Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Савицкая, Оксана Александровна

• Савицкая, Оксана Александровна
• кандидат ветеринарных наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Савицкая, Оксана Александровна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Туберкулез крупного рогатого скота — проблема инфекционной патологии животных.

2.2. Иммунная система крупного рогатого скота: основные понятия.

2.3. Механизмы иммунного ответа у животных, ^ инфицированных M.bovis.

2.4. Иммунологические методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Антигены микобактерий.

3.2. Экспериментальные животные.

3.3. Благополучные и неблагополучные по туберкулезу хозяйства, аллергические и лабораторные исследования на туберкулез.

3.4. у-ИФН ИФА.

3.5. Электрофорез в ПААГ-ДСН.

3.6.Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Отработка постановки у-ИФН ИФА и внесение дополнений в методику.

4.2. Динамика постинфекционного Т-клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных М. bovis телят.

4.3. Сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и метода у-ИФН ИФА в благополучных по туберкулезу хозяйствах.

4.4. Сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и метода у-ИФН ИФА в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота»

Туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии в большинстве стран мира, включая Россию. Несмотря на проводимые профилактические и оздоровительные мероприятия, эпизоотическая ситуация по этой болезни остается напряженной и даже чревата осложнениями.

На современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остается диагностика этой болезни. В настоящее время основным и массовым методом диагностики туберкулеза является внутрикожная туберкулиновая проба (ВТП) с применением ППД-туберкулина для млекопитающих. Однако одной из важных проблем при диагностике туберкулеза ВТП является проблема неспецифических или парааллергических реакций на туберкулин. Проблемам, связанным с разработкой высокочувствительных и специфичных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, посвящены многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов (П.П.Вишневский, 1937; С.Н.Вышелесский, 1948; М.К.Юсковец, 1965; И.В.Поддубский, 1957, 1967; М.А.Сафин, 1981; А.С.Донченко, 1981, 1994; Б.Я.Хайкин и Л.М.Ходун, 1991; Н.П.Овдиенко, 1991; А.Х.Найманов, 1993; Ю.И.Смолянинов, 1994; Ю.А.Макаров, 1997; Р.А.Нуратинов, 1998; Т.В.Гребенникова с соавт., 1999; А.Н.Шаров с соавт., 2000; L.A.Corner, 1994; L.A.Sechi et al., 1999; R.E.Romero et al., 1999; M.J.Waters et al, 2000; C.Coetsier et al., 2000; H.Park et al., 2000; M. Amadori et al., 2002 и др.). Тем не менее, и в настоящее время прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота имеет две главные противоположные проблемы: с одной стороны - перевыявление, т.е. выявление здоровых животных с «парааллергическими» реакциями на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах, а с другой стороны — недовыявление зараженных туберкулезом животных в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Поэтому, при проведении исследований на туберкулез в благополучных хозяйствах следует повысить специфичность, а в неблагополучных - чувствительность диагностических исследований. Задачи эти не совсем простые, т.к. при повышении чувствительности ВТП (увеличением дозы, кратности введения туберкулина, изменением критериев оценки реакции и т.д.) одновременно снижается ее специфичность и наоборот, при увеличении специфичности - снижается чувствительность ВТП. Кроме того, известно, что на проявление аллергических реакций влияют многочисленные факторы внешней среды, индивидуальные особенности организма животного, условия кормления и содержания и т.д. Поэтому в целях совершенствования аллергической диагностики туберкулеза можно подобрать наиболее чувствительные и удобные места для введения туберкулина, оттитровать его дозу и усовершенствовать методы введения, подобрать оптимальные критерии оценки аллергических реакций. Однако, учитывая массовость и масштабность проведения исследований на туберкулез стандартизировать организмы всех исследуемых животных по реактивности из-за различных внешних и внутренних факторов вряд ли возможно, т.к. в разных регионах страны с различными климатическими зонами и с разной эпизоотической ситуацией по туберкулезу имеются разные животные с различным проявлением мико-бактериальной инфекции. По этой причине прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота одной внутрикожной туберкулиновой пробой не может быть идеальным диагностическим средством. Поэтому изыскание новых, современных дополнительных методов диагностики туберкулеза животных является весьма актуальным и перспективным и на сегодняшний день.

Известно, что при диагностике туберкулеза большое значение имеют иммунодиагностические методы, направленные на оценку функциональной активности Т-лимфоцитов. Это положение обусловлено тем, что исследованиями C.J.Thorns and J.A.Morris (1983) установлено, что при инфицировании млекопитающих M.bovis доминирующим является клеточный иммунный ответ. Дальнейшие исследования по изучению туберкулеза человека, крупного рогатого скота и других видов животных подтвердили эту концепцию (Wood P.R, Rothel J.S.,1994; Neill S.D. et al., 1994 и др.).

Основными диагностическими методами оценки Т-клеточного иммунного ответа при туберкулезе являются внутрикожная туберкулиновая проба, реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и разработанный сравнительно недавно (Rothel J.S.et al., 1990) «сэндвич»-ИФА на основе монокло-нальных антител, предназначенный для выявления у-интерферона (у-ИФН) в крови инфицированных животных (у-ИФН ИФА). Все методы предполагают использование ППД туберкулина в качестве антигена, стимулирующего пролиферацию Т- клеток in vivo (ВТП) или in vitro (РБТЛ и у-ИФН ИФА).

Внутрикожная туберкулиновая проба уже более 100 лет остается основным методом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. В основе метода лежит реакция организма на внутрикожное введение туберкулина сенсибилизированному животному, являющаяся наиболее ярким примером гиперчувствительности замедленного типа и представляющая собой иммунологически специфическую воспалительную реакцию, обусловленную Т- клетками. Метод ВТП характеризуется высокой чувствительностью, однако основным недостатком этого метода является достаточно высокий процент ложноположительных реакций, возникающих вследствие перекрестной реактивности между антигенами разных видов микобактерий.

РБТЛ является высокочувствительным методом определения специфического иммунного ответа на ППД-туберкулин для млекопитающих и оценки реактивности Т-клеток у инфицированных M.bovis животных. Однако длительность постановки реакции, необходимость выделения лимфоцитов из крови и использования радиоактивной метки для определения уровня клеточной пролиферации являются серьезными ограничениями для использования этого метода в клинической практике.

Достижения в области биотехнологии и иммунохимии сделали возможным применение метода ИФА для выявления и количественного определения уровня цитокинов (интерлейкинов, интерферонов, клеточных факторов, кемокинов и др.)- продуктов секреции различных типов клеток иммунной системы. Это направление интенсивно развивается и одной из наиболее показательных и успешных разработок является у-ИФН ИФА - один из новых перспективных методов прижизненной диагностики туберкулеза.

В настоящее время этот метод наряду с ВТП является узаконенным методом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в Австралии, Новой Зеландии и Румынии.

Теоретической основой разработки у-ИФН ИФА является тот факт, что в крови зараженных туберкулезом животных присутствуют сенсибилизированные Т-лимфоциты, способные к специфическому распознаванию антигенов имеющихся в 1111 Д-туберкулина для млекопитающих. В процессе иммунологического распознавания происходит стимуляция Т-клеток и как следствие этого выделение цитокина- у-интерферона, определяемого в крови методом «сэндвич»-ИФА. Обнаружение у-ИФН свидетельствует о наличии возбудителя туберкулеза в организме исследуемого животного. Для получения более достоверных результатов прижизненных диагностических исследований на туберкулез, большинство авторов рекомендуют использовать комплексный метод диагностики, т.е. одновременно два метода: внутрикож-ную туберкулиновую пробу и у-ИФН ИФА.

Высокая чувствительность и специфичность у-ИФН ИФА была подтверждена при проведении широкомасштабных диагностических исследований в США, Ирландии, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира (D.L.Whipple et al., 1995, 2001; M.Monaghan et al., 1997; O. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; TJ.Ryan et al., 2000; J.M.Pollock et al., 2000; B.M.Buddie et al., 2001; R.K.Katial et al., 2001; A.M.Perez et al., 2002 и др.).

