Биоразнообразие аноксигенных фототрофных бактерий и их роль в продукции органического вещества в меромиктических водоемах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Лунина, Ольга Николаевна

• Лунина, Ольга Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лунина, Ольга Николаевна

Актуальность работы

К настоящему времени накоплено много данных, касающихся геохимической деятельности, физиологии и распространения аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах (Горленко, 1977; Кондратьева, 1996; Van Gemerden, Mas, 1995; Overmann, 1997; Imhoff, 2003, 2005). Места массового обитания фототрофных бактерий обычно делят на три типа: термальные источники, мелководные (соленые и пресные) водоемы, стратифицированные водоемы (Горленко, 1981). Однако в небольших количествах аноксигенные фототрофные бактерии присутствуют практически во всех водоемах, а также в затопляемых почвах.

Широкое распространение фототрофных серобактерий обусловлено их способностью использовать при фотосинтезе сероводород в качестве донора водорода. Эта физиологическая особенность позволяет пурпурным и зеленым серобактериям занять особую экологическую нишу в меромиктических водоемах, имеющих анаэробную зону, доступную солнечному свету. Первичная продукция фототрофных серобактерий может быть весьма значительной, и при активном росте в водоемах биомасса этих бактерии становится-' пищей для амеб, ряда ракообразных и других беспозвоночных животных. Несерные пурпурные бактерии, которые не используют сероводород или используют, но имеют при' этом низкую скорость роста, никогда не развиваются в значительном количестве. Фототрофные серобактерии обладают также альтернативными путями обмена, которые служат у них средством для переживания неблагоприятных периодов существования.

Большинство предыдущих исследований базировалось на морфо-физиологическом определении видов выделенных аноксигенных фототрофных бактерий (Горленко, 1977; Кондратьева, 1996; Van Gemerden and Mas, 1995). Однако с развитием молекулярно-биологических методов морфо-физиологической идентификации оказалось недостаточно для установления видовой принадлежности микроорганизмов. Поэтому на сегодняшний день требуется ревизия большинства видов фототрофных бактерий, выделенных в 70-80 гг. прошлого столетия из различных меромиктических водоемов, с целью установления их филогенетического положения. Мало изученными остаются также сезонная изменчивость структуры и активность сообществ аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических водоемах различных типов.

На чистых культурах фототрофных и хемолитотрофных бактерий показан эффект фракционирования углерода, что приводит к некоторому облегчению образующейся биомассы бактерий по сравнению с используемой углекислотой {Wong, Sackett, 1975;

Бондарь и др., 1976; Qandt et al, 1977; Zyakim et al., 1977; Зякун и др., 1996, 1998; Зякун, Ивановский, 2000; Ладыгина, 2003). Поэтому изотопный состав органического углерода взвеси и углекислоты может быть хорошим индикатором зоны развития фототрофных и/или хемолитотрофных бактерий в природных сообществах. Вместе с тем до сих пор в литературе известны лишь единичные данные о закономерностях фракционирования изотопов углерода микробным сообществом, развивающимся на границе окисленных и восстановленных вод в меромиктических водоемах. В частности, имеются сведения об изменении изотопного состава органического углерода взвеси в водной толще Черного моря вблизи хемоклина (.Иванов и др., 2000), в меромиктическом озере Могильное {Иванов, 2001), в соленом меромиктическом озере Кейки (Kaiike) в Японии (Ohkouchi et al., 2003, 2005), а также в пресном меромиктическом озере Каданьо (Cadagno) в Швейцарии (Camacho et al, 2001). Поэтому представляет интерес исследование эффекта фракционирования изотопов углерода в зоне массового развития фототрофных бактерий в меромиктических водоемах в сочетании с лабораторным изучением особенностей фракционирования на чистых культурах фототрофных бактерий.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы было определение биоразнообразия аноксигенных фототрофных бактерий и их роли в продукции органического вещества в меромиктических водоемах.

В задачи входило:

1. Количественная оценка вклада аноксигенных фототрофных бактерий в продукцию органического вещества в меромиктических водоемах.

2. Выделение чистых культур аноксигенных фототрофных бактерий и их идентификация с использованием микробиологических и молекулярных методов.

3. Проведение сравнительных сезонных исследований структуры и активности сообществ аноксигенных фототрофных бактерий.

4. Определение эффектов фракционирования стабильных изотопов углерода сообществом аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических озерах различных типов.

5. Изучение особенностей фракционирования стабильных изотопов углерода чистыми и монокультурами аноксигенных фототрофных бактерий в лабораторных условиях.

Научная новизна

Впервые проведены исследования сообществ аноксигенных фототрофных бактерий озер Шира и Шунет (Хакасия), определена их структура и биологическая продуктивность, описаны сезонные изменения, а также проведен филогенетический анализ выделенных аноксигенных фототрофных бактерий. Также впервые проведен филогенетический анализ выделенных аноксигенных фототрофных бактерий из озер Могильное и Гек-Гёль.

Показано, что сообщества аноксигенных фототрофных бактерий, развивающиеся на границе окисленных и восстановленных вод являются динамичными системами, видовой состав которых изменяется в зависимости от сезона.

Из исследованных озер выделено штаммов аноксигенных фототрофных бактерий, из которых являются новыми родами пурпурных несерных бактерий, а - новыми видами уже известных родов аноксигенных фототрофных бактерий.

На примере озер с разной степенью трофии установлено, что измерение изотопного состава органического и минерального углерода дает представление о локализации и масштабах продукции органического вещества сообществом аноксигенных фототрофных бактерий.

В ходе экспериментов с чистыми культурами выделенных аноксигенных, фототрофных бактерий показано, что фотоавтотрофный рост серобактерий сопровождался фракционированием изотопов углерода, представленных величиной Д13С (°/00), которую •> »3 определяли по разности изотопных характеристик Снсо3" и Сорг- Полученные различия в величинах фракционирования изотопов углерода при фотоавтотрофном росте исследованных культур определяются различиями в путях фиксации углекислоты у пурпурных и зеленых серобактерий, что согласуется с данными предыдущих исследований {Бондарь и др., 1976; Wong, Sackett, 1975; Бондарь и др., 1976; Quandt et al., 1977).

Практическая ценность работы

Исследованные меромиктические водоемы являются уникальными природными экосистемами, требующими бережного отношения. Аноксигенные фототрофные бактерии, развивающиеся в хемоклине меромиктических водоемов, являются естественным биологическим фильтром, препятствующим проникновению сероводорода в верхние слои озер, и тем самым сохраняют баланс между аэробными и анаэробными водами. Проведенные микробиологические и изотопно-геохимические исследования структуры и активности сообществ АФБ позволяют выявить сезонные, физико-химические и другие факторы, 8 определяющие динамику развития и изменчивость аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах. Полученные данные являются необходимой базой для дальнейших мониторинговых исследований этих уникальных экосистем, а также будут необходимы при выработке эффективных мер по сохранению этих природных объектов в случае их деградации.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: 8-й Международной конференции по соленым озерам (Жемчужный, Хакасия, 2002), на 4-й и 5-й Международных конференциях "Водные экосистемы и организмы" (Москва, 2003, 2004), на Всероссийской конференции "Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем центральной Азии" (Улан-Удэ, 2003); на 2-ом Байкальском микробиологическом Симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007).

Объем работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора и экспериментальной части, включающей главы, заключения и выводов, изложенных на странице печатного текста и включает табицы и рисунков, а также список литературы из наименований, из них на русском и на английском языке.

