследования

3.9 Иммуногистохимическое окрашивание срезов биотрансплантата

3.10 Сравнение количества сосудов в экспериментальной и 91 контрольной группах

Глава 4. Обсуждение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное 3D моделирование репаративного остеогенеза и васкулогенеза на границе костной ткани и тканеинженерной конструкции»

Травмы, хирургические вмешательства при доброкачественных и злокачественных опухолях на челюстях заставляют клиницистов и исследователей искать новые подходы к восстановлению пораженной, травмированной или утерянной костной ткани. В ортопедической и стоматологической практике широко применяются остеопластические и остеоиндуктивные материалы различного происхождения. Так, гидроксиапатит был впервые применен в 1978 году, а с конца 80-х годов больше половины статей в специализированном журнале «Materials in Medicine», а также значительное количество исследовательских работ в наиболее престижных ортопедических и стоматологических журналах были посвящены исследованию и применению этого и других остеопластических материалов [19, 57, 72, 127]. В дальнейшем спектр используемых материалов стал значительно расширяться. Несмотря на то, что костная ткань обладает высокой восстановительной способностью, в ряде случаев репаративный процесс в костной ткани (даже при использовании различных остеопластических и остеоиндуктивных материалов) не заканчивается восстановлением ее структуры и функции [20, 21]. Подобные случаи, обусловленные разрушением или недостатком клеток-предшественников костной ткани, можно охарактеризовать как "остеогенную недостаточность" [3, 21, 22, 23]. В связи с этим, на протяжении последних десяти лет в различных странах исследователями и клиницистами ведется поиск новых материалов, а также методик (в том числе и с использованием клеток-предшественников костной ткани) для восстановления не только структуры костной ткани, но и ее функций [38].

Актуальность

Восстановление целостности кости является актуальной проблемой современной травматологии, ортопедии и стоматологии, а также фундаментальных медико-биологических дисциплин. В настоящее время активно ведется поиск новых клеточных технологий, которые позволяли бы ускорить образование костной ткани, как на периферии костного дефекта, так и внутри имплантата.

Как известно, аутологичные и аллогенные костные трансплантаты характеризуются невысокой выживаемостью in situ, плохо взаимодействуют с костью реципиента из-за влияния на нее патофизиологических процессов и подвергаются быстрой резорбции [21-23]. Также часто происходит полная перестройка пересаженной костной ткани, а процесс получения кости прежней прочности длительный и занимает несколько лет. Кроме того, полноценное восстановление костной ткани возможно только при перемещении костного трансплантата на сосудистой «ножке» или после предварительной его пересадки на отдаленные участки тела с включением в кровоток [132, 133]. Такие операции могут быть выполнены с помощью микрохирургической техники в высокоспециализированных стационарах, которые не могут обеспечить потребностей в возрастающем количестве остеопластических операций. По этим причинам в последнее время органные костные трансплантаты признаны неперспективным видом борьбы с дефицитом костной ткани.

В последние годы на первый план в фундаментальной и клинической стоматологии и ортопедии выходят клеточные трансплантаты на основе стволовых и прогениторных клеток. Изучение клеточной биологии костной ткани в культуре, открытие ростовых факторов, контролирующих патоморфологические изменения в поврежденной костной ткани, привело к бурному прогрессу знаний и технологий по направленному остеогенезу, разработке новых методов лабораторного выращивания костной ткани in vitro на биологически активных, не имеющих иммуногенных свойств, заменителях костной ткани, способных к биодеградации и обладающих остеокондуктивными свойствами [51]. Клиницистами получены первые б результаты, которые свидетельствуют о перспективности лечения дефектов костей различных локализаций и доступности подобных методик, и их приемлемой стоимости [109]. Однако дальнейшее развитие новых клеточных технологий в области стоматологии, оперативной травматологии и ортопедии сдерживается тем, что в подобных работах не прослежены отдаленные результаты лечения, недостаточно хорошо освящена динамика процесса, а исследования не структурированы по срокам наблюдения; также часто не описана функциональная активность восстановленной костной ткани, что затрудняет оценку адекватности выбора методов лечения и его эффективности. Как известно, лимиты естественной репарации костной ткани определяются патофизиологическими процессами, приводящими к снижению активности и численности остеобластов, что сопровождается снижением уровня щелочной фосфотазы, остеокальцина, коллагена 1 типа и других маркерных белков остеогенеза, а также дефицитом ростовых факторов, сигнальных молекул и цитокинов, регулирующих процесс репарации. Исследовательские работы с глубоким подходом в этой области и качественным гистологическим описанием патологических процессов единичны [2]. Изучение вопросов данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогенеза, изучить современные способы его оптимизации, что позволит разработать новые методы реконструкции костной ткани in vitro с участием стволовых клеток, остеоиндуктивных и остеопластических высокопористых материалов и факторов, ускоряющих региональную и системную репарацию кости.

