Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Бархатов, Ильдар Мунерович

• Бархатов, Ильдар Мунерович
• кандидат медицинских наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Бархатов, Ильдар Мунерович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика исследуемого материала.

2.2. Методы исследов ания.

2.2.1. Методы получения материала исследования.

2.2.2 Метод выделения мононуклеарной фракции пуповинной крови на градиенте плотности.

2.2.3 Культивирование прилипающей фракции пуповинной крови

2.2.4 Иммунофенотипирование методом проточной цитофлюорометрии.

2.2.5 Методы клоногенного культивирования клеток-предшественников гемопоэза.

2.2.6 Культуральное исследование в метилцеллюлозе.

2.2.7 Индукция дифференцировки мезенхимальных предшественников.

2.2.8 Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. МОНОСЛОЙНАЯ КУЛЬТУРА ПУПОВИННОЙ КРОВИ.

3.1. Морфология прилипающей фракции монослойной культуры пуповинной крови.

3.2. Фенотип прилипающей фракции монослойной культуры пуповинной крови.

3.2.1 Влияние сроков культивирования на фенотипический состав монослойной культуры.

3.2.2 Влияние пассирования на фенотипический состав монослойной культуры.

ГЛАВА 4.СВЯЗБ СОСТАВА МОНОСЛОЙНОЙ КУЛЬТУРЫ ПУПОВИННОЙ КРОВИ С ФЕНОТИПНЧЕСКИМ СОСТАВОМ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ

ПУПОВИННОЙ КРОВИ.

ГЛАВА 5. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОНОСЛОЙНОЙ КУЛЬТУРЫ ПУПОВИННОЙ КРОВИ

5.1 Дифференцировочные потенции клеток прилипающей фракции монослойной культуры ПК.

5.2 Оценка способности клеток монослойной культуры к клональному росту в метилцеллюлозе.

5.3 Гемостимулирующие свойства монослойной культуры пуповинной крови.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека»

Актуальность работы

В трансплантологии все большее место занимает пересадка мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [28,125,172], основным источником которых до последнего времени являлся костный мозг [10,14]. Направления этой терапии связаны со свойствами МСК поддерживать кроветворение при котрансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) [67,76,188]; подавлять иммунные конфликты при аллогенной, особенно неродственной трансплантации [132]; замещать и восстановливать функции поврежденных негемопоэтических тканей (кости, хряща, скелетных мышц, сердечной мышцы, нервной ткани, печени и др.) [24,191,252]. Преимущества МСК в клеточной терапии определяются их иммуномодулирующими способностями, иммунотолерантностью при аллогенной трансплантации и возможностью наработки больших количеств в относительно несложных условиях культвирования [12]. Альтернативными источниками МСК, кроме костного мозга, являются жировая ткань [235], пуповинная кровь, пупочный канатик [199], плацента [30,100] и амниотическая жидкость [101]. Пуповинная кровь (ПК) представляет особый интерес ввиду ее доступности, относительной легкости получения и безопасности для потенциального донора [78]. Как показали многочисленные исследования [32,63,.82,135], МСК могут содержаться в прилипающей клеточной фракции пуповинной крови, требующей культивирования для наработки необходимых для трансплантации количеств МСК. Однако в тоже время имеется ряд публикаций, опровергающий данный факт [150,242], до сих пор остаются неразработанными условия препаративной подготовки и культивирования прилипающей фракции пуповинной крови. Отсутствует четкое представление о клеточном составе, функции первичной культуры прилипающей фракции и ее связи с клеточным составом пуповинной крови. Отдельного внимания заслуживают и эндотелиальные предшественники, недавно обнаруженные в пуповинной крови [116,182,185], обладающие уникальной способностью к постнатальному неоангиогенезу.

Именно поэтому настоящее исследование, посвященное изучению состава и функции первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, представляется высоко актуальным.

Целью настоящей работы явилась стандартизация условий препаративной подготовки, культивирования и оценка клеточного состава; первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать метод культивирования монослойной культуры пуповинной крови (МКПК) доношенных новорожденных.

2. Разработать критерии стандартной оценки первичной культуры« прилипающей фракции пуповинной крови.

3; Оценить влияние на г состав МКПК временных параметров заготовки и хранения образца ПК.

4. Выявить наличие и характер связи между фенотипическим составом мононуклеарной фракции пуповинной крови (МФПК) и ее монослойной культуры.

5; Охарактеризовать дифференцировочные потенции МСК-подобных клеток МКПК.

6. Создать культуральную модель для характеристики гемостимулирующей функции МКПК и оценить колониестимулирующую активность последней.

Научная новизна

Впервые разработан метод структурного анализа первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, основанный на определении соотношения основных клеточных популяций по характерному фенотипу. Отработана оригинальная культуральная модель для характеристики гемостимулирующей функции МКПК и оценки ее колониестимулирующей активности. Впервые было показано, что прилипающая фракция первичной монослойной культуры оказывает стимулирующее влияние на колониеобразование гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, по характеру и силе воздействия близкое к таковому стандартного фидера. При этом существенное влияние на их пролиферативную активность оказывают клеточные элементы с маркерами МСК (С090+С03г). Научной новизной характеризуются результаты сравнения клеточного состава МКПК и МФПК, показавшие, что культивирование прилипающей фракции пуповинной крови увеличивает долю ранних кроветворных предшественников (С034+НЬАБК~) за счет уменьшения доли более зрелых (С034+С045+), при этом отмечается также и увеличение доли эндотелиальных предшественников (С034+СБ45" и С045~СБ31+).