Место проведения работы

Работа проведена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им С.Н. Виноградского РАН, в лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. Н.В. Пименову, а также д.б.н., проф. В.М. Горленко, д.б.н. A.M. Зякуну и академику М.В. Иванову за внимание, заинтересованность и неоценимую помощь при проведении работы, при обсуждении результатов и при подготовке рукописи диссертации. Хочется горячо поблагодарить к.б.н. И.А. Брянцеву и Т.С. Прусакову за большое непосредственное участие в ходе работы, д.б.н., проф. В.К. Плакунова за ценную консультацию при подготовке экспериментов по оптимумам роста культур, к.б.н. Е.С. Баринову, к.б.н. Н.Е. Сузину за получение замечательных микрофотографий, к.б.н. В.Н. Акимова за помощь в проведении филогенетических исследований, к.ф-м.н. Д.Ю. Рогозина за помощь в отборе проб, а также сотрудников лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов С.К. Юсупова, Е.Е. Захарову принимавших активное участие на отдельных этапах отбора проб, к.б.н. И.И. Русанова, к.б.н. A.C. Саввичева, к.б.н. A.M. Лысенко и к.б.н. Ю.В. Болтянскую за большую личную поддержку. Искреннюю признательность автор выражает всем сотрудникам лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов за предоставление технической базы, помощь в освоении методик и содействие в процессе работы.

Принятые сокращения и обозначения

АДФ - аденозиндифосфат, АМФ - аденозинмонофосфат АТФ - аденозинтрифосфат, АФБ — аноксигенные фототрофиые бактерии, Бхл - бактериохлорофилл(ы), ВЦТК -восстановительный цикл трикарбоновых кислот, ГДФ - гуанозинтрифосфат, ЗБ - зеленые бактерии, ЗСБ - зеленые серобактерии, КоА - коэнзим А, НАД(Ф)/НАД(Ф)Н, [NAD(P)H2] -никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный/восстановленный, ОВ - органическое вещество, ПБ - пурпурные бактерии, ПНБ - пурпурные несерные бактерии, ПСБ -пурпурные серобактерии, РБФ(К) - рибулозобифосфат(карбоксилаза), редокс-зона (хемоклнн) - зона одновременного присутствия кислорода и сероводорода, РЦ -реакционный центр, СБ - серобактерии, ФБ - фототрофиые бактерии, ФдВОсст/ ФДокисл -Ферредоксин окисленный/восстановленный, ФЕП - фосфоенолпируват, Ф„, ФФН - фосфат неорганический, пирофосфат неорганический, ФСА - фотосинтетический аппарат, ФСБ — фототрофиые серобактерии, Хл - хлорофилл(ы), ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, ЦТК - цикл трикарбоновых кислот.

ЧАСТЬ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1

АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ В ВОДОЕМАХ 1.1. Места обитания аноксигенных фототрофных бактерий

Аноксигенные фототрофные бактерии (АФБ) являются водными организмами. Три основных фактора определяют распространение фототрофных бактерий в природе: свет, молекулярный кислород и питательные вещества {Гусев, Минеева, 1992). Места обитания фототрофных бактерий обычно делят на три типа: термальные источники, мелководные (соленые и пресные) водоемы, стратифицированные водоемы (Горленко, 1981).

1.1.1. Термальные источники

Необходимым условием для развития микроорганизмов в источниках является их способность прикрепляться к субстрату. В источниках поддерживается на постоянном уровне концентрация сульфида, Eh, рН. В серных источниках благодаря поступлению сульфида извне и доступу света создаются условия благоприятные для развития фототрофных бактерий {Горленко, 1981).

Основным представителем фототрофных бактерий в серных источниках являются нитчатые скользящие бактерии Chlorojlexus {Gibson et al, 1985), которые развиваются при температуре 35-70 °С. Из зеленых серобактерий наиболее часто присутствуют виды рода Chlorobium. Зеленые серобактерии не обнаруживались в источниках с температурой выше °С. Развитие пурпурных бактерий в термальных источниках отмечалось при температуре 4460 °С. В различных источниках отмечались почти все известные виды ПСБ. Чаще других это были виды родов Chromatium, Thiospirillum {Горленко, 1981).

1.1.2. Мелководные водоемы

Характерной чертой мелководных водоемов является их сильная подверженность ветровому перемешиванию. Тем не менее, в природной области водоемов могут формироваться анаэробные условия, поэтому здесь часто наблюдается развитие фототрофных бактерий {Тгирег, 1980).

А. Мелководные соленые водоемы

Массовый рост фототрофных бактерий имеет место в лагунах морей и океанов, эстуариях. В водоемах такого типа, богатых сульфатами, а также содержащих большое количество органического вещества, образующегося за счет переменной продукции водорослей, в значительном количестве развиваются сульфатредуцирующие бактерии -основные продуценты сульфида (Тгирег, 1980). В мелководных соленых водоемах фотосинтезирующие бактерии представлены в основном ПСБ, развивающимися на поверхности ила или на гниющих водорослях (Тгирег, 1980; Горленко и др., 1977). Основными видами серобактерий, выделенных из мелководных соленых водоемов, являются СМогоЫит уЛпо/огте, РгояМесосЫот аейШаги (Кондратьева, Горленко, 1978; Тгирег, 1980). Для мелководных соленых водоемов характерно формирование бактериальных матов. В их состав входят цианобактерии, пурпурные и зеленые серобактерии, а также нитчатые зеленые бактерии. Зеленые серобактерии занимают в матах наиболее стабильную зону, граничащую с зоной сульфатредуцирующих бактерий (Горленко, 1981).

Благоприятные условия для развития серобактерий создаются в небольших прибрежных соленых водоемах со стоячей водой: в канавах, лужах и т. д. Обычно в таких местах происходит обильное развитие водорослей, под которыми на поверхности ила и в придонной воде размножаются разнообразные виды пурпурных серобактерий. Подвижные формы активно плавают, тогда как колониальные ТЫосухйх и ТЫосарза обрастают водную растительность. Имеются сообщения о массовом развитии пурпурных бактерий в бухтах, канавах, во время скопления в них гниющих водорослей.

В водоемах с повышенной концентрацией солей развиваются галофильные формы фототрофных бактерий. К ним относятся пурпурные бактерии ЕсШЫогЪойояргга Иа1орЫ1а, СкготаНит ¿р., цианобактерии. Среди зеленых серобактерий экстремально галофильных форм не обнаружено.

Б. Мелководные пресные водоемы

В мелководных пресных водоемах со стоячей водой развитие серных фототрофных бактерий ограничено присутствием малого количества сульфида и нишу анаэробных фототрофных бактерий занимают несерные пурпурные и зеленые бактерии (Кузнецов, 1970).

Массовое количество ПСБ отмечено в загрязненных водоемах, где образование сульфида происходит в основном за счет процессов гниения (Кузнецов, 1970). Развитие серобактерий обычно наблюдается на поверхности ила. В отдельные периоды развитие пурпурных серобактерий в пресных прудах и лужах происходит настолько интенсивно, что вся вода приобретает розовый цвет.

1.1.3. Стратифицированные водоемы

Во многих водоемах наблюдается явление стратификации, заключающееся в распределении по вертикали слоев воды различной плотности. Тропическим озерам свойственна температурная стратификация, температура поверхностного слоя воды редко опускается ниже температуры глубинного слоя. В озерах умеренных широт стабильность стратификации обычно поддерживается высокой соленостью глубинной воды или особыми географическими условиями. В пресноводных озерах, расположенных в зоне умеренного климата, стратификация обычно наблюдается, если глубина озера превышает м, нижний слой воды обычно бывает наиболее холодным

Озера различаются по характеру стратификации. В голомиктических озерах перемешивание воды идет до дна (в мономиктических циркуляция воды бывает один раз в год, в димиктических - раза в год), в меромиктических область глубинных вод не подвержена перемешиванию в течение всего года (Фортунатов, 1969).

Данная работа имеет прямое отношение к водоемам меромиктического типа, поэтому об этих водоемах будет сказано более подробно.

1.2. Аноксигенные фототрофные бактерии в меромиктических водоемах 1.2.1. Структура стратифицированного (меромиктического) водоема

Во всех озерах с достаточными глубинами при весеннем нагревании вся масса воды разделяется на две области: верхнюю, с более или менее одинаковой температурой, постоянно перемешивающуюся - эпилимнион и глубинную, с более низкой температурой и относительно спокойной водой — монимолимнион (специальное название для монимолимниона меромиктических водоемов). В промежуточном слое - металимнионе -создается градиент температуры - термоклин, и химических соединений - хемоклин {Фортунатов, 1969).