Регенерация кости - сложный многоступенчатый процесс, составляющими которого являются миграция, пролиферация, дифференцировка различных клеточных популяций мезенхимального происхождения. Регенерация костной ткани и развитие кости в эмбриогенезе протекают с участием незрелых клеток мезенхимы, которые сохраняются в так называемых стволовых нишах периоста, эндоста и костного мозга [31, 78, 137]. Теоретические основы использования остеогенных и хондрогенных клеточных элементов в целях костной пластики и лечения повреждений тканей хряща закладывались основоположниками классической гистологии. Известный гистолог A.A. Максимов, еще в двадцатые годы предложил теорию о «мезенхимальном резерве», согласно которому, все «механоциты» (фибробласты, остеобласты, хондроциты и др.) и клетки крови во взрослом организме происходят от слабо дифференцированных полипотентных предшественников [89]. Через некоторое время в процессе исследований, в экспериментах с культурами стромы костного мозга взрослых доноров были выявлены клетки, которые очевидно являлись предшественниками «механоцитов», однако при этом они не были идентичны стволовым клеткам крови по своим свойствам [5].

Исследований патологов, гистологов и морфологов, касающихся целостного гистологического и гистоморфометрического анализа репаративных процессов в костной ране при использовании клеточных биотехнологий в научной литературе недостаточно. Исследовательские работы с глубоким подходом в этой области и качественным гистологическим описанием патологических процессов единичны [2]. Кроме того, одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для культуры клеток, что непосредственно влияет на судьбу клеточной культуры, привнесенной в дефект кости, и исход процесса регенерации кости.

Исследование данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогенеза, изучить современные способы его оптимизации, что может быть использовано в теоретической гистологии и клинической практике. С учетом приведенных положений разрабатываемая проблема является актуальной и представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что и определяет тему данного экспериментального исследования.

Цель исследования

Целью данного исследования является изучение влияния биотрансплантата, состоящего из рЗ-фосфата кальция (ChronOs™) и стромальных клеток подкожной жировой ткани на de novo остеогенез после частичной остеоабразии наружной поверхности нижней челюсти у крыс

Задачи

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать условия получения культуры стромальных клеток подкожной жировой ткани и охарактеризовать ее.

2. Продемонстрировать биобезопасность применения стромальных клеток подкожной жировой ткани при подкожном введении (ксеногенной, аллогенной и аутологичной трансплантациях на различных сроках).

3. Создать и охарактеризовать 3D тканеинженерный биотрансплантат для моделирования репаративного остеогенеза in vivo.

4. Разработать способ получения тканеинженерной конструкции, пригодной для имплантации с целью эффективного и безопасного репаративного остеогенеза.

5. Разработать модель повреждения костной ткани в виде остеоабразии на нижней челюсти крыс.

6. Изучить влияние матрицы с клетками и без них на процессы формирования кости de novo на разных сроках исследования (в том числе и длительных).

Научная новизна

Модифицирован и оптимизирован способ выделения и культивирования стромальных клеток подкожной жировой ткани, показана биобезопасность полученных клеток. Охарактеризован остеогенный потенциал культуры.

Разработана оригинальная технология заселения клеток на выбранную матрицу, доказано выживанием клеток на матрице, показана высокая эффективность прикрепления и пролиферации клеток на матрице. Разработана доклиническая модель исследования костного трансплантата, моделированного in vitro, на животных (in vivo).

Изучен и сопоставлен регенерационный остеогенез без внесения и с внесением в область поверхностного дефекта нижней челюсти стромальных клеток подкожной жировой ткани (СКЖТ), показано их влияние на образование сосудистой сети в области имплантата и вокруг нее.

С помощью гистологического анализа выявлены закономерные этапы остеогенеза, происходящие на границе биотрансплантата и нативной костной ткани нижней челюсти после операции остеобаразии. На разработанной оригинальной модели репаративного остеогенеза у крыс с помощью серийного гистологического анализа изучены особенности действия клеточного трансплантата по сравнению с бесклеточным матриксом. Выявлена и изучена ангиогенная активность клеточного трансплантата. Установлено, что на длительных сроках наблюдения de novo остеогенез идет только в условиях контакта с нативной костью в сравнении с подкожной имплантацией, тогда как васкулогенез происходит в обоих случаях.

Проведенная работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые произведена оценка динамики репаративного остеогенеза и васкулогенеза in vivo.

Теоретическая и практическая значимость

Разработанная технология выделения и культивирования СКЖТ и их последующее заселение на подобранный пористый носитель позволила создать биобезопасный и биодеградируемый тканеинженерный имплантат.

Предложена адекватная экспериментальная модель повреждения костной ткани на животных (операция частичной остеоабразии).

Работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проводится оценка стимуляции и динамики регенерации костной ткани трансплантации тканеинженерного трансплантата, полученного in vitro, путем заселения СКЖТ на пористый носитель ChronOs™. Материалы диссертации могут служить основой для дальнейшей научно-практической работы в данной области и разработки новых биомедицинских технологий. Результаты работы использованы компанией Synthes (Швейцария) для подтверждения биобезопасности и перспектив использования производимого материала в области регенерации костной ткани.