Научное значение имеют полученные в работе данные о структуре первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, изменении ее при различных сроках культивирования и в первом пассаже. Было выявлено, что на фоне длительного культивирования большая часть гемопоэтических клеток элиминируется из культуры и не способна к повторной адгезии. В то же время среди негемопоэтической популяции наблюдается обратное - МСК и эндотелиальные предшественники способны к экспансии в исследованных культуральных условиях, а последовательное пассирование способствует увеличению их концентрации в культуре. Получены важные научные данные о способности МСК монослойной культуры дифференцироваться в адипоциты и остеобласты, подтверждающие функциональную полноценность этих клеток.

Научно-практическое значение заключается в разработке оптимального метода культивирования прилипающей фракции пуповинной крови и референтных показателей клеточного состава популяции, характеризующих первичную культуру этих клеток. Особое практическое значение имеет изучение влияния на состав и функцию первичной культуры сроков и способов препаративной подготовки. Показано, что на фоне увеличения временных параметров забора и хранения образцов ПК снижается концентрация в монослойной культуре МСК-подобных клеток и гемопоэтических клеток, что в свою очередь снижает гемостимулирующую способность МКПК. С целью оптимизации изоляции и последующей экспансии негемопоэтической фракции МКПК показано предварительное выделение мононуклеарной фракции ПК на градиенте плотности.

Работа выполнена в лаборатории регуляции кроветворения (заведующая - д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (руководитель - к.м.н. Румянцев С.А.) Федерального научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор - член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.)

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Бархатов, Ильдар Мунерович

выводы

1. Монослойная культура пуповинной крови (МКПК) представляет собой гетерогенную популяцию. Медиана относительного количества зрелых клеток гемопоэтического ряда составляет (СБ45+) 60,17%; стволовых гемопоэтических клеток (С034+СБ45+) - 0,59%, фенотипически сходных с эндотелиальными предшественниками (СБ34+СВ45~) - 0,31%, и мезенхимальными стволовыми клетками (СБ90+СВЗГ) - 0,50%.

2. Увеличение времени культивирования мононуклеарной фракции пуповинной крови (МФПК) (более 23 дней) приводит к постепенной элиминации из культуры гемопоэтических клеток и возрастанию доли МСК и ЭКП.

3. При пассаже фенотип культуры меняется. При пассировании количество гемопоэтических клеток существенно снижается, на фоне чего увеличивается концентрация негемопоэтической составляющей монослойной культуры ПК.

4. При увеличении времени, предшествующему забору ПК, отмечается снижение относительного количества МСК-подобных клеток и увеличение концентрации эндотелиальных предшественников в МКПК.

5. Основное различие в структуре популяций МФПК и МКПК заключается в том, что при культивировании значительно изменяется соотношение ГСК и ЭКП среди СБ34-положительной популяции в пользу ЭКП.

6. МСК-подобные клетки МКПК способны к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях, что подтверждает их функциональную состоятельность.

7. Прилипающая фракция первичной монослойной культуры оказывает стимулирующее влияние на колониеобразование гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, по характеру и силе воздействия близкое к таковому стандартного фидера. Существенное влияние на их пролиферативную активность оказывают клеточные элементы с маркерами МСК (СБ90+СБ31").

8. Удлинение временных параметров забора и хранения образцов ПК приводят к снижению их гемостимулирующей активности.

Практические рекомендации

1. Оценку состава монослойной культуры пуповинной крови рекомендуется проводить при следующих условиях культивирования: мононуклеарные клетки, выделенные на градиенте плотности Фиколла 1,077 г/л

7 2 эксплантируются в концентрации 1»10 на 1 см в культультуральные пластиковые флаконы с полной питательной средой, содержащей 20-25% эмбриональной телячьей сыворотки, предварительно протестированной на способность к поддержке роста MGK костного мозга, и среду DMEM с содержанием глюкозы 1 г/л.

2. Для количественной оценки состава монослойной культуры пуповинной крови рекомендуется использовать следующие индексы," позволяющие провести структурный анализ основных популяций образующих монослой культуры ПК: индекс гемопоэтических клеток - CD45+/CD45"=1,511; индекс созревания миелоидных клеток - CD14+/CD45+=0,28; индекс ГСК - CD34+CD45+/CD45+= 0,008; индекс ЭКП - CD34+CD45"/CD45"=0,013 и индекс, характеризующий долю МСК среди негемопоэтической популяции МКПК - CD90+GD317GD45" =0,013.

3. Заготовку образца ПК следует производить в первые пять минут после рождения ребенка.

4. Выделение мононуклеарной фракции ПК с последующей инициацией культуры должно проводиться в первые 15-19 часов после заготовки образца ПК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Бархатов, Ильдар Мунерович, 0 год

1. Абдулкадыров K.M., Романенко H.A., Старков H.H. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови //Вопросы онкологии. -2000.-Т. 46, №5.- С.513-520.