1.2.2. Взаимосвязь микробных сообществ в меромиктическом водоеме

Биологическое функционирование водных систем определяется1 в первую очередь уровнем автотрофной продукции. По всей толще эпилимниона развиваются цианобактерии и фототрофные эукариоты, здесь активно идут процессы фотосинтетического образования органического вещества, сюда также поступают экзогенные органические вещества. Значительная часть автохтонной и аллохтонной органики успевает разложиться в аэробной зоне до СО2, который вновь ассимилируется фитопланктоном и вовлекает углерод в повторный круговорот. Часть клеток фототрофов поедается, часть отмирает, оседающая органика скапливается в металимнионе и на дне водоема, и далее распадается в анаэробных условиях при участии ряда синтрофно взаимосвязанных микроорганизмов. Образующиеся в результате продукты распада — ацетат и водород могут использоваться как метанобразующими (в отсутствии сульфата или при малой его концентрации), так и сульфатредуцирующими бактериями (при наличии сульфатов в воде). В результате анаэробных процессов накапливаются различные продукты брожений, молекулярный водород, углекислота, а также метан и сероводород. Создается концентрационный градиент этих соединений, газы иногда поднимаются со дна в виде пузырей. Окисление растворенного метана метанотрофами часто является основным процессом, в котором потребляется кислород. Деятельность денитрифицирующих бактерий приводит к накоплению в монимолимнионе нитритов {Громов, Павленко, 1989).

При доступе света и формировании стабильной анаэробной зоны за счет бактериальной сульфатредукции, в монимолимнионе создаются условия для развития АФБ. Наибольшее распространение получают зеленые и пурпурные серобактерии, развивающиеся в водной толще. Первичная продукция анаэробных фототрофов может быть весьма значительной, и при активном росте эти бактерии могут служить пищей для амеб, ряда ракообразных и других беспозвоночных животных. Образующаяся в процессе аноксигенного фотосинтеза элементная сера и сульфаты тут же используются сульфатредукторами. Здесь же могут активно развиваться некоторые цианобактерии, например ОвсШШопа Итпейса, устойчивые к сероводороду и способные осуществлять аноксигенный фотосинтез за счет использования сероводорода в качестве восстановителя углекислоты. У нижней границы кислородной зоны могут развиваться аэробные серобактерии.

1.2.3. Гидрохимические особенности меромиктических водоемов

Стратифицированные водоемы могут сильно различаться по таким показателям, как общая минерализация, солевой состав, окислительно-восстановительный потенциал, освещенность, концентрация сульфида, а также наличие органических веществ (Кузнецов, 1970). Эти параметры являются определяющими для развития того или иного сообщества АФБ, а также других населяющих водоем организмов, поэтому основные из них будут рассмотрены ниже.

Пурпурные и зеленые серобактерии характеризуются близкими потребностями в факторах среды, часто сосуществуют вместе в освещенных анаэробных водных средах (пресных или соленых), богатых сульфидом. Пурпурные несерные бактерии имеют свою экологическую нишу. Как правило, они не развиваются в зонах активного роста фототрофных серобактерий. Благоприятные условия для роста пурпурных несерных бактерий, более чувствительных к сульфиду, но менее чувствительных к кислороду, создаются в местах, богатых органическими веществами. Высокая степень трофии водоема также является важным фактором для развития зеленых несерных бактерий (Гусев, Минеева, 1992).

А. Влияние солености водоемов на развитие аноксигенных фототрофных бактерий

Соленостью водоема называется общая сумма солей, содержащихся в воде. От суммарного количества ионов, зависит осмотическое давление в водной среде обитания, к которому чувствительны почти все гидробионты.

По Венецианской системе (1958) природные воды подразделяются на пресные (до 0.5 г/л), миксогалинные, или солоноватые (0.5-30 г/л), морские или эугалинные (30-40 г/л), и пересоленные (более г/л). Солоноватые (миксогалинные) воды подразделяются, в свою очередь, на олигогалинные (0.5-5 г/л), мезогалинные (5-18 г/л) и полигалинные (18-30 г/л).

К пресным водоемам относятся реки и большинство озер, к эугалинным - Мировой океан, к миксогалинным и гииергалинным - некоторые озера и отдельные участки Мирового океана (Дедю, 1990).

На нашей планете существует всего несколько десятков меромиктических соленоводных озер, в нижних слоях водной толщи которых постоянно поддерживается анаэробная зона. В соленых озерах высоко содержание сульфатов, а также достаточно высока продукция органического углерода. Здесь наблюдается наиболее массовое развитие АФБ, которые обычно образуют ярко окрашенный слой у верхней границы анаэробной зоны. Среди соленых стратифицированных водоемов большой интерес представляют водоемы, имевшие или имеющие в настоящее время связь с морем {Реликтовое озеро Могильное., 1976).

В стратифицированных пресных озерах преимущественное развитие получают зеленые серобактерии Chlorobium phaeobcicteriodes, Chlorobhtm clathrotiforme, Ancalohloris perfilievii, в то время как ПСБ в них обнаруживаются редко. Еще лучшее развитие зеленых серобактерий наблюдается в меромиктических озерах, обогащенных сульфатами, т. к. в этих водоемах содержится значительное количество сульфида (Кузнецов, 1970). Некоторые зеленые серобактерии встречаются и в пресных и в соленых водоемах. Такие виды, как Chlorobium vibrioforme, Prosthecochloris aestuarii и Chloroherpeton thalassium пока выделены только из соленых водоемов {Кондратьева, 1996).

Среди ПСБ к планктонным формам ряда пресных водоемов принадлежат Chromatium okenii, Allochromatium warmingii, Thiospirillum jenense, Amoebobacter purpureus1, Tiopedia rosea. В стратифицированных соленых озерах распространены Thiocapsa roseopersicina, Lamprobacter modesthalophilus и небольшие формы Chromatium. Находят ПСБ и на водных растениях. В прибрежной полосе морей в значительном количестве растут Chromatium buderi2, Thiocapsa roseopersicina, Thiocapsa pfennigii, Thiocystis vioiaceae. ПСБ обнаружены также в соленых болотах {Кондратьева, 1996). Большинство ПНБ встречается только в пресных водоемах. Отдельные представители этих микроорганизмов встречаются в прибрежной полосе морей, а также соленых озерах. Rhodopseudomonas palustris, Rhodomicrobium vannielii являются галотолерантными, а к облигатно галофильным относятся виды Rhodobacter sulfidophilus, Rhodobacter adri oticus, Rhodobacter euryhalinus, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudomonas mediasalinum, Rhodopseudomonas salexigens, Rhodopseudomonas salinarium (последние две бактерии растут при концентрации NaCl 18-20 %) {Кондратьева, 1996).

По сравнению с ПСБ численность ПНБ в стратифицированных водоемах невелика. В пресных водоемах она составляет 10-102 кл/мл по сравнению с 104-106 кл/мл ПСБ; в соленых - кл/мл по сравнению с 105—107 кл /мл ПСБ {Компанцева, 1985).

Б. Влияние кислорода и сероводорода на развитие аноксигенных фототрофных бактерий

АФБ различаются по чувствительности к кислороду, при освещении большинство из них предпочитает для роста анаэробные условия. Такие условия в водоеме могут формироваться как за счет процессов сульфатредукции и образования сероводорода, так и в отсутствии сероводорода.

Кислород поступает в воду в основном за счет фотосинтетической деятельности водорослей и диффузии из воздуха, поэтому верхние слои водной толщи, как правило, богаче кислородом, чем нижние. С повышением температуры и солености воды концентрация в ней кислорода понижается. В слоях, сильно заселенных животными и бактериями, может создаваться резкий дефицит Ог из-за его усиленного потребления. Около дна водоемов условия могут быть близки к анаэробным (Чернова, Былова, 1988). Такие условия, при наличии света, и особенно в присутствии растворенной органики, вполне подходят для развития несерных видов фототрофных бактерий (повсеместно распространены Rhodopseadomonas palustris и Rhodopseudomonas viridis2). Однако для развития пурпурных и зеленых серобактерий решающее значение имеет наличие сероводорода.