Разработанная технология выделения и культивирования клеток СКЖТ, а также их заселения на матрицу позволяет совершенствовать и внедрять в клиническую практику методы улучшения течения репаративной регенерации костной ткани (при переломах, дефектах костей и др.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная технология пересадки тканеинженерного биотрансплантата на основе остеопластического материала ChronOs™ и клеток СКЖТ в область дефекта плоской кости ускоряет процесс формирования кости de novo и обеспечивает формирование функционально активной костной ткани.

2. Присутствие в трансплантате культуры клеток СКЖТ приводит к сокращению сроков образования костной ткани de novo в основном за счет улучшения формирования сосудистого русла и кровоснабжения в пересаженном биотрансплантате на ранних сроках.

3. Пересадка тканеинженерного биотрансплантата, моделированного in vitro на основе ChronOs и клеток СКЖТ является наиболее перспективной стратегией для последующего клинического использования, по сравнению с пересадкой носителя без клеточного материала.

Реализация работы

Результаты работы служат теоретическим обоснованием для дальнейшего развития клеточных биотехнологий и их внедрения в травматологическую и стоматологическую практику. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. На основе результатов диссертации планируется проведение ограниченных клинических испытаний в стоматологической практике.

Апробация работы Основные положения работы доложены на:

1. MGH-HKU-Nature China Forum: Molecular Medicine and Biopharma Opportunities. "Comparison of different stem cell sources and biomimetic scaffolds for bone tissue engineering." (2007, Hong Kong);

2. Международной конференции «Osstem Meeting 2007 Early and Esthetic» (2007, Москва);

3. V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (2008, Москва);

4. Российской конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (2008, Москва)

Структура и объем работы Материалы диссертации представлены на 112 страницах. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методик исследования, результатов исследований, заключения, выводов, и списка литературы. Работа содержит 34 рисунка и 9 таблиц. Список литературы включает 143 источника, из них 5 отечественных и 138 иностранных авторов.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Мелихова, Варвара Сергеевна

Выводы

1. Получены и охарактеризованы стромальные клетки подкожной жировой ткани. Показана биобезопасность применения стромальных клеток подкожной жировой ткани после подкожного введения (ксеногенной, аллогенной и аутологичной трансплантациях на различных сроках).

2. Разработан метод создания тканеинженерного биотрансплантата, на основе остеопластического материала Chronos™ и клеток СКЖТ, показана дифференцировка клеток СКЖТ в остеогенном направлении, при культивировании в составе данного биотрансплантата in vitro.

3. Разработана модель повреждения костной ткани в виде остеоабразии на нижней челюсти крыс; пригодная для оценки репаративного влияния тканеинженерного биотрансплантата на de novo остеогенез.

4. С использованием разработанной модели, показана эффективность пересадки биотрансплантата (клетки СКЖТ на матрице Chronos™) по сравнению с пересадкой матрицы без внесения клеток в процессе репаративного остеогенеза.

5. Показано, что de novo формирование функционально активной костной ткани при использовании биотрансплантата происходит во многом за счет достоверного увеличения количества сосудов в биотрансплантате.

Заключение

В связи с развитием исследований в областях стволовых клеток и тканевой инженерии нерешенными остаются проблемы пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников на матрице-носителе, а также функциональные характеристики полученной ткани в отсутствие необходимого кровоснабжения.

В соответствии с поставленной целью были проведены клеточные, молекулярные и экспериментально-гистологические исследования, которые позволили охарактеризовать постабразивную регенерацию костной ткани после трансплантации тканеинженерного имплантата, выявить его воздействие на костную ткань нижней челюсти, представить перспективы использования данного метода в клинической практике.

В результате первого этапа исследования разработан и модифицирован протокол получения культуры клеток СКЖТ крыс и человека. В экспериментах по биобезопасности при подкожной инъекции аллогенные и ксеногенные клетки либо поглощались макрофагами, либо были заключены в соединительнотканную капсулу. Поэтому все дальнейшие эксперименты проводили только с аутологичными культурами клеток.

При помощи световой и сканирующей электронной микроскопии выделенные клетки СКЖТ охарактеризованы морфологически: это фибробласты, эндотелиоциты, незрелые клетки-предшественники, гладкомышечные клетки, перициты. Доминирующим морфо-фенотипом в такой культуре являются мелкие полигональные фибробластоподобные клетки с мелким ядром, которые по мере пролиферации и дифференцировки культуры изменяют свою форму от полигональной к веретеновидной. Функциональная активность клеток продемонстрирована при помощи молекулярных методов. Процесс заселения клеток на носитель служит индуктором дифференцировки клеток СКЖТ в остеогенном направлении, что было доказано выявлением экспрессии специфически геном остеогенеза.

На основе полученных данных была разработана экспериментальная доклиническая модель костной ЗD композиции после остеоабразии на нижней челюсти и изучено влияние пересаженного имплантата на регенеративный остеогистогенез. Эксперименты выполнены на 57 взрослых крысах.

