Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Функер, Елена Викторовна

• Функер, Елена Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Функер, Елена Викторовна

Список основных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. БАКТЕРИОФАГИ: СВОЙСТВА, ПЕРСПЕКТИВЫ

ПРИМЕНЕНИЯ И ПРОИЗВОДСТВА.

1.1. Бактериофаги. Физико-химические и антигенные свойства.

1.2. Устойчивость фагов к факторам воздействия.

1.3. Основные стадии взаимодействия фага с бактерией.

1.4. Применение бактериофагов.

1.5. Технологические аспекты производства лечебно-профилактических препаратов бактериофагов.

1.6. Препараты бактериофагов. Лекарственные формы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. СОЗДАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ КОЛЛЕКЦИИ

ШТАММОВ - ПРОДУЦЕНТОВ БАКТЕРИОФАГОВ.

3.1. Характеристика биохимических, тинкториальных, морфологических, культуральных свойств микроорганизмов.

3.2. Чувствительность штаммов микроорганизмов к бактериофагам.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОГО ФАГОВОГО

ПРЕПАРАТА.

4.1. Разработка универсальной питательной среды.

4.2. Создание технологии получения комплексного препарата - секстафага.

4.3. Характеристика свойств секстафага.

4.3.1. Влияние физико-химических факторов и стабильность препарата.

4.3.2. Антибактериальная активность препарата.

4.3.3. Хроматографический профиль.

4.3.4. Электронно-микроскопическая характеристика секстафага.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА РЕКТАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ СЕКСТАФАГА.

5.1. Особенности получения суппозиториев с бактериофагами.

5.2. Изготовление суппозиториев с комплексным препаратом - секстафагом и свойства полученной лекарственной формы.

5.3. Изучение динамики выведения секстафага при пероральном и ректальном путях введения и применение суппозиториев в клинической практике.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов»

Актуальность проблемы

Инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, в том числе Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp.; Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., в настоящее время представляют существенную проблему, как с клинических, так и с эпидемиологических позиций. Традиционными препаратами этиотропной терапии гнойно-воспалительных заболеваний являются антибиотики. Однако применение антибиотиков сопряжено не только с гибелью патогенных агентов, поддерживающих инфекционный процесс, но и с подавлением нормальной микрофлоры человека, ее адгезивных свойств [81, 146]. Вопрос об успешной профилактике и терапии гнойно-септических инфекций приобретает чрезвычайную актуальность в условиях формирования полирезистентности микроорганизмов к антибиотикам [20, 48, 99, 196, 201, 207, 233, 256]. В связи с этим интенсифицируются исследования по совершенствованию и разработке альтернативных методов лечения, в том числе и фаготерапии. Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются: высокая чувствительность к ним патогенной микрофлоры, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к применению [62, 82, 254].

В сфере фагового производства актуальны задачи, связанные с конструированием новых препаратов и усовершенствованием технологического процесса, включая отбор и использование высокочувствительных штаммов-продуцентов, разработку питательных сред для культивирования бактериофагов, изготовление более широкой номенклатуры лекарственных форм. В условиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, наиболее целесообразно создание поливалентных комбинированных бактериофагов [22, 130, 159]. Распространенными формами выпуска препаратов бактериофагов являются жидкие лекарственные формы и таблетированные фаги кишечной группы. В последние годы на фоне значительного увеличения объемов выпуска препаратов ведутся работы по созданию новых лекарственных форм [6, 15, 33, 88, 108, 117, 118, 119, 224, 254]. Среди различных способов введения лекарств широкое распространение в медицинской практике получает ректальный способ, преимуществами которого являются: попадание лекарственного вещества непосредственно в общий кровоток, минуя желудок; увеличение скорости всасывания; уменьшение частоты аллергезирующего действия; простота, безболезненность введения, а также удобство использования в детской практике [69]. Целесообразность выпуска лекарственных форм бактериофагов для ректального введения, в том числе суппозиториев, диктуется также необходимостью сохранения литической активности фагов, так как при пероральном приеме они в значительной степени инактивируются соляной кислотой желудочного сока [63, 129].

Цель настоящего исследования - создание композиции, изучение биологических свойств и разработка лекарственных форм комплексного фагового препарата на основе отобранных из клинического материала условно патогенных микроорганизмов-продуцентов бактериофагов.

Основные задачи исследования:

1. Детально исследовать морфо-физиологические свойства выделенных из клинического материала штаммов-продуцентов бактериофагов (Е. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и создать коллекцию из перспективных в производственном отношении микроорганизмов.

2. Оптимизировать и унифицировать условия производственного процесса репродукции бактериофагов.

3. Разработать способ получения комплексного фагового препарата и охарактеризовать его биологические свойства.

4. Получить лекарственную форму комплексного фагового препарата для ректального введения (суппозитории), исследовать ее фармакодинамику и эффективность применения в клинической практике.

