Вируснейтрализующие рекомбинантные антитела против вируса клещевого энцефалита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Леванов, Лев Николаевич

• Леванов, Лев Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Леванов, Лев Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирус клещевого энцефалита.

1.1.1. Таксономия и строение вируса.

1.1.2. Строение и свойства структурных белков вируса КЭ.

1.1.3. Строение н свойства неструктурных белков вируса КЭ.

1.1.4. Жизненный цикл вируса клещевого энцефалита.

1.1.5. Профилактика клещевого энцефалита.

1.2. Структура и свойства антител.

1.2.1. Общий план строения антител.

1.2.2. Инженерия антител.

1.2.3. Механизмы нейтрализации вирусной инфекционпостн антителами.

1.2.4. Механизмы нейтрализации флавивирусной инфекционности антителами.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Растворы.

2.1.3. Ферменты.

2.1.4. Культу рал ьные среды.

2.1.5. Эукариотические клетки и бактерии.

2.1.6. Вирусы и рекомбинантные белки.

2.1.7. Плазмиды.

2.1.8. Используемые олигонуклеотиды.

2.2. МЕТОДЫ.

2.2.1. Выделение суммарной РНК из гибридомных клеток.

2.2.2. Синтез кДНК и амплификация генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов мыши.

2.2.3. Ферментативный гидролиз ДНК.

2.2.4. Элюция фрагментов ДНК.

2.2.5. Встраивание фрагментов ДНК в векторную плазмиду.

2.2.6. Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов мыши.

2.2.7. Электрофоретическое фракционирование ДНК.

2.2.8. Трансформация клеток Е. coli плазмндной ДНК.

2.2.9. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

2.2.10. Приготовление субклеточных фракций Е. coli.

2.2.11. Очистка одноцепочечных антител.

2.2.12. Трансфекция эукариотических клеток илазмидными ДНК.

2.2.13. Очистка химерных антител с помощью аффинной хроматографии.

2.2.14. Электрофоретический анализ белков.

2.2.15. Вестерн-блот анализ.

2.2.16. Иммуноферментный анализ.

2.2.17. Определение констант аффинности одноцепочечных антител в растворе.

2.2.18. Определение гетерофазных констант аффинности одноцепочечных, мопоклонпльных и химерных антител.

2.2.19. Исследование вируснейтрализующей активности рекомбинантных антител против вируса КЭ в реакции ингибировання фокусообразования на монослос эукариотических клеток Veto Е6.

2.2.20. Исследование вируснейтрализующей активности рекомбинантных антител против вируса КЭ в реакции ингибнрования бляшкообразования на монослое эукарпотнческих клеток СПЭВ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Получение генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей моноклональных антител 13D6 и 10С2.

3.2. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих одноцепочечные антитела против вируса клещевого энцефалита

3.3. Экспрессия генов одноцепочечных антител в клетках Е. coli.

3.4. Оценка специфичности одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов.

3.5. Очистка одноцепочечных антител.

3.6. Определение констант аффинности scl3D6 и sclOC2.

3.7. Исследование вируснейтрализующих свойств одноцепочечных антител.

3.8. Конструирование химерных антител против вируса клещевого энцефалита.

3.9. Экспрессия генов химерных антител в клетках НЕК 293Т.

3.10. Исследование иммунохимических свойств полученных химерных антител.

3.11. Исследование вируснейтрализующих свойств химерных антител.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вируснейтрализующие рекомбинантные антитела против вируса клещевого энцефалита»