Полученные данные, свидетельствуют о выраженном положительном влиянии клеточного компонента трансплантата на репаративный остеогенез после абразии костной ткани, а предложенная модель (сочетание операции по остеоабразии и использование матрицы, как с клетками так и без них) позволяет рассматривать перспективы клинического применения современной клеточной биотехнологии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мелихова, Варвара Сергеевна, 2009 год

1. Быков B.JI. Частная гистология человека: Крат, обзорный курс. СПб.: Сотис, 1999.-300 с.

2. Деев Р. А. Посттравматическая регенерация костной ткани при трансплантации культуры косномозговых стромальных клеток: Дис. канд. мед. наук. СПб., 2006.

3. Дулаев А.К., Гололобов В.Г., Деев Р.В., Иванов Д.Е., Николаенко Н.С., ЦупкинаН.С., Пинаев Г.П. Остеогенные клетки и их использование в травматологии. // Медицинский академический журнал. 2003. Т.З. №3. -С.59-66.

4. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: БЭБиМ, 1998.-250 с.

5. Фриденштейн А. Я, Лалыкина К. С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки предшественники. М,: Медицина, 1973.

6. About I., Bottero М J., de Denato P., Camps J., Franquin J.C., Mitsiadis T.A. Human dentin production in vitro. Exp Cell Res. 2000. V.258. - P. 33-41.

7. Agrawal C.M., Athanasiou K.A.; Heckman, J.D. Biodegradable PLA/PGA polymers for tissue engineering in orthopaedica. // Material Science Forum. -1997. 250.-P. 115-128

8. Ahmed T.A., Dare E.V., Hincke M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. // Tissue Eng Part В Rev. 2008. 14(2). - P. 199215.

9. Alhadlaq A., Mao JJ. Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. // Stem Cells Dev. 2004. 13. -P.436-448.

10. Arkudas A. Beier J., Heidner K. Axial prevascularization of porous matrices by an arteriovenous loop promotes survival and differentiation of transplanted autologous osteoblasts / / Tissue Eng. 2007. V. 13. № 7. - P. 1549-1560.

11. Atala A. Tissue engineering, stem cells and cloning: current concepts and changing trends. // Expert Opin Biol Ther. 2005.5. - P.879-892.

12. Attawia M.A., et al. Cytotoxocity testing of poly(anhydride) for orthopaedic applications. // J Biomed Mater Res. 1995. 29. - P.1233-1240

13. Aubin J.E., Liu F. The osteoblast lineage. // In: Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA., editor. Principles of Bone Biology. San Diego , Academic Press. - 1996.-P. 51-67.

14. Bancroft G.N., Sikavitsas V. I., Mikos A.G. Technical Note: Design of a Flow Perfusion Bioreactor System for Bone Tissue-Engineering Applications. // Tissue Eng. 2003. - P. 549-554.

15. Barlow AJ, Francis-West PH. Ectopic application of recombinant BMP-2 and BMP-4 can change patterning of developing chick facial primordia. // Development. 1997. 124(2).-P.391-398.

16. Behravesh E., Yasko A.W., Engel P.S., Mikos A.G. Synthetic biodegradable polymers for orthopaedic applications. // Clin Orthop. — 1999. 367S. — P.l 18185

17. Blair H.C. How the osteoclast degrades bone. // Bioassays. 1998. 20(10). -P.837-846.

18. Bohr H., Schaadt O. Bone mineral content of the femoral neck and shaft: Relation between cortical and trabecular bone. // Calcified Tissue International. 1985. 37(4). - P.340-344.

19. Bostman O., Partió E., Hirvensalo E., Rokkanen P. Foreign-body reactions to polyglycolide screws. // Acta Orthop Scand. 1992. 63. - P. 173-176.

20. Bostman O., Paivárinta U., Partió E., Vasenius J., Manninen M., Rokkanen P. Degradation and tissue replacement of an absorbable polyglycolide screw in the fixation of rabbit osteomies. // J Bone Joint Surg. 1992. 74A. - P.1021-1031.

21. Bostman O.M. Intense granulomatous inflammatory lesions associated with absórbale internal fixation devices made of polyglycolide in ankle fractures. // Clin Orthop. 1992. 278. - P.178-199.

22. Bostman O.M. Osteolytic changes accompanying degradation of absorbable fracture fixation implants. // J Bone Joint Surg. 1991. 73B. P.679-682.

23. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. // Science. — 2000. 290(5497).-P. 1775-1779.

24. Bruder S.P., Kraus K.H., Goldberg V.M., Kadiyala S. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. // J Bone Joint Surg Am. 1998. 80(7). P. 985-996.

25. Bruder S.P., Kurth A.A., Shea M., Hayes W.C., Jaiswal N., Kadiyala S. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. // J Orthop Res. 1998b. 16(2). - P. 155-162.

26. Bruens M.L., Pieterman H., de Wijn J.R., Vaandrager J.M. Porous polymethylmethacrylate as bone substitute in the craniofacial area. // J Craniofac Surg. 2003. 14. - P.63-68.

27. Burg K.J., Porter S., Kellam J.F. Biomaterials development for bone tissue engineering. //Biomaterials . -2000. 21. -P.2347-2359.