Научная новизна

Проведено изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств большой группы условно патогенных микроорганизмов, выделенных из клинического материала лечебных учреждений Пермского края. Произведен отбор штаммов - потенциальных продуцентов бактериофагов. Оптимизирован и унифицирован процесс репродукции бактериофагов на основе использования универсальной питательной среды (Патент RU 2247151 «Способ получения полибактериофага», приоритет от 06.05.2002). На основе высоковирулентных фагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) сконструирован поливалентный комплексный 6-компонентный препарат Секстафаг с широким спектром и высоким уровнем антибактериальной активности. Изучена фармакодинамика различных лекарственных форм Секстафага при пероралыюм и ректальном путях введения препарата.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о методических подходах к конструированию и изготовлению фаговых препаратов, включая постоянное обновление коллекции штаммов-продуцентов с изучением их свойств, репродукцию бактериофагов на универсальной питательной среде и особенности создания на их основе лекарственных форм.

Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными микробиологическими и технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления бактериофагов к условиям массового производства препаратов, а также созданием нового комплексного фагового препарата, расширяющего арсенал антибактериальных лекарственных средств. Сформирована коллекция производственных микроорганизмов-продуцентов для изготовления моно - и комплексных препаратов бактериофагов. Разработана универсальная казеиново-кислотная среда, позволяющая получать препараты бактериофагов со сниженным содержанием балластных веществ. Предложен способ получения комплексного препарата, включающий раздельное культивирование отдельных компонентов с последующим объединением высокоактивных монофагов с заданными свойствами. Получены лекарственные формы Секстафага: жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные на основе жидкого концентрата. Созданная технология используется в производстве препарата Секстафаг жидкий (получено более 270 промышленных серий). Результаты научной работы отражены в НД:

1. Регламент производства на бактериофаг стрептококковый жидкий № 1105-01.

2. ФСП 42-002823-22-02 на бактериофаг стрептококковый жидкий.

3. Регламент производства № 1103-01 на Секстафаг® (пиобактериофаг поливалентный) жидкий.

4. ФСП 42-002827-05-02 на Секстафаг® (пиобактериофаг поливалентный) жидкий.

5. Экспериментально-производственный регламент производства на Секстафаг® суппозитории ректальные (пиобактериофаг поливалентный).

6. Проект ФСП и проект инструкции по применению на Секстафаг® суппозитории ректальные (пиобактериофаг поливалентный).

Положения, выносимые на защиту

1. Использование коллекции региональных штаммов-продуцентов бактериофагов (Е. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и универсальной казеиново-кислотной питательной среды обеспечивает получение фаговых препаратов, обладающих высокой специфической активностью и низким содержанием балластных веществ.

2. Предложенный способ раздельного культивирования монофагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) с последующим объединением в единую лекарственную форму с активностью не ниже 10'5 каждого компонента обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего выраженным этиотропным действием по отношению к условно патогенным микроорганизмам.

3. Лекарственная форма препарата Секстафаг для ректального применения (суппозитории), полученная по разработанной технологии, оказывает терапевтический эффект в лечебной практике и обладает более длительной динамикой выведения, чем жидкий препарат.

Апробация работы н публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научно - практической конференции «Вакцинопрофилактика в XXI веке», Пермь, 2000; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Пермь, 2001; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004; Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», Уфа, 2005; Научно-практической конференции «Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития», Пермь, 2005; Научной конференции «Актуальные вопросы клинической медицины», Пермь, 2005; Научно-практической конференции «Трудные и нестандартные ситуации в хирургии. Новые технологии в медицине», Ижевск, 2006; Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование», Пермь, 2006; Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск, 2006; Международной Российско-китайской научной конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice», Пермь, 2006; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006.

Диссертация апробирована на заседании научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и рекомендована к защите.

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Полученные результаты защищены патентом на изобретение РФ.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнена на базе отделения бактериофагов и лаборатории бактериофагов в соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации 01.9.90 002643).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 150 страницах, содержит 24 таблицы и 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 271 источник, из них 173 отечественных и 98 иностранных авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Функер, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Сформирована постоянно обновляющаяся коллекция производственных условно патогенных штаммов - продуцентов бактериофагов, выделенных из клинического материала, позволяющая получать высоковирулентные фаговые препараты.

2. Разработан унифицированный способ репродукции бактериофагов с использованием универсальной казеиново-кислотной питательной среды, обеспечивающий получение препаратов бактериофагов с низким содержанием балластных веществ и высокой специфической активностью.

3. Сконструирована фаговая композиция, состоящая из стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного и коли бактериофагов, оказывающая выраженное этиотропное действие на условно патогенные микроорганизмы.

4. Предложен способ получения препарата Секстафаг, включающий раздельное культивирование монофагов с их последующим объединением в равных количествах, обеспечивающих специфическую активность в композиции не ниже 10"5 по каждому компоненту, и изготовлением лекарственных форм: жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные.

5. Исследована фармакодинамика комплексного фагового препарата при использовании разработанных лекарственных форм и оценена эффективность суппозиториев в клинической практике.

Заключение

В последние годы отмечается повсеместный рост лекарственной резистентности микроорганизмов к антибиотикам и большое число побочных реакций при их использовании. В связи с этим, потребность в антимикробных препаратах, действенных в отношении современных возбудителей и не угнетающих нормофлору человека, заставила клиницистов обратить свое внимание на бактериофаги, которые успешно применяли для лечения кишечных и гнойных инфекций еще до открытия антибиотиков. Лечебно-профилактические бактериофаги содержат высоковирулентные бактериофаги строго специфической направленности. Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагам, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии.

В условиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами наиболее перспективна разработка поливалентных комбинированных бактериофагов.

С целью создания комплексного фагового препарата - секстафага проводилась работа по отбору штаммов-продуцентов с формированием производственной коллекции, подбору оптимальной питательной среды для производства бактериофагов и разработке способа получения.

Формирование коллекции условно патогенных микроорганизмов проводилось на основе бактериологического анализа клинического материала. Дифференциальная диагностика выделенных штаммов микроорганизмов осуществлялась по их тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам.

За период с 1996 г. по 2000 г. для отбора высокочувствительных штаммов-продуцентов бактериофагов проанализировано 7616 штаммов микроорганизмов, выделенных в баклабораториях г. Перми и Пермского края, а также полученных из ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Максимальное пополнение коллекции проведено в 1999-2000 гг. при изучении свойств микроорганизмов St. aureus (245 штаммов), Streptococcus spp. (374 штамма), Enterococcus spp. (335 штаммов), Ps. aeruginosa (245 штаммов), E. coli (226 штаммов), Proteus spp. (573 штамма.), Klebsiella spp. (563 штамма). Штаммы микроорганизмов представленной таксономической принадлежности, обладающие типичными для каждого вида свойствами, оценивали по чувствительности к монобактериофагам (стафилококковому, стрептококковому, синегнойному, клебсиеллезному, протейному и коли). Лизируемость культур определяли по методу Аппельмана, а также при нанесении неразведенного фага на газон культуры на агаре. Наибольший диапазон литического действия отмечался у стафилококкового бактериофага. Чувствительность к данному бактериофагу клинических штаммов стафилококков составила 95%. По диапазону действия (количество лизируемых фагом культур в разведении 10 ) исследованные нами бактериофаги располагались в следующем порядке: стафилококковый - 78,2%, синегнойный - 71,7%, коли - 69,1%, клебсиеллезный - 64%, протейный - 54%, стрептококковый - 8,9% (для энтерококков) и 1,9% (для стрептококков), хотя чувствительность этих культур к стрептококковому фагу, разведенному в 10 раз весьма высокая и составляла 69,5%.

В связи с тем, что чувствительность стрептококков и энтерококков к стрептококковому фагу сильно отличалась, нами была изучена видовая принадлежность стрептококков и лизируемость их бактериофагом. Отмечена высокая чувствительность к стрептококковому бактериофагу Streptococcus pneumoniae- 84%, S. anginosus- 78%, S. agalactiae- 75%, S. pyogenes- 59%. Средний процент чувствительности для стрептококков составил 71%. Enterococcus faecalis , Е. faecium лизировались фагом в 22% случаев.

В дальнейшем микроорганизмы, чувствительные к бактериофагам в разведении не ниже 104 , пассировали с маточными бактериофагами под контролем специфической активности. В коллекцию отбирали штаммы, лизнруемые маточными бактериофагами в титре 10"6 и выше. Штаммы Escherichia coli отбирали с учетом различия серогрупп.

При формировании коллекционного пула St. aureus проводили фаготипирование штаммов с применением типового международного набора стафилококковых фагов. При изучении фагочувствительности 937 штаммов отмечено постоянное изменение чувствительности стафилококков к типовым и лечебным фагам. Выявлена высокая чувствительность к стафилококковому бактериофагу микроорганизмов, выделенных при гнойных инфекциях у взрослых (80 - 98%) и у детей (95 до 98%). Вызывающие энтеральные заболевания штаммы St. aureus лизировались фагами значительно слабее и существенно отличались по фагочувствительности в зависимости от места выделения штамма. Принимая во внимание данное обстоятельство, в коллекцию были отобраны штаммы стафилококков с разными фаготипами с учетом чувствительности к лечебному стафилококковому бактериофагу.

Проведенные исследования позволили сформировать производственную коллекцию, которая в настоящее время включает около 600 штаммов условно патогенных микроорганизмов. Пополнение и постоянное обновление коллекции обеспечивают адекватность препаратов бактериофагов современной этиологической структуре циркулирующих возбудителей.

Процесс культивирования бактериофагов предполагает создание с помощью питательных сред благоприятных условий для размножения фаговых частиц. Наиболее распространенными питательными средами в производстве бактериофагов являются дорогостоящие и недостаточно стандартные мясные среды. Нами были проведены исследования по изучению возможности использования в качестве альтернативы более экономичных казеиновых сред. Отличительными особенностями разработанного варианта казеиновой среды является то, что в качестве питательной основы использован кислотный гидролизат казеина со степенью расщепления 0,6-0,7, а также добавлен мультивитаминный комплекс. Кроме того, оптимизирован способ получения гидролизата, включающий одновременное изоосаждение нерасщепленного казеина и обработку гидролизата углем.