2. Алексеев И.В., Волынец М.Д., Владимирская Е.Б. и др. //Гематол. и трансфузиол,- 1996.- Т.41, №2.- С. 16-18.

3. Афанасьев Б. В., Алмазов В. А. Родоначальные кроветворные клетки человека: Физиология и патология. Л.: Наука, 1985. — 204 с.

4. Афанасьев Б. В., Тиранова С. А., Кулибаба Т. Г., Зубаровская Л. С., Большакова Г. Д., Забелина Т. С. Клонирование кроветворных клеток человека в системе «агаровая капля-жидкая среда». //Терапевт, арх., 1983, № 8, -С. 114122.

5. Быков В.Л., Цитология и общая гистология. СПб, Сотис, - 1998.

6. Владимирская Е.Б., Майорова O.A.,Румянцев С.А., Румянцев А.Г. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М.:ИД Медпрактика -М,2005, 392 с.

7. Румянцев А.Г. Трансплантация костного мозга. Медицинские показания. // //Новый медицинский журнал. -1996, №4, -С. 20-24.

8. Фриденштейн А.Я., Дериглазова Ю.Ф., Кулагина H.H. Клонирование клеток-предшественников для фибробластов в монослойных культурах клеток. //Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. -1973; №76, -С. 90-94.

9. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы гемопоэтического микроокружения. //Терапевт, архив. -1980, -Т.52; №9: -С.67-71.

10. Чертков И. Л., Фриденштейн А .Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения. -Москва; 1977 .

11. Al-Khaldi A, Eliopoulos N, Martineau D, et al. Postnatal bone marrow stromal cells elicit a potent: VEGF-dependent neoangiogenic response in vivo. //Gene Ther. -2003, -N10. -P.621-629.

12. Angoulvant D, Clerc A, Bench al al S, et al. Human mesenchymal stem cells suppress induction of cytotoxic response to alloantigens: //Biorheology. -2004,— -N41, -P.469-476

13. Anklesaria P, Kase K, Glowacki J, et ah Engraftment of a clonal bone marrow stromal cell line in vivo stimulates hematopoietic recovery from; total body irradiation. //Proc Natl Acad Sci U S A. -1987. -N84. -P.7681-7685:

14. Antonchuk J, Sauvageau G, Humphries RK. HOXB4 overexpression mediates very rapid stem cell regulation and competitive hematopoietic repopulation. //Exp Hematol. -2001. -N29. -P.1125-1134.

15. Aoki M, Yasutake M, Murohara T. Derivation of functional endothelial progenitor cells from human umbilical card blood mononuclear cells isolated by a novel cell filtration device.//Stem Cells.-2004.-N22:-P.994-1002.

16. Armitage J. Bone marrow transplantation. // N. Engl.J.Med.-1994. N.330. P.827 178

17. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. //Science. -1997. -N275. -P.964-967.

18. Assmus B, Schachinger V, Teupe C, et aL Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). //Circulation. -2002. -N106. -P.3009-3017.

19. Austin TW, Solar GP, Ziegler FC et al . A role for Wnt gene family, in hematopoiesis: expression of multilineage progenitor cells. //Blood 1997. -N89:-P.3624-3635.

20. Badorff C, Brandes RP, Popp R, et al. Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes. //Circulation. -2003. -N107. -P.1024-1032.

21. Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D, et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. //Cell. -2003.-N114. -P.763-776.

22. Bieback K, Kern S, Kluter H et al . Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. //Stem Cells. -2004. -N22. -P.625-634.

23. Bompais H, Chagraoui J, Canron X et al . Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. //Blood; -2004. -N107. -P.2577-2584.

24. Bonanno G, Perillo A, Rutella , S et al . Clinical isolation and functional characterization^ of cord blood CD133+ hematopoietic progenitor cells. //Transfusion. -2004. -N.44. -P.1087-1097.

25. Bruder SP, Jaiswal N, Haynesworth SE. Growth kinetics, self-renewalj and the osteogenic potential of purified human mesenchymal; stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation. //J Cell Biochem. -1997. -N64. -P.278-294.

26. Caplan AI. The mesengenic process. //Clin Plast Surg. -1994. -N21. -P.429-435.

27. Cheng F, et al. Induced differentiation of human cord blood mesenchymal stem/progenitor cells into cardiomyocyte-like cells in vitro. //J Huazhong Univ Sei Technolog Med Sci. -2003. -Vol.23; N2. -P.154-157.

28. Cheng FJ, et al. The growth characteristics of mesenchymal stem/progenitor cells in human umbilical cord blood. //Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. -2003. .-Vol.11, N6.-P.565-568.

29. Cherry, Yasumizu R., Toki J., et al. Production of hematopoietic stem cell-chemotactic factor by bone marrow stromal cells. //Blood. -1994. -N83. -P.964-971.

30. Choi K, Kennedy M, Kazarov A, Papadimitrou JC, Keller G. A common precursor for hematopoietic and endothelial cells. //Development. -1998. -N125. -P.725-732.

31. Clapp DW, Freie B, Lee WH, Zhang YY. Molecular evidence that in situ-transduced fetal liver hematopoietic stem/progenitor cells give rise to medullary hematopoiesis in adult rats. //Blood. -1995. -N86. -P.2113-2122.