При умеренном содержании сероводорода в воде монимолимниона обычно доминируют ПСБ Amoebobacter purpureus1 и некоторые виды Thiocapsa. Эти ПСБ распространены в озерах наиболее широко. При умеренных концентрациях сероводорода в водоемах с достаточной освещенностью преимущество также получают ПСБ (Горленко, 1981).

При увеличении концентрации сероводорода преимущество для развития все больше начинают получать зеленые серобактерии. Ряд видов (.Pelodictyon luteolum, Pelodictyon clathratiforme, Ancalochloris perfilievii и др.), обладает высокой толерантностью к H2S, превосходя в этом отношении все известные пурпурные бактерии. В то же время зеленые бактерии - единственные облигатные фотолитотрофы, способные жить и при низких концентрациях сульфида. Это возможно благодаря их синтрофизму с сульфат- и серовосстанавливающими бактериями с образованием консорциумов Chlorochromatium aggregatum, Chlorochromatium glebulum, Pelochromatium roseiun, Pelochromatium roseo-viride и др. {Горленко, 1981; Кузнецов и др., 1985).

По сравнению со многими ПСБ, большинство ПНБ выдерживают меньшую концентрацию сероводорода. Преобладание среди фотосинтезирующих микроорганизмов ПНБ может служить показателем отсутствия в водоеме стабильной анаэробной зоны (Компанцева, 1985). В местах, где содержание сероводорода достаточно высоко, встречаются лишь отдельные представители этих микроорганизмов, в частности Rhodobacter sulfidophilus, Rhodobacter sulfoviridis. В то же время ПНБ, как уже отмечалось выше, менее чувствительны к молекулярному кислороду, чем ряд ПСБ, хотя в значительном количестве и они присутствуют в тех местах, где условия анаэробные или кислорода мало.

В. Влияние трофии водоема на развитие аноксигенных фототрофных бактерий

Интенсивность поступления сероводорода со дна в водную толщу зависит от активности процессов сульфатредукции, что в свою очередь, помимо солености, напрямую зависит от трофии водоема. Под трофией водоема обычно понимается концентрация органического вещества и биогенных элементов и связанная с этим величина продукции органического вещества в водоеме.

По степени трофии водоемы подразделяются на олиготрофные (4-40 г С/(м2хгод)), мезотрофные (40-150 г С/(м2хгод)), евтрофные (150-600 г С/(м2хгод)), дистрофирующие и дистрофные (10-20 г С/(м2 год)) {Кузнецов, 1970; Абросов, 1982;. Исаченко, 1993). Олиготрофные озера в основном сосредоточены в северных широтах и в горных районах на отложениях из гальки и песка; мезотрофные и дистрофирующие - на подзолистых почвах лесной и лесостепной зон; евтрофные - в лесостепных и степных зонах на богатых черноземах, дистрофные - в лесной северной и южной подзоне тайги, в тундре. "

На практике зачастую оказывается сложно определить к какому из перечисленных типов относится тот или иной водоем. При этом большое значение приобретают такие показатели как прозрачность воды, содержание и распределение кислорода в водной толще, численность микроорганизмов, степень минерализации образующейся органики. Наибольшие трудности в определении трофии возникают при сравнении водоемов разных климатических поясов. Так, например, в олиготрофных по всем показателям тропических озерах при высоких температурах воды биологические процессы протекают настолько интенсивно, что в монимолимнионе возникает дефицит кислорода, характерный для озер евтрофного типа {Hobbie, 1964;Beeton, 1965; Marshall, Falconer, 1973; Перес Эйрис, 1977).

В олиготрофных озерах развитие АФБ определяется главным образом глубиной положения границы сероводородного слоя. В олиготрофном горном озере Гек-Гёль (Азербайджан) на глубине м, куда благодаря высокой прозрачности воды все же поступало 0.23 % поверхностного освещения, было показано развитие слоя зеленых серобактерий СЫогоЫит рИаеоЬаМегогсЗея. В другом олиготрофном озере Марал-Гёль граница сероводородной зоны располагалась на глубине 17-19 м, и здесь, наряду с СЫогоЫит phaeobacteroid.es, развивались также ПСБ ТЫосаряа яр. (Горленко, 1977).

Разнообразие АФБ в мезотрофных озерах определяется разнообразием сочетаний физико-химических параметров. В мезотрофных озерах Беловодь, Мышиньер, Конан-Ер, по данным Сорокина и Горленко (Горленко, 1977), преимущественное развитие получают ПСБ родов СЪготайит, ТЫосарза, АтоеЬоЬасЧег, также могут в значительном количестве встречаться консорциумы, образованные разными видами ЗСБ. В мезотрофном озере Кузнечиха наряду с симбиотическими формами зеленых бактерий было показано развитие нитчатых зеленых бактерий СМогопета giganteum. В мезотрофном озере Могильное АФБ были представлены коричневоокрашенными формами зеленых серобактерий.

В евтрофных водоемах происходит наиболее бурное развитие АФБ, для них характерно развитие ПНБ, в то время как состав серобактерий в сообществе соленых евтрофных водоемов и пресных евтрофных водоемов обычно сильно отличается (.Горленко, 1977).

Г. Влияние спектрального состава света, а также интенсивности и характера освещения на развитие аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах

Интенсивность и спектральный состав света является одним из основных факторов, определяющих возможность развития АФБ в водоемах.

Основная масса подающей на Землю солнечной энергии (примерно %) приходится на долю видимых лучей (400-740 нм), почти % на инфракрасную область спектра и приблизительно % - на ультрафиолетовую область спектра с длиной волны 300-380 нм Ультрафиолетовые лучи с длиной волны до нм полностью поглощаются молекулами кислорода атмосферы, а лучи с длиной волны 220-300 нм эффективно задерживаются озоновым слоем Земли. Начиная с нм и дальше, излучение индуцирует фотосинтетические и фототаксические реакции. Видимый свет в качестве источника энергии используют фототрофные бактерии, при этом, в целом клетки прокариот способны использовать более широкий диапазон длин волн (300-1100 нм), чем клетки эукариот (300— нм) СГусев, Минеева, 1992). а) Поглощение света каротиноидами

Большинство АФБ обязаны своей окраской содержащимся в их клетках каротиноидам, что говорит об огромном функциональном значении этих пигментов. Каротиноиды поглощая коротковолновый свет (несущий большую энергию, чем свет, поглощаемый бактериохлорофиллами), а также препятствуя фотоокислению бактериохлорофиллов, делают возможным существование АФБ в условиях хорошей освещенности. Каротиноиды также обеспечивается возможность существования АФБ на большой глубине в условиях почти полной темноты.

Известно, что различные лучи солнечного спектра поглощаются водой с разной интенсивностью. Глубже всего проникает свет голубой и зеленой частей спектра (450-550 нм), сильнее поглощается ультрафиолетовый и красный свет (Гусев, Минеева, 1992).

Некоторые виды пурпурных бактерий могут жить на мелководье под слоем влажного песка толщиной в несколько сантиметров, который играет роль красного фильтра. В озерах на той глубине, где пурпурные и зеленые бактерии находят необходимые для их развития анаэробные условия, столб расположенной выше воды, обычно, сам по себе оказывается эффективным фильтром, который пропускает только зеленый и сине-зеленый свет с длинами волн от 450-550 нм В этом случае свет поглощают в основном каротиноиды, а не бактернохлорофиллы. Выделенные из таких мест АФБ обычно отличаются очень высоким содержанием каротиноидов (Стейниер, 1979).

Среди зеленых серобактерий есть виды, которые способны расти на весьма значительной глубине (20-30 м), куда доходит лишь небольшой процент солнечной радиации, причем лучи, с длиной волны в области нм. Как правило, в таких условиях встречаются виды, окрашенные в коричневый цвет (Chlorobium phaeobacteroides, Chlorobium phaeovibrioides, консорциумы Pelochromatium), которые синтезируют бактериохлорофилл е и каротиноиды серии изорениератина (Кондратьева, 1996). В Черном море Бхл е и Chlorobium phaeobacteroides, который его образует, обнаружены на глубине м (Répéta et al., 1989; Manske et al, 2005). б) Поглощение света бактериохлорофиллами

Пурпурные и зеленые бактерии часто развиваются в водоемах под более или менее плотным слоем из цианобактерий и водорослей, эффективно поглощающих свет до нм Фотосинтез пурпурных и зеленых бактерий в этих условиях связан со способностью бактериохлорофиллов поглощать длинноволновый свет в красной и инфракрасной областях спектра за пределами поглощения хлорофиллов. Такая способность объясняется тем, что светособирающие антенны АФБ имеют другие спектральные характеристики: включение Бхл в мембранный светособирающий комплекс приводит к смещению максимумов поглощения в красную область спектра в гораздо большей степени, чем это характерно для Хл оксигенных фототрофов (Громов, Павленко, 1989) (Таб.1).