При сравнительном изучении характера роста микроорганизмов на мясной среде (бульон Мартена) и казеиново-кислотной среде выявлено, что разработанная среда обладает хорошими ростовыми свойствами и подходит для культивирования ряда условно патогенных бактерий (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris et mirabilis, E. coli, Ps. aeruginosa).

Проведенные исследования явились предпосылкой для создания технологии получения комплексного препарата, включающей раздельное культивирование бактериофагов. В стационарных условиях в реакторах в казеиново-кислотную среду одновременно засевали суточную микробную культуру из расчета (75±25) млн. клеток на 1 мл среды и маточный бактериофаг в количестве 0,2 % от объема засеваемой среды. Культивирование вели при температуре (36±1) °С в течение (18±2) часов до полного лизиса культуры. Полученный фаголизат подвергали сначала осветляющей, а затем стерилизующей фильтрации. После этого стерильные фаголизаты (стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиеллезный, синегнойный и коли) с титром по Аппельману не ниже 10"5 объединяли в равных объемах в 6-компонентный препарат - секстафаг. Такая технология обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего значительной антибактериальной активностью по отношению к условно патогенным микроорганизмам.

К достоинствам препарата следует отнести то, что полученный на казеиново-кислотной среде, он содержит балластных веществ в 5-6 раз меньше (по белковому азоту), чем фаголизаты с мясных питательных сред (бульон Мартена, мясо-пептонная среда).

Таким образом, разработанная технология базируется на применении универсальной питательной среды для всех используемых в производстве комплексного препарата культур: стафилококка, стрептококка, клебсиелл, синегнойной и кишечной палочек, протея, что обеспечивает стабильную репродукцию всех бактериофагов и позволяет получать секстафаг со сниженным содержанием балластных веществ. Технология получения секстафага® (пиобактериофага) жидкого внедрена в производство, получено более 270 серий секстафага жидкого по 250,0 л.

В ходе изучения свойств комплексного препарата установлено, что по устойчивости к физико-химическим факторам более стабильными являются клебсиеллезный, синегнойный, коли и протейный фаги, а лабильными -стафилококковый и стрептококковый, особенно это проявляется при высокотемпературных воздействиях.

Для сравнительной характеристики антибактериальной активности секстафага и антибиотиков оценена чувствительность к ним микроорганизмов, выделенных из клинического материала. Исследованию подверглись 2050 штаммов микроорганизмов: St. aureus (627 штаммов), S. pyogenes (183 штамма), S. pneumoniae (104 штамма), S. viridans (137 штаммов), Е. coli (649 штаммов), Kl. spp. (165 штаммов), Proteus spp. (94 штамма), Ps. aeruginosa (91 штамм), выделенные за период 2001 - 2002 гг. Так, у стафилококков степень чувствительности к секстафагу (76,7%) намного превосходила активность пенициллина (8,5%) и ампициллина (22,3%), находилась на уровне таких антибиотиков, как эритромицин (77,5 %) и оксациллин (78,8 %), а уступала только ципрофлоксацину (97,3 %), гентамицину (92,9 %) и цефазолину (89,5 %).

Результаты оценки специфической лизирующей активности секстафага по отношению к клиническим штаммам условно патогенных микроорганизмов свидетельствуют о создании высокоактивного препарата, не уступающего по эффективности многим современным антибиотикам.

Сравнительное изучение чувствительности микроорганизмов, полученных из баклабораторий лечебных учреждений г.Перми к секстафагу жидкому и пиобактериофагу поливалентному очищенному жидкому (производства

Филиала ФГУП МЗ РФ «НПО «Микроген» в г. Уфа) показало, что спектр действия этих препаратов совпадает и практически не отличается (р > 0,05).

При хроматографическом анализе комплексных препаратов бактериофагов разных производителей (Пермь, Уфа, Н.Новгород) выявлено, что содержание низкомолекулярных веществ в жидком секстафаге в 2,5-3 раза меньше, чем в пиобактериофаге и интести-бактериофаге (рис. 7). Это свидетельствует о том, что в секстафаге присутствует меньше балластных веществ, чем в других комплексных препаратах, что связано с составом применяемой питательной среды.

Полученные серии препарата - секстафаг жидкий обладали высокой специфической активностью, были стерильны, не токсичны и стабильны в течение 2-х лет хранения при температуре от 2 до 8 °С. Обращают на себя внимание показатели специфической активности препарата. Титр компонентов секстафага при определении по Грациа составил с ч

2,0 -10 - 6,0 • 10 ), что значительно выше, чем показатели титрования по Аппельману (10'5,86 - Ю"6,00). На газоне культур стафилококковый, стрептококковый, синегнойный и коли бактериофаги образуют негативные колонии размером 0,5-1,5 мм, протейный фаг - 0,1-0,2 мм и 1-2 мм, клебсиеллезный - колонии с ореолом, в центре прозрачная зона диаметром 2 мм.

Электронно-микроскопическое исследование составляющих компонентов секстафага позволило визуально выявить и охарактеризовать морфологические особенности различных видов фагов. Морфологически отдифференцировано 9 фагов, среди которых 3 вида относятся к стрептококковым фагам, 2 - к клебсиеллезным и по 1 виду - к синегнойному, протейному, стафилококковому и коли фагу. Выявлены особенности строения вирионов и разный механизм адсорбции фага на клетке, что является важным аспектом при отборе бактериальных вирусов для лечебных целей. Подтверждено, что все монофаги, входящие в секстафаг, являются высоковирулентными.