28. Buttery L.D., Bourne S., Xynos J.D., Wood H., Hughes F.J., Hughes S.P.,

29. Episkopou V., Polak J.M. Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. // Tissue Eng. 2001. 7(1). -P.89-99.

30. Calandrelli L., Calarco A., Laurienzo P., Malinconico M., Petillo O., Peluso G. Compatibilized polymer blends based on PDLLA and PCL for application in bioartificial liver. // Biomacromolecules. 2008. 9(6). -p.1527-1534.

31. Caplan A.I. Osteogenesis imperfecta, rehabilitation medicine, fundamental research and mesenchymal stem cells. // Connect. Tissue Res. 1995. V.31. №4. - P.S9-14.

32. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. // J Orthop Res. 1991. 9. - P.641-650.

33. Caplan A.I., Elyaderani M., Mochizuki Y., Wakitani S., Goldberg V.M. Principes of cartilage repair and regeneration. // Clin Orthop 1997. V.342. -NP.254—269.

34. Connolly J.F. Injectable bone marrow preparations to stimulate osteogenic repair. // Clin Orthop Relat Res. 1995. V.313. - P.8-18.

35. Cowan C.M., Shi Y.Y., Aalami O.O., Chou Y.F., Mari C., Thomas R. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. // Nat Biotechnol. 2004. 22. - P.560-567.

36. Cserjesi P., Brown D., Ligon K.L., Lyons G.E., Copeland N.G., Gilbert D.J., Jenkins N.A., Olson E.N. Scleraxis: a basic helix-loop-helix protein that prefigures skeletal formation during mouse embryogenesis. // Development. -1995. 121(4).-P.1099-1110.

37. De Kok I J., Chang S.S., Moriarty J.D., Cooper L.F. A retrospective analysis of peri-implant tissue responses at immediate load/provisionalized microthreaded implants. // Int J Oral Maxillofac Implants. 2006.21(3). -P.405-412.

38. De Kok I.J., Peter S J., Archambault M., van den Bos C., Kadiyala S., Aukhil I., Cooper L.F. Investigation of allogeneic mesenchymal stem cell-based alveolar bone formation: preliminary findings. // Clin Oral Implants Res. -2003.14(4)-P.481-489.

39. Delezoide A.L., Benoist-Lasselin C., Legeai-Mallet L., Le Merrer M., Munnich A., Vekemans M., Bonaventure J. Spatio-temporal expression of FGFR 1, 2 and 3 genes during human embryo-fetal ossification. // Mech Dev. 1998. 77(1).-P. 19-30.

40. DeLise A.M., Tuan R.S. Alterations in the spatiotemporal expression pattern and function of N-cadherin inhibit cellular condensation and chondrogenesis of limb mesenchymal cells in vitro. // J Cell Biochem. 2002. 87(3). - P.342-359.

41. Detamore M.S., Athanasiou K. A. Use of a Rotating Bioreactor toward Tissue Engineering the Temporomandibular Joint Disc. // Tissue Eng. — 2005. -P.1188-1197.

42. Dhuriati R., Liu X., Gay C.V., Mastro A.M., Vogler E. A. Extended-Term Culture of Bone Cells in a Compartmentalized Bioreactor. // Tissue Eng. — 2006. 12. P.3045-3054.

43. Ducy P., Schinke T., Karsenty G. The osteoblast: a sophisticated fibroblast under central surveillance. // Science. 2000. 289(5484). - P.1501-1504.

44. Dudas J.R., Marra K.G., Cooper G.M., Penascino V.M., Mooney M.P., Jiang S., Rubin J.P., Losee J.E. The osteogenic potential of adipose-derived stem cells for the repair of rabbit calvarial defects. // Ann Plast Surg. 2006. 56(5). -P.543-548.

45. Fialkov J.A., Holy C.E., Shoichet M.S., Davies J.E. In vivo bone engineering in a rabbit femur. // J Craniofac Surg. 2003. 14(3). - P.324-332.

46. Fitzpatrick L. A., Turner R. T., Ritman E. R. Endochondral Bone Formation in the Heart: A PossibleMechanism of Coronary Calcification. // Endocrinology. -2003. 144(6). -P.2214-2219

47. Folkman, J. Hochberg M. Self-regulation of growth in three dimensions. II J. Exp. Med. 1973. Vol. 138. - P.745-753.

48. Gabbay J.S., Heller J.B., Mitchell S.A., Zuk P.A., Spoon D.B., Wasson K.L., Jarrahy R., Benhaim P., Bradley J.P. Osteogenic potentiation of human adipose-derived stem cells in a 3-dimensional matrix. // Ann Plast Surg. -2006. 57(1). P.89-93.

49. Gazdag A.R., Lane J.M., Glaser D., Forster R.A. Alternatives to autogenous bone graft: efficacy and indications. // J Am Acad Orthop Surg. 1995. 3(1). -P. 1-8

50. Giannoudis P.V., Al-Lami M.K., Tzioupis C., Zavras D., Grotz M.R.Tricortical bone graft for primary reconstruction of comminuted distal humerus fractures. // J Orthop Trauma. -2005. 19(10).- P. 741-3

51. Gilbert S. F. Developmental Biology. Sunderland (MA):Sinauer Associates, Inc., 2000.

52. Grayson W.L., Bhumiratana S., Cannizzaro C., Chao P.H., Lennon D.P., Caplan A.I., Vunjak-Novakovic G. Effects of Initial Seeding Density and Fluid Perfusion Rate on Formation of Tissue-Engineered Bone. // Tissue Eng Part A.-2008. 14(11).-P.1809-1820.