Таблица 1. Основные длинноволновые максимумы поглощения света Хл прокариот in vitro и in vivo СГромов, Павленко, 1989). систематическая группа тип хлорофилла длина волны, нм в эфире в живых клетках

Прохлорофиты Хл Ъ 650

Цианобактерии Хл а 680-683

Зеленые бактерии Бхл d 725

Зеленые бактерии Бхл с 745

Пурпурные бактерии Бхл а 850-910

Пурпурные бактерии Бхл b 1020- 1035

Крайняя граница длинноволновой части спектра определяется способностью Бхл Ъ некоторых пурпурных бактерий поглощать свет с длиной волны до 1100 нм Кванты света с еще большей длинной волны несут слишком мало энергии и не могут участвовать в фотохимических реакциях. в) Интенсивность и характер освещения

Бактериальная пластинка, состоящая из фототрофных бактерий в озерах, содержащих сероводород, располагается на глубине от 3.5 до м (Кузнецов, 1970; Weisel, 1975; Feafeng, 1976), и вследствие этого до зоны бактериального фотосинтеза доходит от до 0.1 % солнечного света. Известно (Sa if a, Sakamoto, 1970), что фитопланктон не может осуществлять фотосинтез при освещении ниже %, тогда как пурпурные и зеленые бактерии часто развиваются на больших глубинах, где освещенность значительно ниже этой величины (Manske et al., 2005).

И среди пурпурных и среди зеленых бактерий есть виды, предпочитающие слабое освещение. Однако большинство АФБ предпочитают условия хорошего освещения и в естественных условиях испытывают недостаток освещения, поскольку развиваются в водоемах на глубине под слоем водорослей и цианобактерий, где также часто присутствует затенение от высших растений (Кондратьева, Самуилов, 1989).

Экспериментально показано, что зеленые и коричневые серобактерии способны развиваться при более тусклом свете, чем пурпурные бактерии (Biebl, Pfennig, 1978).

В целом, развитие массы фототрофов имеет своим пределом самозатенение, при котором ниже расположенные организмы не получают достаточно света для развития.

Важную роль играет темновой обмен фототрофов в течение ночи, когда осуществляется дыхание или, в анаэробных условиях, брожение (Заварзин, Колотилова, 2001).

ГЛАВА 2

АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ: СИСТЕМАТИКА, ЦИТОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ, МЕТАБОЛИЗМ 2.1. Отличительные особенности группы аноксигенных фототрофных бактерий

Аноксигениые фототрофные бактерии (АФБ) представляют собой группу грамотрицательных преимущественно водных микроорганизмов, способных расти фотолитоавтотрофно в бескислородных условиях, осуществляя фотосинтез без образования кислорода. Общим для всех видов АФБ является наличие бактериохлорофиллов и каротиноидных пигментов (Таб. 2, 3). Синтез фотосинтетических пигментов в клетках АФБ подавляется в присутствии кислорода.

Таблица 2. Максимумы поглощения бактериохлорофиллов в живых клетках аноксигенных фототрофных бактерий и в ацетоновом экстракте (Bergey s Mannual of Systematic Bacteriology, 1989; Кондратьева, 1996).

Бхл максимумы поглощения Бхл в живых клетках (нм) максимумы поглощения Бхл в ацетоне (нм)

Бхл a 375, 590, 805, 830-890 770

Бхл b 400,605, 835-850, 1020-1035 790

Бхл с 745-760 660

Бхл d 710-745 650

Бхл е 700-725 647

Таблица 3. Основные группы каротиноидов аноксигенных фототрофных бактерий (Bergey \s Mannual of Systematic Bacteriology, 1989; Кондратьева, 1996). название группы каротиноидов основные компоненты, входящие в состав группы

Нормальная спириллоксантиновая серия Ликопин, родопин, спириллоксантин

Альтернативная спириллоксантиновая серия Хлороксантин, сфероиден, сфероиденон, (спириллоксантин)

Океноновая серия Окенон

Родопинальная серия Ликопин, ликопинал, ликопинол, родопин, родопинал, спириллоксантин

Хлоробактиновая серия Хлоробактин, изорениератин, р-каротин, у-каротин

АФБ не способны использовать воду в качестве донора электронов (этим они отличаются от цианобактерий, водорослей и высших растений) и нуждаются в более восстановленных соединениях, которыми обычно являются сероводород, и другие восстановленные соединения серы, водород, а также ограниченное число простых органических соединений. Фотосинтетическая ССЬ-ассимиляция происходит при участии только одной фотосистемы требует присутствия внешних доноров электронов.

2.2. Систематика аноксигенных фототрофных бактерий

Со времени открытия фотосинтезирующих бактерий прошло почти лет. Сначала (1838) появились описания микроорганизмов известных сейчас как пурпурные серобактерии (Ehrenberg). Позднее (1852) были обнаружены зеленые серобактерии (Perty), и наконец (1887), несерныс пурпурные бактерии (Esmarch).

В настоящее время среди аноксигенных фототрофных бактерий различают группы: пурпурные серобактерии, пурпурные несерные бактерии, зеленые серобактерии, зеленые несерные (нитчатые) бактерии.

Согласно последнему изданию Берджи (Garrity et al. 2001, 2005) на основании сравнительного анализа последовательностей гена 16S рРНК, АФБ относятся к домену Bacteria и классифицируются следующим образом

Все пурпурные бактерии относятся к типу "Proteobacteria". Пурпурные серобактерии входят в класс Gammaproteobacteria, где они образуют порядок Chromatiales с двумя семействами Chromatiaceae и Ectothiorodospiraceae (Imhoff, 2005).

Семейство Chromatiaceae включает рода, из которых рода представлены пурпурными серобактериями: Chromatium, Allochromatium, Halochromatium, Isochromatium, Lamprobacter, Lamprocystis, Marichromatium, Pfennigia, Rliabdochromatium, Thermochromatium, Thioalkalicoccus, Tltiocapsa, Thiococcus, Thiocystis, Thiodyction, Thioflavicoccus, Thiohalocapsa, Thiolamprovum, Thiopedia, Thiorhodococcus, Th iorh odovibrio, Thiospirillunu

Семейство Ectothiorodospiraceae включает родов, из которых рода принадлежат пурпурным серобактериям: Ectothiorodospira, Halorliodospira, Thiorhodospira.

Пурпурные несерные бактерии на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК оказались близки к различным видам нефототрофных бактерий и, согласно последним данным, не образуют монофилетической группы. Разные виды несерных пурпурных бактерий распределены между двумя классами Alphaproteobacteria (порядки

Шюс1о8рп-П1а1е8, Шш(1оЬас1ега1е$, ШшоЫа^в) и Ве1арго1еоЬас1епа (порядки КЬо^сусЫев, ВигкЬоИепа1е8).

Класс А1рЬарго1еоЬас1епа содержит большинство известных на сегодняшний день родов пурпурных несерных бактерий (<ЗаггИу е/ а1., 2005). Порядок Шм^овртНакБ содержит два семейства КИобоэртНасеас и Асе1:оЬас1епасеае, в составе которых, наряду с прочими бактериями, несерные пурпурные бактерии образуют несколько родов. Семейство Шюс1о8рш11асеае включает родов несерных пурпурных бактерий: Югойояри'Шит, Рк аеояртИ шп, ШюйосШа, Шюйоврка, Юю(1оуШгю, Ююхеояргга, Шг овеозртЫ шп. Семейство Асе^Ьас1егтсеае, помимо родов прочих бактерий, содержит только род, образованный несерными пурпурными бактериями - ШгойорИа (Таб. 4).

