Биотехнологические аспекты производства препаратов сальмонеллезного бактериофага тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, кандидат фармацевтических наук Шитова, Ольга Ивановна

• Шитова, Ольга Ивановна
• кандидат фармацевтических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Шитова, Ольга Ивановна

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Введение

ГЛАВА 1. Эпидемиологические особенности сальмонеллеза на современном этапе, биологические свойства сальмонелл.

Бактериофаги (обзор литературы)

1.1. Эпидемиологические особенности сальмонеллеза

1.2. Биологические свойства сальмонелл

1.3. Общая биология бактериофагов

1.3.1. Распространение бактериофагов в природе, морфология, физико-химические и антигенные свойства

1.3.2. Способы культивирования и очистки препаратов бактериофагов, критерии оценки их эффективности

1.3.3. Лекарственные формы препаратов бактериофагов

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Микроорганизмы

2.1.2. Маточный бактериофаг

2.1.3. Препараты

2.1.4. Питательные среды

2.1.5. Вспомогательные вещества

2.1.6. Подопытные животные

2.2. Методы исследования

2.2.1. Технологические методы

2.2.2. Микробиологические методы

2.2.3. Физико-химические методы

2.2.4. Биологические методы

2.2.5. Статистические методы

ГЛАВА 3. Создание производственной коллекции штаммов-

продуцентов сальмонеллезного бактериофага

3.1 Эпидемиологические особенности сальмонелл еза и биологические свойства сальмонелл, циркулирующих в Пермском крае

3.2. Основные принципы отбора штаммов - продуцентов

сальмонеллезного бактериофага

ГЛАВА 4 Получение жидкого очищенного препарата

сальмонеллезного бактериофага

4.1. Совершенствование технологии культивирования жидкого сальмонеллезного бактериофага

4.2. Разработка оптимального способа очистки сальмонеллезного бактериофага

4.3. Характеристика свойств жидкого сальмонеллезного бактериофага

4.3.1. Хроматографический профиль препарата сальмонеллезного

бактериофага различной степени очистки

4.3.2 Содержание белка в препарате при различной степени очистки

4.3.3 Изучение биологических свойств очищенного сальмонеллезного бактериофага

4.3.4. Оценка стабильности препарата жидкого сальмонелллезного бактериофага

4.3.5. Антибактериальная активность сальмонеллезного бактериофага

ГЛАВА 5 Разработка желудочно-резистентных таблеток

сальмонеллезного бактериофага без оболочки

5.1. Разработка состава таблеток сальмонелл езного бактериофага

5.1.1. Подбор оптимального состава таблеток сальмонелл езного бактериофага

5.1.2. Выбор соотношения вспомогательных веществ и концентрата сальмонеллезного бактериофага

5.2. Оптимизация технологических факторов таблетирования

5.2.1. Апробация различного способа высушивания таблетированного сальмонеллезного бактериофага

5.2.2. Влияние технологических параметров на сохранение специфической активности и желудочной резистентности таблетированных бактериофагов

5.3. Стандартизация желудочно-резистентных таблеток с сальмонеллезным бактериофагом без оболочки

5.3.1. Технологическая стандартизация гранулята

5.3.2. Технологическая стандартизация таблеток

5.3.3. Исследование активности желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага без оболочки

5.3.4. Изучение стабильности таблеток сальмонеллезного бактериофага в процессе хранения

5.3.5. Биологические испытания препарата

Заключение

Выводы

Список использованной литературы

Приложения

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БФ - бактериофаг

ВВ - вспомогательные вещества

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГИСК - Государственный институт стандартизации и Контроля медицинских иммунобиологических препаратов

ГФ - Государственная Фармакопея

МИБП - медицинский иммунобиологический препарат

МПБ - мясо-пептонный бульон

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза

МЦ - метилцеллюлоза

НД - нормативная документация

ОКИ - острые кишечные инфекции

ГТР - промышленный регламент

ФСП - фармакопейная статья предприятия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнологические аспекты производства препаратов сальмонеллезного бактериофага»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Актуальность проблемы заболеваемости сальмонеллезами, которые занимают одно из ведущих мест в структуре острых кишечных инфекций, определяется их повсеместным распространением, тяжестью течения патологического процесса, возможностью неблагоприятных исходов, длительностью бактерионосительства и значимостью социально-экономического ущерба. Эпидемическая ситуация по сальмонеллезам в мире продолжает оставаться неблагополучной. В последние годы наблюдается тенденция роста заболеваемости сальмонеллезами в России, уровень которой в 2011 г. составил 36,13 на 100 тыс. населения [34, 108].

Высокая устойчивость сальмонелл к антибиотикам, основным средствам этиотропной терапии пациентов с данной патологией, появление полирезистентных вариантов возбудителя [16, 19, 66, 119], ставят задачу поиска новых лекарственных антимикробных средств, созданных на основе современных биотехнологий.

Одним из направлений в решении этой сложной проблемы является использование лечебно-профилактических препаратов бактериофагов, обеспечивающих специфическое литическое действие на возбудителя и не оказывающих побочных токсических и аллергических реакций на организм человека. В условиях возрастания устойчивости микроорганизмов к антибиотикам бактериофаги начинают все шире использоваться в клинической практике [46, 47, 48, 62, 63, 74, 87, 95, 130].

В сфере изготовления препаратов бактериофагов актуальными являются задачи, связанные с усовершенствованием технологического процесса их производства, включая разработку эффективных способов очистки, конструирование новых поликомпонентных препаратов и создание новых лекарственных форм.

В настоящее время при выпуске сальмонеллезных бактериофагов предпочтение отдается жидким лекарственным формам. Однако, при пероральном приеме препарата кислая среда желудка оказывает инактивирующее действие на бактериофаг. Сохранение исходной активности фага, уменьшение объемов препаратов при их транспортировке и хранении диктует необходимость выпуска таблетированных и капсульных лекарственных форм.

Таким образом, обеспечение высокой литической активности фага и придание препарату качественно новых потребительских свойств, ставят задачу создания нового желудочно-резистентного таблетированного варианта препарата сальмонеллезного бактериофага на основе совершенствования технологии его производства.

Цель настоящего исследования - совершенствование технологии производства жидкого очищенного препарата сальмонеллезного бактериофага и создание на его основе желудочно-резистентных таблеток.

Основные задачи исследования

1. Создать производственную коллекцию штаммов сальмонелл -продуцентов сальмонеллезного бактериофага с включением в ее состав штаммы серологических вариантов сальмонелл, циркулирующих в Пермском крае.

2. Усовершенствовать процесс культивирования и разработать способ очистки жидкого сальмонеллезного бактериофага.

3. Оценить эффективность разработанного способа очистки сальмонеллезного бактериофага, изучить стабильность и антибактериальную активность экспериментально-производственных серий.

4. Разработать состав и оптимизировать технологию изготовления и параметры таблетирования сальмонеллезного бактериофага.

5. Провести оценку качества желудочно-резистентных таблеток

сальмонеллезного бактериофага, изучить их стабильность в процессе хранения.

Научная новизна

На основе разработанных принципов периодического обновления качественного и количественного состава культур сальмонелл сформирована производственная коллекция из штаммов - продуцентов сальмонеллезного бактериофага, отражающая этиологическую структуру сальмонеллеза в Пермском крае.

Определены методические приемы по совершенствованию технологии производства сальмонеллезного бактериофага, включая процессы культивирования и очистки бактериофага от бактериальных клеток и балластных веществ.

Разработаны и признаны изобретением новые технологические подходы для получения таблетированной формы сальмонеллезного бактериофага, обеспечивающие его устойчивость к кислому содержимому желудка (Патент РФ на изобретение № 2410084).

Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными микробиологическими и технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления сальмонеллезного бактериофага к условиям массового производства препарата, расширяющего арсенал отечественных антибактериальных средств. Сформирована коллекция штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага, подвергаемая периодическому обновлению на основе штаммов сальмонелл, циркулирующих на территории Пермского края.

Оптимизирован способ совместного культивирования штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага из разных серологических групп сальмонелл и разработан способ очистки сальмонеллезного бактериофага от

бактериальных клеток и балластных веществ, позволяющий получить стабильный очищенный препарат с высокой литической активностью.

Результаты научной работы отражены в НД: Промышленный регламент № 2057-09 на производство Бактериофага сальмонеллезного групп A,B,C,D,E жидкого раствора для приема внутрь и местного применения. Проект ФСП на Бактериофаг сальмонеллезный групп A,B,C,D,E таблетки.

Разработан состав и технология производства желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага без оболочки. В экспериментально-производственных условиях получены 3 серии желудочно-резистентных таблеток, соответствующих показателям качества нормативной документации.

Апробация работы и публикации Диссертация апробирована и рекомендована к защите на межкафедральном заседании ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава РФ и научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава РФ в г. Перми «Пермское НПО «Биомед» 17 октября 2012 г.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Вакцинология - 2006; Вакцинология - 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006; Москва, 2010; Международной Российско-китайской конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice», Пермь, 2006; Российской научно-практической конференции «Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения», Пермь, 2008; Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», Пермь, 2008; XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2010.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ. Получен Патент РФ № 2410084 на изобретение «Фармацевтическая композиция на основе секстафага (пиобактериофага поливалентного) или бактериофага сальмонеллезного и способ ее получения».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Создание производственной коллекции штаммов сальмонелл - продуцентов сальмонеллезных бактериофагов, обеспечивает получение препарата Бактериофаг сальмонеллезный групп A,B,C,D,E, обладающего высокой специфической активностью.

2. Использование способа совместного культивирования сальмонеллезного бактериофага и бактерий сальмонелл групп A,B,C,D,E на казеиново-кислотной среде с последующей очисткой фаголизата методом ультрафильтрации позволяет оптимизировать технологию получения и повысить качество получаемого препарата.

3. Оптимизация технологических параметров производства таблетированной формы сальмонеллезного бактериофага (подбор композиции, выбор соотношения вспомогательных веществ и концентрата, метода сушки, формы и массы таблетки, давления прессования) обеспечивает создание желудочно-резистентных таблеток, соответствующих требованиям нормативной документации.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и иллюстрирована 16 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы включает 146 источников, включая 119 отечественных и 27 зарубежных авторов.

Конкретное участие автора в получении научных результатов

Основные экспериментальные результаты, приведенные в работе, получены самим автором или при непосредственном его участии. Формирование коллекции штаммов сальмонелл с изучением их биологических свойств, адаптация маточного бактериофага; оптимизация технологии производства сальмонеллезного бактериофага с разработкой способов очистки; изучение физико-химических и биологических свойств жидкого очищенного бактериофага выполнены лично автором. Разработка оптимального состава, оптимизация технологических параметров таблеточной композиции с сальмонеллезным бактериофагом проведены совместно с сотрудниками кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии Пермской государственной фармацевтической академии. Контроль показателей качества экспериментальных и производственных серий препарата жидкого очищенного сальмонеллезного бактериофага, таблеток с сальмонеллезным бактериофагом проводился в отделении бактериофагов при участии автора на базе научного отдела и ОКК НПО «Биомед».

Публикации

1. Ефимова, М. Г. Опыт получения бактериофага сальмонеллезного групп А, В, С, D, Е / М. Г. Ефимова, А. В. Казьянин, О. И. Шитова // 2-nd Russian Chinese international scientific conference on pharmacology «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice» : Materials of conference, 25-27 September, 2006, Perm, Russia, 2006. - Perm, 2006. - P. 57.

2. Ефимова, M. Г. Изучение чувствительности сальмонелл к бактериофагу / М. Г. Ефимова, О. И. Шитова // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения

инфекционных болезней» : материалы Всерос. науч.-практ. конф., 21-22 нояб., Москва. - Москва, 2006. - С. 42.

3. Шитова, О. И., Получение сальмонеллезного бактериофага путем адаптации и селекции / О. И. Шитова, М. Г. Ефимова // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов : материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед», 17-18 июня 2008 г. - Пермь, 2008. - С. 106-108.

4. Технологические аспекты разработки таблеток сальмонеллезного фага / О. И. Шитова [и др.] // Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения : материалы Рос. науч.-практ. конф. ПГФА : материалы Рос. науч.-практ. конф. ПГФА, проводимой в рамках 14-ой междунар. выставки «Медицина и здоровье» (13-15 нояб. 2008 г.). -Пермь. - Пермь, 2008. - С. 261-264.