В 1975 году была описана методика, позволяющая получать гибридомные клеточные линии, секретирующие моноклональные антитела (МКА) с желаемой антигенной специфичностью. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии. Созданы десятки тысяч высокоаффинпых антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также с низкомолекулярньши антигенами. На их основе получены конъюгаты с различными функциональными соединениями -токсинами, ферментами, а также магнитными частицами, радиоактивными и рсптгеноконтрастными атомами. Такие конъюгаты находят широкое применение в научных исследованиях, медицине, ветеринарии. Описаны примеры получения с помощью указанной технологии антител, обладающих каталитической активностью, так называемых абзимов (Maynard, 2000; Kipriyanov, 2004). Однако все упомянутые выше антитела и их производные широко используются, в основном для целей диагностики и биотехнологии. Их применение для терапии ограничивается тем, что с помощью гибридомной технологии удается получать, главным образом, молекулы мышиных иммуноглобулинов, которые вызывают у человека иммунный ответ, что приводит к их связыванию и нейтрализации (Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006). Создание человеческих гибридом затрудняется из-за сложности получения иммунных лимфоцитов, отсутствия подходящих миеломпых клеточных линий, низкой эффективности гибридизации и нестабильное™ образующихся гибридных клеток. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммупогенности мышиных МКА путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека. Для решения этой проблемы были разработаны подходы, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов антител мыши с константными доменами человеческих аитител, «гуманизация» путем замены гипервариабельных районов в молекуле антитела человека па аналогичные участки из мышиного антитела, получение полноразмерных антител человека с помощью трансгенных мышей и технологии фагового дисплея.

В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают химерные антитела. Технология получения химерных антител относительна проста и экономически выгодна, а терапевтический эффект достаточно высок. Именно поэтому в списке рекомбинапгпых антител, одобренных и разрешенных FDA для терапевтических целен, подавляющее количество антител являются химерными.

На сегодняшний день в клинике используются следующие препараты химерных антител: abciximab (ReoproR: Fab anti-GpIIb/IIIa, Centocor/Eli Lilly) -для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, Rituximab (RitxanR: IgGl anti-CD20, Biogen-IDEC) - для лечения больных неходжкинскими лнмфомами, infliximab (RemicadeR: IgGl anti-TNF-a, Centocor) - для лечения ревматоидных артритов и болезни Крона, Basiliximab (SimulectR: IgGl anti-CD25, Novartis) - в трансплантологии при отторжении трансплантата, Cetuximab (ErbituxR: IgGl anti-EGRF, ImClone) - для лечения рака прямой кишки (Gavilondo, 2000; Laffly, 2005; Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006).

Кроме того, значительное количество химерных антител находится на стадии клинических испытаний: С225 (IgGl anti-EGRF-рецептор, ImClone Systems) - для лечения раковых заболеваний, ChTNT-l/b (IgGl anti-CD20, Techniclone Int.) - для лечения больных неходжкинскими лимфомами, CaroRXTM (IgA anti-Strepococcus mutans, Planet Biotechnology) - для профилактики кариеса (Gavilondo. 2000; Laffly. 2006).

К настоящему времени получены химерные антитела против ряда вирусных патогенов: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (Major, 1994), вируса гепатита В (Preston, 1998; Bose, 2006), С (Law, 2008) и Е (Luo, 2007), вируса Varicella-Zoster (Shankar, 2005). Показано, что химерные антитела могут осуществлять протекцию и нейтрализацию вирусных агентов (Shankar. 2005; Bose, 2006; Luo, 2007).

Одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов на территории Российской Федерации является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать серьезные поражения нервной системы. Современная эпидемическая ситуация в некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока в отношении КЭ характеризуется значительным ростом заболеваемос i и (Локтев, 2007). Эта закономерность характерна не только для этих регионов России, где регистрируется большая часть случаев заболеваний, но и для многих европейских стран. В настоящее время единственным специфическим средством лечения этого заболевания является гамма-глобулин против вируса КЭ, получаемый из крови иммунизированных людей. Высокая стоимость данного препарата, его дефицит и возможный риск при его применении делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Таким альтернативным средством могли бы стать вируснейтрализующие химерные антитела против вируса КЭ.

