Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и отбор из нее вируснейтрализующих антител против ортопоксвирусов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Дубровская, Виктория Владиславовна

• Дубровская, Виктория Владиславовна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дубровская, Виктория Владиславовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 СТРУКТУРА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ИХ ГЕНОВ.

1.1.1 Структура антител.

1.1.2 Гены иммуноглобулинов.

1.1.3 Реорганизация генов иммуноглобулинов в ходе дифференцировки В-лимфоцитов.

1.2 ПОЛУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ.

1.2.1 Фаговый дисплей.

1.2.1.1 Фрагменты антител, используемые для фагового дисплея.

1.2.1.2. Фаги, используемые для дисплея фрагментов антител.

1.2.2 Комбинаторные библиотеки антител человека.

1.2.2.1 Конструирование наивных библиотек.

1.2.2.2 Конструирование синтетических библиотек.

1.2.2.3. Конструирование иммунных библиотек.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и отбор из нее вируснейтрализующих антител против ортопоксвирусов»

Благодаря своей высокой специфичности и широкому спектру связываемых антигенов, антитела нашли широкое применение в фундаментальных исследованиях, медицине и биотехнологии. Но, если в качестве диагностических и аналитических реагентов антитела применяются уже давно и довольно успешно, то применение антител в терапии связано с рядом проблем [1]. Несмотря на разнообразие, только ограниченный набор антител обладает свойствами, подходящими для подобного использования. Так, терапевтические антитела не должны быть иммуногенны и должны иметь длинный период полувыведения из организма человека. К тому же необходимо, чтобы они были устойчивы к агрегации, преципитации и действию протеаз. В соответствии с применением должны учитываться и другие свойства антител: размер, аффинность, эффекторная функция и способность проникать в ткани [2]. Кроме того, необходимо наличие способа их наработки в препаративных количествах.

Открытие Kohler и Milstein гибридомной технологии в 1975 году [3] позволило нарабатывать моноклональные антитела грызунов разной специфичности. С тех пор гибридомы стали основным источником моноклональных антител (МАТ), использующихся в фундаментальных исследованиях и в биотехнологии при создании тест-систем. Но при использовании мышиных МАТ в терапии оказалось, что они имеют ряд недостатков, среди которых короткий период полувыведения, недостаточная активация эффекторных функций и, главное, развитие у человека иммунного ответа против мышиных антител, особенно при повторном использовании. Для решения этих проблем были разработаны стратегии, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов AT мыши с константными доменами человеческих AT, «гуманизация» путем замены CDR и удаление Т-хелперных эпитопов из состава молекулы антитела. Уменьшить степень иммунного ответа, направленного против антител, позволило также использование антител приматов [4].

Тем не менее, полностью человеческие МАТ наиболее ценны для терапевтического применения, поэтому было разработано несколько подходов к их получению из различных источников - человеческих гибридом, трансгенных мышей и in vitro библиотек. Однако, получать стабильные линии человеческих гибридом, продуцирующих высокоаффинные МАТ, удается очень редко по причине отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы [5, 6]. Еще одним способом получения МАТ человека стали трансгенные мыши, у которых собственные гены иммуноглобулинов заменены на человеческие [4,7]. Но при таком подходе, как и при получении МАТ человека с помощью гибридомной технологии, набор антигенов, против которых могут быть получены антитела ограничен только теми антигенами, которые могут быть использованы для иммунизации, при этом невозможно получить необходимые в терапии антитела против собственных белков человека [4]. Спектр антигенов может быть практически неограничен, если в качестве источника антигенсвязывающих доменов антител использовать комбинаторные библиотеки. В этом случае антигенсвязывающий сайт антитела желаемой специфичности отбирается из огромных репертуаров фрагментов антител, которые экспонированы на поверхности бактериофагов [8] либо с помощью других дисплейных технологий - на рибосомах [9] или дрожжах [10]. При этом существуют различные подходы к созданию комбинаторных библиотек, и выбор того или иного подхода зависит от конкретной задачи.

В последнее время все чаще технологию фагового дисплея стали применять для отбора рекомбинантных антител с целью получения на их основе терапевтических препаратов для лечения инфекционных заболеваний. Кроме того, такие антитела также используют для исследования антигенной природы различных вирусов [11-15].

