Денатуранты и стабилизаторы структуры белков: Анализ предпочтительной сольватации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат химических наук Ковригин, Евгений Леонидович

• Ковригин, Евгений Леонидович
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ковригин, Евгений Леонидович

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ б

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Явление предпочтительной сольватации как основа механизмов стабилизации/дестабилизации структуры белков в водных растворах с высоким содержанием неводной компоненты

2.1.1 Предыстория вопроса

2.1.2 Термодинамический анализ влияния состава раствора на

равновесия (денатурационное, растворение и олигомеризация белков) И

2.1.2.1 Основные величины И

2.1.2.2 Связь между предпочтительными взаимодействиями и молекулярными контактами

2.1.3 Экспериментальные наблюдения

2.1.3.1 Выделение вкладов воды и добавки в предпочтительную сольватацию

2.1.3.2 Предпочтительная гидратация и стабилизация белков

2.1.3.3 Два основных типа предпочтительной гидратации

2.1.3.3.1 Первый тип: неспецифическое взаимодействие

2.1.3.3.2 Второй тип: специфическое взаимодействие

2.2 Стабилизация и денатурация: калориметрия и нетермодинамические

методы

2.2.1 Температурная зависимость стабильности белков в смешанных растворителях

2.2.1.1 Влияние малополярных органических добавок на термостабильность, энтальпию и скачок теплоемкости при денатурации. Предсказание температур схождения энтропии и энтальпии

2.2.1.2 Влияние стабилизаторов на термодинамические параметры

денатурации. Скачок теплоемкости. Температуры схождения энтальпий

2.2.1.3 Комбинированное использование денатурационных данных и

равновесного диализа

2.2.1.4 Стабилизация нативного свернутого состояния белка не обязательно требует от растворителя способности формировать упорядоченные кластеры

вокруг гидрофобных групп

2.2.1.5 Гипотетический эффект стабилизации белков при пониженных

температурах малыми концентрациями денатурантов

2.2.2 Структурные исследования белков в смешанных средах: возникновение ненативных лабильных конформаций белковой цепи

2.2.3 Белки в средах с низким содержанием воды. Ферментативная активность в смешанных средах 47 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Реактивы

3.2 Приготовление буферных растворов с высоким содержанием

неводной компоненты

3.2.1 Буферные растворы

3.2.2 Измерение реального рН водно-органической смеси

3.2.3 Контроль состава раствора (рефрактометрия и гравиметрия)

3.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка в водно-органической смеси

3.4 Контроль мономолекулярности нативного состояния белка

3.5 Сканирующая микрокалориметрия 57 3.5.1 Оборудование и подготовка препаратов 57 3-5.2 Экспериментальые проблемы, вызванные высоким содержанием неводной компоненты

3.5.3 Первичная обработка термограмм тепловой денатурации

3.5.4 Обработка результатов экспериментов методом наименьших квадратов

3.6 Методы расчета основных термодинамических функций

стабилизации нативной структуры лизоцима

3.6.1 Выбор уравнений для подгонки экспериментальных значений температуры и энтальпии

3.6.2 Аналитические уравнения для энтропии и свободной энергии стабилизации структуры, поглощения протонов и скачка сольватации при переходе из нативного в денатурированное

состояние

3.7 Измерение давления насыщенного пара над водными растворами органических веществ

3.7.1 Аппарат для измерения давления паров

3.7.2 Вычисление парциального давления водяного пара

3.7.3 Вычисление коэффициентов активности

ЗЛА Температурная зависимость коэффициентов активности

3.7.5 Измерения парциальной удельной энтальпии воды в растворах полиспиртов

3.8 Расчет скачка предпочтительной сольватации при температурах тепловой денатурации на основе денатурационных данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Исследование стабилизирующего влияния полиспиртов

4.1.1 Исследование активности воды в растворах полиспиртов

4.1.2 Расчет скачка предпочтительной сольватации при тепловой денатурации лизоцима в растворах полиспиртов

4.2 Исследование дестабилизирующего эффекта органических неионных

денату рантов

4.2.1 Исследование тепловой денатурации лизоцима методом сканирующей калориметрии

4.2.2 Расчет активности компонентов в растворах ряда органических неионных соединений

4.2.3 Расчет изменения предпочтительной сольватации

4.3 Исследование тепловой денатурации лизоцима в растворах

ацетонитрила методом сканирующей калориметрии

4.3.1 Контроль кинетики денатурации

4.3.2 Результаты сканирующей калориметрии

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1 Термодинамика влияния стабилизирущих добавок на лизоцим

5.2 Термодинамика влияния денатурирующих добавок на лизоцим

5.2.1 Корелляция скачка предпочтительной сольватации при денатурации лизоцима в водных растворах ряда негомологичных органических соединений с их активностью

5.2.2 Различие зависимостей денату рационного скачка сольватации лизоцима в растворах ДМ С О и других рассмотренных соединений

5.3 Температурная зависимость термодинамических параметров

стабилизации лизоцима в смешанном растворителе

5.3.1 Энтальпия разворачивания

5.3.2 Термодинамическая стабильность лизоцима в водных растворах

МеСЫ

5.3.3 Поглощение протонов при разворачивании

5.3.4 Скачок предпочтительной сольватации (разность между

нативным и денатурированным состоянием белка)