Необходимо отметить эффективность применения секстафага в лечебной практике. Комбинированный препарат - секстафаг производства «Пермского НПО «Биомед» успешно использован в качестве средства фагопрофилактики инфекционно-воспалительных осложнений при кесаревом сечении. Применение комбинированного бактериофага позволило снизить частоту инфекционно-воспалительных осложнений с 26,7 % до 18,7 % (Трушков А.Г., 2003). Эффективность терапии больных хроническим неспецифическим эндометритом составила 72-75 % (Меззи Халед Бен Абдала, 2003). Комплексное использование антибиотиков и бактериофагов при пиелонефрите у беременных явилось более эффективным и щадящим по сравнению с традиционной антибиотикотерапией (Захарова Ю.А., 2004). Оптимизация хирургической тактики, проведение антибактериальной терапии с учетом чувствительности изолированной микрофлоры к химиопрепаратам и использование в комплексной терапии секстафага позволили снизить летальность у больных инфицированным панкреонекрозом с 27,8 % до 13,3% (Субботин A.B., 2006).

Анализируя потребительские свойства лекарственных форм с бактериофагами, мы остановили свой выбор на суппозиториях. Работа по созданию суппозиториев с секстафагом включала ряд последовательных этапов. В первой серии экспериментов отрабатывали технологию получения суппозиториев на модели одного бактериофага - клебсиеллезного. В суппозиторную основу активное вещество вводили либо в сухом, либо в жидком виде. Мы отдали предпочтение последнему варианту, поскольку активность жидких фагов сохраняется дольше, чем лиофилизированных. Для предварительной подготовки биологически активного компонента был использован метод мембранной ультрафильтрации. Достоинством этого метода является совмещение стадии очистки и концентрирования бактериофагов. Проведенные исследования показали, что с помощью разделительных аппаратов на полых волокнах марки ВПУ-15 можно получить концентрированные клебсиеллезные бактериофаги с активностью в 100-150 раз выше исходной и очисткой по белковому и общему азотам в 78,0 и 63,4 раз соответственно.

Такой подход позволил сохранить практически без потерь специфическую активность бактериофага и обеспечить высокую степень его очистки. Полученные концентраты клебсиеллезного бактериофага были использованы при приготовлении 20 вариантов суппозиториев с применением ряда жировых основ (Себао, витепсолы марок Н-15, \V-35) и эмульгаторов (Т-2, МГД) в различных пропорциях. Сравнение двух суппозиторных основ (Себао и витепсол) выявило значительные преимущества последнего по физическим свойствам. Была определена оптимальная доза концентрированного бактериофага в суппозиторной массе - 20 %. Установлено, что суппозитории, приготовленные на смеси витепсолов марок Н-15 и \V-35 обладали хорошими структурно - механическими свойствами, не оплавлялись в руках и практически полностью сохраняли специфическую активность в течение 1,5 лет при температуре хранения от2до8°С.

Приготовление суппозиториев с секстафагом проводили по алгоритму, разработанному для клебсиеллезного бактериофага в свечах. Для создания необходимой дозировки в лекарственной форме компоненты секстафага так же, как и клебсиеллезный бактериофаг предварительно концентрировали. Необходимо отметить, что специфическая активность концентрированных монофагов должна быть не ниже 10". При формовании свечей важную роль играет температурное воздействие на суппозиторную массу. Учитывая это, было изучено влияние различных температур в течение 1 часа на концентрированный секстафаг и суппозиторную массу. Установлено, что максимально допустимая температура процесса выливания не должна превышать 40 °С.

По разработанной технологии изготовлены экспериментально-производственные серии секстафага в суппозиториях. На секстафаг суппозитории ректальные оформлена необходимая НД (производственный регламент, проект ФСП). 3 экспериментально-производственные серии препарата вместе с документацией прошли контроль в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, получен положительный ответ. Отмечено, что специфическая активность всех компонентов секстафага в суппозиториях сохраняется в пределах нормы (не менее 10"4) в течение 1,5 лет хранения при температуре от 2 до 8°С. По остальным показателям (описание, микробиологическая чистота, средняя масса, время полной деформации, токсичность) суппозитории по истечении срока хранения соответствовали требованиям нормативной документации.

Таким образом, предложена и отработана технология изготовления суппозиториев с секстафагом, в соответствии с которой концентрат бактериофагов вводится в суппозиторную основу в жидком виде, исключая стадию лиофилизации, что значительно удешевляет производственный процесс и обеспечивает длительное сохранение специфической активности фагов.