Одними из наиболее многочисленных и сложноорганизованных представителей царства Vira являются поксвирусы, которые поражают практически все известные таксономические группы животных, начиная от насекомых и кончая млекопитающими, в том числе и человека, при этом большая часть патогенных для человека поксвирусов относится к роду Ортопоксвирусов [16]. Наиболее патогенными для человека являются вирус натуральной оспы, кроме того, генерализованную инфекцию может также вызывать вирус оспы обезьян. Известно, что вакцинация ВОВ, ранее использованная для ликвидации натуральной оспы, приводит к формированию у вакцинированных людей длительного состояния напряженности иммунитета [17, 18]. Но высокий процент осложнений, возникающих в результате классического оспопрививания, особенно у людей с врожденным или приобретенным иммунодефицитом, делает необходимым разработку новых специфических средств профилактики поствакцинальных осложнений. В настоящее время таким средством является сывороточный вакцинный иммуноглобулин (VIG) [19], тем не менее, его применение сопровождается биологическим риском. Альтернативой VIG могли бы быть протективные моноклональные AT человека против ортопоксвирусов.

Целью данной работы являлось конструирование иммунной комбинаторной фаговой библиотеки scFv антител человека против ортопоксвирусов, отбор из нее вируснейтрализующих антител и исследование их иммунохимических свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• сконструировать и охарактеризовать комбинаторную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе мРНК лимфоцитов периферической крови доноров, предварительно вакцинированных вирусом осповакцины;

• отобрать из сконструированной библиотеки вируснейтрализующие scFv антитела, специфичные к рекомбинантному белку ргАЗОЬ вируса натуральной оспы, и исследовать их связывание с этим антигеном;

• отобрать из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующие scFv антитела, специфичные к вирусу оспы коров, и исследовать их иммунохимические свойства;

• определить белок-мишень для вируснейтрализующих scFv антител, специфичных к вирусу оспы коров;

• определить аминокислотные последовательности отобранных одноцепочечных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов. Из сконструированной библиотеки впервые отобраны одноцепочечные антитела человека, специфичные к рекомбинантному белку вируса натуральной оспы ргАЗОЬ, способные нейтрализовать вирус осповакцины. Получена панель вируснейтрализующих одноцепочечных антител человека против вируса оспы коров. Сконструирован штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбинантный белок prJ3L вируса оспы коров (штамм Гришак). Показано, что 8 из 10 вируснейтрализующих антител специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком prJ3L, а также с его природными аналогами в составе вирионов вируса оспы коров, осповакцины и эктромелии. Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий растворимое одноцепочечное антитело Ь9, специфически взаимодействующее с вирусом оспы коров. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ь9. Определены аминокислотные последовательности всех полученных антител.

Поскольку в данной работе получены антигенсвязывающие домены антител человека, на их основе в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могли бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилактических средств, а также терапевтических препаратов предупреждения поствакцинальных осложнений и, возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 7 Международных конференциях: 6th, 7th и 8th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Женева, Швейцария, 2004, 2005 и 2006), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005), 7th John Humphrey advanced summer programme in immunologythe interface between immunology and medicine (Москва, Россия, 2005), Международная конференция «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, 2006), Международная конференция "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, Россия, 2006); и 2 Российских конференциях: III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), VII Межгосударственная научно-практическая конференция (Оболенск, Россия, 2006).

Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением тестирования антител на наличие вируснейтрализующей активности, которое проводилось в лаборатории химических антимикробных препаратов, руководитель к.м.н. Е.Ф.Беланов. Вместе с автором в тестировании антител принимали участие Н.И. Бормотов, З.Ф. Киселева и Т.Э. Юн.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Дубровская, Виктория Владиславовна

выводы

1. Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов. Размер библиотеки составил 3><10 независимых клонов, функциональный размер - не менее 97%.

2. Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбинантный белок prJ3L вируса оспы коров (штамм Гришак) с уровнем продукции около 15% суммарного клеточного белка.

3. Из сконструированной библиотеки методом аффинной селекции было отобрано 20 уникальных одноцепочечных антител человека, специфичных к рекомбинантному белку вируса натуральной оспы ргАЗОЬ. Было показано, что антитела 4.1 и d4 способны нейтрализовать инфекционность вируса осповакцины.