5.3.5 Противоречия, возникающие при моделировании взаимодействия смешанного растворителя с поверхностью лизоцима

6. ВЫВОДЫ

7. БЛАГОДАРНОСТИ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Денатуранты и стабилизаторы структуры белков: Анализ предпочтительной сольватации»

1. ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время проблема предсказания влияния сложного растворного окружения на стабильность и конформационную подвижность белковых макромолекул является одним из весьма актуальных вопросов физики белка. Растворное окружение белков in vivo представляет собой сложную среду, состоящую из множества специфических и неспецифических лигандов (в число которых входит и вода), взаимодействующих с белковой поверхностью. В связи с этим, возникает насущная необходимость научиться количественно предсказывать влияние денатурирующих и стабилизирующих добавок на белки в водных растворах. Решение этой задачи даст возможность a priori оценивать стабильность белков в реальном многокомпонентном окружении в условиях как нормальных, так и стрессовых.

Кроме того, одним из плодотворных и многообещающих направлений энзимологии является использование многокомпонентных сред для проведения ферментативного катализа. Необходимость использования различных растворных добавок здесь обусловлена возможностью управления специфичностью и скоростями катализа, что делает многие ферментные системы реально применимыми в биотехнологии. Будучи одним из критически значимых факторов для осуществления каталитической функции, стабильность ферментов в применяемых смешанных растворителях до сих лор количественно не оценивалась и выбор сред для катализа ведется практически методом "проб и ошибок". Разработка количественных представлений о стабилизации белков в присутствии растворных добавок различной природы способна стимулировать прогресс в этой важной области исследований.

Диссертация посвящена изучению параметров стабилизации третичной структуры лизоцима куриного яйца в водных растворах ряда веществ, которые оказывают как стабилизирующее, так и денатурирующее действие на белок. Лизоцим был избран как наиболее удобный объект для такого рода исследования, поскольку это относительно небольшой, хорошо растворимый белок, процесс разворачивания которого близок к механизму "все-или-ничего" во всех практически изученных условиях. Термодинамика стабилизации этого белка в водных растворах и растворах солей, мочевины и гуанидин гидрохлорида достаточно подробно изучена, что формирует хорошую базу для исследования механизмов

взаимодействия белковой поверхности с ко-растворителями менее полярной природы. Выбор веществ, влияние которых на лизоцим изучалось в данной диссертации, был обусловлен как практической важностью данных ко-растворителей с точки зрения молекулярной биологии и ферментативного катализа, так и интересами физической химии белков. В диссертации были исследованы и проанализированы параметры стабилизации лизоцима в растворах следующих веществ: (1) денатурантов - ацетон, диоксан, диметилсульфоксид, ацетонитрил, метанол, этанол, пропанол; (2) стабилизаторов: этиленгликоль, глицерин, мезо-эритрит, ксилит, сорбит, мезо-инозит.

Полученные результаты позволяют

(1) сделать предположения о возможном общем механизме действия ряда органических неионных денатурантов,

(2) критически пересмотреть существующую гипотезу относительно стабилизации белков в присутствии полиспиртов,

(3) впервые подтвердить существовавшую ранее гипотезу о возможности стабилизации структуры белка малыми концентрациями органического неионного денатуранта при низких температурах.

Диссертация состоит из двух основных частей. Первая - Обзор Литературы посвящена рассмотрению текущего состояния проблем связанных со стабильностью, структурой и функцией белков в смешанных средах. Вторая часть, -экспериментальная, включает в себя описание материалов и методов использованных и разработанных в диссертации, результаты работы и их обсуждение.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Ковригин, Евгений Леонидович

6. выводы

1) Показано, что стабилизирующее влияние полиспиртов на лизоцим (измеряемое как скачок сольватации при тепловой денатурации) монотонно увеличивается в гомологическом ряду с ростом числа гидроксиметильных групп в молекуле полиспирта (с ростом мол. веса/объема) и не коррелирует с понижением активности воды в тех же растворах. Усиление сети водородных связей воды в присутствии полиспиртов не является, таким образом, главным фактором, вызывающим стабилизацию белка. Корреляция стабилизирующего эффекта с молекулярным весом добавки указывает на то, что главную роль в эффекте полиспиртов на стабильность лизоцима играет, по-видимому, неспецифическое исключение молекул полиспирта из сольватной оболочки белка за счет их молекулярных размеров.

2) Обнаружена группа структурно негомологичных органических веществ, чье дестабилизирующее влияние на лизоцим в начальном диапазоне концентрации зависит только от величины их термодинамической активности в растворе.

3) Установлено, что характер взаимодействия неводного компонента с водой не определяет прямо стабильности белка в смешанном окружении. По-видимому, доминирующую роль в стабилизации/дестабилизации белковой структуры должны играть непосредственные взаимодействия поверхности белка с добавленным неводным компонентом.

4) Показано, что дестабилизирующее влияние ацетонитрила на лизоцим уменьшается при понижении температуры и сменяется стабилизирующим в области небольших концентраций ацетонитрила. Это подтверждает гипотезу о возможности стабилизации белков низкими концентрациями органических неионных денатурантов за счет усиления гидрофобного эффекта в таких растворах. Показано, что электростатический вклад в это явление относительно невелик.