5. Получение таблеток с сальмонеллезным бактериофагом / О. И. Шитова [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 254-256.

6. Разработка желуд очно-резистентной лекарственной формы сальмонеллезного бактериофага / О. И. Шитова [и др.] // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» : сб. материалов конгр. -Москва, 2010. - С. 746-747.

7. Характеристика свойств таблетированной лекарственной формы поливалентных бактериофагов / О. И. Шитова [и др.] // Биопрепараты. -2010.-№2.-С. 14-16.

8. Бактериофаги: Опыт производства и применения / О. И. Шитова [и др.] // Фармация.-2010.-№3.-С. 36-37.

9. Серологический пейзаж сальмонелл, циркулирующих в Пермском крае и их чувствительность к антимикробным препаратам / О. И. Шитова [и др.] // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции

«Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 9-10 нояб. 2010 г., Москва. - Москва, 2010. - С. 129.

10. Шитова, О. И., Эпидемиологические особенности, биологическая характеристика и чувствительность к антимикробным препаратам сальмонелл, циркулирующих в Пермском крае / О. И. Шитова, А. В. Казьянин, Ю. А. Захарова // Сиб. мед. журн. - 2011. - Т. 26, № 2, вып.2. - С. 116-120.

11. Шитова, О. И. Разработка оптимального способа очистки сальмонеллезного бактериофага / О. И. Шитова, А. В. Казьянин // Вестн. Перм. гос. фармац. акад. -2012,-№9.-С. 252-254.

12. Патент № 2410084 1Ш. Фармацевтическая композиция на основе секстафага (пиобактериофага поливалентного) или бактериофага сальмонеллезного и способ ее получения / О. И. Шитова [и др.]. - № 2009123376/15 ; заявл. 19.06.2009 ; опубл. 27.01.2011. - 6 с.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, номер государственной регистрации 01.9.50 007426.

ГЛАВА 1. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА САЛЬМОНЕЛЛ. БАКТЕРИОФАГИ

(обзор литературы)

1.1. Эпидемиологические особенности сальмонеллеза

Сальмонеллезы как инфекционные заболевания из группы острых кишечных инфекций (ОКИ) распространены повсеместно и регистрируются в виде спорадических случаев и в форме эпидемических вспышек. Начиная с 80-х годов прошлого века, сальмонеллезы стали одной из актуальных современных проблем многих экономически развитых стран мира [34, 56, 64, 66, 94]. По данным ВОЗ за 1997-2007 гг. заболеваемость сальмонеллезом в мире выросла в 6 раз [108]. Особенностью такого резкого подъема явилась возросшая циркуляция среди населения вида Salmonella enteritidis, обусловленная значительным инфицированием объектов промышленной переработки мяса птицы и яиц.

Хорошо известно, что сальмонеллы принадлежат к числу микроорганизмов, широко распространенных во всех странах мира, при этом некоторые серовары этого возбудителя убиквитарны (S. typhimurium, S. enteritidis), другие, напротив, циркулируют лишь в определенных регионах планеты. Так, S. berta нашла широкое распространение в Северной Америке, S. sendai преимущественно вызывает заболевания на Дальнем Востоке, варианты S. Uganda и S. wangata чаще других регистрируют на Африканском континенте, а виды S. madelia и S. aliona встречаются только в Южной Америке.

Несмотря на такие особенности географического распространения, все сальмонеллы полипатогенны: их подавляющее большинство встречают у человека, животных и птиц. Некоторые из сальмонелл способны вызывать заболевания лишь у определенных видов животных: S. dublin - у крупного рогатого скота, S. choleraesuis - у свиней, S. gallinarum - у птиц. В последние

годы нередко эти представители становятся возбудителями инфекции не только у других животных, но и у человека.

В России официальная регистрация сальмонеллезов была введена в 1960г. Именно в этом году было зарегистрировано 7348 случаев сальмонеллезов (показатель составил 6 на 100 тыс.). С 1960 по 1968 гг. уровень заболеваемости оставался стабильным и не превышал 12,5 на 100 тыс. За период с 1969 по 1978 гг. показатель вырос до 53,6 на 100 тыс. С 1979 по 1986 г. произошло некоторое снижение заболеваемости (25,4 на 100 тыс.), а в 1992г. начался новый подъем до 80,1 на 100 тыс. К 2005 г. произошло существенное снижение заболеваемости до 29,3 на 100 тыс. Однако, с 2006 г. вновь наблюдалась тенденция к росту, и в 2011 г. ее уровень превысил в 6 раз показатель 1960 года, составив 36,1 случаев на 100 тыс.

В 70-е годы в этиологической структуре сальмонеллезов преобладал вариант & ¡урШтипит, определявший около 70% всех случаев заболеваний. По данным литературы хорошо известно, что представители Б.1урЫтигшт способны вызывать очаги внутрибольничных инфекций (ВБИ) с множественными случаями [15, 16, 53, 85, 102]. С середины 80-х годов XX века и до настоящего времени доминирующую позицию занимает & еШегШсИз. [26, 37, 49, 83, 103].

Изложенное выше позволяет сделать вывод о том, что заболеваемость сальмонеллезом, по-прежнему остается актуальной эпидемиологической и клинической медицинской проблемой [106].

1.2. Биологические свойства сальмонелл

Сальмонеллы являются грамотрицательными палочками, имеют перитрихиальные (по всей поверхности клетки) жгутики, что делает их подвижными.

Сальмонеллы относятся к факультативным анаэробам, хорошо растут на стандартных питательных средах и не требуют специальных условий для

культивирования. Оптимальной температурой роста для них является 37 °С, предпочтительная реакция среды слабощелочная (pH 7,2-7,6) [11, 94, 137].

Типичные варианты сальмонелл не разлагают лактозу, но ферментируют глюкозу, рамнозу, ксилозу, арабинозу, мальтозу, дульцит, сорбит, трегалозу, маннит с образованием кислоты и обычно газа. Сальмонеллы являются оксидазонегативными, каталазопозитивными, и индолнегативными микроорганизмами. В реакции Фогес-Проскауэра всегда отрицательные, положительны в реакции с метиловым красным, не обладают ферментом уреазой, большинство серовариантов цитратпозитивны и продуцируют сероводород.

Сальмонеллезы относятся к группе полиэтиологичных инфекционных заболеваний человека, животных и птиц с фекально-оральным механизмом передачи. Возбудитель, относящийся к семейству Enterobacteriaceae sp., был назван в честь американского ученого D. Salmon, описавшего его в 1885г., как микроорганизм S. suipestifer (ныне известный, как S. choleraesuis). Родовое название - Salmonella spp. было утверждено на основе приоритета в 1933г. Международным соглашением в соответствии с правилами ботанической номенклатуры. Согласно определителю бактерий Берджи род Salmonella представлен двумя видами - S. enterica и S. bongori. Вид S. enterica делится на несколько подвидов, обозначаемых номерами или собственными именами: S. enterica (I), S.salamae (II), S.arizonae (Illa), S.diarizonae (Illb), S.houtenae (IV), S. indica (VI). Вид S. bongori -все серовары вида S.bongori имеют символ (V) [11, 50].

В диагностической схеме Кауфмана-Уайта к 2007г. насчитывалось более 2579 серологических вариантов сальмонелл, различающихся антигенной структурой и ферментативной активностью. Из них примерно 150 типов постоянно обнаруживают в Европе [11,71].

Сальмонеллам, как облигатно-патогенным микроорганизмам, свойственно токсинообразование, они вырабатывают эндо - и энтеротоксин.

Энтеротоксин представляет собой термолабильный белок с молекулярной массой 90 000-110 000 кДа. Токсический белок проявляется в течение нескольких часов в жидкой фазе растущей культуры, и его синтез обусловлен природой питательной среды, аэробностью, рН, температурой и длительностью выращивания в термостате. Энтеротоксин, активируя аденилатциклазу, приводит к повышению уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), что приводит к активной секреции электролитов и интерстициальной жидкости в просвет кишечника. Стенка кишечника при этом остается морфологически интактной, однако значительный объем жидкости, секретируемой в течение нескольких часов, может приводить к обезвоживанию, угрожающему жизни пациента [25, 127, 133].

Эндотоксин является липополисахаридом (ЛПС) - липополисахаридным комплексом, входящим в состав клеточной стенки бактерий и выделяющимся в окружающую среду, главным образом, при лизисе микроорганизма. Эндотоксины всех грамотрицательных бактерий, к которым относятся и сальмонеллы, по своему химическому строению и биологическим свойствам одинаковы и отличаются лишь составом полисахаридной части, то есть антигенной специфичностью [44]. Молекулярная масса мономеров различных ЛПС может варьировать в достаточно широких диапазонах. Известны эндотоксины с молекулярными массами от 2,5 кДа (с укороченной О-специфической цепью) до 70 кДа (с очень длинной О-специфической цепью) [121]. Большая же часть ЛПС имеет молекулярную массу от 10 до 20 кДа. Однако мономерные ЛПС могут образовывать и супрамолекулярные структуры с молекулярной массой до 1000 кДа [35]. Первичной мишенью в механизме действия бактериальных липополисахаридов являются моноциты и тканевые макрофаги, вырабатывающие медиаторы воспаления, ответственные за развитие многообразных эндотоксических реакций - интерлейкины (ИЛ), фактор некроза опухоли (ФНО-а), простагландины (ПГ) и др. Указанные медиаторы обладают очень высокой биологической активностью. Большие

концентрации таких медиаторов в организме могут привести к множеству различных патофизиологических реакций, как лихорадка, гипотония, лейкопения, тахикардия, рассеянная внутрисосудистая коагуляция и т. д.

Сальмонеллы устойчивы к воздействию физических и химических факторов внешней среды. Так, агаровые культуры 5*. с/ю/егаеяшя не погибают

о о

при О С в течение 142 дней, а при 10 С - в течение 115 дней. Наиболее устойчивой к неблагоприятным воздействиям является 6*. 1урЫтипит, которая на протяжении 7-12 месяцев может сохранять жизнеспособность на ткани, бумаге, в комнатной пыли и имеет выраженную устойчивость к высушиванию, ультрафиолетовому облучению (УФО), а также рекомендуемым концентрациям дезинфицирующих средств. По данным многих авторов, данный возбудитель (Б. 1урШтигшт) обладает множественной устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам и, в первую очередь, к антибиотикам [14, 50, 76, 101, 102]. Это обусловлено особыми биологическими свойствами данного серологического варианта, который приобрел в последние десятилетия выраженные черты «госпитального» штамма.

Анализ данных ряда научных работ по изучению антибиотикорезистентности штаммов сальмонелл, циркулирующих на отдельных территориях Российской Федерации, позволил выявить неоднозначность полученных результатов. Так, исследования Кафтыревой Л.А. и Кожуховой Е.А. (2009 г.) охарактеризовали антибиотикорезистентность 711 штаммов Б.еШегШсИБ, циркулирующих на территории Санкт-Петербурга в 20032005 гг. и отметили относительно 2002 г. возрастание в общей структуре устойчивых к тетрациклину, хлорамфениколу и ампициллину изолятов с 2,7% до 14,5%-19,9% 14,5%-19,9% [54]. Оценка чувствительности 66 штаммов сальмонелл, циркулирующих в г.Екатеринбурге (2000 г.), выявила их высокий уровень резистентности к ампициллину (16,7%), ампициллину/сульбактаму (16,7%), тетрациклину (13,8%), ко-тримоксазолу (6,1%) [19].

Исследования, проведенные Г.Б. Шагиевой, Р.Х. Ахметишиной и JI.B. Цукерман в г. Казани (2010 г.), выявили устойчивость 63,2% сальмонелл к фуразолидону (исследовано 282 штаммов). При этом устойчивость этих же штаммов к ампициллину не превысила 34,4%, к левомицетину - 18,4%. Наиболее высокий уровень чувствительности выделенные культуры имели к ципрофлоксацину - 97,5% и сальмонеллезному бактериофагу - 97% [119]. Анализ антибиотикограмм 340 штаммов S. enter itidis, выделенных от госпитализированных в стационары г.Москвы детей в 1992-2006гг., выявил присутствие в лечебных учреждениях столицы полирезистентных штаммов возбудителя (31,9%). Был отмечен рост лекарственной устойчивости сальмонелл к налидиксовой кислоте и аминогликозидам (гентамицину и тобрамицину) на фоне сохранения чувствительности к карбапенемам, некоторым фторхинолонам, аминопенициллинам и цефалоспоринам 3-4 поколения. Авторы отмечают, что дальнейшая эволюция лекарственной устойчивости сальмонелл может привести к формированию наиболее агрессивных популяций возбудителя, «внутрибольничных эковаров», что неизбежно приведет к активизации эпидемического процесса внутрибольничного (госпитального) сальмонеллеза и осложнит клиническое течение болезни [38, 39, 66].