32. Clark BR, Kealing A. Biology of bone marrow? stroma. //Ann NY Acad Sci. -1995. -N770. -P.70-78.

33. Clark E, Wognum AW, Marciniak Ret'ah Mesenchymal cell precursors from human bone marrow have a phenotype that is direct from cultured mesenchymal cells and are exclusively present in a small subset of CD451ow SH2+ cells. //Blood.-2001.-N98.-P:85a.

34. Colter DC, Class R, Digirolamo CM; Prockop DJ. Rapid expansion of recycling stem cells in, cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. //Proc. Nati. Acad. Sci USA.-2000. -N97. -P.3213-3218.

35. Conget P, Minguel JJ. Adenoviral-mediated gene transfer into ex vivo expanded human bone marrow mesenchymal progenitor cells. //Exp Hematol. -2000. -N28. -P.382-390.

36. Conget PA, Minguell JJ. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. //J Cell Physioh -1999. -N181. -P.67-73.

37. Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E,et ah Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions. //Blood. -2006. -N107. -P.367-372

38. Couri C, Foss M; Voltarelli C. Secondary prevention of type 1 diabetes mellitus, stopping immune destruction and promoting 6-cell regeneration: //Braz J Med Biol Res.-2006.-N39.-P.1271-1280.

39. Crisa L, Cirulli V, Smith K et al. Human cord blood progenitors sustain thymic T-cell development and a novel form of angiogenesis. //Blood 1999. -N94. -P.3928-3940.

40. Deans RJ^ Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses.//Exp Hematol.-2000.-N28.-P.875-884.

41. Denning-Kendall PA, Evely R, Singha S, Chapman M, Bradley BA and Hows JM. In vitro expansion of cord blood does not prevent engraftment of severecombined immunodeficient repopulating cells. //British Journal of Haematology. -2002.-N116.-P.218-228

42. Di Nicola M, Carlo-Stella C, Magni M, et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. //Blood 2002. -N99: -P.3838-3843

43. Dignat-George F, Sampol J. Circulating endothelial cells in vascular disorders: new insights into an old concept.//Eur J Haematol: -2000. -N65. -P.215-220.

44. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL, Karsenty G. Osf2/Cbfal, A transcriptional activator of osteoblast differentiation; //Cell 1997. -N89. -P.743-754.

45. Eggermann J, Kliche S, Jarmy G et al . Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological: comparison using human umbilical cord blood.//Cardiovascular Res.-2003.-N58.-P.478-486.

46. E1-Seisi S, et al: Renal pathology at autopsy in patients who died after hematopoietic stem cell transplantation. //Biol Blood Marrow Transplant. -2003. -Vol9, N11. -P.683-688.

47. Erices A, Conget P, Minguell JJ. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. //Br J Haematol. -2000. -N109: -P.235-242.

48. Falkenburg J.H.F., Lim F.T.H. Использование пуповинной крови вместо костного мозга для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // РМЖ. -1996 Т. 3 - № 4. - С.24-31.

49. Fan C-L, Li Y, Gao P-J et al . Differentiation of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood CD 34-cells in vitro. //Acta PharmacoFSin. 2003. -N24.-P.212-218.

50. Fernandez Pujol B, Lucibello FC, Gehling UM, Lindemann K, Weidner N, Zuzarte ML, Adamkiewicz J, Elsasser HP, Muller R, Havemann K. Endothelial-like cells derived from human CD14 positive monocytes. //Differentiation. -2000 . -Vol.65, N5. -P.287-300.

51. Fibbe W., Noort W. Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cell transplantation: //Ann N Y Acad Sei. -2003. -N996. -P.235-44.

52. Frid.-MG, Kale VA, Stenmark KR. Mature vascular endothelium can give rise to smooth muscle cells via endothelialmesenchymal transdifferentiation. In vitro analysis. //Circ Res. -2002. -N90. -P.1189-1196.

53. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Latsinik N.V. et al. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the haematopoietic tissues: Cloning in vitro and retransplantation in vivo. //Transplantation. -1974. -N17. -P.331-340.

54. Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN; Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. //Exp Hematol. -1976. -N4. -P.267-274

55. Friedenstein, A. J., Deriglasova, U. F., Kulagina, et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. //Exp. Hematol. -1974. -N2. -P.83 -92:

56. Gang EJ, Jeong JA, Han S, Yan Q, Jeon C-J, Kim H. In vitro endothelial potential of human UC blood-derived mesenchymal stem cells. //Cytotherapy. -2006 Vol.8, N3. -P.215-227.

57. Gang EJ; Jeong JA, Hong SH, et al. Skeletal myogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood; //Stem Cells. -2004.-N22.-P.617-624.

58. Gang EJ, Jeong JA, Hong SH, Hwang SH, et al. Skeletal Myogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Isolated from Human Umbilical: Cord Blood. //Stem Cells.-2004.-N22.-P.617-624.