Целью данной работы являлось получение вируснеГп рализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита и исследование их свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• клонирован^ гены, кодирующие вариабельные домепы тяжелых (Vh) и легких (VL) цепей МКА 13D6 и 10С2 против вируса КЭ и определить их нуклеотидные последовательности;

• сконструировать на основе полученных VH- и VL-reHOB рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие химерные и одноцепочечные антитела против вируса КЭ;

• исследовать иммунохпмические свойства полученных химерных и одноцепочечных антител;

• исследовать вируснейтрализующие свойства полученных рекомбинантных антител.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе впервые скопсгруированы рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие продукцию вируснейтрализующих химерных и одноцепочечных антител прошв вируса клещевого энцефалита в эукариотпческих клетках и в клетках Е. соН,- соответственно. Определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности этих антител. Показано, что одноцепочечное антитело scl3D6 и химерное антитело chl3D6 способны ингибировать инфекционность вируса КЭ в культуре эукариотических клегок. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для одноцепочечного и химерного антител scl3D6 и chl3D6 в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero Е6 ив реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ. Исследованы иммунохимическпе свойства одноцепочечных и химерных антител. С помощью методов иммуноферментного анализа определены константы аффинности полученных рекомбинантных одноцепочечных и химерных антител.

В ходе данной работы впервые были получены химерные антитела против вируса клещевого энцефалита, обладающие вируснейтрализующими свойствами. Полученные антитела после проверки их терапевтических свойств могли бы стать основой для разработки препарата для лечения клещевого энцефалита.

Получен стабильный штамм-продуцент растворимых вируснейтрализующих одноцепочечных антител против вируса КЭ. который задепоннрован в коллекции микроорганизмов ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора.

Апробация работы и публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 8 Международных конференциях: 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "'The interface between Immunology and Medicine" (Москва, Россия, 2005). 8th International EMBL PhD Student Symposium "Biology of Disease A Molecular Battlefield" (Гейдельберг, Германия, 2006), 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "Immunology and viral infection" (Москва, Россия, 2007), 1st International Summer School 2008 "Pathogen-Host Interplay" (Берлин-Погсдам, Германия, 2008), International Life Sciences Students" Conference (Варшава, Польша, 2008), FEBS Practical Course "Structural variations in genome, gene expression, single cell analysis: arrays, beads, high-throughput sequencing" (Прага, Чехия, 2008), the 13lh CIMO Winter School "Biomolecules in health and disease" (Хельсинки, Финляндия,

2009), 34th FEBS Congress "Life's Molecular Interactions" (Прага, Чехия, 2009); и одной Российской конференции - III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск. Россия, 2006).

Вклад автора.

Большинство экспериментов, а также анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением тестирования антител на наличие вируснейтрализующей активности, которое проводилось к.б.н. Ь.П. Гончаровой и к.б.н. А.Б. Рыжиковым в лаборатории молекулярной иммунологии ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор'" Роспотребнадзора, руководитель к.б.н. А.Б. Рыжиков. Эксперименты по очистке одноцепочечных антител проводились совместно с сотрудником института Медицинской Биотехнологии (Филиал ФГУН Г11Ц ВБ "Вектор") к.б.н. JI.P. Лебедевым. Секвенирование генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей моноклональных антител, проводили сотрудники отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФГУН Г11Ц ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (к.б.н. А.В. Качко и И.В. Гаврилова).

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Леванов, Лев Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Определены нуклеотндные и выведены аминокислотные последовательности VH- и V| -доменов мышиных МКА 13D6 и 10С2, направленных к гликопрогеину Е вируса КЭ, и показано, что Vh-сегменты МКА 13D6 и 10С2 принадлежат к семействам VHJ558.45 и VHJ558.47 тяжелых цепей антител мыши, входящим в состав III группы, а Vl-сегмепты принадлежат к III группе к-цепей.

2. На основе Уи- и У^генов МКА 13D6 и 10С2 сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела scl3D6 и scl0C2 против вируса КЭ. Получены штаммы-продуцепты этих одноцепочечных антител. Показано, что константы аффинности одноцепочечных антител scl3D6 и sclOC2 составили 3,0 х 107 М"1 п 1,2 х 10' М" для равновесия в растворе, а в случае образования комплексов антиген-антитело

7 16 1 на поверхности- 2,8 * 10 М" и 8,1 х 10 М" , соответственно.