Таблица 4. Пурпурные несерные бактерии, входящие в класс А1рЬарго1еоЬае1епа. порядок семейство род

МюсЬзршНакБ ШюёозртПасеае Шюйо$рич11ит РЪаеозричИит КНос1ос1зШ Ккойояргга ШюйочЛгю Шозео5р1га ЯкозеозртПит

АсеШа^епасеае КкойорИа

ШюсЬЬайеЫеБ ШюёоЬа^егасеае ШойоЪасгег КкойоЪаса Шо^уиктг Л.Иос1о11гакш1ит

КЫгоЫакэ ВгаёугЫгоЫасеае Ююс1оЫан1ш Якойорвеийотопаи

НурЬотюгоЫасе Я/юс1от1сгоЫит Юю(1ор1апе$

Млос1оЫасеае ЯкойоЫит

Порядок Шюс1оЬас1ега1е$ состоит из семейства "Шю(1оЬас(егасеае", в которое, помимо родов прочих бактерий, входит рода несерных пурпурных бактерий: ШюйоЪасХег, ШюйоЬаса, ШюйогШит, ШинШкаЫзх'шт.

Порядок ШтоЫакэ включает семейства Вгас1угЫ2оЫасеае, НурЬопнсгоЫасеае, Шни1оЫасеае в составе которых, наряду с прочими бактериями, несерные пурпурные бактерии образуют несколько родов. В семействе Вгас1угЫгоЫасеае пурпурными несерными бактериями представлено рода: К1ю(1оЫазШз, 11110(1ор$еш1отопа$. В семействе

НурЬогшсгоЫасеае - рода: ВШ1осМоп8, ШюйотгсгоЫит, Ююйор1апе$. В семействе Шю(1оЬ1асеае - род ЮюЛоЫит.

Класс ВеГарго1еоЬас1епа на сегодняшний день включает только рода несерных пурпурных бактерий {Сагг Ну е( а1, 2005). Два из них, род Шю(1о/егах и род ЯиЬпутос, входят в порядок ВигкИоШепакв в составе семейства Сотатопа(1асеае. Род Шюс1осус1и8 входит в порядок Шюс1осус1а1е8 в составе семейства Ш!ос1осус1асеае (Таб. 5).

Таблица 5. Пурпурные несерные бактерии, входящие в класс Betaproteobacteria. порядок семейство род

Burkholderiales Comamonadaceae Rhodoferax Rubrivivax

Rhodocyclales Rhodocyclacea Rhodocyclus

Зеленые серобактерии, согласно последним данным, полученным на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, представляют собой монофилетическую группу и выделены в отдельный тип Chlorobi, содержащий единственный класс Chlorobia, состоящий из единственного порядка Chlorobiales, с единственным семейством Chlorobiaceae (Garrily, Holt, 2001). Семейство Chlorobiaceae включает родов: Chlorobium, Ancalochloris, Chloroherpeton, Pelodictyon, Prosihecochloris.

Согласно современной классификации зеленые несерные бактерии (нитчатые скользящие зеленые бактерии) входят в состав типа Chloroflexi, класса Chloroflexi, где они представлены порядком Chloroflexales, содержащим семейство Chloroflexaceae, которое в свою очередь включает'4 рода: Chloroflexus, Chlor опета, Heliothrix, Oscillochoris (Gar ri (у, Holt, 2001).

Для данной диссертационной работы наибольший интерес представляют пурпурные серобактерии семейства Chromatiaceae, пурпурные несерные бактерии, а также зеленые серобактерии, и поэтому далее речь пойдет, преимущественно, о них.

2.3. Морфология, цитология, физиология, темновой метаболизм аноксигенных фототрофных бактерий

Жизнедеятельность фототрофов определяют в основном физические факторы, прежде всего поступление света, поэтому их разнообразие основывается на физическом приспособлении к условиям среды обитания. Малые размеры, обеспечивающие высокую интенсивность обмена с окружающей средой у хемотрофных бактерий, для фототрофов не представляют первостепенной необходимости. Нерегулярное поступление света, зависящее от сезона, времени суток, погоды, обуславливает необходимость накопления ассимилятов в запасных веществах как полиглюкоза или жиры. Отсюда возникает возможность формирования более крупных клеток, чем клетки хемотрофных прокариот (Заварзин, Колотнлова, 2001).

2.3.1. Морфология, цитология пурпурных бактерий

Все пурпурные бактерии являются одноклеточными микроорганизмами. Некоторые виды из числа СИготайасеае (ТЫоресИси ТЫосарза, СИготаИит и др.) образуют микроколонии разной формы (полусферические, сетчатые, тетрады, сарциноподобные).

Морфология пурпурных бактерий различна. Среди них выделяют сферические, овальные (ТЫоресНа, ТМосарза, ТМосузШ), прямые палочковидные формы {Шю(1оЪас1ег), вибрионы (ТЫогкойоуЛгю), клетки в форме полуколец (ТЫойусйоп, К!юс1осуск^), спирально извитые (ТЫозртИит, ЕсШЫог]юйо8р1га). Размеры клеток пурпурных бактерий обычно составляют 2-3 мкм, однако в зависимости от вида бактерий они могут варьировать от 0.4 до мкм Крупными считаются клетки размером 4.5-6 х 6-16 мкм (СИготаПит окепп, ТЫоартШт]епетс) и более.

Встречаются как подвижные формы пурпурных бактерий (СИготаПит, ТЫозртИит), имеющие один или несколько жгутиков, так и неподвижные (ТЫосаряа). У подвижных видов пурпурных бактерий проявляется фотофобная реакция, однако при уменьшении интенсивности освещения клетки резко изменяют направление своего движения и остаются в более освещенном участке. У ряда подвижных видов проявляется способность к фото- и хемотаксису под действием света, кислорода, химических веществ {Кондратьева, 1996). Некоторые ПСБ не имеющие жгутиков (представители родов ТЫосаряа, ТЫойШуоп, ЬатргосузЛз, ЬатргоЬас(ег), могут образовывать газовые вакуоли. У ПСБ они гораздо шире (100-120 нм) и короче (до нм), чем у зеленых фотосинтетиков (длина различна, ширина от до нм).

Благодаря активному и пассивному движению бактерии расселяются и находят оптимальные условия для своего развития. Thiospirillum и Chromatium в водоемах движутся вверх, пока условия среды остаются благоприятными, независимо от света и темноты (Pfennig, 1967). Достигая границы кислородной зоны, они изменяют направление движения и опускаются вниз (отрицательный аэротаксис).

Как и большинство других грамотрицательных бактерий, пурпурные бактерии имеют ригидную клеточную стенку, в которой различают внутренний пептидогликановый слой и внешнюю мембрану. У отдельных видов, например, из числа Chromatium, обнаружен поверхностный белковый слой в виде гексагональной сетчатой структуры.

В естественных условиях большинство микроорганизмов выделяют значительное количество слизистого магериала (гли кокал икс), который выполняет множественную функцию: прикрепительную, защитную, создает? микроусловия вокруг клеток и микроколоний, является посредником между организмом и средой, а также между группами клеток.

Большинство пурпурных бактерий размножается бинарным делением клеток. Лишь у представителей родов Rhodopseudomonas Blastochloris и Rhodomicrobium имеет место почкование.

Запасными веществами пурпурных бактерий служат полифосфаты, поли-р-гидроксимасляная кислота, полисахариды (глюканы типа гликогена). У бактерий семейства Chromatiaceae характерно накапливание в клетках серы в виде гранул диаметром до мкм У одних видов скопления серы могут располагаться по всей клетке, у других - на полюсах. Скопления серы, как и скопления поли-р-гидроксимасляной кислоты окружены белковой оболочкой шириной 2-25 нм

У ряда бактерий способных к автотрофии констатировано наличие в клетках карбоксисом, полиэдрических образований, окруженных белковой оболочкой. Они содержат рибулозобифосфаткарбоксилазу, ключевой фермент, участвующий в ассимиляции диоксида углерода через цикл Кальвина.