4. Методом аффинной селекции из сконструированной библиотеки было отобрано 14 уникальных одноцепочечных антител человека, специфичных к вирусу оспы коров. Показано, что 10 из отобранных антител способны нейтрализовать инфекционность вируса оспы коров. Показано, что 8 из 10 вируснейтрализующих антител специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком prJ3L, а также с его природными аналогами в составе вирионов вирусов оспы коров, осповакцины и эктромелии.

5. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вируснейтрализующие антитела и показано, что:

- Vh домены антител 4.1 и d4 принадлежат к 23 подсемейству Vh3 семейства иммуноглобулинов человека, а их Vl домены - к A3 0 и L19 подсемействам УкЗ семейства иммуноглобулинов человека;

- Vh домены антител, отобранных против ВОК, принадлежат к 9 подсемейству Vh3 семейства и к 18 подсемейству VhI семейства иммуноглобулинов человека, а их Vl домены - к 012, 018 и L12 подсемействам VkI семейства и к 16 подсемейству VX1 семейства иммуноглобулинов человека.

6. Впервые получен штамм Escherichia coli, продуцирующий в растворимой форме одноцепочечное антитело Ь9, отобранное против вируса оспы коров. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ь9 в реакции связывания с вирусом оспы коров, которая составила 3,1хЮ8±0,5ХЮ8 М'1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дубровская, Виктория Владиславовна, 2006 год

1. Maynard J. and Georgiou G. Antibody engineering. // Annu. Rev. Biomed. Eng. -2000. V.2. - P.339-376.

2. Ewert S., Huber T., Honegger A. and Pluckthun A. Biophysical properties of human antibody variable domains. //J. Mol. Biol. 2003. - V.325. - P.531-553.

3. Kohler G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature. 1975. - V.256. - P.495-497.

4. Laffly E. and Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after . // Hum. Antibodies. 2005. - V.14. - P.33-55.

5. Karpas A., Dremucheva A. and Czepulkowski B.H. A human myeloma cell line suitable for the generation of human monoclonal antibodies. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. - V.98. - P.1799-1804.

6. Kellermann S.A. and Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. -2002. V.13. - P.593-597.

7. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E. and Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - V.12. - P.433-455.

8. Hanes J. and Pluckthun A. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. - V.94. - P.4937-4942.

9. Feldhaus M. and Siegel R. Flow cytometric screening of yeast surface display libraries. // Methods Mol. Biol. 2004. - V.263. - P.311-332.

10. Schmaljohn C., Cui Y., Kerby S., Pennock D. and Spik K. Production and characterization of human monoclonal antibody Fab fragments to vaccinia virus from a phage-display combinatorial library. // Virology. 1999. - V.258. - P.189-200.

11. Kim S.J., Jang M.H., Stapleton J.T., Yoon S.O., Kim K.S., Jeon E.S. and Hong H.J. Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display. // Virology. 2004. - V.318. - P.598-607.

12. Fields. Virology. Lippincott-Raven Publishers. Philadelphia. New York 1996.

13. Галактионов В.Г., Иммунология, Издательство "РИЦ МКД". Москва. 2000. 488 с.

14. Richard A.Goldsby, Thomas J.Kindt, Janis Kuby, Barbara A.Osborne. Immunology. W H Freeman & Co. 2003.556 p.

15. Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. and . Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. // Nature. 1989. - V.342. - P.877-883.

16. Chothia C., Lesk A.M., Gherardi E., Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. // J. Mol. Biol. -1992. V.227. - P.799-817.

17. Morea V., Tramontano A., Rustici M., Chothia C. and Lesk A.M. Conformations of the third hypervariable region in the VH domain of i mmunoglobulins. //J. Mol. Biol. 1998. - V.275. - P.269-294.

18. Tomlinson I.M., Cox J.P., Gherardi E., Lesk A.M. and Chothia C. The structural repertoire of the human V kappa domain. // EMBO J. 1995. - V.14. - P.4628-4638.

19. Kabat E.A., Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S., Foeller C., Sequences of Proteins of Immunological Interest. US Department of Health and Human Services, Washington, DC -1991.