Следующий раздел нашей работы включал изучение динамики выведения секстафага при пероральном и ректальном путях введения у здоровых людей и больных панкреонекрозом. Исследования показали, что при ректальном способе введения бактериофагов, так же как и при пероральном, происходит всасывание фагов в кровь, циркуляция в организме человека и выведение с мочой. При этом наблюдается длительная циркуляция бактериофагов в организме человека и лучшее сохранение их литической активности. Кроме того, положительными моментами ректального применения секстафага являются: отсутствие воздействия желудочного сока; насыщение венозной системы кишечника с дальнейшим поступлением препарата в общий кровоток; специфическое действие секстафага на энтеробактерии толстой кишки.

Изучена терапевтическая эффективность препарата - секстафаг суппозитории ректальные в комплексном лечении больных. Работа проведена в 2005 г. во 2-м урологическом отделении ГКБ № 2 г.Перми. В исследование было включено 22 больных острым необструктивным пиелонефритом. Пациенты были разделены на две группы: больные основной группы получали комплексную терапию, включающую секстафаг суппозитории ректальные 2 раза в день, современные антибиотики широкого спектра, дезинтоксикационную терапию; группа сравнения получала аналогичное лечение, но без суппозиториев.

У больных основной группы при проведении комплексной терапии, включающей суппозитории с секстафагом, гипертермия исчезла в среднем через 3,1+ 0,3 суток с момента начала лечения, в группе сравнения - через 5,0 + 0,4 суток. Разница статистически достоверна (Р < 0,01). У 1 (9,1%) больного группы сравнения через 14 суток отмечалось сохранение субфебрильной температуры тела. Лейкоцитоз крови снижался значительно быстрее у больных основной группы. Через 14 суток терапии все больные имели нормальное содержание лейкоцитов крови, а среднее значение лейкоцитов составило 6,0x109/л, т.е. показатель лейкоцитоза снизился на 57,7%. В группе сравнения через 2 недели у 3 пациентов (27,3%) сохранялся гиперлейкоцитоз, среднее число лейкоцитов периферической крови снизилось меньше, чем в основной группе.

Все 11 больных основной группы были выписаны на амбулаторное лечение с отсутствием лейкоцитурии и бактериурии. При этом у 8 (81,8%) больных, у которых была выявлена бактериальная флора (преимущественно кишечная палочка) со средним микробным числом 459,1x103, при контрольном посеве мочи не было обнаружено патогенной флоры. В группе сравнения к 14 суткам у 36,4% больных сохранялась лейкоцитурия, у 18,2% в посеве мочи вновь высевались бактерии со средним микробным числом 121,7х103.

В результате проведённого исследования установлено, что применение секстафага в новой лекарственной форме - суппозиториях в сочетании с антибактериальной терапией является эффективным методом лечения острого необструктивного пиелонефрита. Применение данного препарата возможно до получения результатов бактериологического исследования мочи, что выгодно отличает комплексные бактериофаги от монофагов. Таким образом, целесообразно в схему комплексной терапии острого пиелонефрита включать секстафаг суппозитории ректальные.

Материалы исследований фармакодинамики и клинической эффективности препарата секстафаг суппозитории ректальные позволяют отметить высокую антибактериальную активность в отношении условно патогенных микроорганизмов и являются предпосылкой для дальнейшего использования их в медицине.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен комплексный фаговый препарат - секстафаг, обладающий высокой антибактериальной активность по отношению к условно патогенным микроорганизмам. На основе концентрированного секстафага создана ректальная лекарственная форма препарата - секстафаг суппозитории ректальные. Изучение фармакодинамики разных лекарственных форм секстафага показало, что ректальный способ обеспечивает длительную циркуляцию бактериофагов в организме человека. В ходе клинических исследований установлено, что применение секстафага в новой лекарственной форме - суппозиториях в сочетании с антибактериальной терапией является эффективным методом лечения острого необструктивного пиелонефрита.

127

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Функер, Елена Викторовна, 2007 год

1. Адаме М. Бактериофаги/ М. Адаме М, 1961.- 527 с.

2. Азлецкая А. Е. О путях выделения бактериофага из организма / А.Е. Азлецкая // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1950. - № 11. - С. 69-71.

3. Алферова Э.В. Биологические свойства бактериофага Enterobacter и разработка научных основ получения препарата бактериофагов: Автореф. дне. .канд. биол. наук / Э.В. Алферова Уфа, 1995. - 30 с.

4. Ананьев В.Н. Использование новой лекарственной формы в лечебном процессе / В.Н. Ананьев, Ю.Т. Новиков, Е.А. Фурина и др. // Межд. науч. конф. «Фармация в XXI веке: инновации и традиции»: Тез. докл. С-Пб.: СПХФА, 1999. - С. 45-46.

5. Ангджапаридзе Т.Г. Бактериофаг у здоровых людей / Т.Г. Ангджапаридзе // Труды Тбилисского научно-исследовательского института микробиологии, эпидемиологии инфекционных болезней. Тбилиси: Мед. газ., 1962. - С. 385-386.

6. Аркадьева З.А. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» / З.А. Аркадьева, A.M. Безбородов, И.Н. Блохина и др.; Под ред Н.С. Егорова. М.: Высш. шк., 1989. - 688 с.