У большинства пурпурных бактерий имеется способность к образованию внутриклеточных мембран, в которых локализуются пигменты и осуществляются локальные стадии фотосинтеза. Форма внутриклеточных мембран у разных видов пурпурных бактерий может различаться, но во всех случаях фотосинтезирующие структуры происходят от цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и являются ее продолжением

Различают несколько типов фотосинтетического аппарата (ФСА): 1. ФСА везикулярного типа характерен для родов Thiocapsa, Thiocystis, Chromatium.

Представляет собой плотно прилегающие друг к другу, ограниченные мембраной пузырьки и трубочки размером 40-80 им.

2. ФСА трубчатого типа представляет систему происходящих от ЦПМ разветвленных трубочек диаметром 43-47 нм. Такой тип ФСА обнаружен лишь у Thiocapsa pfennigii.

3. Расположенные по периферии клеток ламеллярные мембранные структуры из дисков, собранных в стопки. Эти стопки расположены под углом к ЦПМ (у ПНБ рода Rhodospirillum).

4. Сложенный ламеллярный тип строения фотосинтетических мембран обнаружен у всех видов рода Ectothoirhodospira. ФСА данного типа представляет собой стопки тилакоидов, количество которых в стопке составляет от до 20. Каждый тилакоид, в свою очередь, ограничен парной мембраной, которая образуется в результате контакта соседних тилакоидов.

Пигментный состав является одним из важных систематических признаков пурпурных бактерий. Большинство пурпурных бактерий имеют Бхл а, основной максимум поглощения которого в растворе лежит в области нм, что соответствует 800-850 нм in vivo. Некоторые пурпурные бактерии образуют Бхл b (Blastochloris, Ectothiorhodospira) с максимумом поглощения in vivo 1020-1100 нм. Содержание у пурпурных бактерий бактериохлорофиллов зависит от возраста культур, состава среды, интенсивности освещения.

Каротиноиды пурпурных бактерий обуславливают поглощение света в области 400-500 нм, причем имеют несколько максимумов поглощения. От состава каротиноидов, а также их содержания зависит в основном цвет культур пурпурных бактерий. Он бывает розовым, красным, пурпурным, оранжевым, желтым. Для пурпурных бактерий характерны каротиноиды океноновой, спириллоксантиновой и родопинальной групп.

2.3.2. Отношение пурпурных бактерий к параметрам внешней среды

Даже те виды пурпурных бактерий, которые растут только в анаэробных условиях, довольно долго сохраняют жизнеспособность в присутствии молекулярного кислорода, т. е. проявляют к нему большую толерантность, чем ряд других строгих анаэробов, например, сульфатредукторов.

Оптимальная температура для роста многих пурпурных бактерий 25-30 С, иногда С, отдельные виды устойчивы к высокой температуре {Halorhodospira halophila, Halorhodospira halochloris, Termo ehr omatium tepidum).

По отношению к условиям освещения пурпурные бактерии можно разделить на две группы. Первая группа включает виды, которые предпочитают слабое освещение 150-300 лк

Chromatium okenii, Chromatium weissei). Более многочисленна вторая группа, в которую входят виды, хорошо растущие при освещении 300-2000 лк (Ectothiorhodospira mobilis, Thiocapsa roseopersicina) (Caumette, 1989).

Большинство видов пурпурных бактерий относятся к морским формам и не могут развиваться в отсутствии NaCl. Среди них Thiocapsa roseopersicina, Thiocystis violacea, Allochromatium vinosum и другие ПСБ, требующие для своего развития 1-3 % NaCl. К экстремальным галофилам относятся Ectothiorhodospira halophila выделенная из испарительного бассейна солевых промыслов и Ectothiorhodospira marismortui, выделенная из гиперсоленого серного источника (Горленко и др., 1977).

Рост разных представителей пурпурных серобактерий возможен при значениях рН среды от 4.8 до 11, оптимальным для многих из них является рН 7-7.5. Ряд видов (Chromatium okenii, Chromatium weissei) хорошо растут при рН 6.5-6.8. С другой стороны, известны пурпурные бактерии, которые хорошо растут и при рН 8-9 (многие виды рода Ectothiorhodospira).

Многие ПНБ нуждаются в одном или нескольких витаминах группы В. Среди ПСБ больше видов, которые не нуждаются в каких-либо факторах роста, но для части из них необходим витамин Bi2 (Lamprocystis purpurea, Chromatium okenii, Thiospirilium jenense и некоторые другие виды).

Большинство ПСБ и значительное число ПНБ могут расти в автотрофных условиях. Часть ПСБ (Chromatium okenii, Chromatium weissei, Isochromatium buderi, Thiospirillum jenense, Thiocapsa roseopersicina и др.) относятся к категории облигатных автотрофов, их рост зависит от наличия углекислоты и неорганических доноров электронов в виде восстановленных соединений серы или молекулярного водорода. Эти микроорганизмы если и используют ацетат, пируват (реже пропионат и некоторые другие органические соединения), то в значительно меньшем количестве, чем СОг, и обычно как дополнительные источники углерода.

В качестве источника серы для синтеза ряда соединений ПСБ (особенно облигатно автотрофные) обычно используют сульфид, тиосульфат, цистеин, а некоторые также молекулярную серу, метионин и глутатион. Однако большинство ПНБ, а также некоторые ПСБ (Allochromatium vinosum, Ectothiorhodospira mobilis) могут для этого использовать сульфаты.

Восстановленные соединения серы, прежде всего сульфид, используются большинством ПСБ в качестве доноров электронов при фотосинтезе и в других процессах. ПСБ обычно растут при концентрации сульфида до 0.1-0.2 % (4-8 мМ). Большинство ПНБ выдерживают концентрацию 0.1-0.3 % сульфида, хотя есть, также, виды проявляющие большую чувствительность к сероводороду, и виды, растущие при более высокой его концентрации (Компанцева, 1985).

Есть пурпурные бактерии, использующие в качестве окисляемых субстратов молекулярную серу, сульфит, тиогликолят, диметилсульфид, полисульфид, но чаще всего они используют тиосульфат. Многие пурпурные серные и несерные бактерии окисляют молекулярный водород.

Пурпурные бактерии проявляют способность использовать различные соединения азота (N2, NO3", NO2", N0, триметиламин, мочевину, гидролизат казеина, отдельные аминокислоты и др.), но обычно они лучше растут при наличии аммония. Ассимиляция N2 обычно сопровождается появлением в среде молекулярного водорода (Кондратьева, 1996).

2.3.3. Тсмновой метаболизм пурпурных бактерий

В темноте в анаэробных или аэробных условиях пурпурные бактерии потребляют эндогенные запасные продукты, а также ряд органических веществ, находящихся в среде, что сопровождается восстановлением молекулярной серы до сероводорода. Рост культур при этом не отмечен.

Значительное число ПНБ, а также некоторые ПСБ (Thiocapsa roseopersicina, Ectothiorhodospira shaposhnikovii, Allochromatium minutissimum) могут очень медленно расти в анаэробных условиях в темноте за счет брожения или анаэробного дыхания, с образованием небольшой биомассы.

Значительно больше ПНБ, а также некоторые ПСБ (Thiocapsa roseopersicina, Lamprobacter modestohalophiliis, Allochromatium minutissimum) могут расти в темноте за счет аэробного дыхания, используя органические вещества и в качестве окисляемых субстратов, и как основные источники углерода. При этом скорость роста бактерий в отдельных случаях приближается к таковой в фототрофных условиях (Кондратьева, 1996).

Thiocapsa roseopersicina, Lamprocystis purpurea, Thiocystis violaceae и некоторые виды Chromathun в темноте при наличии кислорода окисляют сульфид, тиосульфат, а некоторые и молекулярный водород, при этом они не требуют обязательного присутствия органических соединений как источников углерода, поскольку сохраняют способность фиксировать углекислоту через цикл Кальвина. У ПСБ Thiocystis violaceae и Marichromatium gracile, рост в темноте в хемолитоавтотрофных условиях оказался возможным лишь на протяжении нескольких генераций. У Thiocapsa roseopersicina штамм BBS5 образование и функционирование рибулозобифосфаткарбоксилазы мало зависит от содержания О2, поэтому данный микроорганизм может окислять тиосульфат и фиксировать СОг даже в условиях сильной аэрации, как на свету, так и в темноте. Дыхание пурпурных бактерий ингибируется светом (Кондратьева, 1996).