20. Williams S.C., Frippiat J.P., Tomlinson I.M., Ignatovich 0., Lefranc M.P. and Winter G. Sequence and evolution of the human germline V lambda repertoire. // J. Mol. Biol. 1996. - V.264. - P.220-232.

21. Cox J.P., Tomlinson I.M. and Winter G. A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage. // Eur. J. Immunol. 1994. - V.24. -P.827-836.

22. Barbie V. and Lefranc M.P. The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments. // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. - V.15. -P.171-183.

23. Kawasaki K., M inoshima S., N akato E., S hibuya K., S hintani A., S chmeits J.L., Wang J. and Shimizu N. One-megabase sequence analysis of the human immunoglobulin lambda gene locus. // Genome Res. 1997. - V.7. - P.250-261.

24. Pallares N., Frippiat J.P., Giudicelli V. and Lefranc M.P. The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments. // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. - V.15. - P.8-18.

25. Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops. // J. Mol. Biol. 1992. - V.227. -P.776-798.

26. Matsuda F. and Honjo T. Organization of the human immunoglobulin heavy-chain locus. // Adv. Immunol. 1996. - V.62. - P. 1-29.

27. Ignatovich 0., Tomlinson I.M., Jones P.T. and Winter G. The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda) repertoire. // J. Mol. Biol. 1997. -V.268. - P.69-77.

28. Willats W.G. Phage display: practicalities and prospects. // Plant Mol. Biol. 2002. - V.50. - P.837-854.

29. Huston J.S., Mudgett-Hunter M., Tai M.S., McCartney J., Warren F., Haber E. and Oppermann H. Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins. // Methods Enzymol. -1991. V.203. - P.46-88.

30. Hoogenboom H.R., de Bruine A.P., Hufton S.E., Hoet R.M., Arends J.W. and Roovers R.C. Antibody phage display technology and its applications. // Immunotechnology. 1998. - V.4. - P. 1-20.

31. Sternberg N. and Hoess R.H. Display of peptides and proteins on the surface of bacteriophage lambda. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. - V.92. - P. 16091613.

32. Zucconi A., Dente L., Santonico E., Castagnoli L. and Cesareni G. Selection of ligands by panning of domain libraries displayed on phage lambda reveals new potential partners of synaptojanin 1. // J. Mol. Biol. 2001. - V.307. - P.1329-1339.

33. Huse W.D., Sastry L., Iverson S.A., Kang A.S., Alting-Mees M., Burton D.R., Benkovic S.J. and Lemer R.A. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. // Science. 1989. - V.246. - P. 12751281.

34. Danner S. and Belasco J.G. T7 phage display: a novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. - V.98. - P. 12954-12959.

35. Ren Z. and Black L.W. Phage T4 SOC and HOC display of biologically active, full-length proteins on the viral capsid. // Gene. 1998. - V.215. - P.439-444.

36. Beck E. and Zink B. Nucleotide sequence and genome organisation of filamentous bacteriophages fl and fd. // Gene. -1981. V. 16. - P.35-58.

37. Hill D.F. and Petersen G.B. Nucleotide sequence of bacteriophage fl DNA. // J. Virol.- 1982.-V.44.-P.32-46.

38. Kay B.K., Winter G., McCafferty J. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. Academic press. 1996.306 p.

39. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. // Science. 1985. - V.228. - P.1315-1317.

40. Bass S., Greene R. and Wells J.A. Hormone phage: an enrichment method for variant proteins with altered binding properties. // Proteins. 1990. - V.8. - P.309-314.

41. McCafferty J., Jackson R.H. and Chiswell D.J. Phage-enzymes: expression and affinity chromatography of functional alkaline phosphatase on the surface of bacteriophage. // Protein Eng. -1991. V.4. - P.955-961.

42. Scott J.K. and Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. // Science. 1990. - V.249. - P.386-390.

43. Devlin J.J., Panganiban L.C. and Devlin P.E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules. // Science. 1990. - V.249. - P.404-406.

44. Barbas C.F., III, Kang A.S., Lerner R.A. and Benkovic S.J. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1991. V.88. - P.7978-7982.

45. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G. and Chiswell D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. // Nature. 1990. - V.348. - P.552-554.

46. Clackson T., Hoogenboom H .R., Griffiths A .D. and Winter G. Making antibody fragments using phage display libraries. // Nature. -1991. V.352. - P.624-628.