К сожалению, в нашей стране этот метод совершенно не известен. Поэтому вопросы, связанные с изучением Т-клеточного иммунного ответа при туберкулезе крупного рогатого скота и возможности использования у-ИФН ИФА в качестве метода прижизненной диагностики туберкулеза на территории России, являются весьма актуальными и представляют значительный интерес как в научном, так и в практическом аспектах.

Цель работы. Сравнительная характеристика и оценка диагностической ценности реакций клеточного иммунитета при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Изучение возможности применения у-ИФН ИФА для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Основные задачи исследований:

1.Отработать методику постановки и учета результатов «сэндвич» -ИФА предназначенного для детекции у-ИФН в образцах крови крупного рогатого скота. Провести сравнительную оценку отечественных и голландских ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц, используемых в диагностике туберкулеза и определить возможность использования отечественных туберкулинов в коммерческом наборе «BOVIGAM™» (CSL Veterinary, Австралия) для стимуляции Тн1 -клеток крови in vitro.

2. Изучить динамику формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят. Для этого с помощью «сэн-двич»-ИФА определить уровень у-ИФН в крови зараженных туберкулезом животных в процессе постинфекционного иммуногенеза.

3. Провести сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.

4. Изучить возможность применения у-ИФН ИФА для дифференциации неспецифических реакций при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах.

Научная новизна работы.

Впервые проведена сравнительная оценка голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ГТПД- туберкулинов для птиц и показана возможность использования отечественного ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в коммерческом наборе «BOVIGAM™» для стимуляции Тн1 -клеток крови in vitro.

Комплексными исследованиями с использованием ВТП и у-ИФН ИФА изучена динамика формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят. Получены новые данные о сроках появления и максимального содержания у-ИФН в крови зараженных туберкулезом животных в процессе постинфекционного иммуногенеза.

Впервые в РФ проведены сравнительные испытания ВТП и у-ИФН ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Установлена высокая специфичность метода у-ИФН ИФА с использованием голландского ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц при исследовании животных после предварительно проведенной туберкулинизации отечественным аналогом.

Установлена возможность применения у-ИФН ИФА для дифференциации аллергических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах.

Практическая значимость исследований.

Метод у-ИФН ИФА целесообразно использовать как дополнительный метод прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах Российской Федерации. Установленные временные показатели диагностического появления у-ИФН в крови, могут служить ориентиром при оценке иммунного ответа животных, инфицированных M.bovis.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований механизмов формирования иммунного ответа основных популяций Т-лимфоцитов на различные антигены или виды микобактерий.

По результатам экспериментов разработаны «Методические рекомендации по определению у-интерферона методом иммуноферментного анализа (у-ИФН ИФА) для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» рассмотренные на заседании Ученого совета института и утвержденные директором ВИЭВ.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты экспериментов по изучению динамики формирования Т-клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят и определению уровня у-ИФН в крови зараженных туберкулезом животных в процессе постинфекционного иммуногенеза;

• результаты сравнительных исследований по определению диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА в качестве методов прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• 6-м Международном симпозиуме по ветеринарной иммунологии, Швеция, Уппсала, 2001;

• Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных», Москва, 2003;

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2004. Публикаиии. По материалам диссертации опубликовано две научные работы и три приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 15 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает 175 источников (12 отечественных и 163 зарубежных авторов).

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Савицкая, Оксана Александровна

6. выводы

1. Для прижизненной диагностики туберкулеза отработан метод «сэндвич»- ИФА, предназначенный для детекции у-ИФН в пробах крови крупного рогатого скота. Установлено, что метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.

2. Проведена сравнительная электрофоретическая оценка структурного состава голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц. Показана возможность использования отечественного ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в коммерческом наборе «BOVIGAM™ » для стимуляции Тн1 -клеток крови in vitro в дозе 50 мкл/мл.

3. Комплексными исследованиями с использованием внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА изучена динамика формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят. Определены сроки появления и максимального содержания у-ИФН в крови опытных животных в процессе постинфекционного иммуногенеза. Установлена максимальная 100%-ная совпадаемость результатов ВТП и у-ИФН ИФА на 135-е сутки после заражения. При этом у экспериментально зараженных телят диагностическое повышение уровня у-ИФН в крови происходило на 20-50 суток раньше, чем внутрикожная реакция на ППД-туберкулин для млекопитающих.

4. Показано, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, у-ИФН ИФА дает в 3 раза меньше ложноположительных результатов по сравнению с внутрикожной туберкулиновой пробой. При этом установлена 100%-я совпадаемость результатов полученных с помощью ВТП и у-ИФН ИФА при исследовании здоровых животных.

5. Установлено, что в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве, при исследовании инфицированных туберкулезом коров, результаты исследований с применением внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА совпали в 81,2% случаях.

6. Полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют об эффективности у-ИФН ИФА в качестве прижизненного (наряду с ВТП) метода иммунодиагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Установлено, что эффективность вышеуказанных методов, основанных на реакциях клеточного иммунитета, существенно возрастает при их совместном применении.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ у-ИФН ИФА целесообразно использовать как дополнительный метод прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в целях дифференциации аллергических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах Российской Федерации. Исследования с помощью метода у-ИФН ИФА рекомендуется проводить через 7-30 суток после проведения плановой туберкулинизации.

Установленные временные показатели диагностического появления у-ИФН в крови могут служить ориентиром при оценке иммунного ответа животных, инфицированных M.bovis.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В структуре инфекционных болезней животных туберкулез крупного рогатого скота занимает особое место по своему социальному и экономическому значению, нанося значительный экономический ущерб промышленному животноводству. При этом эффективность противоэпизоотических и профилактических мероприятий при туберкулезе, проводимых в системе мер по предупреждению возникновения и распространения болезни, в значительной степени зависит от своевременной постановки диагноза и удаления больных животных, как основного источника возбудителя инфекции, из оз-доравливаемых стад. Таким образом, ранняя прижизненная диагностика является наиболее эффективным средством борьбы с туберкулезом, о чем свидетельствуют многочисленные данные отечественных и зарубежных авторов (Н.П.Овдиенко, А.Х.Найманов, 1998; Т.В.Гребенникова с соавт., 1999; А.Н.Шаров с соавт., 2000; J.M.Pollock and P.Andersen, 1997; H.M.Vordermeier et al, 1999; M.J.Waters et al, 2000 и др).

В настоящее время, несмотря на проводимые профилактические и оздоровительные мероприятия, эпизоотическая ситуация по этой болезни остается напряженной и даже чревата осложнениями. Во многих экономически развитых странах отмечается увеличение заболеваемости туберкулезом людей и животных, появляются остро прогрессирующие формы болезни и резистентные штаммы возбудителя ко многим противотуберкулезным препаратам. Правительство Российской Федерации постановлением от 11 июня 1998 г. №582 утвердило Федеральную целевую программу «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в России на 1998-2004 годы».

Для проведения комплекса противотуберкулезных мероприятий, необходимы высокочувствительные и специфичные лабораторные исследования, роль которых чрезвычайно высока.

Однако, несмотря на развитие и расширение арсенала современных методов исследований, направленных на выделение и идентификацию возбудителя (прежде всего ПЦР и РАЛ), вопросы диагностики туберкулеза остаются до конца нерешенными, что значительно осложняет борьбу с этой болезнью.

В настоящее время ученые из ведущих стран мира большое значение придают не только вышеуказанным методам, но и современным иммуноди-агностическим методам (прежде всего ИФА), направленным на оценку функциональной активности Т-лимфоцитов при инфицировании животных M.bovis (Wood P.R, Rothel J.S.,1994; Neill S.D. et al., 1994 и др.) или на выявление специфических антител к различным антигенам микобактерий (Lya-shchenko К.Р. et al., 1998; Amadori M. et al., 2002 и др.). Это обстоятельство обусловлено, прежде всего, следующим: а) достижениями в изучении иммунной системы крупного рогатого скота и ее роли в иммунопатогенезе туберкулеза; б) достижениями в изучении структурного состава и биологических свойств различных видов микобактерий; в) получением и использованием моноклональных антител заданной специфичности, гомогенных по аффинности и изотипу.