5) Обнаружено, что при определенном содержании ацетонитрила в среде (около 0.06 мольных долей) разность в предпочтительной сольватации нативного и денатурированного лизоцима практически не зависит от температуры на интервале, как минимум, в 60 К, тогда как в области разбавленного раствора температурная зависимость этой величины весьма велика.

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю Сергею Александровичу Потехину, а также всем сотрудникам группы термодинамики белка за помощь в процессе работы над диссертацией и теплую дружественную атмосферу, способствовавшую плодотворной работе. Автор таже очень благодарен всем сотрудникам Института белка, с кем ему пришлось сотрудничать и просто работать рядом, за доброе отношение и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ковригин, Евгений Леонидович, 1999 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вревский М.С. (1953) Теория растворов, Изд. АН СССР, Москва.

2. Измайлов Н.А. (1966) Электрохимия растворов, Химия, Москва.

3. Ковригин Е.Л., М.Д.Киркитадзе, С.А.Потехин (1996) Энтальпия стабилизации структуры лизоцима куриного яйца в водных растворах диметилсульфоксида, Биофизика 41, вып.З, стр. 549-553,

4. Ковригин Е.Л., С.А.Потехин (1996) Микрокалориметрическое исследование влияния диметилсульфоксида на тепловую денатурацию лизоцима", Биофизика 41, вып.6, стр. 1201-1206,

5. Коган В.Б., Фридман В.М. (1957) Справочник по равновесию между жидкостью и паром в бинарных и многокомпонентных системах, Госхимиздат, Ленинград.

6. Коган В.Б., Фридман В.М., Кафаров В.В. (1966) Равновесие между жидкостью и паром, Наука, Москва.

7. Потехин С.А., Ковригин Е.Л. (1998) Влияние кинетических факторов на тепловую денатурацию и ренатурацию биополимеров. Биофизика 43 (2) 223232

8. Alexandrescu A., Ng Y-L. and Dobson С.M. (1994) Characterization of a trifluoroethanol-induced partially folded state of alpha-lactalbumin. J. Mol. Biol. 235, 587-599

9. Arakawa T., Bhat R., Timasheff S.N. (1990a) Preferential interactions determine protein solubility in three-component solutions: The MgCl2 system. Biochemistry, 29, 1914-1923

10. Arakawa T., Bhat R., Timasheff S.N. (1990b) Why preferential hydration does not always stabilize the native structure of globular proteins, Biochemistry 29, 1924-1931

11. Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y., .Crowe J.H (1990c) "The basis for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis", Cryobiology 27, 401-415,

12. Arakawa T., Timasheff S.N. (1982a) Stabilization of protein structure by sugars. Biochemistry 21, 6536-44

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

Arakawa T., Timasheff S.N. (1982b) Preferential interaction of proteins with salts in concentrated solutions. Biochemistry 21, 6545-52

Arakawa T., Timasheff S.N. (1983) Preferential interaction of proteins with solvent components in aqueous amino acid solutions. Arch. Biochem. Biophys. 224, 169-177.

Arakawa T., Timasheff S.N. (1984a) Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts: Balance between hydration and salt binding. Biochemistry 23, 5912-23

Arakawa T., Timasheff S.N. (1984b) Protein stabilization and destabilization by guanidinium salts. Biochemistry 23, 5924-29

Arakawa T., Timasheff S.N. (1984c) The mechanism of action of Na-glutamate, lysine HC1 and piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) in the stabilization of tubulin and microtubule formation., J. Biol. Chem. 259, 4979-4986,

Arakawa T., Timasheff S.N. (1985a) Mechanism of poly(ethylene glycol) interaction with proteins, Biochemistry 24, 6756-6762

Arakawa T., Timasheff S.N. (1985b) The stabilization of proteins by osmolytes.,Biophys. J. 47, 411-414

Baldwin R.L. (1989) How does protein folding get started?, Trends Biochem. Sci. 14, 291-294

Baldwin R.L. (1996) How Hofmeister ion interactions affect protein stability, Biophys J. 71, 2056-2063

Ben-Naim A., Baer S. (1964) Solubility and thermodynamics of solution of argon in the water-ethanol system, Trans. Faraday Soc. 60, 1736

Ben-Naim A., Hidrophobic Interactions., Plenum Press, New York, (1978)

Ben-Naim A., Moran G. (1965) Solubility and thermodynamics of solution of argon in the water + p-dioxane system, Trans. Faraday Soc. 61, 821

Bhat R., Timasheff S.N. (1992) Steric exclusion is the principal source of the preferential hydration of proteins in the presence of polyethylene glycols, Protein Science 1, 1133-43

26. Biringer R.G., Fink A.L. (1982) Methanol-stabilized intermediates in the thermal unfolding of ribonuclease A. Characterization by 1H nuclear magnetic resonance, J. Mol. Biol. 160, 87-116

27. Brandts J.F. (1969) in Structure and Stability of Biological Macromolecules, pp. 213-290, NY: Marcel Dekker, 694 pp.

28. Brandts J.F., and Hunt L. (1967) The thermodynamics of protein denaturation. III. The denaturation of ribonuclease in water and in aqueous urea and ethanol mixtures., J. Amer. Chem. Soc. 89, 4826-4838