7. Арсентьева В.А. Внутривенное применение больших доз бактериофага в хирургии/

8. B.А. Арсентьева // Советская медицина. 1941. - № 9. - С. 18-20.

9. Асланов Б.И. Пути рационального использования синешойных бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике / Б.И. Асланов, Р.Х. Яфаев, Л.П. Зуева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. - № 5. - С. 72-76.

10. Бабаева С. Н. Специфический паратифозный В бактериофаг / С.Н. Бабаева // Вопросы эпидемиологии, профилактики и клиники кишечных инфекций. М.: Наука, 1954. - С. 177-182.

11. Бабалова Г.Г. О профилактическом значении дизентерийного сухого бактериофага / Г.Г. Бабалова, К.Т. Кацитадзе, Л.А. Сакварелидзе и др. // ЖМЭИ. 1968. - № 2.1. C. 143-145.

12. Бактериофаготерапия урологических инфекций // Метод, рек. № 96/53. -М.: Минздравмедпром РФ, 1996. 7 с.

13. Белоусов Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия / Ю.Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Лепахин. М.: Универсум, 1993. - С. 280-293.

14. Боговазова Г.Г. Иммунобиологические свойства и терапевтическая эффективность препаратов бактериофагов клебсиелл / Г.Г. Боговазова, H.H. Ворошилова, В.М. Бондаренко и др. // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. -№3.- С. 30-33.

15. Боговазова Г.Г. Эффективность бактериофага Klebsiella pneumoniae при терапии экспериментальной клебсиеллезной инфекции / Г.Г. Боговазова, H.H. Ворошилова, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. -1991. № 4. - С. 5-8.

16. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях/ В.М. Бондаренко// Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997.-№4.-С. 20-26.

17. Бродинова Н.С. Влияние биопрепаратов на состав микрофлоры при кишечных и урогенитальных инфекциях / Н.С. Бродинова, Л.Н. Мазанкова, О.В. Ерилова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - № 9. - С.10.

18. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий/ О.В. Бухарин. М.: Медицина,1999.-367 с.

19. Вартапетов А. Я. Бактериофагия глубоких форм стрептодермий / АЛ. Вартапетов // Сб. тр. межинст. конфер. по проблеме бактериофагии, созванной в Тбилиси при институте вакцин и сывороток. Тбилиси, 1959. - С. 77-78.

20. Виноградова И.Н. Производственные питательные среды/ И.Н. Виноградова// Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. -М.: Медицина, 1964. т. 1. - С. 339-384.

21. Ворошилова H.H. Научные основы и разработка технологий производства препаратов бактериофагов Shigella и Klebsiella: Автореферат дне. .д-ра мед. наук / H.H. Ворошилова. Москва, 1992. - 53 с.

22. Габриэлян Н.И. Чувствительность нозокомиальной микрофлоры, циркулирующей в трансплантационной клинике, к лечебным бактериофагам / Н.И. Габриэлян, Е.М. Горская, Т.С. Спирина и др. // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2004.-№6.-С. 6-10.

23. Гаевская Н.Е. Характеристика умеренных фагов, выделенных из атоксигенных штаммов холерных вибрионов эльтор, изолированных от людей / Н.Е. Гаевская // Пробл. особо опас. инфекций. 2005. - № 2. - С. 40-43.

24. Гамалея Н.Ф. Бактериолизины ферменты, разрушающие бактерии / Н.Ф. Гамалея //Русский архив патологии, клинической медицины и бактериологии. - 1898. - № 6. -С. 607-613.

25. Георгадзе И.И. Получение и использование нового комбинированного биологического препарата «Интерфаг» / И.И. Георгадзе, Н.В. Топурия, Л.Г. Ткемаладзе//Мед. нов. Грузии. 1997. - № 10. - С. 12-16.

26. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц. Москва: Практика, 1999.-459 с.

27. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак.- М.: Мир, 2002. 589 с.

28. Голубева И.В. Энтеробактерии: (Руководство для врачей) / И.В. Голубева, В.А. Килесо, Б.С. Киселева и др. Под редакцией В.И. Покровского. М.: Медицина, 1985.-321 с.

29. Гольдфарб Д.М. Адсорбция фага на бактериальной клетке / Д.М. Гольдфарб // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1958. - № 5. - С. 64-69.

30. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 2. — 11-е изд., доп. Москва: Медицина, 1990.-400 с.

31. Д Эрелль. Бактериофаг / Д Эрелль. Гос. Изд., 1926.- 222 с.

32. Давидов М.И. Первый опыт применения бактериофагов / М.И. Давидов,

33. B.Б. Веретенников // Пленум Российского общества урологов: Материалы. М., 2000.-С. 64-65.

34. Дарбеева О.С. Опыт использования адаптированных препаратов бактериофагов / О.С. Дарбеева, JI.M. Майская, Т.С. Перепанова // Биопрепараты.- 2002.- № 1.1. C. 13-17.

35. Дарбеева О.С. Современная ситуация в области производства и применения лечебно-профилактических бактериофагов// О.С. Дарбеева, JI.M. Майская,г

36. PJL Парфешок и др.// Вакцинолошя 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Матер. Всеросс. науч.- практич. конфер. Москва, 2006-С. 39.