Известно, что иммунологические методы, в основе которых лежит высокоспецифическое взаимодействие антител с антигенами, нашли широкое применение во всех фундаментальных и прикладных исследованиях, требующих индикации любых биоорганических субстанций (вирусов, бактерий, клеток, и т.д.). Последние десятилетия стали периодом интенсивного развития принципиально новых аналитических систем (ИФА, иммунохроматогра-фический метод и др.), которые предполагают применение специальных маркеров, позволяющих с высокой чувствительностью регистрировать минимальные количества образовавшихся в результате реакции иммунных комплексов. Преимущества этих методов заключаются не только в высокой чувствительности и уникальной специфичности, но и в применении инструментального учета результатов, что существенно повышает точность анализа и обуславливает возможность его автоматизации в процессе проведения массовых исследований.

В настоящее время различные модификации ИФА, основанные на применении как поли-, так и моноклональных антител, широко используются для диагностики инфекционных и паразитарных болезней, углубленной характеристики иммунного статуса здоровых и больных людей и животных, идентификации поверхностных антигенов клеток иммунной системы, контроля биологических препаратов.

Однако, если ИФА-методы, направленные на детекцию специфических антител к различным антигенам микобактерий еще находятся на стадии разработки и использования в научно-исследовательских лабораториях, то у-ИФН ИФА несколько лет назад появился на международном ветеринарном рынке в виде коммерчески доступного диагностического ИФА-набора. Этому предшествовал прогресс в изучении иммунной системы крупного рогатого скота и результатов интенсивных исследований, направленных на идентификацию и функциональную характеристику различных субпопуляций лейкоцитов и секретируемых ими продуктов, изучение организации генома и иммунологической роли главного комплекса гистосовместимости и т.д.

В настоящее время метод у-ИФН ИФА наряду с ВТП является узаконенным методом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в Австралии, Новой Зеландии и Румынии. Высокая чувствительность и специфичность метода была подтверждена при проведении широкомасштабных диагностических исследований в США, Ирландии, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира (D.L.Whipple et al., 1995, 2001; M.Monaghan et al., 1997; O. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; T.J.Ryan et al., 2000; J.M.Pollock et al., 2000; B.M.Buddie et al., 2001; R.K.Katial et al., 2001; A.M.Perez et al, 2002 и др.).

В 2001 г. у-ИФН ИФА рекомендован для использования в США в качестве дополнительного к ВТП метода прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

G. Jungersen с соавт. (2002) и более ранние исследования (H.Billman-Jacobe et al., 1992; J.R.Stabel, 1996; M.T.Collins et al., 1996, 2001 и др.) показали эффективность применения у-ИФН ИФА для диагностики парату-беркулеза крупного рогатого скота.

В связи с этим можно выделить три основные цели нашей работы:

Г11

1.С использованием коммерческого набора «BOVIGAM » определить уровень у-ИФН в крови, экспериментально зараженных M.bovis, телят и изучить динамику формирования Т- клеточного иммунного ответа у животных в процессе постинфекционного иммуногенеза.

2. Провести сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в различных регионах и хозяйствах РФ.

3. На основе полученных результатов изучить возможность применения у-ИФН ИФА в качестве дополнительного метода прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота на территории Российской Федерации.

Все выше перечисленные цели обусловили выбор опытных моделей настоящего исследования и методических подходов к решению поставленных задач.

На первом этапе необходимо было отработать методику постановки и учета результатов у-ИФН ИФА и определить возможность использования отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц в коммерческом у-ИФН ИФА наборе. В результате проведенных экспериментов была отработана методика постановки у-ИФН ИФА с учетом установленной возможности длительного хранения реагентов и использования туберкулинов отечественного производства при постановке реакции. При этом установлено, что при использовании отечественных ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в наборе «BOVIGAM™» их оптимальная доза необходимая для стимуляции Т-клеток крови in vitro, составляет 50 мкл/мл. Ранее исследования аналогичной направленности были проведены D.L.Whipple et al. (2001) которые сравнили ППД- туберкулин для млекопитающих и ППД- туберкулин для птиц, изготовленные в США с аналогичными туберкулинами, произведенными в Австралии с целью их возможного использования в коммерческом наборе «ВОVIGAM™». Авторами установлено, что значения ОП 450 при использовании ППД- туберкулина для млекопитающих, изготовленного в США, были выше аналогичных значений полученных с использованием туберкулина произведенного в Австралии, однако сравнительная интерпретация результатов была одинакова в обоих случаях. Это позволило авторам сделать вывод о возможности использования американских ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в австралийском у-ИФН ИФА наборе и подчеркнуть, что использование данного метода в сочетании ВТП может значительно улучшить диагностику туберкулеза крупного рогатого скота.

Таким образом, обобщив результаты, полученные при проведении первого этапа нашей работы, был сделан вывод о том, что наши исследования подтвердили мнение зарубежных ученых о высокой чувствительности, специфичности, информативности и воспроизводимости метода «сэндвич»-ИФА по определению у-ИФН в пробах крови крупного рогатого скота (J.S.Rothel et al., 1990, 1992; M.Monaghan et al., 1997; S.A.Pottumarthy et al., 1999; S.G.Rhodes et al., 2000, 2001; R.K.Katial et al., 2001; J.M. Pollock et al., 1996, 1997, 2000, 2002 и др.).

Дальнейшие наши исследования были направлены на изучение динамики формирования постинфекционного Т- клеточного иммунного ответа у телят и сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА в экспериментальных условиях. Для этого был проведен опыт по экспериментальному заражению телят M.bovis с последующими прижизненными и посмертными диагностическими исследованиями на туберкулез. Для экспериментального заражения использовали ВТП-негативных телят (п=6), полученных из благополучного по туберкулезу хозяйства, которым перорально 3-х кратно с интервалом в 24 часа вводили вирулентную культуру M.bovis (музейный штамм «8») в дозе 0,2 мг полувлажной бактериальной массы культуры/кг живой массы теленка (приблизио тельно 10 клеток М. bovis). Через 7 суток животным вводили культуру еще раз в такой же дозе. Животных контрольной группы (п=3) не заражали. Прижизненные исследования проводили в процессе постинфекционного иммуногенеза на 0, 7, 14, 21, 28, 35, 65, 85, 110 и 135 сутки после заражения с использованием аллергической пробы и у-ИФН ИФА, посмертные - сразу же после убоя животных (через год п.з.). Результаты патологоанатомических, культуральных и биологических методов исследований свидетельствовали о том, что телята опытной группы заразились туберкулезом. При этом установлено, что все телята контрольной группы оставались здоровыми в течение периода всего эксперимента, что было подтверждено результатами как посмертных, так и прижизненных исследований.

Результаты ИФА по определению динамики содержания у-ИФН в крови телят опытной группы в процессе постинфекционного иммуногенеза свидетельствовали о том, что Т-клеточный иммунный ответ формировался у всех экспериментально зараженных животных. При этом у этих животных установлены различия в сроках появления и относительном содержании у-ИФН в крови. В большинстве случаев (в 4-х из 6-ти) достоверное диагностическое увеличение уровня у-ИФН в крови отмечено на 35-е — 65-е сутки после заражения, в двух других — на 85-е и 110-е сутки п.з. соответственно. Самое высокое содержание у-ИФН установлено также у 4 телят: №1, 4, 2, 6 на 65-е (ОП 450 В-А равен 0,754), 110-е сутки п.з. (0,56) и на 135-е сутки (0,763 и 0,95) после заражения соответственно. У двух телят (№3 и №5) уровень у-ИФН в крови был значительно ниже и на 110-е сутки п.з. показатели ОП 450 В-А составляли 0,3 и 0,44 соответственно. Результаты изучения динамики Т-клеточного иммунного ответа у опытных животных также свидетельствовали о том, что в большинстве случаев после достижения своего максимального значения уровень у-ИФН в крови имел выраженную тенденцию или к своему снижению (у 3-х телят) или к увеличению (у 2-х телят). Только у одного теленка в процессе постинфекционного иммуногенеза уровень у-ИФН в крови после достоверного повышения оставался постоянным и на относительно низком уровне.