29. Brandts P.M., Middelkoop C.M., Gelsema W.J., DeLigny C.L. (1986) Hydrophobic interaction chromatography of simple compounds on alkyl-agarose with different alkyl chain lengths and chain densities. Mechanism and thermodynamics., J. Chromatogr. 356, 247-259

30. Bull H.B., Breeze K. (1968) Protein hydration. 1 Binding sites. Arch. Biochem. Biophys. 128, 488-496

31. Carpenter J.F., Crowe J.H. (1988) The mechanism of cryoprotection of proteins by solutes, Cryobiology 25, 244-255

32. Casassa E.F., Eisenberg H. (1964) Thermodynamic analysis of multicomponent solutions. Adv. Prot. Chem. 19, 287-395

33. Cheek P.J., Lilley T.H. (1988) The enthalpies of interaction of some amides with urea in water at 25C. J. Chem. Soc. Faraday trans. I, 84, 1927-40

34. Chicz R.M. and Regnier F.E. (1990) High-performance liquid chromatography: effective protein purification by various chromatographic modes. Methods Enzymol. 182, 329-421

35. Cohn E.J., Edsall J.T., (1943) Proteins, Amino Acids and Peptides, NY, Reinhold

36. D or dick J. S. (1989) Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents. Enzyme Microb. Technol. 11, 194

37. Eisenberg H. (1994) Protein and nucleic acid hydration and cosolvent interactions: establishment of reliable baseline values at high cosolvent concentrations, Biophysical Chemistry 53, 57-68

38. Fink A.L. (1986) Effects of cryoprotectants on enzyme structures. Cryobiology 23, 28-37

39. Fink A.L., Painter B. (1987) Characterization of the unfolding of ribonuclease A in aqueous methanol solvents Biochemistry 26, 1665-71

40. Fu L., Freire E. (1992) On the origin of the enthalpy and entropy convergence temperatures in protein folding., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9335-9338

41. Fujita Y., Iwasa Y., Noda Y. (1982a) The effect of polyhydric alcohols on the thermal denaturation of lysozyme as measured by differential scanning calorimetry. Bull. Chem. Soc. Jpn. 55, 1896-1900

42. Fujita Y., Izumiguchi S., Noda Y. (1982b) Effect of dimethylsulphoxide and homologs on the thermal denaturation of lysozyme as measured by differential scanning calorimetry. Int.J.Pept. 19, 25-31.

43. Fujita Y., Noda Y. (1983) The effect of organic solvents on the thermal denaturation of lysozyme as measured by differential scanning calorimetry, Bull. Chem. Soc. Jpn 56, 233-237

44. Fujita Y., Noda Y. (1984a) Differential scanning calorimetric studies on the thermal denaturation of ribonuclease A in aqueous 2-methyl-2,4-pentanediol., Bull. Chem. Soc. Jpn 57, 1891-1896

45. Fujita Y., Noda Y. (1984b) The effect of ethylene glycol on the thermal denaturation of ribonuclease A and chymotrypsinogen A as measured by differential scanning calorimetry, Bull. Chem. Soc. Jpn 57, 2177-2183

46. Garlid K.D. (1979) Aqueous phase structure in cells and organelles, in "Cell-Associated Water", Drost-Hansen W., Clegg J.S., eds, Academic Press, NY

47. Gast IC., Zirwer D., Muller-Frohne M., Damaschun G. (1999) Trifluoroethanol-induced conformational transitions of proteins: Insights gained from the differences between a-lactalbumin and ribonuclease A. Protein Science 8, 625-634

48. Gekko K, Ohmae E, Kameyama K, Takagi T Acetonitrile-protein interactions: amino acid solubility and preferential solvation. Biochim (1998) Biophys Acta Sep 8; 1387(1-2): 195-205

49. Gekko K. (1981a) Mechanism of polyol-induced protein stabilization: solubility of amino acids and diglycine in aqueous polyol solutions. J Biochem (Tokyo) Dec;90(6): 1633-41

50. Gekko K. (1981b) Enthalpy and entropy of transfer of amino acids and diglycine from water to aqueous polyol solutions, J Biochem (Tokyo) 90(6): 1643-52

51. Gekko K. (1982) Calorimetric study on thermal denaturation of lysozyme in polyol-water mixtures, J. Biochem. (Japan) 91, 1197-1204

52. Gekko K., Koga S. (1984) The stability of protein structure in aqueous propylene glycol: amino acid solubility and preferential solvation of protein. Biochim. Biophys. Acta 786. 151-60

53. Gekko K., Morikawa T. (1981a) Preferential hydration of bovine serum albumin in polyhydric alcohol-water mixtures. J. Biochem (Japan) 90, 39-50

54. Gekko K., Morikawa T. (1981b) Thermodynamics of polyol-induced thermal stabilization of chymotrypsinogen. J. Biochem (Japan) 90, 51-60

55. Gekko K., Ohmae E., Kameyama K, Takagi T (1998) Acetonitrile-protein interactions: amino acid solubility and preferential solvation. Biochim Biophys Acta Sep 8; 1387(1-2): 195-205

56. Gekko K., Timasheff S.N., (1981a) Mechanism of protein stabilization by glycerol: preferential hydration in glycerol-water mixtures. Biochemistry 20, 4667-4676

57. Gekko K., Timasheff S.N., (1981b) Thermodynamic and kinetic examination of protein stabilization by glycerol. Biochemistry 20, 4677-4686