59. Gartner S., Kaplan H;S. Long-term culture of bone marrow cells. //Proc Natl Acad Sei USA. -1980. -N77. -P.4756-4759.

60. Gerson SL. Mesenchymal stem cells, no longer second class marrow citizens. //Nat Med. 1999. -N5. -P.262-264.

61. Gill M, Dias S, Hattori K,.et al. Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2+AC133+ endothelial precursor cells. //Circ Res. 2001-N88. -P.167-174.

62. Gluckman E, Broxmeyer HE, Auerbach AD et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. //N Engl J Med 1989. -N321. -P.1174 -1178.

63. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem, cell transplantation. // Exp: Hematol. -2000. -N28. -P.1197-205.

64. Gluckman E, Broxmeyer HE. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilical-cord blood//N. Engl. J. Med -2001 Vol.344, N24. -P.1860-1861.

65. Goodwin HS, Bicknese AR, Chien SN et al . Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat and neural markers. //Biol Blood Marrow Transpl. -2001. -N7. -P.581-588.

66. Groh ME, Maitra B, Szekely E, Koc ON. Human mesenchymal stem cells require monocyte-mediated activation to suppress alloreactive T cells. //Exp Hematol. -2005.-N33.-P.928-34.

67. Gronthos S, Simmons PJ. The growth factor requirements of STRO-l-positive human marrow stromal precursors under-deprived conditions in vitro. //Blood. -1995. -N85. -P.929-940.

68. Gronthos S, Zannettino AC, Hay SJ, Shi S, Graves SE, Kortesidis A, Simmons PJ. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. //J Cell Sci. -2003. -N116. -P:1827-1835.

69. Gronthos S., Simmons PJ. The growth factor requirements of STRO-l-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro. //Blood.-1995.-N85.-P.4

70. Guerriero A., Worford L., Holland H.K., et al. Thrombopoietin is synthesized by bone marrow stromal cells. //Blood 1997. -Vol.90, N9. -P.3444-3455.

71. Gutierrez-Rodriguez M, Reyes-Maldonado E, Mayani H. Characterization of the adherent cells developed in Dexter-type long-term cultures from human umbilical cord blood. //Stem Cells. -2000. -N18. -P.46-52

72. Hardeman EC, Chiu CP, Minty A, Blau HM. The pattern of actin expression in human fibroblast X mouse muscle heterokaryons suggests that human muscle regulatory factors are produced. //Cell. -1986. -N47. -P.123-130

73. Harraz M, Jiao C, Hanlon HD, et al. CD34+ blood-derived human endothelial cell progenitors. //Stem Cells. -2001. -N19. -P.304-312.

74. Haynesworth SE, Baber MA, Caplan AL. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal anibodies. -//Bone. -1992. -N13. -P.69-80.

75. Herzog E., Chai. Li., Krause S. Plasticity of marrow-derived stem cells. //Blood.2003. -N102. -P.3483-3493

76. Hildbrand P, Cirulli V, Prinsen RC et al . The role of angiopoietins in the development of endothelial cells from cord blood CD34- progenitors. //Blood2004. -N107. -P.2010-2019.

77. Honma T,Honmou O, Iihoshi S, et al. Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat. //Exp Neurol. -2006. -N199. -P.56-66.

78. Hou L, Cao H, Wang D et al . Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro. //Int J Hematol. -2003. -N78. -P.256-261.

79. Hows JM, Bradley BA, Marsh JC, Luft T, Coutinho L, Testa NG, Dexter TM. Growth of human umbilical-cord blood in longterm haemopoietic cultures. //Lancet. -1992. -Vol.340, N8811. -P.73-76

80. Huang S., Terstappen L.W. Formation of haematopoietic microenvironment and haematopoietic stem cell from single human bone marrow stem cells. //Nature.-1992. -N360. -P.745-749.

81. Igura K, Zhang X, Takahashi K, Mitsuru A, et al; Isolation and characterization of mesenchymal progenitor cells from chorionic villi of human placenta.//Gytotherapy:-2004:-Vol.6, N6.-P;543-53:

82. In't Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der Keur C, Noort WA, Glass FH, Willemze R, Fibbe WE, Kanhai HH Amniotic fluid as a novel source of mesenchymal stem cells for therapeutic transplantation. //Blood 2003. -N102. -P.1548-1549.

83. Ingram D, Mead L, Tanaka H et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. //Blood 2004. -N104. -P.2752-2760.

84. Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C, et aL Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. //Circulation.-2002.-N105.-P.732-738:

85. Jackson KA, Majka SM, Wang H, et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem; cells. //J Clin Invest. -2001. -N107. -P.1395-1402.

86. Javazon E.N., Goiter D.C., Schwarz E.J., Prockop D.J. Rat marrow stromal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells. //Stem cells. -2001. -N19. -P.219-225.

87. Javazon EH, Beggs KJ; Flake AW. Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging. //Exp Hematol. -2004. -N32. -P.414-425.

88. Jiang XX, Zhang Y, Liu B, et al. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. //Blood 2005. -N105. -P.4120-4126;

89. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL et al . Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. //Nature 2002. -N418. -P.41-49.

90. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, et al. Largaespada DA, Verfaillie CM. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. //Nature 2002. -N418. -P.41-49.

91. Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T et al . Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. //Exp Hematol 2002.-N30.-P.896-904.

92. Kalka C, Masuda H, Takahashi T, et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial; progenitor cells for therapeutic neovascularization. //Proc Natl Acad Sei U S A.-2000.-N97.-P.3422-3427.