Результаты наших исследований по определению уровня у-ИФН в крови животных, экспериментально зараженных М. bovis, совпадают с результатами аналогичных исследований, проведенных зарубежными исследователями в последние годы. Так самые первые опыты, проведенные J.M.Pollock и P.Andersen (1997), показали, что у животных, экспериментально инфицированных М. bovis (п=4), начиная с 3-й недели п.з., формируется выраженный Т-клеточный ответ к антигенам микобактерий. При этом авторами установлено, что относительное количество у-ИФН в крови достигало максимума через 5 недель п.и., далее несколько снижалось к 7-й неделе и оставалось на достигнутом уровне до 16-й недели п.з. (срок наблюдения) с незначительной тенденцией к увеличению в конце эксперимента. S.G.Rhodes et al. (2000) отмечали сильный у-ИФН- иммунный ответ у экспериментально зараженных телят через 4-е недели после инфицирования. По их результатам этот ответ имел тенденцию к увеличению в течение 6-8 недель п.з. D.N.Wedlock et al. (2000) проводили опыты по оценке эффективности вакцинации телят препаратами, состоящими из белков культурального фильтрата М. bovis и рекомбинантного ИЛ-2 крупного рогатого скота, путем последующего инфицирования опытных животных вирулентным штаммом М. bovis Wag201. Исследователями установлено, что уровень у-ИФН увеличивался в крови животных через 2-е недели после иммунизации, через 4-е — достигал своего максимального значения после чего начинал снижаться и на момент экспериментального заражения (13-я неделя) доходил практически до нуля. Через 2 недели после проведения экспериментального заражения в крови животных резко увеличивался уровень у-ИФН, затем этот показатель достигал своего максимального значения (5 недель п.з.), снижался к 10-й неделе п.з. и далее практически не изменялся до 17-той недели п.з. (срок наблюдения). В опытах H.E.Kennedy et al (2002) достоверное увеличение у

ИФН в крови экспериментально инфицированных 6-ти месячных телят, деплетированных по WC1+ у5 Т-клеткам, наблюдалось уже на 19-39 сутки п.з.

Одновременно с проведением исследований по изучению динамики формирования постинфекционного у-ИФН - иммунного ответа у зараженных телят, на этой же экспериментальной модели нами была решена еще одна задача данного опыта - оценка диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА. Анализ полученных результатов позволил констатировать 100%-ную совпа-даемость результатов двух методов на 135-е сутки п.з., однако диагностическое повышение уровня у-ИФН, установленное методом ИФА, происходило на 20 — 50 суток раньше чем была зарегистрирована внутрикожная реакция животных на ППД- туберкулин для млекопитающих. Эти результаты согласуются с мнением W.Lilenbaum et al (1999) показавших в своих экспериментах возможность более раннего обнаружения (на 60 — 120 суток) животных, инфицированных М. bovis, с помощью у-ИФН ИФА по сравнению с ВТП.

Одной из главных задач, стоящих перед нами в процессе выполнения данной работы, была сравнительная оценка диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА в качестве методов прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ. В качестве опытных моделей для исследований были взяты животные, принадлежащие трем благополучным по туберкулезу хозяйствам (№1, п=20; №2, п=60 и №3, п=35) и одному неблагополучному по туберкулезу хозяйству (п=16).

При планировании и проведении экспериментов был использован опыт цитированных ранее зарубежных ученых проводивших подобные исследования в Австралии, Новой Зеландии, Ирландии, США, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира. Суммарные результаты сравнительных исследований по определению диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА представлены на рисунке 7. положительные в у-ИФН ИФА отрицательные в у-ИФН ИФА

0,5

1 1,5

ОП 450 проб А

2,5

Рисунок 7. Суммарные результаты исследований методом у-ИФН ИФА с использованием голландских ППД- туберкулина для птиц и ППД- туберкулина для млекопитающих.

На оси абсцисс представлены показатели ОП 450 проб, стимулированных ППД- туберкулином для птиц; на оси ординат - показатели ОП 450 проб, стимулированных ППД- туберкулином для млекопитающих. В исследованиях использованы пробы (п=131), полученные из четырех животноводческих хозяйств РФ, как положительные (п=100), так и отрицательные (п=31) в ВТП.

Результаты проведенных нами исследований показали, что все животные обследованных хозяйств, не реагирующие на ППД-туберкулин для млекопитающих в ВТП (п=31), были также отрицательными и в у-ИФН ИФА. Эти данные, а также результаты, полученные в опыте по экспериментальному заражению телят музейным штаммом М. bovis, свидетельствуют о том, что метод у-ИФН ИФА не давал ложноположительных результатов при исследовании здоровых животных. Эти данные были подтверждены отрицательными результатами проведенных в дальнейшем посмертных патологоанатомических и лабораторных исследований на туберкулез выборочно убитых ВТП-негативных животных.

Анализируя результаты исследований 16 реагировавших на туберкулин животных, принадлежащих неблагополучному по туберкулезу хозяйству (№4, Тамбовской области) следует отметить, что 13 животных были также положительными и в у-ИФН ИФА. При этом показатели ОП 450 В-А у этих животных составляли от 0,167 до 2,342, что в ряде случаев значительно выше аналогичных показателей, полученных при исследовании экспериментально зараженных телят. Это может свидетельствовать о том, что уровень у-ИФН в крови животных, инфицированных полевыми культурами М. bovis, может быть существенно выше, чем у животных, зараженных музейным штаммом М. bovis в эксперименте. В этих же исследованиях 3 животных дали положительную реакцию в ВТП и отрицательную - в у-ИФН ИФА. Однако результаты посмертных исследований этих животных были отрицательными, что позволило предположить, что они не болели туберкулезом.

При проведении сравнительных исследований животных, относящихся к благополучным по туберкулезу хозяйствам, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями (№1 и №3) все 29 животных, положительно реагирующих на ППД- туберкулин для млекопитающих в ВТП, были отрицательными в у-ИФН ИФА при использовании как голландских, так и отечественных туберкулинов для стимуляции Т-клеток in vitro. Дальнейшие исследования послеубойного материала с помощью культураль-ных и биологических методов, направленные на выделение и идентификацию M.bovis, не дали положительного результата. Таким образом, использование метода у-ИФН ИФА в этих хозяйствах позволило исключить ложно-положительные результаты ВТП при постановке комплексного диагноза на туберкулез.

Интересные результаты были получены в хозяйстве №2, где наблюдается достаточно выраженный разброс результатов ВТП и у-ИФН. Поголовье данного хозяйства требует дальнейшего обследования с целью подтверждения или отклонения диагноза. Как уже было отмечено (см. раздел 4.3.) появление в благополучном по туберкулезу хозяйстве большого количества реагирующих на туберкулин животных в ВТП и у-ИФН ИФА - положительных животных, может свидетельствовать либо о возникновении нового очага заболевания или являться о высокой степени сенсибилизации поголовья животных атипичными микобактериями. Ранее зарубежными авторами было установлено, что на результат у-ИФН ИФА существенно влияют следующие факторы: применение вакцины БЦЖ, глюкокортикостероидов и других препаратов, введенных до или после проведения туберкулинизации и способных усиливать или ослаблять Т-клеточный иммунный ответ у животных, что обуславливает необходимость проведения дополнительных разноплановых исследований (О. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; D.N. Wedlock et al., 2000 и др).

Результаты наших экспериментов по оценке диагностической ценности метода у-ИФН ИФА также подтвердили результаты цитированных в настоящей работе зарубежных авторов, установивших возможность дифференциальной диагностики животных, инфицированных микобактериями бычьего вида от животных, сенсибилизированных микобактериями птичьего вида. Так, в наших опытах, экспериментально зараженные M.bovis, телята не реагировали на ППД-туберкулин для птиц в у-ИФН ИФА. При этом, при проведении исследований в хозяйствах, 5 животных, положительно реагирующих на ППД- туберкулин для млекопитающих в ВТП, оказались положительными на М. avium в у-ИФН ИФА.