53. Griffiths M., Ojeh N., Livingstone R., Price R., Navsaria H. Survival of Apligraf in acute human wounds. // Tissue Eng. 2004.10(7-8). - P.l 1801195.

54. Gronthos S., Mankani M., Brahim J., Robey P.G., Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97. - P.13625-13630.

55. Grynpas M. D., Bonar L. C., Glimcher M. J. X-ray diffraction radial distribution function studies on bone mineral and synthetic calcium phosphates. //Journal of Materials Science. 1984. 19:(3).-P.723-736.

56. Handa K., Solchaga L.S., Caplan A. I., et al. BMP-2 induction and TGF-beta 1 modulation of rat periosteal cell chondrogenesis. // J Cell Biochem. 2001. 81. -P.284-94.

57. Hoerstrup S. P. ,Sodian R., Sperling J.S., Vacanti J.P., Mayer Jr. J. E. New Pulsatile Bioreactor for In Vitro Formation of Tissue Engineered Heart Valves. // Tissue Eng. 2000. 2. - P.75-79.

58. Hogan B.L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. // Genes Dev. 1996. 10(13). -P.1580-1594.

59. Hong, L., Mao J.J. Tissue-engineered Rabbit Cranial Suture from Autologous Fibroblasts and BMP2 // J. Dent. Res. 2004. 83(10). - P. 751-756.

60. Horton W.A. The biology of bone growth. // Growth Genet. Horm. 1990. 6. — P.21-23.

61. Huang C.Y., Hagar K.L., Frost L.E., Sun Y., Cheung H.S. Effects of cyclic compressive loading on chondrogenesis of rabbit bone-marrow derived mesenchymal stem cells. // Stem Cells. 2004b. 22(3). -P.313-323.

62. Huang C.Y., Reuben P.M., D'Ippolito G., Schiller P.C., Cheung H.S. Chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in agarose culture. // Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2004. 278(1). -P.428-436.

63. Jen A.C., Peter S.J., Mikos A.G. Preparation and use of porous poly(a-hydroxyester scaffolds for bone tissue engineering. // In: Tissue Engineering Methods and Protocols. Morhgan JR, Yarmush ML eds. Totowa. Humana Press, 1999.

64. Jeong S.I., Kim S.H., Kim Y.H., Jung Y., Kwon J.H., Kim B.S., Lee Y.M. Manufacture of elastic biodegradable PLCL scaffolds for mechano-active vascular tissue engineering. // J Biomater Sci Polym Ed. — 2004. 15(5). — P.645-660.

65. Jilka R.L., Weinstein R.S., Bellido T., Roberson P., Parfitt A.M., Manolagas S.C. Increased bone formation by prevention of osteoblast apoptosis with parathyroid hormone. // J Clin Invest. 1999. 104(4). - P.439-446.

66. Jilka R.L., Weinstein R.S., Parfitt A.M., Manolagas S.C. Quantifying osteoblast and osteocyte apoptosis: challenges and rewards. // J Bone Miner Res. -2007. 22(10). P.1492-1501.

67. Khouri, R.K., Upton J., Shaw W.W. Préfabrication of composite free flaps through staged microvascular transfer : an experimental and clinical study // Plast Reconstr Surg. -1991. 87. P. 108-115.

68. Kim S.H., Kwon J.H., Chung M.S., Chung E., Jung Y., Kim S.H., Kim Y.H. Fabrication of a new tubular fibrous PLCL scaffold for vascular tissue engineering. //J Biomater Sci Polym Ed. 2006. 17(12).-p.1359-1374.

69. Kronenthal R.L. Biodegradable polymers in medicine and surgery. // Polymer Sci Technol. 1975. 8.-P. 119-137

70. Laurencin C.T., El-Amin S.F., Ibim S.E., Willoughby D.A., Attawia M., Allcock H.R., Ambrosio A.A. A highly porous 3-dimentional polyphophazene polymer matrix for skeletal tissue regeneration. // J Biomed Mater Res. 1996. 30. - P.133-138.

71. Lieberman J.R., Daluiski A., Einhorn T.A. The role of growth factors in the repair of bone. Biology and clinical applications. // Bone and Joint Surgery. -2002. 84-A(6). P.1032-1044.

72. Lisignoli G., Zini N., Remiddi G., et al. Basiv fibroblast growth factorenhances in vitro mineralization of rat bone marrow stromal cells grown on non-woven hyaluronic acid based polymer scaffold. // Biomaterials. 2001. 22. -P.2095-2105.

73. Liu F., Aubin J.E., Malaval L. Expression of leukemia inhibitory factor (LIF)/interleukin-6 family cytokines and receptors during in vitro osteogenesis: differential regulation by dexamethasone and LIF. // Bone. -2002. 31(1).-P.212-219.