47. Milstein C. The Croonian lecture, 1989. Antibodies: a paradigm for the biology of molecular recognition. // Proc. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 1990. - V.239. - P. 1-16.

48. Gao C., Mao S., Kaufmann G., Wirsching P., Lerner R.A. and Janda K.D. A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. - V.99. - P.12612-12616.

49. Rodi D.J. and Makowski L. Phage-display technology-finding a needle in a vast molecular haystack. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - V.10. - P.87-93.

50. Rondot S., Koch J., Breitling F. and Dubel S. A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display. // Nat. Biotechnol. 2001. - V.19. -P.75-78.

51. Duenas M. and Borrebaeck C.A. Novel helper phage design: intergenic region affects the assembly of bacteriophages and the size of antibody libraries. // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V.125. - P.317-321.

52. Skerra A. and Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. // Science. 1988. - V.240. - P.1038-1041.

53. Better M., Chang C.P., Robinson R.R. and Horwitz A.H. Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. // Science. 1988. - V.240. - P.1041-1043.

54. Larrick J. W., W allace E .F., C oloma M .J., B ruderer ULang A .B. and Fry K .E. Therapeutic human antibodies derived from PCR amplification of B-cell variable regions. // Immunol. Rev. 1992. - V.130. - P.69-85.

55. Marks J.D., Hoogenboom H.R., Bonnert Т.Р., McCafferty J., Griffiths A.D. and Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. // J. Mol. Biol. -1991. V.222. - P.581-597.

56. Johnson G. and Wu T.T. Kabat Database and its applications: future directions. // Nucleic Acids Res. 2001. - V.29. - P.205-206.

57. Perelson A.S. and Oster G.F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. // J. Theor. Biol. 1979.-V.81.-P.645-670.

58. Little M., Welschof M., Braunagel M., Hermes I., Christ C., Keller A., Rohrbach P., Kurschner Т., Schmidt S., Kleist C. and Terness P. Generation of a large complex antibody library from multiple donors. // J. Immunol. Methods. 1999. -V.231. - P.3-9.

59. Waterhouse P., Griffiths A.D., Johnson K.S. and Winter G. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. // Nucleic Acids Res. 1993. - V.21. - P.2265-2266.

60. Sblattero D. and Bradbury A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. // Nat. Biotechnol. 2000. - V.18. - P.75-80.

61. Geoffroy F., Sodoyer R. and Aujame L. A new phage display system to construct multicombinatorial libraries of very large antibody repertoires. II Gene. 1994. -V.151. - P.109-113.

62. Barbas C.F., III, Bain J.D., Hoekstra D.M. and Lerner R.A. Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1992. V.89. - P.4457-4461.

63. Hoogenboom H.R. and Winter G. By-passing immunisation. Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro. // J. Mol. Biol. -1992. V.227. - P.381-388.

64. Braunagel M. and Little M. Construction of a semisynthetic antibody library using trinucleotide oligos. // Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. - P.4690-4691.

65. Noronha E.J., Wang X., Desai S.A., Kageshita T. and Ferrone S. Limited diversity of human scFv fragments isolated by panning a synthetic phage-display scFv library with cultured human melanoma cells. II J. Immunol. 1998. - V.161. -P.2968-2976.

66. Carlsson R. and Soderlind E. n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2001. - V.l. - P.102-108.

67. Gavilondo J.V. and Larrick J.W. Antibody engineering at the millennium. // Biotechniques. 2000. - V.29. - P.128-6,138.

68. Amersdorfer P., Wong C., Smith T., Chen S., Deshpande S., Sheridan R. and Marks J.D. Genetic and immunological comparison of anti-botulinum type A antibodies from immune and non-immune human phage libraries. // Vaccine. -2002. V.20. - P.1640-1648.

69. Kipriyanov S.M. and Little M. Generation of recombinant antibodies. // Mol. Biotechnol. -1999. V.12. - P.173-201.

70. Welschof M., Temess P., Kipriyanov S.M., Stanescu D., Breitling F., Dorsam H., Dubel S., Little M. and Opelz G. The antigen-binding domain of a human IgG-anti-F(ab')2 autoantibody. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. -V.94. - P.1902-1907.