Наши обобщенные данные в сопоставлении с результатами зарубежных исследований последних лет, подтверждают положение об эффективности применения методов прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, основанных на реакциях Т-клеточного иммунитета. Так, О. R.Gonzalez Llamazares et al. (1999) сравнивали методы прижизненной диагностики болезни (ВТП и у-ИФН ИФА) по отношению к посмертным методам (ПЦР, культуральным и биологическим) при исследовании 1136 голов крупного рогатого скота из 85-ти стад Испании и установили следующее. Чувствительность метода у-ИФН ИФА (84,9%) была выше чем ВТП (80,2%), однако комбинация этих методов давала максимальную чувствительность — 92,2%. В своих исследованиях, проведенных в США D.L.Whipple et al. (1995, 2001) определили чувствительность ВТП как 80,4 — 84,4%, а у-ИФН ИФА -55,4 - 97,1% и установили, что максимальная эффективность использования этих двух прижизненных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота достигается при параллельной интерпретации их результатов.

J.A.Streeton et al (1998) определили чувствительность и специфичность метода у-ИФН ИФА для диагностики туберкулеза у людей после проведения ВТП как 90 и 98% соответственно.

После проведения экспериментов все исследователи рекомендовали использовать метод у-ИФН ИФА для совместного применения с ВТП в Национальных программах по ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота в своих странах. В большинстве случаев ученые предлагают исследовать кровь животных методом у-ИФН ИФА через 8 — 30 суток после проведения тубер-кулинизации (M.Monaghan et al., 1997; T.J.Ryan et al., 2000; B.M.Buddie et al., 2001; D.L.Whipple et al., 2001 и др). По их мнению, такая комбинация двух методов позволяет выявить 87 — 95,2% инфицированных M.bovis животных.

Таким образом, резюмируя весь изложенный в представленной работе материал, можно сделать общее заключение о том, что у-ИФН ИФА при совместном применении с внутрикожной туберкулиновой пробой, представляет диагностическую ценность в качестве дополнительного метода прижизненного обнаружения зараженных туберкулезом животных.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Савицкая, Оксана Александровна, 2004 год

1. Безгин В.М. Промышленная технология производства биологических препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота. Дисс.доктора биол.наук, М., 1999, 51 с.

2. Бороздин Э.К., Исаев М.К., Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. и др. Устойчивость быков некоторых пород и линий к туберкулезу при искусственном заражении / В кн.: Использование высокоценных сельскохозяйственных животных. М., 1988,29-36.

3. Гребенникова Т.В., Грабовецкий В.В., Кальнов C.JI. и др. Дифференциальная диагностика микобактерий методом полимеразной цепной реакции // Ветеринария, 1999, 3, 17-20.

4. Наставление по диагностике туберкулеза животных // М., 1986, 43 с.

5. Найманов А.Х., Косенко В.И., Якушева О.В. Туберкулез крупного рогатого скота при естественном и искусственном заражении // Труды ВИЭВ, 1991, т.69, 144-150.

6. Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. Основные направления и достижения науки в борьбе с туберкулезом и паратуберкулезом животных // Труды ВИЭВ, 1998, т.71, 195-214.

7. Трофимов И.Г. Туберкулез сельскохозяйственных животных (tuberculosis)//Лекция, 1997.

8. Туберкулез. Санитарные правила СП 3.1.091-96 Ветеринарные правила ВП 13.3.1310-96 //М., 1996.

9. Федоров Ю.Н., О.А.Верховский. Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии//Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с. 114-124.

10. Шаров А.Н., Ерошенко Л.А., Суханов И.П. и др. ПЦР при диагностике туберкулеза//Ветеринария, 2000, 2, 19-22.

11. Шаров А.Н., Ерошенко Л.А., Суханов И.П. и др. Эффективность методов прижизненной диагностики туберкулеза // Ветеринария, 2000, 2, 16.

12. Amadori М., Lyashchenko К.Р., Gennaro M.L. et al. Use of recombinant proteins in antibody tests for bovine tuberculosis. — Vet. Microbiol., 2002, 85, 379.

13. Andres M. Perez, Michael P. Ward and Viviana Ritacco Simulation-model evaluation of bovine tuberculosis-eradication strategies in Argentine dairy herds. -Preventive Veterinary Medicine, 2002, 54 (4), 351-360.

14. Assoian, R. К., В. E. Fleurdelys, H. C. Stevenson, P. J. Miller, D. K. Mad-tes, E. W. Raines, R. Ross, M. B. Sporn. 1987. Expression and secretion of type P transforming growth factor by activated human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6020.

15. Baliko, Z., L. Szereday, and J. Szekeres-Bartho. 7<TT lymphocytes in Mycobacterium tuberculosis infection. Thorax. 52:375.

16. Bartow, R. A., D. N. McMurray. 1998. Lymphocytes expressing FcT receptors suppress antigen-induced proliferation in cells from guinea-pigs infected with virulent Mycobacterium tuberculosis. Cell. Immunol. 184:51.

17. Bassey, E. O., and M. T. Collins. 1997. Study of T-lymphocyte subsets of healthy and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-'mfected cattle. Infect. Immun. 65:4869-4872.

18. Beerwerth, W. 1967. The culture of mycobacteria from feces of domestic animals and their significance for epidemiology and control of tuberculosis. Prax. Pneumol. 21:189-202.

19. Bendixen, P. H. 1978. Immunological reactions caused by infection with Mycobacteriumparatuberculosis. A review. Nord. Veterinaermed. 30:163-168.

20. Bensaid, A., M. Haddam. 1991. Individual antigens of cattle: bovine CD4 (BoCD4). Vet. Immunol. Immunopathol. 27:51.

21. Bland, J. M., and D. G. Altman. 1986. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet i:307-310.

22. Bluestone, J. A., D. Pardoll, S. O. Sharrow, B. J. Fowlkes. 1987. Characterization of murine thymocytes with CD3-associated T-cell receptor structures. Nature 326:82.

23. Boom, W. H., K. N. Balaji, R. Nayak, K. Tsukaguchi, K. A. 1994. Characterization of a 10- to 14-kilodalton protease-sensitive Mycobacterium tuberculosis H37Ra antigen that stimulates human 1ST cells. Infect. Immun. 62: 5511.

24. Boom, W.H., R.S.Wallis and K.A.Chervenak. 1991. Human Mycobacterium tuberculosis-reactive CD4+ T cell clones: heterogeneity in antigen recognition, cytokine production and cytotoxicity for mononuclear phagocytes. Infect. Immun. 59:2737-2743.

25. Brenner, M. В., J. McClean, D. P. Dialynas, J. L. Strominger, J. A. Smith, F. L. Owen, J. G. Seidman, S. Ip, F. Rosen, M. S. Krangel. 1986. Identification of a putative second T-cell receptor. Nature 322:145.

26. Buddie BM, Ryan TJ, Pollock JM, Andersen P, de Lisle GW. Use of ESAT-6 in the interferon-gamma test for diagnosis of bovine tuberculosis following skin testing. Vet Microbiol., 2001, 80 (l):37-46.

27. Buddie, В. M., F. E. Aldwell, A. Pfeffer, G. W. de Lisle, and L. A. Corner. 1994. Experimental Mycobacterium bovis infection of cattle: effect of dose of M. bovis and pregnancy on immune responses and distribution of lesions. N. Z. Vet. J. 42:167-172.

28. Buddie, В. M., G. W. de Lisle, A. Pfeffer, and F. E. Aldwell. 1995. Immunological responses and protection against Mycobacterium bovis in calves vaccinated with a low dose of BCG. Vaccine 13:1123-1130.

29. Chiodini, R. J., W. C. Davis. 1992. The cellular immunology of bovine paratuberculosis: the predominant response is mediated by cytotoxic 7/5 T lymphocytes which prevent CD4+ activity. Microb. Pathog. 13:447.

30. Clarke, C. J. 1997. The pathology and pathogenesis of paratuberculosis in ruminants and other species. J. Сотр. Pathol. 116:217.

31. Cocito, C., P. Gilot, M. Coene, M. de Kesel, P. Poupart, and P. Vannuffel. 1994. Paratuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 7:328-345.