74. Lokmic, Z. Stillaert F., Morrison W. Thompson E.W., Mitchell G.M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. // FASEB J. 2007. 21(2). - P. 511-522.

75. Long F., Zhang X.M., Karp S., Yang Y., McMahon A.P. Genetic manipulation of hedgehog signaling in the endochondral skeleton reveals a direct role in the regulation of chondrocyte proliferation. // Development. 2001. 128(24). -P.5099-5108.

76. Long J.R., Liu P.Y., Lu Y., Xiong D.H., Zhao L.J., Zhang Y.Y., Elze L., Recker R.R., Deng H.W. Association between COL1A1 gene polymorphisms and bone size in Caucasians. // Eur J Hum Genet. 2004. 12(5). - P.383-388.

77. Mao J.J. Stem-cell-driven regeneration of synovial joints. // Biol Cell. 2005. 97. -P.289-301.

78. Marion N.W., Mao J.J. Bone Reconstruction with Bone Marrow Stromal Cells. /Editors-In-Chief J.N. Abelson, M.I. Simon. Founding. Editors S.P. Colowick, N.O. Kaplan // Methods In Enzymology. 2006. - Vol. 420. -P.362-380.

79. Maximow A. A, Bindegewebe und blutbildendes Gewcbe, Handb. d. mickr. / Von W. v, M, Jlendorf // Anat. d. Menschen. Herausgegeb. 1927. - Bd. 2. T. I. - S. 232-560.

80. McLarren K.W., Lo R., Grbavec D., Thirunavukkarasu K., Karsenty G.,

81. Stifani S. The mammalian basic helix loop helix protein HES-1 binds to and modulates the transactivating function of the runt-related factor Cbfal. // J Biol Chem. 2000. 275(1). - P.530-538.

82. Mirams M., Tatarczuch L., Ahmed Y.A., Pagel C.N., Jeffcott L.B., Davies H.M., Mackie E.J. Altered gene expression in early osteochondrosis lesions. // J Orthop Res. 2008. Oct 17. Epub ahead of print.

83. Morava E., Korteszi J., Weisenbach J., Caliebe A., Mundlos S., Mehes K. Cleidocranial dysplasia with decreased bone density and biochemical findings of hypophosphatasia. // Eur J Pediatr. 2002. 161(11). - P.619-622.

84. Murray P.E., About I., Franquin J.C., Remusat M., Smith A.J. Restorative pulpal and repair responses. // J Am Dent Assoc. -2001. 132. P.482-491.

85. Nakashima K., Zhou X., Kunkel G., Zhang Z., Deng J.M., Behringer R.R., de Crombrugghe B. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. // Cell. 2002. 108(1).-P.17-29.

86. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S.M., Li B., Pickel J., McKay R., Nadal-Ginard B., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. //Nature. 2001. 410. -P.701-705.

87. Oyajobi B.O., Lomri A., Hott M., Marie P.J. Isolation and characterization of human clonogenic osteoblast progenitors immunoselected from fetal bone marrow stroma using STRO-1 monoclonal antibody. // J Bone Miner Res. -1999. 14(3). -P.351-361.

88. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca

89. J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science. 1999. 284. -P.143-147.

90. Poulsom R., Alison M.R., Cook T., Jeffery R., Ryan E., Forbes S.J., Hunt T., Wyles S., Wright N.A. Bone marrow stem cells contribute to healing of the kidney. // J Am Soc Nephrol. 2003. 14. - P.48S-54S.

91. Rah D.K. Art of replacing craniofacial bone defects. //Yonsei Med J . -2000. 41. -P.756-765.

92. Rodrigo I., Hill R.E., Balling R., Mbnsterberg A., Imai K. Paxl and Pax9 activate Bapxl to induce chondrogenic differentiation in the sclerotome. // Development. 2003. 130(3). - P.473-482.

93. Sage E.H. Purification of SPARC/osteonectin. // Curr Protoc Cell Biol. 2003. Chapter 10:Unit 10.

94. Sasano Y., Zhu J.X., Kamakura S., Kusunoki S., Mizoguchi I., Kagayama M. Expression of major bone extracellular matrix proteins during embryonic osteogenesis in rat mandibles. // Anat Embryol (Berl). -2000. 202(1). P.31-37.

95. Schaefer D.J., Klemt C., Zhang X.H., Stark G.B. Tissue engineering with mesenchymal stem cells for cartilage and bone regeneration // Chirurg. 2000. 79(9).-P.1001-1008.

96. Shi S., Bartold P., Miura M., Seo B., Robey P., Gronthos S . The efficacy of mesenchymal stem cells to regenerate and repair dental structures. // Orthod Craniofac Res. 2005. 8. P.191-199.

97. Shi S., Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. // J Bone Miner Res. 2003. 18. P.696-704.

98. Shioi A., Ross F.P., Teitelbaum S.L. Enrichment of generated murine osteoclasts. // Calcif Tissue Int. 1994. 55(5). - P.387-394.