93. Kalka C, Masuda H, Takahashi T, et al. Vascular endothelial growth factor 165 gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells in human subjects.//Circ Res.-2000.-N86:-P.1198-1202.

94. Kalka C, Tehrani H, Laudenberg B, et al. VEGF gene transfer mobilizes endothelial progenitor cells in patients with inoperable coronary disease. //Ann Thorac Surg. -2000. -N70. -P.829-834.

95. Kang HJ; Kim SC, Kim YJ et al: . Short-term phytohaemagglutinin-activated mononuclear cells induce endothelial progenitor cells from cord blood GD34+ cells. //Br J Haematol 2001. -N113. -P. 962-969.

96. Kang XQ, Zang WJ, Bao LJ, Li DL, Xu XL, Yu XJ. Differentiating characterization of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in vitro: //Cell Biology International: -2006. -N30. -P.569-575.

97. Kaushal S; Amiel GE, Guleserian KJj et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. //Nat Med. -2001. -N7.-P.1035-1040.

98. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. //Circulation. -2004. -N109. -P.1543-1549.

99. Klein A.K., Dyck J.A:, Stitze! K.A., Shimizu J., Fox L.A., Taylor N. Charakterization of canina fetal lymphohematopoiesis: studies of GM-CFC, CFU-L and CFU-f.//Exp.HematoL-1983. Vol.11, N.4. - P: 263-274.

100. Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. //Nat Med. -2001. -N7.-P.430-436.

101. Koegler G, Sensken S, Airey J et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. //J Exp Med.-2004.-N200:-P.123-135.

102. Kovacic JC, Graham RM. Stem-cell therapy for myocardial diseases. //Lancet.-2004.-N363.-P.1735-1736

103. Krampera M, Glennie S, Dyson J; et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. //Blood. -2003. -N101. -P.3722-3729.

104. Kuwana M, Okazaki Y, Kodama H, Satoh T, et al. Endothelial differentiation potential of human monocyte-derived multipotential cells. //Stem; Gells.-2006.-N24.-P.2733-2743.

105. Laughlin MJ, Barker J, Bambach B et al . Hematopoietic engraftment and survival in adult recipients of umbilical-cord blood from unrelated donors. //N Engl J Med. -2001. -N334. -P.l 815-1822.

106. Laughlin MJJ Eapen M, Rubinstein P et al. Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia. //N Engl J Med. -2004. -N351. -P.2265 -2275.

107. Lee OK, Kuo TK, Chen W-M et als. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. //Blood. -2004. -N103. -P.1669 -1675.

108. Long GD, Laughlin M, Madan.B et al . Unrelated umbilical cord blood transplantation, in adult patients. //Biol Blood Marrow Transpl. -2003. -N9. -P.772-780.

109. Lu-Lu L, Liu Y-J, Yang S-G, et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. //Haematologica. -2006. -N91. -P;1017-1026.

110. Maitra Bj Szekely E, Gjini K, et al. Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation; //Bone Marrow Transplant.-2004.-N33.-P.597-604.

111. Majumdar MK, Banks V, Peluso DP, Morris EA. Isolation, characterization, and chondrogenic potential, of human bone marrow-derived multipotential stromal cells.//J Cell PhysioL-2000.-N185.-P.198-106

112. Mareschi K, Biasin E, Piacibello W et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. //Haematologica. -2001. -N86.-P.1099-1100.

113. Martin D:R., Cox N.R., Hathcock T.L., Niemeyer G.P., Baker H;J. Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem, cells from: feline bone marrow. //Exp. Hematol. -2002. -N30.-P.879-886.

114. Mayani H., Rodrigues M.R., Espinoza L. et al. Kinetics of Hematopoiesis in Dexter-Type Long-Term? Cultures established from Human Umbilical Cord Blood Cells. //Stem Cells 1998. -N16. -P.127-135.

115. McNiece IK, Almeida-Porada G, Shpall EJ et al . Ex vivo expanded cord blood cells provide rapid engraftment in fetal sheep but lack long-term engrafting potential.//Exp Hematol.-2002.-N30.-P.612-616.

116. Meister B;, Herold M., Mayr A., et al. Interleukin-3, interleukin-6, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and erythropoietin; cord blood levels of preterm and term neonates. //Eur J Pediatr. -1993. -Vol.152, N7. -P.569-573.

117. Migliaccio Gj Migliaccio AR, Petti S, et al. Human embryonic hemopoiesis: kinetics of progenitors and precursors underlying, the yolk sac-liver transition.//J Clin Invest.-1986:-N78.-P.51-60.

118. Milner LA, Kopan R, Martin DIK et al . A human homologue of the Drosophila developmental gene, notch, is expressed in CD34- hematopoietic precursors.//Blood.-1994.-N83.-P.2057-2062.

119. Minguell JJ, Conget P, Erices A. Biology and clinical utilization: of mesenchymal progenitor cells. //Braz J Med Biol Res. -2000. -N33. -P.881-887.

120. Minguell JJ: Mesenchymal stem cells.//Exp Biol Med.-2001.-N226.-P.507-520.

121. Miranville A, Heeschen C, Sengenes C, et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived: stem cells. //Circulation. -2004. . -N110.-P:349-355.