37. Дарсавелидзе М. Разработка и создание нового лечебно-профилактического поливалентного препарата энтеробактериофага против кишечных инфекций/ М. Дарсавелидзе, Т. Чанишвили, Т. Габсиония и др. // Кутаис. мед. журнал. 1999. -№ 1-2. - С. 161-164.

38. Дарсавелидзе М.А. Характеристика донорспецифических РНК-содержащих бактериофагов Escherichia coli / М.А. Дарсавелидзе, Т.Г. Чанишвили // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - № 2. - С. 86-88.

39. Домникова Н.П. Частота выделения и антибиотикочувствительность грамотрицательной микрофлоры у пациентов с гемобластозами / Н.П. Домникова, Е.В. Брякотнина, В.Н. Ильина // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2004.-№3.-С. 3-6.

40. Ермаков Е.В. Об эффективности бактериофагов в лечении неспецифических заболеваний легких / Е.В. Ермаков, В.Г. Новожилов, В.А. Кирилова и др.// Сов. мед. -1984.-№2.-С. 37-39.

41. Ермольева З.В. Фаготерапия / З.В. Ермольева, О.И. Шевякова // Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. М.: Медицина, 1964. - т. 4. - С. 202-211.

42. Желудева И.В. Обоснование выбора бактериофагов для лечения воспалительных заболеваний пародонта / И.В. Желудева, E.JI. Жиленков, JI.H. Максимовская и др. // Пародонтолошя. 2002. - № 1-2. - С. 46-50.

43. Жиленков Е.Л. Совершенствование методов конструирования бактериофагов для лечения лор-патологии / Е.Л. Жиленков, Д.В. Попов, В.М. Попова и др. // Биопрепараты. 2002. - № 2. - С. 2-6.

44. Жуков-Вережников Н. Н. О сущности и значении бактериофагии. Сообщение 8-е. Новые доводы в пользу герменативной теории бактериофагии / H.H. Жуков-Вережников // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1947. - № 2. -С. 48-52.

45. Жуков-Вережников H.H. К вопросу о сущности и значении бактериофагии. Сообщение 5-е. Значение феномена д'Эрель для изучения биологии бактерий /, H.H. Жуков-Вережников // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1936. -т. 17,№4.-С. 571-580.

46. Заева С. П. Анаэробные бактериофаги/ С. П. Заева. М., 1945. - 89 с.

47. Заривчацкий М.Ф. Бактериофаги в комплексном лечении больных с пюйно-сепшческими заболеваниями в хирургии/ М.Ф. Заривчацкий, Л.П. Механошина, И.Н. Мугатаров//Terra medica. 1999. - С. 13-14.

48. Захарова Ю.А. Использование препаратов бактериофагов у беременных с пиелонефритом: Автореф. дискшщ. мед. наук/Ю А. Захарова-Пермь, 2004-20с.

49. Зуев В.А. Литическая активность бактериальных вирусов / В.А.Зуев. М., 1969. -184 с.

50. Зыкова Л. С. Факторы персистенции уропатогенов в диагностике, прогнозировании и лечении пиелонефрита у детей: Дис. .д-ра мед. наук / Л.С.Зыкова Оренбург, 1998.-394с.

51. Иванов A.B. Клиническое применение бактериофагов (практическое руководство) / A.B. Иванов. С-Пб.: Петрохимфарм, 2000.-41 с.

52. Казарновская С.С. Бактериофагия / С.С. Казарновская. Л.: Изд-во АН СССР, 1932.116 с.

53. Канорский И.Д. Течение раневого процесса на фоне фаготерапии хронического остеомиелита/ И.Д. Канорский, А.Г. Ханин, З.Ф. Василькова и др. // Хирургия. -1977.-№ 1.-С.61-65.

54. Карбахш М. Мембранные процессы в медицине и биотехнологии/ М. Карбахш, X. Перль// Журнал Всес. хим. общ. 1987. - Т.32. - № 6. - С. 669-673.

55. Квеситадзе И.Ф. Установление сроков появления в крови антител при разных методах дачи фага/ И.Ф. Квеситадзе, И.Ф. Михайлова // Журнал микробиол., эшщемиол. и иммунобиол. 1957. - №1. - С. 99-104.

56. Кисина В.И. Фаготерапия воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин/ В.И. Кисина, Т.С. Перепанова, К.И. Забиров и др. // Вестник дерматологии и венерологии. 1996. - № 5. - С. 75.

57. Козлова Н.Г. Некоторые особенности создания лекарственных средств в форме суппозиториев / Н.Г. Козлова, Е.Е. Замараева, Л.И. Драник // Фармация. 1992. -№6.-С. 80-82.

58. Кокин Г.А. Фаготерапия и фагопрофилактика газовой гангрены / Г.А. Кокин // Военная медицина в Великую Отечественную войну. М., 1946. - Т. 3. - С. 56-63.

59. Кондратьева Т.С. Биофармацевтические исследования детских суппозиториев с фосфотиамином / Т.С. Кондратьева, Н.Г. Преферанская, Г.П. Матюшина, О.Н. Кондратьева//Фармация. 1990. -№ 5. - С. 14-17.f75,76,77,78,79,8081,82