58. Gerlsma S.Y. (1968) Reversible denaturation of ribonuclease in aqueous solutions as influenced by polyhydric alcohols and some other additives J. Biol. Chem. 243, 957-961

59. Gerlsma S.Y. Stuur E.R. (1972) The effect of polyhydric and monohydric alcohols on the heat-induced reversible denaturation of lysozyme and ribonuclease., Int. J. Peptide Protein Res. 4, 377-383

60. Griebenov, A.M. Klibanov (1996) "On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents." J. Amer. Chem. Soc. 118, 11695-1170

61. Gupta M. (1992) Enzyme function in organic solvents, Eur. J. Biochem. 203, 2532

62. Hade E.P.K., Tanford C., (1967) Isopiestic compositions as a measure of preferential interactions of macromolecules in two-component solvents. Application to proteins in concentrated aqueous cesium chloride and guanidine hydrochloride, J. Am. Chem. Soc. 89, 5034-40

63. Hammou H.O., Plaza del Pino I.M., Sanchez-Ruiz J.M. (1998) Hydration changes upon protein unfolding: cosolvent effect analysis., New J. Chem., 1998, 1453-1461

64. Harding M.M., Williams D.H., Wolfson D.N. (1991) Characterization of a partially denatured state of a protein by two-dimensional NMR: reduction of the hydrophobic interactions in ubiquitin Biochemistry 30, 3120-3128

65. Herskovits T.T., Gadegbeku B., Jaillet H. (1970) On the structural stability and solvent denaturation of proteins. (I) denaturation by alcohols and glycols. J. Biol. Chem. 245, 2588-2598

66. Huot J.-Y., Battistel E., Lumry R., Villeneuve G., Lavallee J.-F., Anusiem A., Jolicoeur C. (1988) A comprehensive thermodynamic investigation of water-ethylene glycol mixtures at 5, 25, and 45°C, Journal of Solution Chemistry 17, p. 601

67. Inoue H., Timasheff S.N. (1968) The interaction of a-lactoglobulin with solvent components in mixed water-organic solvent systems. J. Am. Chem. Soc. 90, 1890-97

68. Inoue H., Timasheff S.N. (1972) Preferential and absolute interactions of solvent components with proteins in mixed solvent systems. Biopolymers 11, 737-743

69. Jacob S.W., Rosenbaum E.E., Wood D.C. (1971) "Dimethyl sulfoxide" Vol.1, Marcel Dekker, NY

70. Jacobson A.L., Turner S.L. (1980) Specific solvent effects on the thermal denaturation of ribonuclease. Effect of dimethylsulfoxide and p-dioxane on thermodynamics of denaturation., Biochemistry 19, 4534-4538

71. Johnson M.L., Faunt L.M. (1992) Parameter estimation by least-squares methods, Methods in Enzymology 210,1-37

72. Kamatari Y.O., Konno T., Kataoka M., Akasaka K. (1998) The methanol-induced transition and the expanded helical conformation in hen lysozyme. Protein Science 7, 681-688

73. Kauzmann W. (1959) Some factors in the interpretations of protein denaturation., Adv.Prot.Chem. 14, 1-63

74. Khmelnitsky Yu.L., Belova A.B., Levashov A.V., Mozhaev V.V. (1991b) Relationship between surface hydrophilicity of a protein and its stability against denaturation by organic solvents FEBS Letters 284, 267-269

75. Khmelnitsky Yu.L., Mozhaev V.M., Belova A.B., Sergeeva M.V., Martinek K. (1991a) Denaturation capacity: a new quantitative criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis Eur.J.Biochem. 198, 31-41

76. Kirkwood J.G., Goldberg R.J. (1950) Light scattering arising from composition fluctuations in multi-component systems. J. Chem. Phys. 18, 54-57

77. Knubovets T., Osterhout J.J., Connolly P.J., Klibanov A.M. (1999) Structure, thermostability, and conformational flexibility of hen egg-white lysozyme dissolved in glycerol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1262-1267

78. Koga Y. (1996) Mixing schemes in aqueous solutions of non-electrolytes: a thermodynamic approach. J. Phys. Chem. 100, 5172-5181

79. Kovrigin E.L., Potekhin S.A. (1997) Preferential solvation changes upon lysozyme heat denaturation in mixed solvents, Biochemistry 36, 9195-9199

80. Kuntz I.D. (1971) Hydration of macromolecules. III. Hydration of polypeptides. J. Am. Chem. Soc. 93, 514-516

81. Kuntz I.D., Kauzmann W. (1974) Hydration of proteins and polypeptides. Adv. Prot. Chem. 28, 239-245

82. Kupke D.W. (1973) Density and volume change measurements, in Physical Principles and Techniques in Protein Chemistry, Part C, ed/ Leach S.J., pp. 175, NY, Academic

83. Kuwajima K.(1989) The molten globule state as a clue for understanding the folding and cooperativity of globular-protein structure Proteins: Struct. Funct. Genet. 6, 87-103

84. Lai J.T.W., Lau F.W., Robb D., Westh P., Nielsen G., Trandum C., Hvidt A., Koga Y. (1995) Excess partial molar enthalpies, entropies, gibbs energies and volumes in aqueous dimethylsulphoxide., J. Solution Chem. 24, 89-102