3. На основе Ун- и У^генов МКА 13D6 и 10С2 сконструированы пары рекомбинантных плазмидных ДНК pD6H и pD6L, а также рС2Н и pC2L, обеспечивающих при совместном введении в клетки НЕК293Т синтез химерных антител chl3D6 и chlOC2. специфично взаимодействующих с рекомбинантным белком Е вируса КЭ. Константы аффинности chl3D6 и chlOC2 составили 7,3 х 107 М"1 и 2,8 х Ю7 М"1, соответственно.

4. Показано, что одноцепочечное антитело scl3D6 и химерное антитело chl3D6 обладают способностью нейтрализовать инфекционпость вируса КЭ в культуре эукариотических клеток. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для этих антител в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero Е6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на мопослое эукариотических клеток СПЭВ, которые составили 16,7 мкг/мл и 11,2 мкг/мл для одноцепочечного антитела scl3D6 и 4,5 мкг/мл и 1.9 мкг/мл для химерного антитела chl3D6, соответственно.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Леванов, Лев Николаевич, 2009 год

1. Байков И.К. Матвеев Л.Э., Леванов Л.Н., Тикунова Н.В. Одпоцепочечное антитело scl4D5 против белка Е вируса клещевого энцефалита // Вестник НГУ. 2009. (принята в печать).

2. Батанова Т.А. Создание неиммуной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и получение из этой библиотеки антител против фактора некроза опухоли альфа: Автореф. диссертации кандидата биологических наук. Новосибирск, 2005.

3. Беспалов И.А., Шиянов Г1.А., Лукашевич Л.В. Получение одноцепочечных антител к ферригину человека в клетках Escherichia coli // Молекулярная биология. 1993. - №27. - С. 451-460.

4. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: РИЦ МКД, 2000.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.

6. Добрикова Е.Ю., Плетнев А.Г. Полноразмерная ДНК-копия генома вируса клещевого энцефалита // Биоорганическая химия. 1995. - Т. 21. - №7. -С. 528-534.

7. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.

8. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики // Вопросы вирусологии. — 2005. -№3.~ С. 26-32.

9. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Руководство для врачей. -Новосибирск, 2001.

10. Исаева М.П., Леонова Г.Н. Кожемяко В.Б. и др. Апоптоз как механизмцитопатического действия вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1998. - №4. - С. 182-186.

11. Локтев В.Б., Терновой В.А., Негесов С.В. Молекулярно-гснетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. -2007. №5.-С. 6-10.

12. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.

13. Мапиатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

14. Оценка эпидемиологической опасности природных очагов флавивирусных инфекций / О.В. Морозова, Л.Э. Матвеев, В.Н. Бахвалова и др. // Тез. докл. X юбилейного международного форума "Высокие технологии XXI века". М., 2009. - С. 355-357.

15. Николенгсо Г. Н., Протопопова Е. В., Ильичев А. А., Коновалова С. П., Карпенко Л. И., Локтев В. Б., Порываева В. А., Тикунова Н. В. Рекомбинантные антитела к вирусу клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии.-2002.-Т. 47.-№5.-С. 31-36.

16. Николенко Г.Н. Создание рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита и изучение их свойств: диссертация кандидата биологических наук. — Новосибирск, 1999.

17. Пол У. Иммунология. М.: Мир, 1989.

18. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощиантиидиотипических анштел // Вопросы вирусологии. 1997. - Т. 42. -№6. - С. 264-268.

19. Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1996. - №2. - С. 50-53.

20. Ратникова Л.И., Тер-Багдасарян Л.В., Миронов И.Л. Современные представления о патогенезе клещевого энцефалита // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - №5. - С. 41-45.

21. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000.

22. Скрипченко Н.В., Моргацкий Н.В., Аксенов О.А., Иванова Г.П., Тюленева Г.А., Караськова Н.Г., Иванова М.В., Карасев В.В. Новый подход к профилактике клещевого энцефалита у детей // Инфекционные болезни. 2005. - Т. 3. - №4. - С. 61-64.

23. Финни Д. Введение в теорию планирования экспериментов. М.: Мир, 1970.

24. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2002.

25. Allison S.L., Schalich J., Stiasny К., Mandl C.W., Kunz С., Heinz F.X. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH // J. Virol. 1995. - V. 69 (2). - P. 695-700.

26. Barbas C., Bjorling E., Chiodi F. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 9339-9343.

27. Batra S.K., Jain M., Wittel U.A., Chauhan S.C. and Colcher D. Pharmacokinetics and biodistribution of genetically engineered antibodies // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V. 13. - P. 603-608.

28. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay // Journal of immunological methods.- 1987,-V. 100.-P. 173-179.

29. Berger M., Shankar V. and Vafai A. Therapeutic applications of monoclonal antibodies // Am. J. Med. Sci. 2002. - V. 324. - P. 14-30.

30. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7 - P. 1513-1523.

31. Bird R.E. Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee S.M., Lee Т., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. Single-chain antigen-binding proteins // Science. 1988. - V. 242. - P. 423-426.

32. Bobrovnik S.A. Determination of antibody affinity by ELISA. Theory // J. Biochem. Biophys. Methods. -2003. V. 57.-P. 213-236.

33. Bose В., Khanna N., Acharya S.K., Sinha S. Generation and characterization of a single-gene mouse-human chimeric antibody against hepatitis В surfacc antigen // J. Gastroenterol. Hepatol. 2006. - V. 21 (9). - P. 1439-1447.

34. Breedveld F.C. Therapeutic monoclonal antibodies // Lancet. 2000. - V. 355. -P. 735-740.

35. Bressanelli S., Stiasny K., Allison S.L. Stura E.A., Duquerroy S., Lescar J. Heinz F.X., Rey F.A. Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation // EMBO J. 2004. - V. 23 (4). -P. 728-38.

36. Brioen P., Rombaut В., Boeye A. Hit-and-run neutralization of poliovirus // J. Gen. Virol. 1985. - V. 66. - P. 2495-2499.

37. Burton D.R. Antibodies, viruses and vaccines // Nat. Rev. Immunol. 2002. — V. 2.-P. 706-713.

38. Burton D., Barbas C., Persson M. A large array of human monoclonal antibodies to type 1 human immunodeficiency virus from combinatorial of asymptomatic seropositive individuals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V. 88.-P. 10134-10137.

39. Cheung S., Dietzscold В. Koprowski H. A recombinant human Fab expressed in E. coli neutralizes rabies virus // J .Virol. 1992. - V. 66. - P. 6714-6720.

40. Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. and . Conformations of immunoglobulin hypervariable regions //Nature. 1989. - V. 342. - P. 877-883.

41. Co M., Deschamps M., Whitley R. Queen C. Humanized antibodies for antiviral therapy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 28692873.

42. Crill W.D., Roehrig J.T. Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells // J. Virol. 2001. - V. 75. - P. 7769-7773.

43. Davies A., Greene A., Lullau E. and Abbott W.M. Optimisation and evaluation of a high-throughput mammalian protein expression system // Protein Expr. Purif. 2005. - V. 42.-P. 111-121.

44. Davis C.G., Jia X.C., Feng X. and Haak-Frendscho M. Production of human antibodies from transgenic mice // Methods Mol. Biol. 2004. - V. 248. - P. 191-200.

45. Delaet I., Boeye A. Monoclonal antibodies that disrupt poliovirus only at fever temperatures //J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 5299-5302.

46. Fishwild D.M. Hudson D.V. Deshpande U. and Kung A.II. Differential effects of administration of a human anti-CD4 monoclonal antibody, HM6G, in nonhuman primates // Clin. Immunol. 1999. - V. 92. - P. 138-152.

47. Flamand A., Raux H., Gaudin Y., Ruigrok R.W. Mechanisms of rabies virus neutralization // Virology. 1993. - V. 194. - P. 302-313.