99. Skarja G.A., Woodhouse K.A. Synthesis and characterization of degradable Polyurethane elastomers containing an amino acid-based chain extender. // J Biomater Sei Polym Ed. 1998. 9. -P.271-295.

100. Smith J.R., Pochampally R., Perry A., Hsu S.C., Prockop D J. Isolation of a highly clonogenic and multipotential subfraction of adult stem cells from bone marrow stroma. //Stem Cells. -2004. 22(5). P.823-831.

101. Studitsky A.N. Uber das Wachstum des Knochengewebes und Periostis in vitro und auf der Allantois / A.N. Studitsky / / Archiv fur experimentelle Zellforschung besonders Gewebezbchtung (Explantation). 1933. Bd. XIII. -S. 390-406.

102. Sweetwyne M.T., Brekken R.A., Workman G., Bradshaw A.D., Carbon J., Siadak A.W., Murri C., Sage E.H. Functional analysis of the matricellular protein SPARC with novel monoclonal antibodies. // J Histochem Cytochem. -2004. 52(6). — P.723-733.

103. Temenoff J.S., Mikos A.G. Injectable biodegradable materials for orthopaedic tissue engineering. // Biomaterials. 2000. 21. - P.2405-2412.

104. Thomson R.C. Biodegradable polymer scaffolds to regenerate organs. // Adv Polymer Sei. 1995. 122. -P.245-274.

105. Tiedeman J.J., Garvin K.L., Kile T.A., Connolly J.F. The role of a composite, demineralized bone matrix and bone marrow in the treatment of osseous defects. //Orthopedics. 1995. 18(12). - 1153-1158.

106. Unda F J., Martin A., Hilario E., Bugue-Kirn C., Ruch J.V., Arechaga J. Dissection of the odontoblast differentiation process in vitro by a combination of FGF1, FGF2, and TGFbetal. // Dev Dyn. -2000. 218. -P.480-489.

107. Vacanti, C.A., Bonassar L.J., Vacanti M.P., Shufflebarger J. Replacement of an avulsed phalanx with tissue-engineered bone. // N. Engl. J. Med. 2001. 344. - P.1511-1514.

108. Verbürg A.D., Klopper P. J., van den Hooff A., Marti R.K., Ochsner P.E. The healing of biologic and synthetic bone implants. // Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 1988. 107:(5). - P.293-300.

109. Wallis M.C, Yeger H, Cartwright L, Shou Zh.,Radisic M,

110. Jennifer Haig, Suoub M., Roula Antoon, Walid A. Farhat. Feasibility Study of a Novel Urinary Bladder Bioreactor. // Tissue Eng. Part A. 2008. 14(3). -P.339-348.

111. Wan D.C., Siedhoff M.T., Kwan M.D., Nacamuli R.P., Wu B.M., Longaker M.T. Refining retinoic acid stimulation for osteogenic differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells. // Tissue Eng. 2007. 13(7). -P.1623-1631.

112. Wang H., Fertala A., Ratner B.D., Sage E.H., Jiang S. Identifying the SPARC binding sites on collagen I and procollagen I by atomic force microscopy. // Anal Chem. 2005. 77(21). - P.6765-6771.

113. Warnke P.H., Springer I.N., Wiltfang J. Growth and transplantation of a custom vascularised bone graft in a man. / / Lancet. 2004. 364(9436). -P.766-770.

114. Warnke P.H., Springer I.N., Wiltfang J., Acil Y., Eufinger H., Wehmuller M., Russo P.A., Bolte H., Sherry E., Behrens E., Terheyden H. Growth and transplantation of a custom vascularised bone graft in a man. // Lancet. 2004. 364(9436).-P.766-770.

115. Williams C., Wick T.M. Perfusion Bioreactor for Small Diameter Tissue-Engineered Arteries. //Tissue Eng. 2004. 10(5-6). - P.930-941.

116. Wright E., Hargrave M.R., Christiansen J., Cooper L., Kun J., Evans T., Gangadharan U., Greenfield A., Koopman P. The Sry-related gene Sox9 is expressed during chondrogenesis in mouse embryos. //Nat Genet. — 1995. 9(1). — P.15-20.

117. Yin T., Li L. The stem cell niche in bone. // J.Clin. Invest. 2006. 116. — P.1195 - 1201.

118. Yoo J.U., Johnstone B. The role of osteochondral progenitor cells in fracture repair. // Clin. Orthop. 1998. V.355. Suppl. P.73-81

119. Zambotti A., Makhluf H., Shen J., Ducy P. Characterization of an osteoblast-specific enhancer element in the CBFA1 gene. // J Biol Chem. 2002. 277(44). - P.:41497-41506.

120. Zou X., Li H., Chen L., Baatrup A., B&nger C., Lind M. Stimulation of porcine bone marrow stromal cells by hyaluronan, dexamethasone and rhBMP 2. // Biomaterials. 2004. 25(23). - P.5375-5385.

121. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. // Mol Biol Cell. 2002. 13(12). - P.4279-4295.

122. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell based therapies. // Tissue Eng. 2001. 7. -P.211-228.