32. Collins, M. T. 1996. Diagnosis of paratuberculosis. Vet. Clin. N. Am. Food. Anim. Pract. 12:357-371.

33. Collins, M. Т., G. Lisby, C. Moser, D. Chicks, S. Christensen, M. Reichelderfer, N. Hoiby, B. A. Harms, О. O. Thomsen, U. Skibsted, and V.

34. Binder. 2000. Results of multiple diagnostic tests for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in patients with inflammatory bowel disease and in controls. J. Clin. Microbiol. 38:4373-4381.

35. Collins, R. A., D. Wirling, S. E. Duggan, A. P. Bland, K. R. Parsons, C. J. Howard. 1999. itfT cells present antigen to CD4+ aPT cells. J. Leukocyte Biol. 63:707.

36. Collins, R. A., P. Sopp, I. Gelder, W. I. Morrison, C. J. Howard. 1996. Bovine t/S TcR+ T lymphocytes are stimulated to proliferate by autologous Theileria annulata-infected cells in the presence of interleukin-2. Scand. J. Immunol. 44:444.

37. Constant, P., F. Davodeau, M.-A. Peyrat, Y. Poquet, G. Puzo, M. Bonneville, J.-J. Fournie. 1994. Stimulation of human 7£T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands. Science 264:267.

38. Corner L.A. Postmortem diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Vet. Microbiol., 1994, 40, 53-63.

39. D'Sousa, C. D., A. M. Cooper, A. A. Frank, R. J. Mazzaccaro, B. R. Bloom, I. M. Orme. 1997. An anti-inflammatory role for 7<5T lymphocytes in acquired immunity to Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 158:1217.

40. Davis, W. C., W. C. Brown, M. J. Hamilton, C. R. Wyatt, J. A. Orden, A. M. Khalid, J. Naessens. 1996. Analysis of monoclonal antibodies specific for the IS TcR. Vet. Immunol. Immunopathol. 52:275.

41. Emery, D. L., F. H. Duffy, and P. R. Wood. 1988. An analysis of cellular proliferation and synthesis of lymphokines and specific antibody in vitro by leucocytes from immunized cattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 18:67-80.

42. Estes D. M. and Brown W. C. Type 1 and type 2 responses in regulation of Ig isotype expression in cattle. Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, 90, 1-10.

43. European Economic Community. 1980. EEC directive 80/219 EEC, amending directive 64/432 annexe B. Off. J. L047:25-32.

44. Ferrick, D. A., M. D. Schrenzel, T. Mulvania, B. Hsieh, G. Ferlin, H. Lep-per. 1995. Differential production of interferon-7 and interleukin-4 in response to Thl- and Th2-stimulating pathogens by 7ЛТ cells in vivo. Nature 373:255.

45. Fifis, Т., L. A. Corner, J. S. Rothel, and P. R. Wood. 1994. Cellular and humoral immune responses of cattle to purified Mycobacterium bovis antigens. Scand. J. Immunol. 39:267-274.

46. Follows, G. A., M. E. Munk, A. J. Gatrill, P. Conradt, S. H. E. Kaufmann.1992. 7lnterferon and IL-2, but not IL-4, are detectable in l/S T cell cultures after activation with bacteria. Infect. Immun. 60:1229.

47. Francis J., Seiler R.J., Wilkie I.W. et al. The sensitivity and specificity of various tuberculin tests using PPD and other tuberculins. — Vet. Rec., 1978, 103, 420-425.

48. Fu, Y.-X., R. Cranfill, M. Vollmer, R. van der Zee, R. L. O'Brien, W. Born.1993. In vivo response of murine 7$T cell to a heat shock protein-derived peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:322.

49. Gershwin L.J., Krakowka S., Olsen R.G.- Immunology and Immunopathol-ogy of Domestic Animals.-Mosby, St.Louis/ Baltimore/ Boston/ Chicago/ London/ Madrid/Philadelphia/Sydney/Toronto, 1995, 195p.

50. Gilot, P., and C. Cocito. 1993. Comparative analysis of three sensitins used in cutaneous testing for tuberculosis and paratuberculosis in cattle. FEMS Microbiol. Lett. 110:307-311.

51. Gorman N.T.- Immunology. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Eds. S.J.Ettinger and E.C.Feldman.- W.B. Saunders Co., Philadelphia/ London/ Toronto/Montreal/Sydney/Tokyo, 1995, vol.2, 1978.

52. Griffin, J. P., К. V. Harshan, W. K. Born, I. M. Orme. 1991. Kinetics of accumulation of Preceptor-bearing T lymphocytes in mice infected with live mycobacteria. Infect. Immun. 59:4263.

53. Haas, W., P. Pereira, S. Tonegawa. 1993. 1/5 cells. Ann. Rev. Immunol. 11:637.

54. Haregewoin, A., G. Soman, R. C. Horn, R. W. Finberg. 1989. Human Ш T cells respond to mycobacterial heat-shock protein. Nature 340:309.

55. Heegaard, P. M. H., and K. Muller. 1988. Lectins and the immune system. J. Immunol. Immunopharmacol. 8:239-247.

56. Hein, W. R., C. R. Mackay. 1991. Prominance of 7/6 T cells in the ruminant immune system. Immunol. Today 12:30.

57. Hewinson, R. G., S. L. Michell, W. P. Russell, R. A. McAdam, and W. R. Jacobs, Jr. 1996. Molecular characterization of MPT83: a seroreactive antigen of Mycobacterium tuberculosis with homology to MPT70. Scand. J. Immunol. 43:490-499.

58. Hirsch, С. S., Т. Yoneda, L. Averill, J. J. Ellner, Z. Toossi. 1994. Enhancement of intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis in human monocytes by transforming growth factor-Pi. J. Infect. Dis. 170:1229.

59. Hoft, D. F., R. M. Brown, S. T. Roodman. 1998. Bacille Calmette-Guerin vaccination enhances human 75T cell responsiveness to mycobacteria suggestive of a memory-like phenotype. J. Immunol. 161:1045.

60. Janeway C.A., Travers P.- Immunobiology. The Immune System in Health -and Disease.- Current Biology Ltd/Churchill Livingstone/Garland Publishing Inc., 1999, 635p.

61. Jorgensen, J. B. 1982. An improved medium for culture of Mycobacterium paratuberculosis from bovine faeces. Acta Vet. Scand. 23:325-335.

62. Jungersen G., A.Huda, J.J.Hansen, and P. Lind. Interpretation of the Gamma Interferon Test for Diagnosis of Subclinical Paratuberculosis in Cattle. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2002, 9, 2, 453-460.

63. Kaufmann, S. H. E., C. Blum, S. Yamamoto. 1993. Crosstalk between <*/P T cells and lis T cells in vivo activation of a/P T cell responses after 7IS T cell modulation with the monoclonal antibody GL3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9620

64. Kennedy H.E., Welsh M.D., Bryson D.G. et al. Modulation of immune responses to Mycobacterium bovis in cattle depleted of WC1+ 7JT cells. Infect. Im-mun., 2002, 70 (3), 1488-1500.

65. Koets, A. P., V. P. Rutten, A. Hoek, D. Bakker, F. van Zijderveld, К. E. Muller, and W. van Eden. 1999. Heat-shock protein-specific T-cell responses in various stages of bovine paratuberculosis. Vet. Immunol. Immunopathol. 70:105115.

66. Krebs, J. R., R. M. Anderson, T. Clutton-Brock, W. I. Morrison, D. Young, and C. Donnely. 1997. Bovine tuberculosis in cattle and badgers. Report to the Rt. Hon. Dr. Jack Cunningham M.P. MAFF Publications, London, United Kingdom.

67. Kronenberg, M. 1994. Antigens recognised by 75T cells. Curr. Opin. Immunol. 6:64.

68. Kuhnle, G., R. A. Collins, J. E. Scott, and G. M. Keil. 1996. Bovine inter-leukins 2 and 4 expressed in recombinant bovine herpesvirus 1 are biologically active secreted glycoproteins. J. Gen. Virol. 77:2231-2240.