Возрастающая устойчивость штаммов сальмонелл к антимикробным препаратам, отмеченная во многих регионах Российской Федерации, появление в лечебных организациях вспышек внутрибольничных инфекций сальмонеллезной этиологии, обусловленных полирезистентными штаммами возбудителя, обращает внимание клиницистов к препаратам сальмонеллезного бактериофага, как безвредному и эффективному средству специфической терапии и профилактики этой актуальной инфекции [51, 65, 101, 102, 111, 118].

1.3. Общая биология бактериофагов

1.3.1. Распространение бактериофагов в природе, морфология, физико-химические и антигенные свойства

Бактериофаги являются самыми распространенными жизненными формами на Земле и в десять раз более многочисленны в окружающей среде, чем бактерии. Их общая численность на планете, согласно приблизительным расчетам, составляет от Ю30до 1032 вирусных частиц. Известно, что каждый тип бактерий имеет свои собственные фаги, которые могут быть выделены отовсюду, где данные микроорганизмы существуют: из сточных вод, фекалий, мочи, почвы, океанских глубин, горячих источников и т.д. [42, 59, 128, 140, 144, 145].

Типичная фаговая частица состоит из «головки» и «хвоста». Головка (или капсид) представляет собой протеиновый слой, часто имеющий форму многогранника; содержит вирусный геном, который обычно включает двойную цепочку ДНК. Бактериофагам присущи 3 стадии существования: вирион, вегетативный вирус и провирус. На основании формы и строения вириона различают 5 морфологических типов бактериофага. Первый тип имеет длинный отросток и сокращающийся футляр, второй - длинный несокращающийся отросток, третий - короткий отросток, четвертый - только аналог отростка. Пятый тип - нитевидный фаг, морфологически представлен в форме гибкой или жесткой нити. Первые три морфологических типа фага содержат двунитчатую ДНК, четвертый - однонитчатую ДНК или РНК, пятый тип -однонитчатую РНК. Имея общую форму и внешний вид, фаги различных видов микроорганизмов различаются между собой по величине соотношений между размерами головок и отростков. Например, для фага кишечной палочки отношение размера головки к длине хвоста равно 1:4, для фага Salmonella typhimurium - 1:5[20].

Согласно классификации Международного Комитета по Таксоносмии Вирусов (ICTV), в медицине находят применение, главным образом,

бактериофаги, относящиеся к порядку Caudovirales «tailed phags» или «хвостатые фаги» [20, 123, 141]. Их подразделяют на три семейства: 1 .Prodoviridae, имеющие короткий несократимый хвостовой отросток (хвост);

2. Siphoviridae, снабженные длинным несократимым хвостом;

3. Myoviridae, обладающие сократимым хвостом.

Основными компонентами бактериофагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты — дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую (РНК). Этим свойством вирусы отличаются от микроорганизмов, которые содержат в клетках оба типа нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота находится в головке фаговой частицы, внутри которой также обнаружено небольшое количество белка (около 3%). Таким образом, по химическому составу фаги являются нуклеопротеидами. В зависимости от типа своей нуклеиновой кислоты их делят на ДНК- и РНК-содержащие. Количество белка и нуклеиновой кислоты у фагов различно. У некоторых представителей содержание их почти одинаковое и каждый из этих компонентов составляет до 50%. Кроме основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и некоторые нейтральные жиры [99, 100].

Следствием осуществления фагом циклов последовательных инфекций бактерий, растущих на поверхности твердой среды (на газоне), является образование негативных колоний (НК), называемых иногда стерильным пятном или бляшкой. Вид НК - признак, чрезвычайно специфичный для данного фага, иногда для группы родственных фагов. Признаки, которые позволяют отличить НК одного фага от НК другого, разнообразны: наличие и размер зоны центрального лизиса; наличие, степень и характер роста в зоне устойчивых бактерий; наличие ореола и характер края РЖ.

Заражение размножающейся культуры чувствительных бактерий соответствующим бактериофагом через несколько часов приводит к лизису бактериальных клеток и значительному увеличению количества бактериофага.

Основоположник учения феномена бактериофагии Феликс ДЭрелль (1917г.) условно разделил инфекционный процесс взаимодействия фага с бактерией на 4 стадии: 1) адсорбция фаговой частицы на клетке-хозяине, 2) внедрение фаговой частицы в клетку, 3) внутриклеточное размножение фагов, 4) лизис клетки-хозяина с освобождением фагового потомства [42, 110, 123, 132].

По механизму взаимодействия фага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают быстрый лизис бактерий, в то время как умеренные фаги проводят часть своего жизненного цикла в пассивном состоянии (в форме профага). Биологическое явление симбиоза микробной клетки с профагом называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Если микробная клетка станет лизогенной, она приобретает новые биологические свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов [61, 128].

Именно поэтому в терапевтических целях используют только вирулентные (хвостатые) фаги. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий. Фаги, имеющие хвостовой отросток с сокращающимся чехлом, адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостового отростка. Первоначально место прикрепления является обратимым, но затем становится необратимым и за этим следует передача от фага генетического материала в бактериальную клетку. Инъекция генома фага в бактериальную клетку хозяина происходит различными способами в зависимости от морфологии вируса, но часто включает сокращение (введение) хвоста и образование отверстия в стенке бактериальной клетки. В процессе прокола клеточной стенки бактерии фагом принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце его хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки.

Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки. За адсорбцией и проникновением фага в клетку следует фаза, получившая название «латентного периода». Происходит биосинтез фаговых компонентов и их самосборка. В бактериальной клетке накапливается до 200 новых частиц фага. Гюнтер Стент (1965) показал, что большинство переносимых атомов, которыми метились родительские частицы фага, входят в состав нового фагового потомства. При этом представители потомства содержат материал бактериальной клетки и компонентов питательной среды [20].

Завершающей фазой во взаимодействии бактерии и бактериофага является фаза лизиса клетки «хозяина» с освобождением фагового потомства, который происходит под действием белков холина и эндолизина. Эндолизин связывается с энзимами и разрушает клеточную стенку микроорганизма. Холины являются мелкими белками, которые накапливаются в мембране клетки до определенного специфического времени, «запрограммированного» в холиновом гене. Когда мембрана становится проницаемой, немедленно следует деструкция муреина с последующим взрывом клетки. Следовательно, холины, контролируют время лизиса бактериальной клетки в инфекционном процессе взаимодействия фага с бактерией [20]. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их полного выхода из клетки) продолжается от 30 до 40 минут. Бактериофаги проходят несколько циклов развития до тех пор, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии [128].

Все фаги обладают антигенными свойствами. При введении фага в организм животного или человека в сыворотке крови образуются специфические антитела. Скорость их образования зависит от пути введения фага [13, 55, 74]. Подкожное и интравенозное введение приводит к быстрому накоплению антифаговых антител в организме, в то время как при энтеральном введении у подопытных животных в сыворотке крови почти не наблюдается накопление антифаговых антител. Исследования З.В. Ермольевой (1964 г.)

показали, что антитела против фага (антифаговый иммунитет) появляются в крови лишь после 10-го дня ежедневных инъекций препарата и не приводят к разрушению фаговых частиц. Они только задерживают адсорбцию последних на бактериях [45]. По данным H.H. Ворошиловой (1992 г.) при парентеральном введении бактериофага в течение 15-20 дней в терапевтических дозах (по 0,33,0 мл/кг) в крови животных антифаговые антитела не выявляются [29]. Аналогичные результаты были получены и Г.Г. Боговазовой (1993 г.). Появление антифаговых антител регистрировали только на 21 день после введения препарата в дозах, превышающих терапевтические концентрации для человека в 1000 раз. Таким образом, изучение антифаговых антител подтвердило возможность длительного парентерального применения бактериофагов [24].

Стабильность лечебно-профилактических препаратов бактериофагов зависит от многих факторов [52]. При этом на их активность и стабильность оказывают значительное влияние такие технологические этапы производства, как культивирование, фильтрация, очистка и концентрация. Бактериофаги становятся устойчивыми в собственных лизатах лишь при двух условиях: если последние не содержат специфических инактивирующих агентов, происходящих из лизированных бактерий (рецепторных веществ), и при наличии соответствующих электролитов. Очищенные фаги наиболее устойчивы в нейтральных буферных растворах, содержащих 0,1 М хлористого натрия, 0,001М хлористого магния и небольшое количество желатина [12].

В запаянных ампулах активность бактериофага может сохраняться годами, однако при доступе воздуха он разрушается в течение 6 недель. Подвергаясь воздействию солнечных лучей или рассеянного света, бактериофаг погибает в течение 2-3 дней. К действию антисептиков фаги менее чувствительны. Например, алкоголь, эфир, 0,5% раствор сулемы или 1,5% раствор лизола на антибактериальную активность фагов не влияет. Вместе с тем, трехвалентные соли алюминия, хрома, железа, соли цинка и меди их

активно инактивируют, а глицерин практически полностью разрушает. Бактериофаги обладают разной чувствительностью к хлороформу. Стафилококковые, клебсиеллезные, сальмонеллезные и коли фаги под действием хлороформа активность не теряют, а фаги В. megaterium и Mycobacterium spp. инактивируются этим химическим веществом в 26,0-99,9 % случаев [109].

Благодаря тому, что бактериофаги обладают природной устойчивостью к хинозолу, данный реактив широко используют в качестве консерванта при получении коммерческих препаратов. Быстро и необратимо инактивируют фаги такие окислители, как хлор, перекись водорода, перманганат калия и йод. От вида бактериофага зависит и их устойчивость к нагреванию. Наиболее лабильны в этом отношении стафилококковые фаги, они необратимо инактивируются уже при 60 °С. Напротив, более устойчивы к действию высоких температур фаги кишечной группы бактерий (70-75 °С). По данным Paul Hauduroy (1927) во влажной среде бактериофаг разрушается лишь при 102 °С, а в высушенном состоянии - при 135 °С [70]. Эти важные физические и химические свойства бактериофагов учитывают при производстве их лечебно-профилактических препаратов.

1.3.2. Способы культивирования и очистки препаратов бактериофагов, критерии оценки их эффективности

Процесс культивирования бактериофагов в питательной среде представляет собой стадию размножения бактериальной популяции штаммов-продуцентов бактериофага и последующую репродукцию на них вирусных частиц. Для интенсивного размножения фагов с получением высокого титра необходимо, чтобы микроорганизм получал полноценное питание. Именно поэтому в питательной среде в легко усвояемой форме и в оптимальных количествах должны содержаться все необходимые химические элементы.

Немаловажное значение в процессе конструирования питательной среды имеет рациональный подбор ее составляющих компонентов, что обеспечивает оптимизацию рецептуры, способствуя более полному удовлетворению физиологических потребностей микроорганизмов.

Например, для культивирования стафилококкового фага зарубежные производители в качестве питательной основы наиболее часто используют такие синтетические среды, как бульон Луриа-Бертани, триптонный бульон, триптон-соевый бульон, маннитол-солевую среду; для стрептококкового фага -вытяжку из сердца и мозга животных [20]. Отечественные производители культивирование бактериофагов (включая сальмонеллезные фаги) предпочитают проводить в мясо-пептонном бульоне (МПА), бульонах Мартена, Хоттингера, или в бульоне на основе ферментативного гемогидролизата [112, 113]. Однако мясные питательные среды являются дорогостоящими и существенно перегружены белками и пептидами. На Пермском НПО «Биомед» культивирование бактерий осуществляют на казеиново-кислотной среде, обладающей хорошими ростовыми свойствами. Ее универсальная рецептура позволяет получать препараты бактериофагов с содержанием балластных веществ (по белковому азоту) в 5-6 раз меньше, чем в фаголизатах, полученных на мясных питательных средах [105, 116].