85. Lam S.Y., Benoit R.L. (1974) Some thermodynamic properties of the DMSO-water and Propylene carbonate-water systems at 25°C, Can. J. Chem. 52, 718722

86. Le Peuch C., Balny C. (1987) Sequental elution of proteins bound by hydrophobic interaction chromatography at subzero temperatures., FEBS Lett., 87, 232-234

87. Lee J.C., Lee L.L.Y. (1979) Interaction of calf brain tubulin with poly(ethylene glycols), Biochemistry 18, 5518-5526

88. Lee J.C., Lee L.L.Y. (1981) Preferential solvent interactions between proteins and polyethylene glycols, J. Biol. Chem. 256, 625-631

89. Lee J.C., Lee L.L.Y. (1987) Thermal stability of proteins in the presence of poly-(ethylene glycols). Biochemistry 26, 7813-7819

90. Lee J.C., Timasheff S.N.(1974) Partial specific volumes and interactions with solvent components of proteins in guanidine hydrochloride. Biochemistry 13, 257265

91. Lin T.Y., Timasheff S.N. (1996) On the role of surface tension in the stabilization of globular proteins. Protein Sci 5(2):372-381

92. Low P.S. (1985) Molecular basis of the biological compatibility of nature's osmolytes. In "Transport Processes, Iono- and Osmoregulation" (R. Gilles, M. Gilles-Baillien, Eds.), pp. 469-477, Springer-Verlag, Berlin,

93. Lustig B., Fink A.L.(1992) The thermal denaturation of ribonuclease A in aqueous-methanol solvents. Biochim. Biophys. Acta 1119, 205-210

94. Makarov A.A., Protasevich I.I., Bazhulina N.P., Esipova N.G. (1995) Heat denaturation of pepsinogen in a water-ethanol mixture. FEBS Letters 357, 58-61

95. Makhatadze G.I., Privalov P.L. (1990) Heat capacity of proteins. I. Partial molar heat capacity of individual amino acid residues in aqueous solution: hydration effect. J. Mol. Biol. 213, 375-384

96. Makhatadze G.I., Privalov P.L. (1992) Protein interactions with urea and guanidinium chloride. A calorimetric study. J. Mol. Biol. 226, 491-505

97. Makhatadze G.I., Privalov P.L. (1993) Contribution of hydration to protein folding thermodynamics. I. The enthalpy of hydration. J. Mol. Biol. 232, 639659

98. Makhatadze GI, Privalov PL (1995) Energetics of protein structure. Adv Protein Chem 47:307-425

99. McPherson A. (1976) Crystallization of proteins from polyethylene glycol. J. Biol. Chem. 251, 6300-1

100. McPherson A. (1985) Use of polyethylene glycol in the crystallization of macromolecules. Methods Enzymol. 114, 120-125

101. Murphy K.P., Freire E. (1992) Thermodynamics of structural stability and cooperative folding behavior in proteins. Adv. Prot. Chem. 43, 313-361

102. Na G.C. (1986) Interaction of calf skin collagen with glycerol: linked function analysis. Biochemistry 25, 967-73

103. Na G.C., Butz L.J., Bailey D.G., Carrol R.J. (1986) In vitro collagen fibril assembly in glycerol solution: evidence for a helical cooperative mechanism involving microfibrils. Biochemistry 25, 958-966

104. Na G.C., Timasheff S.N. (1981) Interaction of calf brain tubulin with glycerol. J. Mol. Biol. 151, 165-178

105. Nelson J.W., Kallenbach N.R. (1986) Stabilization of the ribonuclease S-peptide alpha-helix by trifluoroethanol. Proteins: Struct. Funct. Genet. 1, 211-217

106. Noelken M.E., Timasheff S.N. (1967) Preferential solvation of bovine serum albumin in aqueous guanidine hydrochloride. J. Biol. Chem. 242, 5080-85

107. Nozaki Y., Tanford C. (1970) The solubility of amino acids, diglycine and triglycine in aqueous guanidine hydrochloride solutions. J. Biol. Chem. 245, 1648-1652

108. Nozaki Y., Tanford C. (1971) The solubility of amino acids and two glycine peptides in aqueous ethanol and dioxane solutions: establishment of a hydrophobicity scale. J. Biol. Chem. 246, 2211-2217

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120,

121.

Otting G., Leipinch E., Wuthrich K. (1991) Protein hydration in aqueous solution. Science 254, 974-980

Pace C.N. (1986) Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. Methods Enzymol., 131, 266-280

Pan Y., Briggs M.S. (1992) Hydrogen exchange in native and alcohol forms of ubiquitin. Biochemistry 31, 11405-11412

Parodi R.M., Bianchi E., Cifferi A. (1973) Thermodynamics of unfolding of lysozyme in aqueous alcohol solutions., J. Biol. Chem. 248, 4047-4051

Petros A.M., Mueller L., Koople K.D. (1990) NMR identification of protein surfaces using paramagnetic probes. Biochemistry 29, 10041-10048

Pfeil W. (1998) Protein Stability and Folding: a collection of thermodynamic data., Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York

Pfeil W., Privalov P.L. (1976a) Thermodynamic investigations of proteins. III. Thermodynamic description of lysozyme. Biophys. Chem. 4, 41-50