69. Ladel, С. H., C. Blum, A. Dreher, K. Reifenberg, S. H. E. Kaufmann. 1995. Protective role of t/S T cells and a/P T cells in tuberculosis. Eur. J. Immunol. 25:2877.

70. Lanier, L. L., A. Weiss. 1986. Presence of Ti (WT31) negative T lymphocytes in normal blood and thymus. Nature 324:268.

71. Lathigra, R., Y. Zhang, M. Hill, M. J. Garcia, P. S. Jackett, and J. Ivanyi. 1996. Lack of production of the 19-kDa glycolipoprotein in certain strains of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol. 147:237-249.

72. Li, H., J. C. Ulstrup, Т. O. Jonassen, K. Melby, S. Nagai, and M. Harboe. 1993. Evidence for the absence of the MBP64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun. 61:1730-1734.

73. Lightbody, K. A., R. M. Girvin, D. A. Pollock, D. P. Mackie, S. D. Neill, and J. M. Pollock. 1998. Recognition of a common mycobacterial T cell epitope in MPB59 of Mycobacterium bovis. Immunology 93:314-322.

74. Lightbody, K. A., R. M. Girvin, D. P. Mackie, S. D. Neil, and J. M. Pollock. 1998. T-cell recognition of mycobacterial proteins MPB70 and MPB64 in cattle immunised with antigen and infected with Mycobacterium bovis. Scand. J. Immunol. 48:44-51.

75. Lilenbaum W., Schettini J.C., Souza G.N. et al. Comparison between a gamma-IFN assay and intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis in field trials in Brazil. Zentralbl. Veterinarmed, 1999, 46, 353-358.

76. Lyashchenko, K. P., J. M. Pollock, R. Colangeli, and M. L. Gennaro. 1998. Diversity of antigen recognition by serum antibodies in experimental bovine tuberculosis. Infect. Immun. 66:5344-5349.

77. MacHugh, N. D., A. Bensaid, C. J. Howard, W. C. Davis, W. I. Morrison. 1991. Analysis of the reactivity of anti-bovine CD8 monoclonal antibodies with cloned T cell lines and mouse L-cells transfected with bovine CD8. Vet. Immunol. Immunopathol. 27:169.

78. MacHugh, N. D., J. K. Mburu, M. J. Carol, C. R. Wyatt, J. A. Orden, W. C. Davis. 1997. Identification of two distinct subsets of bovine 7JT cells with unique cell surface phenotype and tissue distribution. Immunology 92:340.

79. Magnusson, M. 1961. Specificity of mycobacterial sensitins. I. Studies on guinea pigs with purified "tuberculin" prepared from mammalian and avian tubercle bacilli, Mycobacterium balnei, and other acid-fast bacilli. Am. Rev. Respir. Dis. 83:57-68.

80. Magnusson, M., and M. W. Bentzon. 1958. Preparation of purified tuberculin RT-23. Bull. W. H. O. 19:829-843.

81. McCole, D. F., M. L. Doherty, A. W. Baird, W. C. Davies, K. McGill, P. R. Torgerson. 1999. T cell subset involvement in immune responses to Fasciola he-patica infection in cattle. Parasit. Immunol. 21:1.

82. McDonald, W. L., S. E. Ridge, A. F. Hope, and R. J. Condron. 1999. Evaluation of diagnostic tests for Johne's disease in young cattle. Aust. Vet. J. 77:113-119.

83. Modlin, R. L., C. Pirmez, F. M. Hofman, V. Torigan, K. Uyemura, Т. H. Rea, B. R. Bloom, M. B. Brenner. 1989. Lymphocytes bearing antigen-specific 18 T-cell receptors accumulate in human infectious disease lesions. Nature 339:544.

84. Monaghan M., Quinn P.J., Kelly A.P. et al. A pilot trial to evaluate the y-interferon assay for the detection of Mycobacterium bovis infected cattle under Irish conditions.- Irish Vet. J., 1997, 50,229-232.

85. Muira, K., S. Nagai, M. Kinomoto, S. Haga, and T. Tokunaga. 1983. Comparative studies with various substrains of Mycobacterium bovis BCG on the production of an antigenic protein. Infect. Immun. 39:540-545.

86. Nabeshima, S., K. Hiromatsu, G. Matsuzaki, A. Mukasa, H. Takada, S. Yo-shida. 1995. Infection of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin in antibody-mediated 7JT-cell-depleted mice. Immunology 84:317.

87. Naessens, G., M. Selighem, N. MacHugh, Y. H. Park, W. C. Davis, and P. Toye. 1992. Selection of BoCD25 monoclonal antibodies by screening mouse L cells transfected with the bovine P55-interleukin 2 (IL-2) receptor gene. Immunology 76:305-309.

88. Neill S.D., Cassidy J., Hanna J. et al. Detection of Mycobacterium bovis infection in skin-test negative cattle with an assay for bovine gamma-interferon. -Vet. Record, 1994,135,134-135.

89. Neill S.D., Cassidy J., Hanna J. et al. Pathogenesis of Mycobacterium bovis in cattle. Vet. Microbiol., 1994, 40, 41-52.

90. Ng, К. H., F. E. Aldwell, N. Wedlock, J. D. Watson, and В. M. Buddie. 1997. Antigen-induced interferon-Y and interleukin-2 responses of cattle inoculated with Mycobacterium bovis. Vet. Immunol. Immunopathol. 57:59-68.

91. Nielsen, S. S., S. M. Thamsborg, H. Houe, and V. Bitsch. 2000. Bulk-tank milk ELISA antibodies for estimating the prevalence of paratuberculosis in Danish dairy herds. Prev. Vet. Med. 44:1-7.

92. Nielsen, S. S., S. M. Thamsborg, H. Houe, and V. Bitsch. 2000. Corrigendum to "Bulk-tank milk ELISA antibodies for estimating the prevalence of paratuberculosis in Danish dairy herds". Prev. Vet. Med., 46:297.

93. Olsen, I. and A.K.Storset. 2001. Innate IFN-gamma production in cattle in response to MPP14, a secreted protein from Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Scand. J. Immunol., 54:306-313.

94. Park H., Jang H., Kim C. et al. Detection and identification of Mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genus- and species-species PCR primers. J. Clin. Microbiol., 2000, 4080-4085.

95. Pechhold, К., D. Wesch, S. Schonelmaier, D. Kabelitz. 1994. Primary activation of Vr9-expressing 7<TT cells by Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 152:4984.

96. Pollock J. M. and Welsh M. D. The WC1+ 76T-cell population in cattle: a possible role in resistance to intracellular infection-Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, 89, 105-114.

97. Pollock JM, Girvin RM, Lightbody KA, Clements RA, Neill SD, Buddie BM, Andersen P. Assessment of defined antigens for the diagnosis of bovine tuberculosis in skin test-reactor cattle. Vet. Rec., 2000, 146(23): 659-65.

98. Pollock, J. M., and P. Andersen. 1997. Predominant recognition of the ESAT-6 protein in the first phase of infection with Mycobacterium bovis in cattle. Infect. Immun. 65:2587-2592.

99. Pollock, J. M., and P. Andersen. 1997. The potential of the ESAT-6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis. J. Infect. Dis. 175:1251-1254.

100. Pollock, J. M., D. A. Pollock, D. G. Campbell, R. M. Girvin, and A. D. Crockard. 1996. Dynamic changes in circulating and antigen-responsive T-cell sub-populations post-Mycobacterium bovis infection in cattle. Immunology 87:236-241.

101. Porro M, Viti S., Antoni G.- Ultrasensitive silver-stain method for the detection of proteins in polyacrylamide gels and immunoprecipitates on agarose gels.-Anal. Biochem., 1982, 127,316-321.

102. Pottumarthy, S., A. J. Morris, A. C. Harrison, and V. C. Wells. 1999. Evaluation of the tuberculin gamma interferon assay: potential to replace the Mantoux skin test. J. Clin. Microbiol. 37:3229-3232.

103. Pritchard, D. G. 1988. A century of bovine tuberculosis 1888-1988: conquest and controversy. J. Сотр. Pathol. 15:651-663.