Хорошо известно, что наиболее благоприятный уровень рН для большинства бактериофагов составляет 7,7-7,8 [84]. Оптимальный срок образования бактериофага в питательной среде при 37 °С находится в интервале от 3 до 18 часов. При температуре ниже 8 °С и выше 46 °С образование бактериофагов прекращается.

Процесс культивирования микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. Специфика периодического культивирования состоит в том, что бактериальные штаммы, находящиеся в питательной среде, проходят полный цикл развития. Увеличение и последующее снижение удельной скорости роста бактериальной культуры, накопление ее биомассы и продуктов

жизнедеятельности в питательной среде происходят однократно [21, 22]. Непрерывное или проточное культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе развития (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста микроорганизма остаются постоянными. Это достигается путем непрерывного добавления в сосуд для выращивания новой порции питательной среды с одновременным удалением такого же ее количества, но содержащего клеточные элементы [43].

В Пермском НПО «Биомед» при производстве препаратов бактериофагов используют периодический метод культивирования, который предусматривает одноразовое внесение посевного материала и маточного бактериофага в питательную среду в начале процесса с последующим конечным выходом биомассы бактериофага. Применение данного способа культивирования позволяет получать более стабильный и постоянный в количественном отношении выход бактериофага, что является важным показателем для планирования производства.

В процессе культивирования бактерий и бактериофагов в питательной среде происходит накопление метаболитов. Установлено, что культуральная среда с фаголизатами бактерий содержит значительное количество балластных веществ, сильно различающихся по своей молекулярной массе. Помимо фаговых вирионов, размером 60-200 нм и компонентов питательной среды, фаголизат может содержать в значительном количестве эндотоксины и энтеротоксины. Комплекс этих веществ обладает широким спектром иммунобиологической активности: вызывает образование антител, обладает адъювантным действием, усиливает реакции гиперчувствительности замедленного типа, продукцию фактора торможения миграции лейкоцитов, оказывает летальное, деструктивное и токсическое действие на ткани внутренних органов человека [29]. При этом ЛПС в жидкой фазе растущей культуры появляется в течение нескольких часов. Его синтез обусловлен природой самой питательной среды, степенью ее аэробности, уровнем рН,

температурой и длительностью выращивания бактериальной взвеси в термостате. Освобождение питательной среды от эндотоксинов, энтеротоксинов и балластных веществ является основной причиной, заставляющей вводить в технологию изготовления препаратов бактериофагов стадию очистки.

Впервые успешная очистка бактериофага от балластных веществ была произведена Максом Шлезингером (1933) при получении бактериофага кишечной палочки - E.coli [12]. Колифаг выращивали в определенной синтетической среде и пропускали через специальные бактериальные фильтры. Затем бактериофаг концентрировали при помощи коллодиевых мембран с размером пор достаточно малым для того, чтобы задержать фаговые частицы. На следующей стадии бактериофаг осаждали центрифугированием.

Некоторые исследователи добавляли в концентрат бактериофага ртуть ^ или оксдирующие агенты, другие специалисты подвергали препарат

воздействию высокой температуры. Однако перечисленные выше агенты и процедуры приводили к разрушению протеиновой оболочки бактериофага, тем самым снижая его литическую активность [12].

В 80-е годы был предложен способ очистки бактериофагов Shigella spp., Salmonella spp. и Staphylococcus spp. от белковых компонентов методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе [33, 67, 117, 126]. Данный способ позволял получить препараты с высокой степенью активности, но сопровождался достаточно высокими технологическими потерями (от 10% до 70% для различных видов бактериофагов). Длительность технологического процесса, составляющая 10-18 часов, и невозможность обеспечения стерильных условий культивирования приводили к дополнительному загрязнению фаголизатов посторонней микрофлорой и продуктами её метаболизма, что, в свою очередь, приводило к повышению токсичности препарата.

Исследования M.J. Kluger проведенные в 1985г, показали возможность использования для очистки препаратов бактериофагов (преимущественно

предназначенных для парентерального введения) аффинных сорбентов типа полимиксина В. Однако представленный метод как и все предыдущие не обеспечивал достаточную степень очистки препарата от примеси эндотоксинов вследствие неодинакового их сродства к полимиксину В [29].

В последние годы в отечественной и зарубежной литературе опубликован ряд работ, посвященных очистке бактериофагов методом гель - ионообменной хроматографии [68, 134, 136, 138, 139]. Так, в работе М.Ю. Захаровой (2005) описан способ получения очищенного препарата, заключающийся в двойном осаждении бактериофага полиэтиленгликолем (PEG- с молекулярным весом 8000 Да.) и последующей хроматографией на аппарате Sephacryl S-500 [135].

Как известно, наиболее эффективным и экономичным способом очистки химических, фармацевтических и лекарственных препаратов, применяемых в биотехнологии, является ультрафильтрация. Ультрафильтрация представляет процесс мембранного разделения растворов высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений, а также фракционирования и концентрирования высокомолекулярных соединений. Он протекает под действием разности давления до и после мембраны [40, 41, 129, 142, 146].

Принцип мембранной фильтрации состоит в том, что отделяемые вещества задерживаются поверхностью фильтра, при этом само вещество образует на поверхности мембраны слой, который, в свою очередь, работает как фильтр. При ультрафильтрации этот слой состоит из задержанных в процессе фильтрации концентрированных растворенных или коллоидных компонентов исходного раствора. Причем, именно он становится определяющим фактором, (больше, чем сама мембрана) влияющим на скорость потока. Это нежелательное явление, называемое концентрационной поляризацией, можно уменьшить снижением адсорбционной способности поверхности мембран, увеличением скорости потока над поверхностью мембраны, созданием турбулентности с помощью дефлекторов в каналах, по

которым течет жидкость, или поддержанием низкой концентрации растворенного вещества (менее 0,5%) [72, 122].

Установлено, что на характер разделения исходного раствора существенно влияют такие физические и химические факторы, как давление, температура, уровень рН, концентрация.

В процессе ультрафильтрации могут возникнуть такие условия, когда в результате высокой проницаемости мембраны, обусловленной повышением рабочего давления, на ее поверхности может образоваться гель, и, как следствие, концентрация растворенного вещества у мембранной поверхности не будет зависеть от рабочего давления (станет постоянной). Из-за увеличения и уплотнения слоя геля проницаемость мембраны также станет постоянной, что приведет к росту сопротивления протекания растворителя через слой геля. С увеличением толщины и плотности слоя геля будет повышаться селективность технологического процесса, вместе с тем уменьшится его производительность [125, 143]. Высокая вязкость разделяемого раствора возникнет и при его повышенной концентрации. При этом на поверхности мембраны будет образовываться гелеобразный слой, влияющий на селективность и производительность процесса.

Напротив, к увеличению проницаемости мембран в процессе ультрафильтрации может приводить повышение температуры разделяемого раствора вследствие уменьшения его вязкости.

При изучении влияния уровня рН на процесс ультрафильтрации было установлено, что изменение этого показателя не влияет на проницаемость высокоселективных мембран по отношению к растворителю. В то же время от уровня рН существенно зависит проницаемость белковых компонентов. Так резкое повышение селективности в области рН 9-10, вероятно, обусловлено увеличением ассоциации молекул белка вблизи изоэлектрической точки. Рост проницаемости мембраны (имеющей небольшой отрицательный заряд) в области значения рН < 7, объясняется притяжением молекул белка с

избыточным положительным зарядом. Необходимо помнить, что для разных растворов белков оптимальные значения рН раствора должны быть различными [122].

Таким образом, при производстве препаратов бактериофагов в части оптимизации способа мембранной ультрафильтрации в производстве бактериофагов необходимо учитывать существенное влияние на процесс всех вышеуказанных факторов.

С 90-х годов XX века метод мембранной ультрафильтрации нашел широкое применение в России при производстве препаратов бактериофагов семейства Enterobacteriaceae {Shigella spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Klebsiella spp. и др.) [18, 29, 104]. Для оценки качества эффективной очистки этих препаратов применяют различные методы, включая определение содержания белка (общего азота и белкового азота), присутствие липополисахарида, изучение хроматографических профилей фаголизатов. При этом используют биологические (эксперименты по оценке острой и хронической токсичности) и иммунологические тесты (реакции гиперчувствительности замедленного типа, пассивной кожной анафилаксии, анафилактического шока) [24, 29].

Так, в работе Н.Н. Ворошиловой на приборе «Супероз-12» были исследованы хроматографические свойства фаголизатов бактерий рода Klebsiella spp. на различных этапах очистки. Исследование показало, что питательная среда и фаголизаты, независимо от видовой принадлежности микроорганизма, содержали белковые компоненты с молекулярной массой от 5 до 160 кДа. В процессе очистки препарата наблюдалось равномерное удаление всех белковых компонентов с молекулярной массой до 160 кДа [29].

В экспериментах in vivo было установлено, что в процессе очистки фаголизатов бактерий Klebsiella spp. содержание липолисахарида и О-антигена снижалось на 63,6-82,1% при этом степень очистки по белку составляла 92,997,5% [29].

В исследованиях Э.В. Алферовой (1995) было показано, что очистка фаголизатов Enterobacter spp. (Е. aerogenes, Е. cloacae, Е. agglomerans) методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания веществ 100-200 кДа обеспечивала высокую степень очистки препарата по белку до 91,8±1,2% и практически не приводила к падению титра фага. Сравнительная характеристика хроматографических свойств фаголизатов и питательной среды показала высокую эффективность использования мембранной ультрафильтрации. В конечном продукте содержались только белковые компоненты с молекулярной массой до 200 кДа. [18].

Аналогичный способ очистки был представлен в работе С.С. Усмановой (2005) при получении препаратов бактериофагов Serratia spp. [104]. Был получен препарат с высокой степенью очистки по белку - 92,4±1,6%. Эффективность разработанного способа была доказана хроматографическим методом.

При изучении безвредности и реактогенности препаратов бактериофагов Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp. в экспериментах по оценке острой и хронической токсичности В.В. Ворошилова, Э.В. Алферова и С.С. Усманова [18, 29, 104] пришли к единому мнению, что неочищенные фаголизаты вызывают выраженные патогистологические изменения внутренних органов опытной группы животных в эксперименте острой, и хронической токсичности. У очищенных методом мембранной ультрафильтрации препаратов бактериофагов, напротив, такая острая и хроническая токсичность отсутствовала. Они не вызывали патологических реакций в тестах системной и пассивной кожной анафилаксии, не обладали повышенной чувствительностью замедленного типа.

1.3.3. Лекарственные формы препаратов бактериофагов

Основными производителями препаратов бактериофагов в России, включая сальмонеллезный бактериофаг, являются такие филиалы ФГУП МЗ РФ «НПО «Микроген» как производственные объединения «Иммунопрепарат» (г.Уфа), «Имбио» (г.Н-Новгород), «Пермское НПО «Биомед» (г.Пермь). На данных предприятиях выпускают дизентерийный, сальмонеллезный, клебсиеллезный, колифаг, псевдомонадный, протейный, стафилококковый, стрептококковый бактериофаги. В связи с полиэтиологичностью большинства гнойно-септических и кишечных инфекций, наблюдаемой в последние годы, особую актуальность приобрели поливалентные комплексные препараты бактериофагов, состоящие из 6-7 компонентов (интестибактериофаг, секстафаг, пиобактериофаг) [80, 97, 98, 114].

В настоящее время фармацевтической промышленностью разработаны различные лекарственные формы этих лечебно-профилактических препаратов (жидкие и таблетированные). Из форм нового поколения заслуживают внимания жидкий бактериофаг в аэрозольной упаковке (Стафилофаг), перевязочный материал (Биодерм), свечи (клебсифаг, секстафаг), мази, линименты (Пиополифаг), лекарственные пленки (Гельфагодонт-1), таблетки. Однако, реальный коммерческий выпуск таких прогрессивных и необходимых практической медицине лекарственных средств весьма ограничен [82, 120].

По-прежнему доля традиционной жидкой формы препаратов бактериофагов в общей структуре составляет 35% [57, 86]. На таблетки с кишечно-растворимой оболочкой приходится лишь 23%, мази и линименты -15%, свечи - 11%), таблетки без оболочки (бактериофаги кишечной группы) и лекарственные пленки - 6%, жидкий бактериофаг в аэрозольной упаковке и перевязочный материал лишь 2%.