71. Dantas-Barbosa C., Brigido M.M. and Maranhao A.Q. Construction of a human Fab phage display library from antibody repertoires of osteosarcoma patients. // Genet. Mol. Res. 2005. - V.4.- P.126-140.

72. Li J., Pereira S., Van Belle P., Tsui P., Elder D., Speicher D., Deen K., Linnenbach A., Somasundaram R., Swoboda R. and Herlyn D. Isolation of the melanoma-associated antigen p23 using antibody phage display. // J. Immunol. -2001. V.166. - P.432-438.

73. Маренникова C.C., Щелкунов C.H. Патогенные для человека ортопоксвирусы, КМК Scientific Press Ltd., Москва. -1998. 386 с.

74. Jacobs N., Chen R.A., Gubser C., Najarro P. and Smith G.L. Intradermal immune response after infection with Vaccinia virus. // J. Gen. Virol. 2006. -V.87. - P.1157-1161.

75. Fenner F, Wittek R., Dumbell K., The Orthopoxviruses, Acad. Press., USA -1989.432 p.

76. Chaudhri G., Panchanathan V., Bluethmann H. and Karupiah G. Obligatory requirement for antibody in recovery from a primary poxvirus infection. // J. Virol. 2006. - V.80. - P.6339-6344.

77. Crotty S., Feigner P., Davies H., Glidewell J., Villarreal L. and Ahmed R. Cutting edge: long-term B cell memory in humans after smallpox vaccination. // J. Immunol. 2003. - V.171. - P.4969-4973.

78. Hopkins R.J. and Lane J.M. Clinical efficacy of intramuscular vaccinia immune globulin: a literature review. // Clin. Infect. Dis. 2004. - V.39. - P.819-826.

79. Demkowicz W.E., Maa J.S. and Esteban M. Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. // J. Virol. 1992. -V.66. -P.386-398.

80. Czemy C.P., Johann S., Holzle L. and Meyer H. Epitope detection in the envelope of intracellular naked orthopox viruses and identification of encoding genes. // Virology. 1994. - V.200. - V.164-111.

81. Dotto G.P., Horiuchi K. and Zinder N.D. The functional origin of bacteriophage fl DNA replication. Its signals and domains. // J. Mol. Biol. 1984. -V.172. - P.507-521.

82. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucleic Acids Res. 1979. - V.7. - P.1513-1523.

83. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. 1984.1-477 с.

84. Laemmli U .К. С leavage о f s tructural р roteins d uring t he assembly о f t he head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

85. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979. - V.76. - P.4350-4354.

86. Ichihashi Y. and Oie M. Neutralizing epitope on penetration protein of vaccinia virus. // Virology. 1996. - V.220. - P.491-494.

87. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж., Молекулярная биология клетки. Мир. Москва -1994. С. 215-283.

88. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген-антитело. Иммунология. Мир. Москва. 1989. 89 с.

89. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. //Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. - P.3389-3402.

90. Brekke O.H. and Loset G.A. New technologies in therapeutic antibody development. // Curr. Opin. Pharmacol. 2003. - V.3. - P.544-550.

91. Tang Y., Jiang N., Parakh C. and Hilvert D. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology. // J. Biol. Chem. -1996. V.271. - P.15682-15686.

92. Turner D.J., Ritter M.A. and George A.J. Importance of the linker in expression of single-chain Fv antibody fragments: optimisation of peptide sequence using phage display technology. // J. Immunol. Methods. 1997. - V.205. - P.43-54.

93. Vazquez M.I. and Esteban M. Identification of functional domains in the 14-kilodalton envelope protein (A27L) of vaccinia virus. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.9098-9109.

94. Meyer H., Osterrieder N. and Czerny C.P. Identification of binding sites for neutralizing monoclonal antibodies on the 14-kDa fusion protein of orthopox viruses. // Virology. 1994. - V.200. - P.778-783.

95. Meyer H., Totmenin A., Gavrilova E. and Shchelkunov S. Variola and camelpox virus-specific sequences are part of a single large open reading frame identified in two German cowpox virus strains. // Virus Res. 2005. - V.108. -P.39-43.

96. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д, Краев А.С., и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука. Сиб. отделение, Новосибирск 1990. 248 с.