104. Radford, A. J., P. R. Wood, H. Billman-Jacobe, H. M. Geysen, T. J. Mason, and G. Tribbick. 1990. Epitope mapping of the Mycobacterium bovis secretory protein MPB70 using overlapping peptide analysis. J. Gen. Microbiol. 136:265.

105. Rhodes, S. G., В. M. Buddie, R. G. Hewinson, H. M. Vordermeier. 2000. Bovine tuberculosis: immune responses in the peripheral blood and at the site of active disease. Immunology 99:195.

106. Rhodes, S. G., D. Gavier-Widen, В. M. Buddie, A. O. Whelan, M. Singh, R. G. Hewinson, H. M. Vordermeier. 2000. Antigenic specificity in experimental bovine tuberculosis. Infect. Immun. 68:2573.

107. Rhodes, S. G., Hewinson, R. G., Vordermeier, H. M. (2001). Antigen Recognition and Immunomodulation by {{gamma}}{{delta}} T Cells in Bovine Tuberculosis. J.Immunology, 166: 5604-5610.

108. Rhodes, S. G., Palmer, N., Graham, S. P., Bianco, A. E., Hewinson, R. G., Vordermeier, H. M. (2000). Distinct Response Kinetics of Gamma Interferon and Interleukin-4 in Bovine Tuberculosis. Infect. Immun. 68: 5393-5400.

109. Roche, P. W., C. G. Feng, and W. J. Britton. 1996. Human T cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64. Scand. J. Immunol. 43:662-670.

110. Roche, P. W., P. W. Peake, H. Billman-Jocobe, T. Doran, and W. J. Britton.1994. T-cell determinants and antibody binding sites on the major mycobacterial secretory protein MPB59 of Mycobacterium bovis. Infect. Immun. 62:5319-5326.

111. Romero R.E., Garzon D.L., Mejia G.A. et al. Identification of Mycobacterium bovis in bovine clinical samples by PCR species-species primers. -Can.J.Vet.Res., 1999, 63, 101-106.

112. Rook, G. A., J. W. Carswell, and J. L. Stanford. 1976. Preliminary evidence for the trapping of antigen-specific lymphocytes in the lymphoid tissue of "anergic" tuberculosis patients. Clin. Exp. Immunol. 26:129-132.

113. Rothel J.S., Jones S.L., Corner L.A. et al. A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-y and its use for the detection of tuberculosis in cattle.- Aust. Vet. J., 1990, 67, 134-137.

114. Rothel, J. S., S. L. Jones, L. A. Corner, J. C. Cox, and P. R. Wood. 1992. The gamma-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis in cattle: conditions affecting the production of gamma-interferon in whole blood culture. Aust. Vet. J. 69:1-4.

115. Ryan TJ, Buddie BM, De Lisle GW. An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing. Res. Vet. Sci., 2000, 69 (1): 57-61.

116. Sechi L.A., Dupre I., Sanguinetti et al. Simple and rapid identification of different species of Mycobacteria by PCR.- Mol. Cell. Probes, 1999, 13, 141-146.

117. Smyth, A. J., M. D. Welsh, R. M. Girvin, and J. M. Pollock. 2001. In vitro responsiveness of 7<TT cells from Mycobacterium bovis-infected cattle to mycobacterial antigens: predominant involvement of WC1+ cells. Infect. Immun. 69:89-96.

118. Sorensen, A. L., S. Nagai, G. Houen, P. Andersen, and A. B. Andersen.1995. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63:1710-1717.

119. Stabel, J. R. 1996. Production of gamma-interferon by peripheral blood mononuclear cells: an important diagnostic tool for detection of subclinical paratuberculosis. J. Vet. Diagn. Investig. 8:345-350.

120. Stabel, J. R. 2000. Cytokine secretion by peripheral blood mononuclear cells from cows infected with Mycobacterium paratuberculosis. Am.J.Vet.Res. 61: 754.

121. Stabel, J. R. 2000. Transitions in immune responses to Mycobacterium paratuberculosis. Vet. Microbiol. 77:465-473.

122. Sweeney, R. W., R. H. Whitlock, C. L. Buckley, and P. A. Spencer. 1995. Evaluation of a commercial enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of paratuberculosis in dairy cattle. J. Yet. Diagn. Investig. 7:488-493.

123. Thorns C.J. and Morris J.A. The immune spectrum of Mycobacterium bovis infection in some mammalian species: a review. Vet. Bull., Weybridge, 1983, 53, 543-550.

124. Tizard I.R.- Veterinary Immunology. An Introduction.- W.B.Saunders Co., Philadelphia/London/Toronto/Montreal/Sydney Tokyo, 1996, 890 p.

125. Toossi, Z., P. Gogate, H. Shiratsuchi, T. Young, J. J. Ellner. 1995. Enhanced production of TGF-P by blood monocytes from patients with active tuberculosis and presence of TGF-P in tuberculous granulomatous lung lesions. J. Immunol. 154:465.

126. Tsukaguchi, К., B. de Lange, W. H. Boom. 1999. Differential regulation of IFN-7, TNF-a and IL-10 production by CD4+ aPTCR+ T cells and У82+ 7<5T cells in response to monocytes infected with Mycobacterium tuberculosis-H37Ra. Cell. Immunol. 194:12.

127. Tsukaguchi, К., K. N. Balaji, W. H. Boom. 1995. CD4+ aPand 7*T cell responses to Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 154:1786.

128. Wahl, S. H. 1992. Transforming growth factor P(TGF-P) in inflammation: a cause and a cure. J. Clin. Immunol. 12:61.

129. Walravens К., V. Wellemans, V. Weynants et al. Analysis of the antigen-specific IFN-7 producing T-cell subsets in cattle experimentally infected with Mycobacterium bovis. —Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, 84, 29-41.

130. Waters, W. R., J. R. Stabel, R. E. Sacco, J. A. Harp, B. A. Pesch, and M. J. Wannemuehler. 1999. Antigen-specific B-cell unresponsiveness induced by chronic Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection of cattle. Infect. Immun. 67:1593-1598.

131. Wedlock D.N, Vesosky В., Skinner M.A. et al. (2000). Vaccination of cattle with Mycobacterium bovis culture filtrate proteins and interleukin-2 for protection against bovine tuberculosis. Infect. Immun. 68:5809-5815.

132. Werz, О., M. Brungs, D. Steinhilber. 1996. Purification of transforming growth factor PI from human platelets. Pharmazie 51:893.

133. Whipple D.L., Bolin C.A., Davis A.J. et al. Comparison of the sensitivity of the caudal fold skin test and a commercial y-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis.- Am. J. Vet. Res., 1995, 56 (4), 415-419.

134. Whitlock, R. H., and C. Buergelt. 1996. Preclinical and clinical manifestations of paratuberculosis (including pathology). Vet. Clin. N. Am. Food. Anim. Pract. 12:345-356.

135. Wiker, H. G., K. Sletten, S. Nagai, and M. Harboe. 1990. Evidence for three separate genes encoding the proteins of the mycobacterial antigen 85 complex. Infect. Immun. 58:272-274.

136. Wood P.R, Rothel J.S. In vitro immunodiagnostic assays for bovine tuberculosis. Vet. Microbiol., 1994,40, 125-135.

137. Wyatt, C. R., C. Madruga, C. Cluff, S. Parish, M. J. Hamilton, W. Goff, W. C. Davis. 1994. Differential distribution of 7<TT-cell receptor lymphocyte subpopulations in blood and spleen of young and adult cattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 40:187.

138. Young, D., L. Kent, A. Rees, J. Lamb, and J. Ivanyi. 1986. Immunological activity of a 38-kilodalton protein purified from Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 54:177-183.

139. Young, D., R. Lathigra, R. Hendrix, D. Sweetser, and R. A. Young. 1988. Stress proteins are immune targets in leprosy and tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4267-4270.

140. Young, R. A., B. R. Bloom, С. M. Grossinsky, J. Ivanyi, D. Thomas, and R. W. Davis. 1985. Dissection of Mycobacterium tuberculosis antigens using recombinant DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2583-2587.