Как и другие препараты бактериофагов, сальмонеллезный фаг, преимущественно выпускаемый в виде жидкой лекарственной формы, во

флаконах по 20 мл и 100 мл, можно применять как перорально, так и ректально (в виде клизм). Однако, при пероральном приеме препарата инактивирующее действие на жидкий бактериофаг может оказать кислая среда желудочного сока [57, 58, 90]. Максимальную активность препарата в различных отделах кишечника позволят обеспечить лекарственные формы сальмонеллезного бактериофага в виде таблеток, суппозиториев или капсул. Однако, применение суппозиториев при пищевой токсикоинфекции или классической форме сальмонеллеза не целесообразно, поскольку основным клиническим симптомом этих заболеваний является ярко выраженный диарейный синдром.

К достоинствам таблетированных форм бактериофагов можно отнести их низкую себестоимость производства и удобство применения. Экономический эффект по снижению себестоимости таблеток достигается заменой использования стеклянной тары на блистерную упаковку, увеличением сроков годности, уменьшением объемов и удобством при транспортировке и хранении препарата.

Выпуск фармацевтическими предприятиями России кислотоустойчивых таблеток с бактериофагами против группы возбудителей ОКИ (дизентерийным, колипротейным, стафилококковым, брюшнотифозным, сальмонеллезным и пиобактериофагом) начался с 80-х годов [6, 115]. Опыт их широкого применения показал, что таблетированные формы имеют свои существенные недостатки. Так, кислотоустойчивая оболочка ограничивает их назначение маленьким детям (нарушается целостность защитного покрытия при дроблении таблетки). При нанесении на таблетку оболочки из органических растворов пленкообразователей возможна инактивация фага в процессе контакта с растворителями и полимерами кислотного характера [91, 131].

Результаты информационного поиска показали, что в настоящее время на отечественном фармацевтическом рынке представлены таблетки с сальмонеллезным бактериофагом без оболочки с пектиновой защитой (филиал «Имбио» Н.-Новгород) [5]. Хорошо известно, что пектины являются

вспомогательным средством при приготовлении многих лекарственных форм, служат основой для получения пастилок, суппозиториев, являются исходным сырьем в приготовлении гидрогелей, таблеток, мягких желатиновых и ректальных капсул.

Так в исследованиях Ю.П. Солодовникова (1970) было показано, что для защиты бактериофагов от действия желудочного сока рекомендуется использовать пектин, так как в опытах in vitro установлено, что именно он защищает фаг от кислой среды желудка, не снижая активности препарата. Однако Д.М. Гольдфарб (1961) приводит противоположные данные, свидетельствующие о том, что пектины могут препятствовать адсорбции фагов на бактериях, оказывать фагостатический эффект и задерживать лизис инфицированных фагом бактериальных клеток [32]. В 2005 году В.И. Решетиков при разработке таблеток с бактериофагами также отметил, что пектин в смеси с наполнителями снижает литическую активность фага, сдвигая pH среды в кислую зону [89]. Разноречивые данные о действии пектинов на бактериофаги, приведенные в данных научной литературы, требуют дальнейшего глубокого изучения.

В настоящее время фармацевтическими компаниями ведется активный поиск вспомогательных веществ, обладающих оптимальными технологическими характеристиками при производстве таблетированных форм бактериофагов (хорошей сыпучестью, кислотоустойчивостью, однородностью, влажностью и другими физическими свойствами).

Результаты исследований В.И. Решетникова и H.A. Ковязиной (2009) свидетельствуют о том, что вспомогательное вещество натрия альгинат в фармацевтической композиции с солями кальция создает желудочно-резистентный каркас, поэтому таблетированная композиция с натрием альгинатом, обладает хорошей желудочной резистентностью, что позволяет сохранить высокую литическую активность фага в лекарственном препарате [57,81].

Таким образом, актуальной задачей фармацевтической промышленности на современном этапе является создание новой таблетированной желудочно-резистентной формы препарата сальмонеллезного бактериофага с высокой литической активностью на основе современных приемов, оптимизирующих технологию его производства. Создание новой формы отечественного препарата с высокой антибактериальной направленностью позволит снизить заболеваемость сальмонеллезами на территории Российской Федерации и повысить эффективность терапии и профилактики этого заболевания.

Заключение диссертации по теме «Технология получения лекарств», Шитова, Ольга Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Сформирована подвергаемая ежегодному обновлению коллекция штаммов сальмонелл, продуцентов сальмонеллезных бактериофагов, обеспечивающая получение препарата (Бактериофаг сальмонеллезный групп A,B,C,D,E), обладающего высокой специфической активностью.

2. Способ совместного культивирования бактерий Salmonella групп A,B,C,D,E и сальмонеллезных бактериофагов на казеиново-кислотной питательной среде, промышленный способ очистки фаголизатов бактерий штаммов сальмонелл от бактериальных клеток, метаболитов и балластных веществ питательной среды с использованием метода ультрафильтрации, позволяет усовершенствовать технологию получения жидкого сальмонеллезного бактериофага.

3. Производственные серии препарата сальмонеллезного бактериофага, полученные в соответствии с разработанной оригинальной технологией, по показателям качества (описание, pH, специфическая активность, стерильность, токсичность) полностью соответствуют требованиям ФСП-000624-020411, по антибактериальной активности находятся на уровне современных антимикробных средств.

4. Оптимальная таблеточная композиция с сальмонеллезным бактериофагом, включает вспомогательные вещества: метилцеллюлозу, сорбит, лактозу, кальция карбонат, натрия альгинат, магния стеарат в соотношении 3:10:20:60:6:1 соответственно, соотношение концентрата и вспомогательных веществ составляет 1,2:1. Наилучшие технологические параметры для сохранения литической активности препарата в композиционной таблеточной массе обеспечивают сублимационное высушивание и давление прессование в диапазоне от 120 до 160 МПа.

5. По показателям качества кишечнорастворимые таблетки сальмонеллезного бактериофага без оболочки двояковыпуклой или плоскоцилиндрической формы с массой не менее 160 мг соответствуют Государственной Фармакопеи XI и сохраняют стабильность в течение 18 месяцев (срок наблюдения) при температуре от 2 до 8°С. На «Бактериофаг сальмонеллезный групп А,В,СД},Е таблетки» разработан проект Фармакопейной статьи предприятия ФГУП «НПО» «Микроген» Минздрава России.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокий уровень заболеваемости сальмонеллезами, регистрируемый в последние годы в мире и в Российской Федерации, появление антибиотикорезистентных штаммов возбудителя, диктует необходимость поиска новых подходов к терапии этих инфекционных заболеваний, в том числе к разработке дополнительного арсенала антимикробных средств. Перспективным направлением в данной сфере является применение препаратов бактериофагов со специфической направленностью, которые следует рассматривать в качестве достойной альтернативы антибиотикам, с их известными отрицательными побочными явлениями. С этой точки зрения совершенствование технологии получения высокоэффективных сальмонеллезных бактериофагов и расширение линейки их лекарственных форм является актуальной биотехнологической и клинической задачей.

С целью создания высоко активного жидкого сальмонеллезного бактериофага, нами проводилась исследовательская работа по отбору штаммов сальмонелл-продуцентов бактериофага с формированием и обновлением их производственной коллекции.

Учитывая сложность в получении редко-встречаемых штаммов сальмонелл, формирование коллекции заняло длительный период времени (2001-2009 гг.). Было изучено 924 культуры сальмонелл групп А, В, С, Б и Е, включая 830 штаммов от пациентов инфекционных больниц г. Перми и Пермского края и 94 штамма из ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва). Фаголизабельные штаммы из этой коллекции в количестве 362 были использованы нами для получения маточного фага. Его адаптация проводилась путем последовательных селектирующих пассажей на отобранных штаммах сальмонелл, под контролем оценки специфической активности. В коллекцию вошли штаммы сальмонелл, лизируемые маточным фагом (согласно ФСП

J1C-000624-020411) в титре 10"6 и выше для S. typhimurium, в титре 10"5 для остальных серологических вариантов.

В дальнейшем производственную коллекцию пополнили еще 63 штамма сальмонелл, выделенных от детей и взрослых г.Перми с диагнозом острой кишечной инфекции. Данная коллекция отражала этиологическую структуру сальмонеллезов Пермского края в 2010-2011гг. и была представлена S. enteritidis, S. injantis, S. typhimurium, S. dublin, S. newport, S. mission, S. africana. Преобладающим видом в этой группе сальмонелл была S.enteritidis (84,2±4,6%). Обновленная производственная коллекция в настоящее время включает 425 штаммов сальмонелл-продуцентов сальмонеллезных бактериофагов. Ее ежегодное пополнение и обновление происходит на основе региональных штаммов сальмонелл отражающих этиологическую структуру сальмонеллезов Пермского края.

С целью совершенствования технологических параметров производства жидкого препарата сальмонеллезного бактериофага, включая процессы его культивирования и очистки от бактериальных клеток и балластных веществ нами были проведены сравнительные испытания по совместному и раздельному культивированию сальмонеллезных бактериофагов групп А, В, С, D, Е, (полученных из штаммов сальмонелл на основе созданной производственной коллекции) на казеиново-кислотной питательной среде.

Разработанная нами технология совместного (в одной емкости) культивирования бактериофагов против сальмонелл разных серологических групп обеспечила получение сальмонеллезного бактериофага с более высокой специфической активностью (титр Ю"5,3±0'15), чем традиционная технология раздельного культивирования (титр jq-4,63±o,24^ Предложенный способ совместного культивирования сальмонеллезных бактериофагов позволил упростить технологический процесс получения препарата за счет масштабирования процесса производства и снижения трудоемкости процесса.

Для эффективной очистки фаголизата бактерий от продуктов фаголизиса, включая эндотоксины и балластные вещества питательной среды, нами был апробирован метод ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания веществ размером 100 кДа. С целью выявления оптимального восстанавливающего раствора для разбавления концентрата бактериофага проведены сравнительные испытания восстанавливающих растворов 0,9% натрия хлорида, 0,9% натрия хлорида с хлоридом магния и фосфатно-буферного раствора.

На основе проведенных исследований был разработан и экспериментально обоснован промышленный вариант ультрафильтрационной очистки жидкого сальмонеллезного бактериофага с оптимальным режимом ультрафильтрации. Двукратное концентрирование фаголизата с последующим его восстановлением до исходного объема 0,9% физиологическим раствором хлорида натрия (или 0,9% физиологическим раствором хлорида натрия с хлоридом магния) и стабилизацией 30% раствором желатина позволило получить очищенный (белковый азот 0,016 мг/мл), стабильный в течение 2 лет препарат сальмонеллезного бактериофага с высокой литической активностью (титр не ниже 10"5).

Изучение чувствительности сальмонелл, выделенных от 63 пациентов инфекционных больниц Пермского края к разработанному нами очищенному препарату сальмонеллезного бактериофага, выявило его высокий уровень литической активности (84%), не уступающий по активности многим современным антимикробным средствам.

При изучении острой токсичности полученного препарата в эксперименте на белых мышах было установлено, что его однократное пероральное введение в дозе 0,5 мл не вызывало гибели животных, не приводило к изменению их внешнего вида, активности и снижению массы тела. По результатам вскрытия внутренние органы животных имели характерные признаки, нормальное расположение и строение, при этом масса органов животных опытной (при введении бактериофага) и контрольной (без введения бактериофага) группы существенно не отличалась (р>0,05).

В эксперименте по оценке хронической токсичности при многократном пероральном введении препарата белым мышам в течение 20 дней не было зарегистрировано ни одного случая их гибели, изменения внешнего вида, поведения, активности и физиологических функций. Разница в массе тела животных сравниваемых групп (опытной и контрольной) была не достоверна (р>0,05). Отсутствие признаков хронической токсичности разработанного нами препарата сальмонеллезного бактериофага подтверждали результаты макроскопического исследования внутренних органов лабораторных животных.

Следующим этапом наших исследований, направленных на сохранение высокой литической активности сальмонеллезного бактериофага при получении его таблетированной формы явился подбор композиции вспомогательных веществ, обеспечивающих стабилизацию жидкого препарата. Необходимость стабилизации была продиктована сериями экспериментов по изучению воздействия на жидкий сальмонеллезный бактериофаг ОДМ раствора кислоты хлористоводородной в течение 1 часа, проведенных нами в опыте «in vitro». Нахождение жидкого фага в указанном растворе приводило к полной потере специфической активности фага по отношению к сальмонеллам группы А и снижение активности на 80-90% - к сальмонеллам групп B,C,D и Е.