Pfeil W., Privalov P.L. (1976b) Thermodynamic investigation of proteins. V. Calorimetric study of lysozyme denaturation by guanidine hydrochloride., Biophys. Chem. 4, 33-40

Pittz E.P., Bello J. (1971) Studies on bovine pancreatic ribonuclease A and model compounds in aqueous 2-methyl-2,4-pentanediol. I. Amino acid solubility, thermal reversibility of ribonuclease A, and preferential hydration of ribonuclease A crystals. Arch. Biochem. Biophys. 146, 513-524

Pittz E.P., Timasheff S.N. (1978) Interaction of ribonuclease A with aqueous 2-methyl-2,4-pentanediol at pH 5.8, Biochemistry 17, 615-623

Plaza del Pino I.M., Sanchez-Ruiz J.M. (1995) An osmolyte effect on the heat capacity change for protein folding, Biochemistry 34, 8621-8630

Potekhin S.A., Kovrigin E.L. (1998) Folding under inequilibrium conditions as a possible reason for partial irreversibilty of heat-denatured proteins: computer simulation study. Biophysical Chemistry 73, 241-248

Prakash V., Loucheux C., Scheufele S., Gorbunoff M.J., Timasheff S.N. (1981) Interactions of proteins with solvent components in 8 M urea. Arch. Biochem. Biophys. 210, 455-464

122. Privalov P.L. (1989) Thermodynamic problems of protein structure. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18, 47-69

123. Privalov P.L. (1992) in Protein Folding, ed. by T.E. Creighton, W.H. Freeman and Co., NY, pp. 83

124. Privalov P.L.(1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv.Protein Chem.33,167-241.

125. Privalov P.L., Gill S.J. (1988) Stability of protein structure and hydrophobic interaction. Adv. Protein Chem. 39, 191-234

126. Privalov P.L., Khechinashvili N.N. (1974) A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86, 665-684

127. Privalov P.L., Makhatadze G.I. (1993) Contribution of hydration to protein folding thermodynamics. II. The entropy and Gibbs energy of hydration. J. Mol. Biol. 232, 660-679

128. Privalov P.L., Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131L, 4-51

129. Ptitsyn O. (1987) Protein folding - hypothesis and experiments. J. Prot. Chem. 6, 273-293

130. Reisler E., Haik Y., Eisenberg H. (1977) Bovine serum albumin and aqueous guanidine hydrochloride solutions. Preferential and absolute interactions and comparison with other systems. Biochemistry 16, 197-203

131. Robinson D.R., Jencks W.P. (1965) The effect of concentrated salt solutions on the activity coefficient of acetyltetraglycine ethyl ester. J. Amer. Chem. Soc. 87, 2462

132. Santoro M.M., Liu Y., Khan S.M.A., Hou L.-X., Bolen D.W. (1992) Increased thermal stability of proteins in the presence of naturally occurring osmolytes. Biochemistry 31, 5278-5283

133. Schachman H.K., Lauffer M.A. (1949) The hydration, size and shape of tobacco mosaic virus. J. Amer. Chem. Soc. 71, 536-541

134. Schellman J.A. (1978) Solvent denaturation, Biopolymers 17, 1305-1322

135. Schellman J.A. (1990) A simple model for solvation in mixed solvents. Application to the stabilization and destabilization of macromolecular structures. Biolphys. Chem. 37, 121-140

136. Schrier E.E., Ingwall R.T., Sheraga H.A. (1965) The effect of aqueous alcohol solutions on the thermal transition of ribonuclease. J.Phys.Chem. 69, 298-303

137. Serjeant E.P. (1984) "Potentiometry and potentiometric titrations" in: Chemical Analysis v.69, Wiley & Sons

138. Shiraki K., Nishikawa K. and Goto Y. (1995) Trifluoroethanol-induced stabilization of the alpha-helical structure of beta-lactoglobulin: implication for non-hierarchical protein folding. J. Mol. Biol. 245, 180-194

139. Skukuya R., Schwert G. (1960) Glutamic acid decarboxylase. Ill The inactivation of enzyme at low temperatures, J. Biol.Chem. 235, 1658

140. Spolar R.S., Livingstone J.R., Record M.T. (1992) Use of liquid hydrocarbon and amide transfer data to estimate contributions to thermodynamic functions of protein folding from the removal of nonpolar and polar surface from water. Biochemistry 31, 3947-3955

141. Stockmayer W.H. (1950) Light scattering in multi-component systems. J. Chem. Phys. 18, 58-61

142. Straume M., Johnson M.L. (1992) Monte-Carlo method for determining complete confidence probability distributions of estimated model parameters, Methods in Enzymology 210, 117-129

143. Sturtevant J.M., Velicelebi G. (1981) Calorimetric study of the interaction of lysozyme with aqueous 1-propanol. Biochemistry 20, 3091-6

144. Tanaka S.H., Yoshihara H.I., Ho A.W.-C., Lau F.W., Westh P., Koga Y. (1996) Excess partial molar enthalpies of alkane-mono-ols in aqueous solutions. Can. J. Chem. 74, 713-721

145. Tanford C. (1964) Isothermal unfolding of globular proteins in aqueous urea solutions., J. Am. Chem. Soc. 86, 2050-2059

146. Tanford C. (1968) Protein denaturation. Adv. Prot. Chem. 23, 121-281

147. Tanford C. (1969) Extension of the theory of linked functions to incorporate the effects of protein hydration. J. Mol. Biol. 39, 539-544

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160.