122. Mitchell JB; Mcintosh K, Zvonic S, Garrett S, et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. //Stem Cells. -2006. -Vol.24, N2. -P.376-385:

123. Miura M, Miura Y, Padilla-Nash H. et all Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stem cells leads to malignant transformation. //Stem Cells. -2006. -Vol.24, N4. -P.1095-1103.

124. Moreau I., Duvert V., Caux C., et al. Myofibroblastic stromal cells isolated from human bone marrow induce the proliferation of both.early myeloid-and B-lymphoid cells.//Blood.-1993.-N82.-P.2396-2405.

125. Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. //J Cell Sci.-2000.-N113.-P.1161-1166.

126. Murga M, Yao L, Tosato/G. Derivation of endothelial cells from CD34-umbilical cord blood. //Stem Cells. -2004. -N22. -P.385-395.

127. Murohara T, Ikeda H, Duan J, et al; Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. //JClinlnvest. — 2000.-N105.-P.1527-1536.

128. Murohara T. Therapeutic vasculogenesis using human cord blood-derived endothelial progenitors. //Trends Cardiovasc Med. -2001. -Nil. -P.303-307.

129. Nauta AJ, Westerhuis G, Kruisselbrink AB, Lurvink EA. Donor-derived mesenchymal stem cells are immunogenic in an allogeneic host and stimulate donor graft rejection in a non-myeloablative setting. //Blood. -2006. -Vol.108, N6. -P.2114-2120.

130. Neuvel R.L.V.D. et al. Stromal cells (CFU-F) in yolk sac, liver, spleen and bone marrow of pre- and postnatal mice. // Br.J:Hematol. 1987 - N66. - P. 1520.

131. Nieda M, Nicol A, Denning-Kendall P, Sweetenham J, Bradley B, Hows J. Endothelial cell precursors are normal components of human umbilical cord blood. //Br J Haematol. -1997. -Vol;98, N3; -P.'775-777.

132. Orlic D, Kajstura J; Ghimentii S, et al: Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. //Proc Natl Acad Sci U S A. -2001. -N98. -P.10344-10349:

133. Oswald J, BoxbergerS, Jorgensen B, et al. Mesenchymal stem cells can.be differentiated: into j endothelial i cells in * vitro: .//Stem* Cells. -2004: -N22. -P;377-384.

134. Owen M. Marrow stromal stem cells. //JCellSci. -1988: -N10. -P.63-76.

135. Peault B. Hematopoietic stem cell emergence in embryonic life: developmental haematology revisited. //J Hematother. -1996. -N5. -P.369-378.

136. Peichev M| Naiyer A, Pereira D et al . Expression of VEGFR-2 and AC133 by. circulating;human CD34- cells identifies a population of functional endothelial precursors. //Blood^-2000.* -N95:.-P.952-958.,

137. Pelosi E, Valtieri M, Coppola S, Botta R, et al: Identification^ of the hemangioblast in postnatal life. //Blood. -2002. -N100. -P.3203-3208.

138. Perry TE, Roth SJ. Cardiovascular tissue engineering: constructing living tissue cardiac valves and blood vessels using bone marrow, umbilical cord blood, and peripheral blood cells.// J Cardiovasc Nurs. -2003. -Vol.18, N1. -P30-37.

139. Pesce M, Orlandi A, Iachininoto MG et al . Myoendothelial differentiation of human; umbilicalt cordi blood-derived stem cells in ischemic limb tissues. //Circ Res. -2003. -N93. -P.51-62.

140. Pittenger M., Mackay A., Beck S., et al. Multilineage potential of: adult human mesenchymal stem cells. //Science: -1999. -N84. -P.143-147.

141. Reyes M., Verfaillie C.M. Charakterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells. //Ann NY Acad Sei. -2001. -N938. -P:231-235.

142. Rocha V, Labopin M, Sanz G et al . Transplants of umbilicalcord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with acute leukemia. //N Engl J Med 2004. -N351. -P.2276 -2285.

143. Rochon C, Frouin V, Bortoli S, Giraud-Triboult K, et al. Comparison of gene expression pattern in?SP cellpopulatibns from four tissues to define common "sternness functions''. //Exp Cell Res. -2006. -Vol.312, N11.-P.2074-2082.

144. Rohde E, Malischnik C, Thaler D, Maierhofer T, et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. //Stem Cells. -2006. -N24. -P.357-367.

145. Sabin FR; Studies on the origim of. blood-vessels, and of red blood corpuscules> as seen in the. living blastoderm of chicks during the second day of incubation. Carnegie Contrib.//Embryol. -1920. -N272. -P.214-262.

146. Sata M, Saiura A, Kunisato A, et al. Hematopoietic stem-cells differentiate into vascular, cells that participate in- the: pathogenesis of atherosclerosis. //Nat Med. -2002. -N8. -P.403-409.

147. Schwartz RE, Reyes M, Koodie L et al . Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. //J Clin Invest.-2002:-N109:-P.1291-1302.

148. Scott R., Burger. Umbilical Cord Blood Stem Cells. Handbook of Transfusion Medicine Academic Press 2001-. -P.171-178.