Для выбора перспективного состава таблеточной композиции было апробировано 18 фармацевтических вариантов с использованием различных компонентов вспомогательных веществ, их количественного соотношения, технологических приемов введения в концентрат бактериофага и способов высушивания.

В ходе проведенных исследований было выявлено значительное преимущество композиции, в которой стабилизацию фага осуществляли лактозой и сорбитом, с последующим добавлением метилцеллюлозы придающей составу гелеобразную массу и препятствующей инактивации фага), кальция карбоната и натрия альгината. Именно натрия альгинат в фармацевтической композиции с кальция карбонатом создавал желудочно-резистентный каркас таблетки, образуя кальция альгинат.

При изучении оптимального соотношения концентрированного сальмонеллёзного бактериофага и наполнителя (апробированы варианты соотношений в диапазоне от 1:3 до 1,25:1). Установлено, что композиция с соотношением 1,2:1 обеспечивает самую высокую стабильность препарата (85,79%).

Таким образом, экспериментально-опытным путем нами была разработана фармацевтическая композиция сальмонеллезного бактериофага, содержащая высушенный фаг с наполнителями в соотношении (1,2:1) при следующем соотношении компонентов в массовых долях: метилцеллюлоза (3,0%), лактоза (20,0%), сорбит (10%), кальция карбонат (60,0%), натрия альгинат (6,0%), кальция или магния стеарат (1,0%).

С целью подбора оптимального варианта высушивания препарата, одного из главных технологических факторов, влияющих на специфическую активность бактериофагов, использовано три варианта сушки таблетируемой массы - воздушная, вакуумная и сублимационная. Установлено, что сохранение наивысшей активности сальмонеллезного бактериофага в таблеточной массе обеспечивает сублимационное высушивание 96,1±1,2%. Вакуумный и воздушный метод высушивания таблеточной массы показали результаты существенно ниже 76,8±6,5% и 67,8 ±8,3% соответственно.

Изучение влияния на специфическую активность бактериофага и его устойчивость к кислой среде желудка таких параметров, как форма и масса таблетки, а также давление прессования, проведенное в эксперименте с 0,1М раствором кислоты хлористоводородной установило, что после 1-часовой экспозиции в кислом растворе таблетки плоскоцилиндрической и двояковыпуклой формы сохраняют исходную форму. При этом бактериофаги разных групп сальмонелл сохраняют литическую активность от исходного уровня на 87,8% и 88,9% соответственно. Исходя из этого, можно считать допустимым выпуск таблеток с сальмонеллезным бактериофагом двояковыпуклой и плоскоцилиндрической формы.

В опыте с тремя сериями таблеток (массой 80 мг, 160 мг, 320 мг) была определена рациональная масса таблетированной формы препарата - 160 мг, эквивалентная по дозе 20 мл жидкого сальмонеллезного бактериофага.

Рекомендуемые показатели давления прессования таблеток в интервале от 120 до 160 МПа были получены нами по результатам тестирования в режимах 40, 80, 120 и 160 МПа. Не смотря на то, что все представленные режимы прессования существенно не влияли на специфическую активность таблеток и их потенциальную желудочную резистентность, таблеточные композиции, спрессованные под давлением 40 и 80 МПа, не соответствовали фармакопейным требованиям ГФ XI, поскольку отличались пористой поверхностью.

Оценка качества разработанных нами желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага групп А,В,С,Б,Е без оболочки, полученных на основе жидкого сальмонеллезного бактериофага и вспомогательных веществ (метилцеллюлоза, лактоза, сорбит, кальция карбонат, натрия альгинат, магния стеарат), установила соответствие препарата требованиям ГФ XI. Таблетки были стабильны в течение 18 месяцев при режиме хранения от 2 до 8 °С. Средний титр их специфической активности после воздействия 0,1М раствора

3 1 3 2

НС1 и желудочного сока составил 10" ' ' 10" ' и был достоверно сопоставим с титром литической активности исходного уровня таблетированного препарата (титр Ю-3'9), что позволяет сделать вывод о кислотоустойчивости разработанных нами таблеток.

Микробиологическая чистота препарата, согласно требованиям ГФ XII, соответствовала категории ЗА. В ходе эксперимента на животных по оценке токсичности таблеток установлено, что готовые таблеточные серии таковой не обладали.

Таким образом, на основе созданной и периодически обновляемой коллекции штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага с использованием новых биотехнологических подходов, включая совместное культивирование и использование метода ультрафильтрации в тангенциальном потоке был получен жидкий очищенный сальмонеллезный препарат сальмонеллезного бактериофага, с высокой антибактериальной активностью. На его основе разработана оригинальная таблеточная композиция «Бактериофаг сальмонеллезный групп А,В,СД),Е таблетки», соответствующая требованиям ГФ XI, XII. Состав композиции защищен патентом РФ на изобретение № 2410084.

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Шитова, Ольга Ивановна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОСТ 64-072-89. Средства лекарственные. Таблетки. Типы и размеры. -Взамен ОСТ 64-7-170-75 ; введ. 1989-07-01. - [Б. м., б. г.]. - 10 с.

2. Государственная Фармакопея СССР / М-во здравоохранения Рос. Федерации. - 11-е изд. - Москва : Медицина, 1991.

Вып. 1.-336 с. Вып. 2. - 400 с.

3. Государственная Фармакопея. Ч. 1. / М-во здравоохранения Рос. Федерации.

- 12-е изд., доп. - Москва: Медицина, 2007. - 469 с.

4. ФС 42-3874-99. Физико-химические, химические, физические, иммунохимические методы контроля медицинских иммунологических препаратов. - Введ. 2000-02-03. - Москва : МЗ РФ, 2000. - 77 с.

5. ФСП 42-05044012-04. Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСБЕ, таблетки.

- Введ. 2006-03-11. - [Б. м.], 2006. - 10 с.

6. ФСП 42-05046668-05. Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСОЕ, таблетки покрытые кишечнорастворимой оболочкой. - Введ. 2006-09-22. - [Б. м.], 2006.-9 с.

7. ФСП-ЛС 000624-020411. Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСОЕ, раствор для приема внутрь и местного применения. - Дата регистрации 2010— 06-21.-[Б. м.], 2010.-9 с.

8. Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений : приказ М-ва здравоохранения СССР № 535 от 22 апр. 1985 г. -Москва, 1985.-126 с.

9. СП 3.3.2.561-96. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов : утв. Глав. гос. санит. врачом Рос. Федерации : введ. в действие с 31.10.96. - [Б. м., б. г.]. - 127 с.

10. МУК 4.2.1890-04. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам :

утв. Глав. гос. санит. врачом Рос. Федерации : введ. в действие с 4.03.04. -Москва : Минздрав России, 2004. - 75 с

11. МУ 4.2.2723-10. Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды : утв. руководителем Федер. службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Глав. гос. санит. врачом Рос. Федерации : введ. в действие с 13.08.10. -Москва, 2010.-49 с.

12. Адаме, М. Бактериофаги / М. Адаме ; пер. с англ. под. ред. A.C. Кривиского. -М., 1961.-527 с.

13. Азлецкая, А. Е. О путях выделения бактериофага из организма // Журн.

микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1950. - № 11. - С. 6971.

14. Акимкин, В. Г. Бактериофаги: исторические и современные аспекты их

применения: опыт и перспективы / В. Г. Акимкин, О. С. Дарбеева, В. Ф. Колков // Клинич. практика. - 2010. - № 4. - С. 48-54

15. Акимкин, В. Г. Современные клинико-эпидемиологические аспекты

нозокомиального сальмонеллеза // Эпидемиология и санитария. - 2010. - № 3. -С. 18-24.

16. Акимкин, В. Г. Эпидемиология и профилактика нозокомиального

сальмонеллеза в стационарах для взрослых // Эпидемиология и инфекц. болезни. - 1998. - № 3. - С. 18-24.

17. Алгоритм разработки рационального состава и технологии

таблетированных бактериофагов / Н. А. Ковязина [и др.] // Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения : материалы Рос. науч.-практ. конф. ПГФА, проводимой в рамках 14-ой междунар. выставки «Медицина и здоровье» (13-15 нояб. 2008 г.). -Пермь, 2008. - С. 267-270.

18. Алферова, Э. В. Биологические свойства бактериофага Enterobacter и разработка

научных основ получения препарата бактериофагов : автореф. дис. ... канд. биол. наук / Э. В. Алферова. - Уфа, 1995. - 30 с.

19. Ахметова, JI. И. Чувствительность к антимикробным препаратам штаммов

шигелл и сальмонелл, выделенных в г. Екатеринбурге / JI. И. Ахметова, С. М. Розанова // Клинич. микробиология и антимикробная терапия. - 2000. - Т. 2, № 3.-С. 58-62.

20. Бактериофаги. Биология и практическое применение / под ред. Э. Каттер, А.

Сулаквелидзе ; науч. ред. А. В. Летаров ; пер. с англ. Е. Е. Куликова [и др,]. -Москва: Науч. мир, 2012. - 640 с.

21. Баснакьян, И. А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами :

монография / И. А. Баснакьян. - Москва : Медицина, 1992. - 189 с.

22. Баснакьян, И. А. Стресс у бактерий : монография / И. А. Баснакьян. - Москва :

Медицина, 2003. - 136 с.

23. Белоусов, В. А. Основы дозирования и таблетирования лекарственных

порошков / В. А. Белоусов, М. Б. Вальтер. - Москва : Медицина, 1980. -216 с.

24. Боговазова, Г. Г. Изучение биологических свойств и терапевтической

эффективности препаратов бактериофагов Klebsiella : автореф. дис. ... канд. мед. наук / Г. Г. Боговазова. - Челябинск, 1993. - 27 с.

25. Бондаренко, В. М. Определение эндотоксина грамотрицательных бактерий в

крови человека / В. М. Бондаренко, В. Г. Лиходед, М. Ю. Яковлев // Микробиология. - 2002. - № 2. - С. 83-89.

26. Борисов, А. С. Этиологическая расшифровка сальмонеллеза у детей / А. С.

Борисов, Н. А. Манылова, И. М. Черницын // Инфекц. болезни. - 2011. -Т. 9. - С. 53. - Прил. 1 : Материалы III Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням, Москва, 28-30 марта 2011 г.

27. Брискин, Б. С. Экспериментальная и клиническая оценка энтеральной терапии

пектинсодержащим препаратом в лечении перитонита / Б. С. Брискин, Д. А. Демидов // Сиб. мед. обозрение. - 2004. - № 4. - С. 13-18.

28. Вальтер, М. Б. Постадийный контроль в производстве таблеток / М. Б.

Вальтер, О. JI. Тютенков, Н. А. Филиппин. - Москва : Медицина, 1982. -208 с.

29. Ворошилова, Н. Н. Научные основы и разработка технологий производства

препаратов бактериофагов Shigella и Klebsiella : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Н. Н. Ворошилова. - Москва, 1992. - 53 с.

30. Гаранин, Б. А. Данные многолетнего изучения специфической активности

бактериофагов / Б. А. Гаранин, Т. А. Аникина // Вакцинология, 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней : материалы Всерос. науч.-практ. конф., 21-22 нояб., Москва. - Москва, 2006. - С. 34.

31. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц ; пер. с англ. Ю. А.

Данилова; под ред. Н. Е. Бузикашвили, Д. В. Самойлова. - Москва : Практика, 1999.-459 с.

32. Гольдфарб, Д. М. Бактериофаги / Д. М. Гольдфарб. - Москва : Медгиз, 1961. -

298 с.

33. Горбаткова, Г. А. Разработка метода концентрации и очистки лечебно-

профилактического поливалентного дизентерийного бактериофага с использованием ионнобменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе : автореф. дис. ... канд. биол. наук / Г. А. Горбаткова. - Москва, 1983. - 22 с.

34. Гурьева, О. В. Клинико-эпидемиологические особенности и вопросы

этиотропной терапии сальмонеллеза enteritidisy детей : автореф. .дис. ... канд. мед. наук / О. В. Гурьева. - Москва, 2010. - 25 с.

35. Гусаров, Д. А. Способы очистки биофармацевтических белков от

эндотоксинов клеточной стенки // Биофармац. журн. - 2009. - Т.1, № 3. -С. 10-17.