48. Foon K.A., Yang X.D., Weiner L.M., Belldegrun A.S., Figlin R.A., Crawford J., Rowinsky E.K., Dutcher J.P., Vogelzang N.J., Gollub J., Thompson J.A.,

49. Schwartz G., Bukowski R.M., Roskos L.K. and Schwab G.M. Preclinical and clinical evaluations of ABX-EGF, a fully human anti-epidermal growth factor receptor antibody // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004. - V. 58. - P. 984990.

50. Foote J. and Winter G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops // J. Mol. Biol. 1992. - V. 224. - P. 487-499.

51. Friguet В., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L. and Goldberg M.E. Measurements of the true affinity constants in solution of antigen-antibody compexes by enzyme-linked immunosorbent assay // Journal of immunological methods. 1985,-V. 77. - P. 305-319.

52. Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A. and Flechner I. A unique natural human lgG antibody with anti-alpha-galactosyl specificity // J. Exp. Med. 1984. - V. 160. - P. 1519-1531.

53. Gavilondo J.V. and Larrick J.W. Antibody engineering at the millennium // Biotechniques. -2000. V. 29(1).-P. 128-132, 134-136.

54. Gollins S.W., Porterlield J.S. A new mcchanism for the neutralization of enveloped viruses by antiviral antibody // Nature. 1986. - V. 321. - P. 244246.

55. Golomb M. Chamberlin M. Characterization of T7-specific ribonucleic acid polymerase. IV. Resolution of the major in vitro transcripts by gel electrophoresis // J. Biol. Chem. 1974. - V. 249 (9). - P. 2858-2863.

56. Goncalvez A.P., Chien C.H., Tubthong K., Gorshkova I., et al. Humanized monoclonal antibodies derived from chimpanzee Fabs protect against Japanese encephalitis virus in vitro and in vivo //J. Virology. 2008. - V. 82 (14). - P. 7009-7021.

57. Gonzales N.R. Pascalis R., Syed J.S., Kashmiri V.S. Minimizing the immunogenicity of antibodies for clinical application // Tumour Biol. — 2005. -V. 26(1).-P. 31-43.

58. Green A.M., Armstrong S.J., DimmockN.J. Mechanisms of neutralization of a nairovirus (Dugbe virus) by polyclonal IgG and IgM // J. Gen. Virol. 1992. -V. 73.-P. 1195-2001.

59. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Research. 2003. - V. 57 (1-2). - P. 129-146.

60. Hardy S.A., Dimmock N.J. Valency of antibody binding to virions and determination by surface plasmon resonance // Rev. Med. Virol. 2004. - V. 14.-P. 123-135.

61. Heinz F.X., Mandl C.W. The molecular biology of tick-borne encephalitis virus // APMIS. 1993. - V. 101 (10).-P. 735-745.

62. Heinz F.X., Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Harris B.A., Rey F., Harrison S.C. The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallozation // J. Virol. 1991. - V. 65 (10).-P. 5579-83.

63. Huston J.S., Tai M.S., McCartney J., Keck P., Oppermann H. Antigen recognition and targeted delivery by the single-chain Fv // Cell Biophys. -1993.-V. 22.-P. 189-224.

64. Hwang W.Y., Foote J. Immunogenieity of engineered antibodies // Methods. -2005. V. 36 (1). - P. 3-10.

65. Icenogle J., Shiwen H., Duke G., Gilbert S., Rueckert R., Anderegg J. Neutralization of poliovirus by a monoclonal antibody: kinetics and stoichiometry// Virology. 1983.- V. 127.-P. 412-425.

66. Itoh K., Inoue K., Hirooka K., ct al. Phage display cloning and characterization of monoclonal antibody genes and recombinant Fab fragment against the CD98 oncoprotein // Jpn. J. Cancer Res. 2001. - V. 92. - P. 1313-1321.

67. Jakobovits A. Production of fully human antibodies by transgenic mice // Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 561-566.

68. Jacobs S.C., Stephenson J.R., Wilkinson G.W. High-level expression of the tick-bome encephalitis virus NS1 protein by using an adenovirus-based vector: protection elicited in a murine model // J. Virol. 1992. - V. 66 (4). - P. 208695.