161,

Tanford C. (1980) "The hydrophobic effect", Wiley-Interscience, NY

Timasheff S.N. (1970) Protein-solvent interactions and protein conformations., Acc. Chem. Res. 3, 62-68

Timasheff S.N. (1982) Preferential interactions in protein-water-cosolvent systems. In "Biophysics of water" (F. Franks, S. Mathias, Eds.), pp. 70-72, Wiley, New-York

Timasheff S.N. (1992a) Water as ligand: preferential binding and exclusion of dénaturants in protein unfolding. Biochemistry 31, 9857-9864

Timasheff S.N. (1992b) in Water and Life, eds Osmond C.B., Bolis C.L., Somero G., pp 70-84, NY, Springer-Verlag, 371 pp.

Timasheff S.N. (1993) The control of protein stability and association by weak interactions with water: how do solvents affect these processes.,Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (22) 67-97.

Timasheff S.N. (1995) Solvent stabilization of protein structure. Methods Mol Biol 40:253-269

Timasheff S.N. (1998) Control of protein stability and reactions by weakly interacting cosolvents: the simplicity of the complicated. Adv Protein Chem 51:355-432

Timasheff S.N., Arakawa T. (1988) Mechanism of protein precipitation and stabilization by cosolvents. J.Crystal Growth 90, 39-46

Timasheff S.N., Inoue H. (1968) Preferential binding of solvent components to proteins in mixed water-organic solvent systems., Biochemistry 7, 2501-2513

Velicelebi G., J.M.Sturtevant (1979) Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry 18, 1180-1186.

Vincent C., Pruliere G., Pajot-Augy E., Gamier V., Campion E., Nguyen E., Renard J.-P. (1987) Comparative effect of cryoprotectants on rabbit embryos cytoskeleton. Cryo-Letters 8, 356-361

Warner D.T. (1962) Some possible relationships of carbohydrates and other biological components with the water structure at 37°C, Nature 196, 1055-1058

Warren J.R., Gordon J.A. (1970) Denaturation of globular proteins. II. The interaction of urea with lysozyme. J. Biol. Chem. 245, 4097-4104

125

162. Warren J.R., Gordon J.A. (1971) Denaturation of globular proteins. IV. A comparative study of the interaction of urea with several proteins., Biochim. Biophys. Acta 229, 215-225

163. Wehland J., Herzog W., Weber K. (1977) Interaction of griseofulvin with microtubules, microtubule protein and tubulin. J. Mol. Biol. Ill, 329-342

164. Westh P., Koga Y. (1997) Intermolecular interactions of lysozyme and small alcohols: a calorimetric investigation. J. Phys. Chem. B 101, 5755-5758

165. Woolfson D.N., Cooper A., Harding M.M., Williams D.H., Evans P.A. (1993) Protein folding in the absence of the solvent ordering contribution to the hydrophobic interaction, J. Mol. Biol. 229, 502-511

166. Wu S.L., Benedek K., Karger B.L. (1986) Thermal behavior of proteins in high performance hydrophobic interaction chromatography. On line spectroscopic and chromatographic characterization., J. Chromatogr. 359, 3-17

167. Wyman J. (1964) Linked functions and reciprocal effects in hemoglobin: A second look. Adv. Prot. Chem. 19, 223-286

168. Wyman J., Gill S.J. (1990) Binding and Linkage. Functional Chemistry of Biological Macromolecules. Mill Valley, CA: University Science Books, 330 p.

169. Xie G, Timasheff S.N. (1997a) Mechanism of the stabilization of ribonuclease A by sorbitol: preferential hydration is greater for the denatured then for the native protein. Protein Sci 6(1):211-221

170. Xie G, Timasheff S.N. (1997b) Temperature dependence of the preferential interactions of ribonuclease A in aqueous co-solvent systems: thermodynamic analysis. Protein Sci 6(l):222-232

171. Xie G, Timasheff S.N. (1997c) The thermodynamic mechanism of protein stabilization by trehalose. Biophys Chem 28;64(l-3):25-43

172. Yang J.J., Pitkeathly M., Radford S.E. (1994) Far-UV circular dichroism reveals a conformational switch in a peptide fragment from the beta-sheet of hen lysozyme. Biochemistry 33, 7345-7353

173. Yang Y., Mayo K.H. (1993) Alcohol-induced protein folding transitions in platelet factor 4: the O-state. Biochemistry 32, 8661-8671

174. Yansey P.H., Clark M.E., Hand S.C., Bowlus R.D., Somero G. (1982) Living with water stress: evolution of osmolyte systems., Science 217, 1244-22

175. Yphantis D.A. (1964) Equilibrium ultracentrifugation of dilute solutions. Biochemistry 3, 297-317

176. Zaks A., Klibanov A.M. (1988) Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. J.Biol.Chem. 263, 3194-3201

177. Zou Q., Habermann S.M., Murphy K.P. (1998) Molecular mechanism of urea denaturation of proteins: model compound studies. 42nd Annual Meeting of Biophys. Society, 22-26 Febriary, Kansas City, Missouri