36. Дарбеева, О. С. Опыт использования адаптированных препаратов бактериофагов / О. С. Дарбеева, JI. М. Майская, Т. С. Перепанова // Биопрепараты. - 2002. - № 1. - С. 13-17.

37. 20-летняя эволюция сальмонеллезной инфекции у детей / О. Е. Ефименко [и др.] // Инфекц. болезни. - 2011. - Т. 9. - С. 125. - Прил. 1 : Материалы III Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням, Москва, 28-30 марта 2011 г.

38. Демин, И. А. Госпитальный сальмонеллез, вызванный SALMONELLA INF ANTIS / И. А. Демин, Е. Б. Брусина // Эпидемиология и инфекц. болезни. - 2006. - № 1.-С. 21-23.

39. Динамика структуры острых кишечных инфекций по данным инфекционного стационара / В. М. Агафонов [и др.] // Инфекц. болезни. -2012 - Т. 10. - С. 9. - Прил. 1 : Материалы IV Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням, Москва, 26-28 марта 2012 г

40. Дытнерский, Ю. И. Мембранные процессы разделения жидких смесей / Ю. И. Дытнерский. - Москва: Химия, 1975. - 232 с.

41. Дытнерский, Ю. И. Обратный осмос и ультрафильтрация / Ю. И. Дытнерский. -

Москва: Химия, 1978. - 352 с.

_ _i

42. Д'Эрелль. Бактериофаг / Д Эрелль. - Москва: Гос. изд-во, 1926. - 222 с.

43. Евтушенков, А. Н. Введение в биотехнологию : курс лекций / А. Н. Евтушенков, Ю. К. Фомичев. - Минск : БГУ, 2002. - 105 с.

44. Езепчук, Ю. В. Биомолекулярныве основы патогенности бактерий / Ю. В. Езепчук. - Москва: Наука, 1977. - 209 с.

45. Ермольева, 3. В. Фаготерапия / 3. В. Ермольева, О. И. Шевякова // Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. -Москва, 1964.-Т. 4.-С. 201-215.

46. Захарова, Ю. А. Использование препаратов бактериофагов у беременных с пиелонефритом : автореф. дис. ...канд. мед. наук / Ю.А. Захарова. - Пермь, 2004.-20 с.

47. Захарова, Ю.А. Совершенствование эпидемиологического надзора за гнойно-септическими инфекциями в акушерских стационарах на основе оптимизации эпидемиологического и микробиологического мониторингов : автореф. дис. . .д-ра. мед. наук / Ю.А. Захарова. - Пермь, 2009.-29с.

48. Зуева, Л. П. Бактериофаги как факторы эволюции госпитальных штаммов и средства борьбы с внутрибольничными инфекциями / Л. П. Зуева, Б. И. Асланов, В. Ю. Хорошилов // Стерилизация и госпит. инфекции. - 2009. -№ 13. -С. 19-25.

49. Изучение острых кишечных инфекций у детей / А. В. Горелов [и др.] //

Эпидемиология и инфекц. болезни. - 1999. - № 2. - С. 41-45.

50. Инфекционные болезни и эпидемиология : учеб. пособие для студентов

высш. мед. учеб. заведений./ И. В. Покровский [и др.]. - 2-е изд., испр. -Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 816 с. - (Учебник для студентов лечебных факультетов медицинских вузов).

51. Использование адаптированного сальмонеллезного бактериофага в практике

лечения и профилактики нозокоминального сальмонеллеза / В. Г. Акимкин [и др.] // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - № 6.-С. 85-86.

52. Каменева, М. А. Сохранение активности лечебных бактериофагов в процессе хранения / М. А. Каменева, И. П. Ефимова // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов : материалы Всерос. конф. 5-7 июня 2000 г., Уфа : в 2 ч. - Уфа, 2000. -Ч. 1.-С. 56-58.

53. Касымов, И. А. Клинико-иммунологические аспекты сальмонелл еза 1урЫшигшш у детей / И. А. Касымов, Г. М. Шарапова // Инфекц. болезни. -2011.-Т. 9, № 1.-С. 42-46.

54. Кафтырева, Л. Е. Течение острой кишечной инфекции, вызванной ЕЫегШсНь, у взрослых и характеристика циркулирующих в Санкт-Петербурге штаммов / Л.

A. Кафтырева, Е. А. Кожухова // Вестн. С.-Петербург, ун-та. Серия 11.- 2009. -Вып. З.-С. 94-102.

55. Квеситадзе, И. Ф. Установление сроков появления в крови антител при разных методах дачи фага / И. Ф. Квеситадзе, И. Ф. Михайлова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1957. - № 1. - С. 99-104.

56. Клинико-эпидемиологическая характеристика сальмонеллеза и его место в структуре острых кишечных инфекций / А. Ю. Холодняк [и др.] // Инфекц. болезни. - 2012. - Т. 10. - С. 412. - С.54. - Прил. 1 : Материалы IV Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням, Москва, 26-28 марта 2012 г.

57. Ковязина, Н. А. Разработка и стандартизация таблеток секстафаг : автореф. дис. ... канд. фармац. наук / Н. А. Ковязина. - Пермь, 2009. - 25 с.

58. Красильников, И. В. Некоторые аспекты современного состояния и перспективы направлений развития производства и применения лечебно-профилактических препаратов бактериофагов / И. В. Красильников, А. К. Лобастова, К. А. Лыско // Биопрепараты. - 2010. - № 2. - С. 13-17.

59. Кривинский, А. С. Вирусы против микробов (Бактериофагия) / А. С. Кривинский. - Москва: Медгиз, 1962. - 92 с.

60. Крисс, А. Е. Меловые адсорбаты бактериофагов, как терапевтические препараты / А. Е. Крисс, С. И. Диденко // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1944. - Т. 18, вып. 4/5. - С. 25-28.

61. Крылов, В. Н. Фаготерапия: мифы и реальность // Наука в России. - 2002. -№4.-С. 41—46.

62. Лазарева, Е. Б. Бактериофаги для лечения и профилактики инфекционных заболеваний // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т. 48, № 1. - С. 3640.

63. Лахно, В. М. Применение фаготерапии в хирургической практике / В. М. Лахно,

B. Н. Бордуновский // Вестн. хирургии. - 2001. - № 1. - С. 122-124.

64. Махмудов, О. С. Диарейные заболевания у детей // Мед. журн. Узбекистана. - 2005. - № 3. - С. 8-10.

65. Милютина, JI. Н. Фаготерапия острых кишечных инфекций у детей // Актуальные вопросы кишечных инфекций : тез. докл. науч.-практ. конф. -Ташкент, 1990.-С. 107-109.

66. Милютина, JI. Н. Эволюция лекарственной резистентности Salmonella enteritidis, выделенных от детей / JI. Н. Милютина, С. Ш. Рожнова, М. А. Головина // Эпидемиология и инфекц. болезни. - 2008. - № 2. - С. 44—47.

67. Нигматуллин, Т. Г. Особенности структуры ДНК и разработка технологии производства очищенных поливалентных препаратов кишечных бактериофагов : автореф. дис. .. .д-ра. биол. наук / Т. Г. Нигматуллин. - Москва, 1984. - 47 с.

68. Новый метод получения высокоочищенного белка Р 32 бактериофага Т4 для биомедицинских исследований / Н. В. Зырина [ и др. ] // Биохимия. - 2011. -Т. 12, № 3. - С. 1101-1118.

69. Носовицкая, С. А. Производство таблеток / С. А. Носовицкая, Е. Е. Борзунов, Р. М. Сафиуллин. - Москва : Медицина, 1969. - 136 с.

70. Одюруа, П. Учение о бактериофаге dHerelle / П. Одюруа ; пер. под. ред. Г. Д. Белоновского. - Ленинград : Практ. медицина, 1927. - 128 с

71. Определитель бактерий Бержди : в 2 т. : пер. с англ. Т. 1 / под. ред. Дж. Хоулта [и др.]. - Москва : Мир, 1997. - 800 с.

72. Оптимизация мембранных методов концентрирования и очистки суспензий и макромолекул / В. Н. Гомолицкий [и др.] // Журн. прикл. химии. - 1983. - № 38. -С. 42-83.

73. Остерман. Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. - Москва : Наука, 1985. - 536 с.

74. Парфенюк, Р. Л. Микробиологические основы пероральной фаготерапии гнойно-воспалительных заболеваний : автореф. дис. ... канд. биол. наук / Р. Л. Парфенюк. - Москва, 2004. - 24 с.

75. Перемитина, Л. Д. Определение безвредности и специфической активности бактериофагов // Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов / под ред. С. Г. Дзагурова [и др.]. -Москва, 1972. - С. 265-269.

76. Покровский, В. И. Пути совершенствования лабораторной диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи / В. И. Покровский [и др.] // Медицинский альманах. - 2012. - №2 (21). - С. 12-16.

77. Потиевский, Э. Г. Длительность сохранения бактерицидного действия стабилизированных водных растворов пектина / Э. Г. Потиевский, Л. И. Лазарева // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т. 49, № 3. - С. 3-5.

78. Практическое пособие по бактериофагии : учеб. пособие для биол. фак. ун-тов / под общ. ред. И. М. Габриловича. - Минск : Высш. шк., 1968. - 180 с.

79. Профилактический эффект альгината кальция при повреждении слизистой оболочки желудка, вызванном индометацином, у крыс / М. Ю. Хотимченко [и др.] // Тихоокеан. мед. журн. - 2007. - № 4. - С. 42^14.

80. Разработка и создание нового лечебно-профилактического поливалентного препарата энтеробактериофага против кишечных инфекций / М. Дарсавелидзе [и др.] // Кутаист. мед.журн. - 1999. - № 1/2. - С. 161-164.

81. Разработка состава и технологии желудочно-резистентных таблеток «Секстафаг» / Н. А. Ковязина [и др.] // Фармация. -2008. - № 7. - С. 36-39.

82. Разработка технологии изготовления суппозиториев с клебсифагом / Н. П. Ефимова [и др.] // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке : (материалы Всерос. науч. конф., посвящ. 105-летию Перм. науч.-производств, объединения «Биомед», 17-18 июня 2003 г.) - Пермь, 2003.-С. 238-242.

83. Распространенность оки в Республике Армения / Л. М. Мхитарян [и др.] // Соврем, наукоемкие технологии. - 2006. - № 8. - С. 115

84. Раутенштейн, Я. И. Бактериофагия. Общие сведения о явлении фаги и его значении в ряде производств / Я. И. Раутенштейн. - Москва : Изд-во АН СССР, 1955. - 144 с. - (Научно-популярная серия).

85. Рафиев, X. JI. Этиологическая структура гнойно-воспалительных заболеваний в различных отделениях больниц Душанбе / X. JI. Рафиев, С. С. Сатаров // Эпидемиология и инфекц. болезни. - 2001. - № 5. - С. 13-15.

86. Регистр лекарственных средств России : энцикл. лекарств / под ред. Ю. Ф. Крылова. - 8-е изд., перераб. и доп. - Москва : PJIC, 2001. - 1503 с.

87. Результаты применения пиобактериофага поливалентного очищенного жидкого при травматических кератитах и язвах роговицы / 3. А. Даутова [и др.] // Актуальные вопросы разработки производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов : материалы Всерос. конф., посвящ 95-летию Уфим. НИИВС им. И. И. Мечникова Гос. унитар. предприятия «Иммунопрепарат», 5-7 июня 2000 г. : в 2 ч. - Уфа, 2000. - Ч. 1. -С. 58-61.

88. Решетников, В. И. Влияние наполнителей и условий сушки на сохранение литической активности бактериофагов / В. И. Решетников, Н. П. Ефимова, М. А. Каменева // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке : (материалы Всерос. науч. конф., посвящ. 105-летию Перм. науч.-производств, объединения «Биомед», 17-18 июня 2003 г.) - Пермь, 2003.-С. 244-247.

89. Решетников, В. И. Методология разработки лекарственных форм с иммунобиологической и адсорбционной активностью : автореф. дис... д-ра фармац. наук / В. И. Решетников. - Пермь, 2005. - 51 с.

90. Решетников, В. И. Проблемы обеспечения кислотоустойчивости таблеток бактериофагов / В. И. Решетников, М. А. Каменева, Н. П. Ефимова // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке : (материалы Всерос. науч. конф., посвящ. 105-летию Перм. науч.-

производств, объединения «Биомед», 17-18 июня 2003 г.) - Пермь, 2003. -С. 228-232

91. Решетников, В. И. Разработка таблеток бактериофагов / В. И. Решетников, М. А. Каменева, Е. В. Функнер // Вестн. Перм. гос. фармац. акад. - 2007. -№2.-С. 358-361.