69. Jiang W., Bonnert T.P., Venugopal K., Gould E.A. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses // Virology. -1994.-V. 200.-P. 21-28.

70. Kellermann S.A. and Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V. 1.3 - P. 593-597.

71. Kettleborough C.A., Saldanha J., Heath V.J., Morrison C.T. and Bendig M.M. Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation // Protein Eng. 1991. -V. 4.-P. 773-783.

72. Kipriyanov S. M., Le Gall F. Generation and production of engineered antibodies // Mol. Biotechnol. 2004. - V. 26 (1). - P. 39-60.

73. Klasse P.J., Sattentau Q.J. Occupancy and mechanism in antibody-mediated neutralization of animal viruses // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - P. 20912108.

74. Knappik A., Ge L., Honegger A., Pack P., Fischer M., Wellnhofer G., Hoess

75. A., Wolle J., Pluckthun A. and Virnekas B. Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and^CDRs randomized with trinucleotides // J. Mol. Biol. 2000. -V. 296.-P. 57-86.

76. Knight D. M., Trinh H., Le J., Siegel S., Shealy D., McDonough M., Scallon

77. B., Moore M.A., Vilcek J., Daddona P., et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody // Mol. Immunol. 1993,-V. 30 (16).-P. 1443-1453.

78. Konishi E., Mason P.W. Proper maturation of the Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein requires cosynthesis with the premembrane protein // J. Virol. 1993. - V. 67 (3). - P. 1672-5.

79. Kopecky J., Grubhoffer L., Kovar V., Jindrak L., Vokurkova D. A putative host cell receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anti-idiotypic antibodies and virus affinoblotting // Intervirology. 1999. - V. 42. - P. 9-16.

80. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

81. Laffly E. and Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. //Hum. Antibodies. -2005. V. 14 (1-2). - P. 33-55.

82. Lorenz I.C., Allison S.L., Heinz F.X., Helenius A. Folding and dimerization of tick-borne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum // J. Virol. 2002. - V. 76 (11). - P. 5480-91.

83. Luo W., Chen Y„ Li L., Xu C., Miao J. Shih J.W., Zhang J., Xia N. Construction and characterization of the chimeric antibody 8C11 to the hepatitis E virus // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2007. - V. 51 (1). - P. 18-25.

84. Maldov D.G., Karganova G.G. Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells // Arch. Virol. 1992. - V. 127. - P. 321-325.

85. Mandl C.W. Steps of the tick-borne encephalitis virus replication cycle that affect neuropathogenesis // Virus Res. 2005. - V. 111 (2). - P. 161-174.

86. Maynard J, Georgiou G. Antibody engineering // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000. - V. 2. - P. 339-376.

87. Mazanec M.B., Coudret C.L., Fletcher D.R. Intracellular neutralization of influenza virus by immunoglobulin A anti-hemagglutinin monoclonal antibodies//J. Virol. 1995.-V. 69.-P. 1339-1343.

88. Mazanec M.B., Kaetzel C.S., Lamm M.E., Fletcher D., Nedrud J.G. Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 6901-6905.

89. McCullough K.C., Smale С.J., Carpenter W.C., Crowther J.R., Brocchi E., Simone F. Conformational alteration in foot-and-mouth disease virus virion capsid structure after complexing with monospecific antibody // Immunology. -1987.-V. 60.-P. 75-82.

90. Mehlhop E., Whitby K., Oliphant Т., Marri A. Engle M., Diamond M.S. Complement activation is required for induction of a protective antibody response against West Nile virus infection // J. Virol. 2005. - V. 79. - P. 7466-7477.

91. Mian I.S., Bradwell A.R. and Olson A J. Structure, function and properties of antibody binding sites // J. Mol. Biol. 1991. - V. 217. - P. 133151.

92. Nose M. and Wigzell H. Biological significance of carbohydrate chains on monoclonal antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V. 80. - P. 6632-6636.

93. Nowak Т., Wengler G. Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus // Virology. 1987. - V. 156 (1). - P. 12737.