149. Seo MJ, Suh SY, Bae YC, Jung JS. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun 2005, 328, 258-264

150. Shaheen Mj Broxmeyer HE. The humoral regulation of hematopoiesis. In: Hoffman R, Benz E, Shattil S, Furie B, Cohen H, Silberstein L, McGlave P, eds. Hematology: Basic Principles and Practice , 4th Edition. -2005. -P.233-265.

151. Shintani S, Murohará T, Ikeda H, et ah Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. //Circulation. -2001. -N103. -P.2776-2779.

152. Simmons PJ; Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. //Blood. -1991. -N78. -P.55-62.

153. Simmons PJ, Torok-Storb B: CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow. //Blood. -1991'. -N78. -P.2848

154. Steinbrook R. The cord-blood-bank controversies. //N Engl J Med. -2004. -N22.-P.2255-2257.

155. Strobel E.S., Gay R.E., Greenberg P.L. Characterization of the in vitro stromal microenvironment of human bone marrow. //Int J Cell Cloning. -1986. -Vol: 4, N5.-P.341-356.

156. Suda T, Takahashi N, Martin J. Modulation of osteoclast differentiation. //Endocr Rev.-1992.-N13.-P.66-80.223; Sugaya K, Alvarez A, Marutle A, Kwak YD, et al. Stem cell strategies for Alzheimer's disease therapy:

157. Takashina T. Haemopoiesis in the human yolk sac. //J Anat. -1987. -N151. -P.125-135.

158. Tiwari A, Hamilton G, Seifalian AM, et al. Regarding "Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood." //J. Vase Surg. -2002. -N35. -P.827.

159. Tolar J., Nauta A., Osborn M. et al. Sarcoma Derived from Cultured Mesenchymal Stem Cells. //Stem cells. -2007. -Vol.25, N2. -P.371-379.

160. Tontonoz P, Hu E. Spiegelman BM. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. //Cell. -1994. -N79.-P. 1147-1156

161. Torok SB: Cellular interactions. //Blood. -1988. -N72. -P.373-385.

162. Van DerBerg DJ; Sharma AK, Bruno E et al. Role of members of the Wnt gene family in human hematopoiesis. //Blood. -1998. -N92. -P.3189-3202.

163. Varnum-Finney B, Purton LE, Yu M et al . The notch ligand, jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. //Blood. -1998.-N91.-P.4084-4091.

164. Vasa M, Fichtischerer S, Aicher A> et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. //Circ Res. -2001. -N89. -P.el-e7.

165. Waller K.E., Olweus J., Lund-Johansen F. et al. The "Common Stem Cell" . hypothesis reevaluated: human fetal bone marrow contains separate populations ofhematopoietic and stromal progenitors. //Blood 1995; Vol.85, N9; -P.2422- 2435.

166. Walter DH, Rittig K, Bahlmann FH, et al. Statin therapy accelerates reendothelialization: a novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. //Circulation. -2002. -N105. -P.3017-3024.

167. Wang J-F, Wang L-J, Wu Y-F et al. Mesenchymal stem/progenitor cells in human umbilical cord blood as support for ex vivo expansion of CD34 hematopoietic stem cells and for chondrogenic differentiation. //Haematologica 2004.-N89.-P.837-844.

168. Wang Y., Huso D., Harrington J. et al. Outgrowth of; a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. //Cytotherapy. -2005. -Vol.7, N6. -P.509-519.

169. Weimann E., Rutkowski S., Reisbach G. G-CSF; GM-CSF and IL-6 levels in cord blood: diminished increase of G-CSF and IL-6 in preterms with perinatal infection compared to term neonates. //J Perinat Med. -1998. -Vol.26, N3. -P.211-218.

170. Wexler S, Donaldson C, Denning-Kendall P et al . Adult bone marrow is a rich; source of human mesenchymal' stem' cells but umbilical cord- and •; mobilized ;; adult blood are not: //Br J Haematol -2003. -N121. -P.368-374.

171. Wurmser AE, Nakashima-K, Summers RG, et al. Cell fusion-independent differentiation of neural stem1 cells to the endothelial lineage. //Nature. -2004: -N430. -P.350-356.

172. YoungrSup < Yoon,. et al. Unexpected severe: calcification! after transplantation of bone marrow cells in acute; myocardial,infarction //Gire 2004: -N109. -P.3154-3157.

173. Zanjani ED; Ascensao JL, Tavassoli M:. Liver-derived fetal hematopoietic stem cells selectively and? referentially.home to the; fetal bone; marrow. //Blood. -1993.-N81. -P.399-404.

174. Zhang Y , Li C , Jiang XX, Li H, et al. Comparison of mesenchymal stem cells from human placenta and bone marrow. //Chinese Med J. -2004, Vol. 117 N6. -P.882-887.

175. Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q, Chopp M. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells participate in cerebral neovascularization after focal cerebral ischemia in the adult mouse. //Circ Res. -2002. -N90. -P.284-288.

176. Ziegler BL, Valtieri M, Almeida Porada G, et al. KDR receptor: a key marker defining hematopoietic stem cells. //Science. -1999. -N285. -P.1553-1558.

177. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. //Tissue Eng. -2001. -N7. -P.211-228.