92. Решетников, В.И. Технологические аспекты разработки таблеток бактериофагов // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке : (материалы Всерос. науч. конф., посвящ. 105-летию Перм. науч.-производств, объединения «Биомед», 17-18 июня 2003 г.) - Пермь, 2003.-С. 232-234.

93. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Минздрава РФ / под общ. ред. Р. У. Хабриева. -М., 2005. -69 с.

94. Сальмонеллезы. Эпидемиология и профилактика / сост. : Р. Ш. Якупова [и др.] - Казань : КГМУ, 2001. - 34 с.

95. Самсыгина, Г. А. Бактериофаги и фаготерапия в педиатрической практике / Г. А. Самсыгина, Е. Г. Бони // Педиатрия. - 1984. - № 4. - С. 67-70.

96. Свежевыделенные штаммы возбудителей - важнейший компонент производства адаптированных лечебно-профилактических бактериофагов / Т. А. Аникина [и др.] // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» : материалы Всерос. науч.-практ. конф., 21-22 нояб., Москва. - Москва, 2006. - С. 14.

97. Современная ситуация в области производства и применения лечебно-профилактических бактериофагов / О. С. Дарбеева [и др.] // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики,

диагностики и лечения инфекционных болезней» : материалы Всерос. науч.-практ. конф., 21-22 нояб., Москва. - Москва, 2006. - С. 39.

98. Сравнительная характеристика литической активности препаратов бактериофагов в отношении возбудителей ГВЗ / J1. М. Майская [и др.] // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» : материалы Всерос. науч.-практ. конф., 21-22 нояб., Москва. - Москва, 2006. - С. 61.

99. Стент, Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / Г. Стент. - Москва : Мир, 1965.-467 с.

100. Тихоненко, А. С. Ультраструктура вирусов бактерий / А. С. Тихоненко. -Москва: Наука, 1968.-170 с.

101. Тришкова, Л. А. Фаготерапия сальмонеллезов у детей / Л. А. Тришкова, С. А. Богатырева, С. П. Нагорная // Кишечные инфекции : респ. межведомств, сб. Минздрава УССР.-Киев, 1998. -Вып. 21. - С. 11-13.

102. Трунилина, Р. А. Эпидемиологические особенности и профилактика нозокомиального сальмонеллеза в отделениях хирургического профиля : автореф. дис. ... канд. мед. наук / Р. А. Трунилина. - Москва, 2004. - 25 с.

103. Удавихина, Л. С. Современные тенденции в эпидемиологии сальмонеллеза, обусловленного Salmonella enteritidis, и роль отдельных пищевых продуктов и блюд в его распространении : автореф. дис. ... канд. мед. наук / Л. С. Удавихина. - Пермь, 2009. - 25 с.

104. Усманова, С. С. Разработка технологии получения препаратов бактериофагов Serratia : автореф. дис. ... канд. биол. наук / С. С. Усманова. -Уфа, 2005.-25 с.

105. Функнер, Е. В. Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов : автореф. дис. ... канд. мед.наук / Е. В. Функнер. - Пермь, 2007. - 24 с.

106. Характеристика бактериальных кишечных инфекций у госпитализированных детей в Санкт-Петербурге / М. К. Бехтерева [и др.] // Инфекц. болезни. - 2012 - Т. 10. - С.54. - Прил. 1 : Материалы IV Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням, Москва, 26-28 марта 2012 г.

107. Чернов, В. И. Изыскание эффективного метода сушки дизентерийного бактериофага // Бактерийные и вирусные препараты : тр. Уфим. НИИВС им. И. И. Мечникова. - Уфа, 1968. - Вып. 9.- С. 218-221.

108. Чиркова, И. В. Биологические свойства бактериофагов к Salmonella typhimurium и их применение в борьбе с сальмонеллезом голубей : автореф. дис. ... канд. биол. наук / И. В. Чиркова. - Москва, 2008. - 24 с.

109. Чувствительность бактериофагов к хлороформу / JI. А. Кособуцкий [и др.] // Здравоохранение Белоруссии. - 1976. - № 2. - С. 51-52.

110. Шаров, Г. Антибиотики, бактерии и фаги // Наука и жизнь. - 2001. - № 9. - С. 98-101.

111. Эйхнер, Э. Э. Инфекционные болезни : пособие для врачей / Э. Э. Эйхнер, Н. Н. Воробьева, О. Н. Сумливая ; Гос. образоват. учреждение высш. проф. образования «Пермская государственная медицинская академия им. Е. А. Вагнера». - Пермь, 2007. - 257 с.

112. Пат. RU2036232, С1 6 С12 N3/00. Способ получения пиобактериофага / Н. Н. Ворошилова [и др.]. - № 5030309 /13 ; заявл. 02.03.92 ;.опубл. 27.05.95, Бюл. № 15-5 с.

113. Пат. RU2183673, МПК7С12 N7/00. Среда для культивирования стафилококкового бактериофага / Н. К. Конькова [и др.]. - № 2001120856 /13 ; заявл. 25.07.01 ; опубл. 20.06.02. - 7 с.

114. Пат. RU 2232808, МПК7 C12N7/00. Биопрепарат на основе бактериофагов для профилактики и лечения сальмонеллеза животных / Э. А. Светоч [и др.] - № 2002127149/13 ; заявл. 11.10.2002 ; опубл. 20.07.2004.-4 с.

115. Пат. RU2241446. Фармацевтическая композиция, содержащая бактериофаги, и способ ее получения. / В. И. Решетников [и др.], - № 2002117099/15 ; опубл. 10.12.04, Бюл. № 34 - 8 с.

116. Пат. RU2245920. Питательная среда для производства бактериофагов и способ ее получения / М. А. Каменева, А. В. Казьянин, Н. П. Ефимова, А. М. Николаева. - № 2002122069/13 ; опубл. 10.02.2005, Бюл. №4.-4 с.

п

117. Пат. SU 653786, МПК А61К35/76. Лечебно-профилактический дизентерийный бактериофаг и способ его получения / Т. Г. Нигматуллин [и др.]. - № 1994076/13 ; заявл. 30.01.74 ; опубл. 10.10.99.

118. Куракин, Э. С. Клиническая и эпидемиологическая эффективность применения адаптированного сальмонеллезного бактериофага в комплексе противоэпидемических мероприятий по ликвидации больничных очагов [Электронный ресурс] / Э. С. Куракин. - Электрон, дан. - Режим доступа : http://www.tele-conf.ru/gospitalnyie-infektsii/, свободный. - Загл. с экрана

119. Шагиева, Г. Б. Особенности антибиотикочувствительности микробов семейства кишечных [Электронный ресурс] / Г.Б. Шагиева [и др.] // Электрон, мед. журн. -2010. - Электрон, дан. - Режим доступа : emm.infomed.su/articles/20-2010-02, свободный. - Загл. с экрана.

120. Abul-Hassan, Н. S. Bacteriophage therapy of pseudomonas burn wound sepsis / H. S. Abul-Hassan, El-Tanah K. Massoud, R. Gomaa // Annals of the MBC. 1990. - Vol. 3, № 4. - P. 262-264.

121. Anspach, F. B. Endotoxin removal by affinity sorbents // Biochem. Biophys. Methods. - 2001. - Vol. 49. - P. 665-681.

122. Bryk, M. T. Colloid chemical aspects of ultrafiltration / M. T. Bryk, E. A. Tsapiuk, V. M. Kochlodan // Synthetic polymeric membranes. - Berlin ; New Jork, 1987.-P. 245-252.

123. Carlton, R. M. Phage therapy: past history and future prospects // Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. - 1999. - Vol. 47. - P. 267-274.

124. Carr, R. L. Evaluating flow properties of solids / R. L. Carr // Chem. Ind. -1965. - Vol. 72, № 1. - P. 163-168.

125. Cernedel, C. Ultrafiltration and factor influencing the pesistance of the depositeol layer // Chem. J. Thechnol. - 1981. - № 3. - P. 192-196.

126. Creaser, E. The purification and chromatography of bacteriophages on anion-exchage cellulose / E. H. Creaser, H. Taussing // Virology. - 1957. - Vol. 4. - P. 200-208.

127. D'Aoust, Jean-Yves. Pathogenicity of foodborne Salmonella // International Journal of Microbiology. - 1991. - Vol. 12. - P. 17-40.

128. Hanlon, G. W. Bacteriophages: an appraisal of their role in the treatment of bacterial infections // Antimicrobial Agents. - 2007. - Vol. 30. - P. 118-128.

129. Genomic analysis of uncultured marine viral communities / M. Britbart [et al.]. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - № 99: - P. 14250-14255,

130. Koch, S. Treatment and prevention of enterococcal infections- alternative and experimental approaches / S. Koch, Markus Hufnagel& Johannes Huebner // Expert Opinion. Biol. Ther. - 2004. - Vol. 4 (9). - P. 1511-1523.

131. Patt, L. Losungsmittelreste in Filamdragees und isolirten Filmuberzugen / L. Patt, V. Hartmann // Pharm. Industrie. - 1976. - Vol. 38, № 10. - P. 902-906.

132. Phages and their application against drug-resistant bacteria / N. Chanishvili [et al.] // The Journal of Chemical Technology and Biotechnology. - 2001. - Vol. 76.-P. 689-699

133. Preparation of endotoxin-free bacteriophages / J. Boratynski [et al.] // Cellular & Molecular Biology Letters. - 2004. - Vol. 9. - P. 200-208.

134. Purification of bacteriophage M 13 by anion exchange chromatography / R. Monjezi [et al.] // Journal of Chromatography B Technol Biomed. Life Sci. -2010.-Vol. 878.-P. 1855-1859.

135. Purification of filamentous bacteriophage for phage display using size-exclusion chromatography / M. Y. Zakharova [et al.] // Bio Techniques. - 2005. - Vol. 38. -P. 194-198.

136. Purification of filamentous bacteriophage M 13 by Expanded Bed Anion Exchange Chromatography / T. C. Ling [et al.] // The Journal of Microbiology. - 2004. - September. - P. 228-232.

137. Qweens, M. D. Salmonella Infection / M. D. Qweens, D. A. Warren // Emedicine Specialties. - 2009. - № 3.

138. Sain, B. Bacteriophage purification by gel chromatography / B. Sain, S. Erdei // Analytical Biochemistry.-1981.-Vol. 110.-P. 128-130.

139. Smrekar, F. Purification and concentration of bacteriophage T4 using monolithic chromatographic supports / F. Smrekar [et al.] // Journal of Chromatography B. -2008.-Vol. 861.-P. 177-180.

140. Sulakvelidse, A. Bacteriophages as therapeutic agents / A. Sulakvelidse, J. G. Morris // Ann. Med. -2001. - Vol. 33, № 8. - P. 507-509.

141. Sulakvelidze, A. Phage therapy: an attractive option for dealing with antibiotic-resistant bacterial infections // Drug Discov. Today. - 2005. - Vol. 10, № 6. - P. 807809.

142. Suttle, C. A. Use of ultrafiltration to isolate viruses from seawater which are pathogens of marine phytoplankton / C. A. Suttle, A. M. Chan, M. T. Cottrell // Appl. Environ. Microbiol. - 1991.-№57.-P. 721-726.

143. Tanny, G. B. Dynamic membranes in ultrafiltration and reverse osmos // Separ. Purify. Methods. - 1978. - Vol. 7, № 2. - P. 183-220.

144. Weber-Dabrowska, B. Bacteriophages as an efficient therapy for antibiotic-resistant septicemia in man / B. Weber-Dabrowska, M. Mulczyk, A. Gorski // Transplant. Proc. -2003.-Vol. 35, №4.-P. 1385-1386.

145. Weber-Dabrowska, B. Bacteriophage Therapy of Bacterial Infections: an Update of Our Institute's Experience / B. Weber-Dabrowska, M. Mulczyk, A. Gorski // Arch. Immunol. Ther. Exp. - 2000. - Vol. 48, № 1. - P. 31-37.

146. Wommak, K. E. Effect of sunlinght on bacteriophage viability and structure / K.E. Wommak [et al.] // Appl. Environ.Microbiol. - 1996. - № 62. - P. 13361341.