94. Nybakken G.E., Oliphant Т., Johnson S., Burke S. Diamond M.S., Fremont D.H. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody // Nature. 2005. - V. 437. - P. 764-769.

95. Pereboev A., Borisevich V., Tsuladze G., Shakhmatov M., Hudman D., Kazachinskaia E., Razumov I., Svyatchenko V., Loktev V., Yamshchikov V. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus // Antiviral Research. 2008. - V. 77. - P. 6-13.

96. Pierson T.C., Fremont D.H., Kuhn R.J., Diamond M.S. Structural insights into the mechanisms of antibody-mediated neutralization of flavivirus infection: implications for vaccine development // Cell Host Microbe. 2008. -V. 4(3).-P. 229-238.

97. Posner M.R., Hideshima Т., Cannon Т., Mukherjee M., Mayer K.H., Byrn R.A. An IgG human monoclonal antibody that reacts with HIV-l/gpl20. inhibits virus binding to cells, and neutralizes infection // J. Immunol. — 1991. — V. 146.-P. 4325-4332.

98. Presta L.G. Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. - V. 58 (5-6). - P. 640-656.

99. Radko B.V., Boitchenko V.E., Nedospasov S.A., Korobko V.G. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor // Russ.

100. J. Immunol. 2002. - V. 7. - P. 371-374.

101. Reading S.A., Dimmock N.J. Neutralization of animal virus infectivity by antibody // Arch. Virol. 2007. - V. 152 (6). - P. 1047-1059.

102. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution // Nature. — 1995.-V. 375 (6529).-P. 291-298.

103. Roder J.C., Cole S.P. and Kozbor D. The EBV-hybridoma technique // MethodsEnzymol. 1986.-V. 121.-P. 140-167.

104. Roehrig J.T., Bolin R.A., Kelly R.G. Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica // Virology. -1998. -V. 246.-P. 317-328.

105. Schlesinger J.J., Brandriss M.W., Cropp C.B., Monath T.P.- Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever virus nonstructural protein NS1 // J. Virol. 1986. - V. 60 (3). - P. 1153-5.

106. Shankar V., Kools J.J. Armour K.L., Clark M.R. A chimeric antibody to varicella-zoster virus glycoprotein E // Hybridoma. 2005. - V. 24 (1). - P. 5054.

107. Skerra A. Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli // Science. 1988. -V. 240. - P. 1038-1041.

108. Smith T.J., Olsen N.H., Cheng R.H., Liu H., Chase E.S., Lee W.M., Lcippe D.M., Mosser A.G., Rueckert R.R., Baker T.S. Structure of human rhinovirus complexed with Fab fragments from a neutralizing antibody // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 1148-1158.

109. Stiasny К., Brandler S. Kossl C., Heinz F.X. Probing the flavivirus membiane fusion mechanism by using monoclonal antibodies // J. Virol. -2007.-V. 81.-P. 11526-11531.

110. Thali M., Moore J.P.,* Furman C., Charles M., Ho D.D., Robinson J., Sodroski J. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gpl20 neutralization epitopes exposed upon gpl20-CD4 binding // J. Virol. -1993.-V. 67.-P. 3978-3988.

111. Thomas P. and Smart T.G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2005. -V. 51. - P. 187-200.

112. Thompson B.S., Moesker В., Smit J.M., Wilschut J., Diamond M.S., Fremont D.H. A therapeutic antibody against west nile virus neutralizes infection by blocking fusion within endosomes // PLoS. Pathog. 2009. V. 5. — P. 193-200.

113. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. - P. 4350-4354.

114. Wright A., Tao M.H.,l£abat E.A. and Morrison S.L. Antibody variable region glyeosylation: position effects on antigen binding and carbohydrate structure // EMBO J. 1991.-V. 10. - P. 2717-2723.

115. Wu S.C. Lin Y.J., Chou J.W., Lin C.W. Construction and characterization of a Fab recombinant protein for Japanese encephalitis virus neutralization // Vaccine. 2004. - V. 23. - P. 163-171.

116. Xiong H., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies // J. Biochem. Mol. Biol. 2005. -V. 38.-P.414-419.