2.3.4. Морфология, цитология зеленых серобактерий

Клетки зеленых серобактерий встречаются как одиночно (СЫогоЫит ркаеоугЪгкпйех), так и объединенные в нити (СЫогоЫит Штсо1а, СЫогоЫит рИаеоЬас(его1с1е^), разветвленные нити, сетчатые микроколонии (Ре1осИс1уоп с1а1кгаИ/огте).

Это грамотрицательные клетки различной формы (сферические, овальные, прямые или изогнутые палочки). Среди них есть ряд видов, образующие клеточные выросты - простеки (РгояМесосЫопз рЬаеоаз\его1йеа). Зеленые серобактерии имеют меньшие размеры, чем пурпурные бактерии: 0.7-1 х 0.8-1.6 мкм

Все зеленые серобактерии неподвижны, за исключением СЫогоИегреШп 1}ш1а$яшт, клетки этого микроорганизма способны к скользящему движению. У ряда зеленых серобактерий в цитоплазме клеток располагаются газовые везикулы (Ре1осИс1уоп, ОясШосЫош и др.), которые, объединяясь, образуют обширные структуры - газовые вакуоли.

Зеленые бактерии имеют типичное для грамотрицательных клеток строение клеточной стенки. У некоторых видов имеется еще один поверхностный белковый Б-слой.

Многие виды зеленых бактерий образуют слизистую капсулу. У некоторых видов клетки часто образуют цепочки, окруженные слизистым чехлом

Размножаются зеленые бактерии бинарным делением, которое иногда напоминает почкование. При этом клетки иногда остаются соединенными в цепочки разной формы и длины.

Большая часть цитоплазмы зеленых бактерий заполнена полирибосомами. Запасными питательными веществами у зеленых бактерий служат полифосфаты, полисахариды (Sirevag, Огтегой, 1977). В отличие от большинства ПСБ, откладывающих серу внутриклеточно, зеленые бактерии, окисляя сульфид или тиосульфат, выделяют элементную серу во внешнюю среду.

Фотосинтетические пигменты у зеленых серобактерий локализованы в хлоросомах, эллипсовидных образованиях 15-40 нм шириной и 90-150 нм длиной, которые окружены одинарной липидной мембраной, в состав которой также входят белки. Хлоросомы непосредственно прилегают к внутренней поверхности ЦПМ и соединены с ней базальной пластинкой.

Основными фотосинтетическими пигментами зеленых серобактерий являются Бхл с максимум поглощения в области 745-755 нм), Бхл d (725-745 нм), Бхл е (710-725 нм). Также, для зеленых бактерий характерно наличие небольшого количества Бхл а (805-812 нм), который входит в состав реакционных центров. Содержание пигментов в клетках зеленых бактерий ниже, чем в клетках пурпурных бактерий.

Кроме бактериохлорофиллов, клетки зеленых бактерий содержат моноциклические каротиноиды хлоробактиновой или изорениератиновой серии, несущие на конце, по крайней мере, одну арильную группировку и улавливающие свет в сине-зеленой области спектра 400-500 нм Для видов с зеленой окраской характерно наличие хлоробактина. В клетках корочневоокрашенных форм присутствует изорениератин (пик поглощения 480-550 нм) (Gloe et al., 1975). Кроме этих пигментов в клетках зеленых бактерий в незначительных количествах обнаружены ликопин, родопин и ^-каротин {Schmidt, 1978).

2.3.5. Отношение зеленых бактерий к параметрам внешней среды

Зеленые серобактерии являются строгими анаэробами и даже небольшая концентрация кислорода для них губительна {Drews, lmhoff, 1991).

Оптимальная температура развития для зеленых серобактерий, обитающих в мелководных водоемах составляет около °С. Зеленые бактерии, развивающиеся в толще воды, предпочитают более низкие температуры 10-25 °С.

Зеленые бактерии являются облигатными фототрофами, рост всех известных видов наблюдается только при наличии света. Чаще всего оптимумом освещенности для зеленых серобактерий является 500-2000 лк. Некоторые виды могут расти и при очень слабом освещении. Так, представители рода Pelodictyon хорошо растут при освещении около 20-100 лк, при более лк их рост ингибируется {Кондратьева, Самуилов, 1989).

Установлено, что все зеленые бактерии морского происхождения, они требуют для своего развития 1-2 % NaCl {Горленко и др. 1977), но способны развиваться в среде при концентрации NaCl от до % {Тгнрег, 1980) Экстремальных галофилов, т.е. видов, способных расти при более чем % NaCl, среди зеленых серобактерий не обнаружено.

Оптимальные значения pH среды для зеленых серобактерий колеблятся находятся в диапазоне 6.6-7 {Горленко и др., 1977).

Большинство родов нуждается в одном или даже большем количестве ростовых факторов, наиболее важными из которых являются биотин, тиамин, п-аминобензойная кислота.

Зеленые серобактерии, как и некоторые виды ПСБ относятся к категории облигатных автотрофов. В отличие от значительного числа пурпурных бактерий, зеленые серобактерии не используют органические соединения в качестве доноров электронов. Хотя отдельные органические вещества несколько увеличивают выход биомассы этих микроорганизмов, их использование возможно лишь при наличии углекислоты и неорганического донора электронов.

Зеленые бактерии не способны к ассимиляционной сульфатредукции, их рост зависит от наличия в среде сульфида, тиосульфата, цистеина или метионина. Кроме того, сульфид обычно используется в качестве донора электронов. Виды из родов СЫогоЫит и Prosthecochloris, проявляют к сульфиду достаточно высокую устойчивость, и могут расти при его концентрации 0.1-0.2 % (4-8 мМ). Однако есть виды, выдерживающие концентрацию сульфида не более 0.03- 0.05 % (.Pelodictyon clathratiforme).

При недостатке сероводорода зеленые серобактерий окисляют молекулярную серу. Известны виды, использующие в качестве доноров электронов тиосульфат (СЫогоЫит limicola forma thiosulfatophilum, СЫогоЫит vibrioforme forma thiosulfatophilum) и молекулярный водород.

В качестве источника азота эти бактерии используют аммоний или N2. В отличие , от пурпурных бактерий, ассимиляция N2 не сопровождается появлением в среде молекулярного водорода, по-видимому, вследствие его быстрого окисления гидрогеназами. Ряд штаммов СЫогоЫит может также использовать глутамин, глутамат и некоторые другие аминокислоты, мочевину, нитраты {Кондратьева, 1996).

2.3.6. Темновой метаболизм зеленых серобактерий

Известно, что в темноте в анаэробных условиях зеленые серобактерии сбраживают запасы полисахаридов, выделяя диоксид углерода, водород и органические кислоты. Образуемая в результате эндогенных процессов энергия расходуется клеткой для поддержания жизнедеятельности, рост культур при этом не обнаруживается {Кондратьева, 1996).

2.4. Особенности бактериального фотосинтеза 2.4.1. Особенности строения фотосинтетического аппарата аноксигенных фототрофных бактерий и процесс фотосинтеза

Под фотосинтезом понимают происходящее в клетках фототрофных организмов преобразование световой энергии в биохимически доступную энергию (АТФ) и восстановительную силу [ЫАО(Р)Нг], а также связанный с этим синтез клеточных компонентов.

Подавляющее число молекул Бхл (более 99.5 %), а также дополнительные пигменты (каротиноиды) ответственны за поглощение света и распределение энергии. Лишь незначительная часть Бхл а выполняет роль фотохимического реакционного центра, в котором протекает фотохимическая окислительно-восстановительная реакция. Система светособирающих пигментов и реакционный центр образуют так называемую фотосинтетическую единицу.

Зеленые бактерии обладают реакционным центром (РЦ) I типа (железо-серного типа), содержащим в качестве первичного донора электронов специальную пару молекул Бхл а с максимумом поглощения Р840 или Р865 (у зеленых бактерий). У пурпурных бактерий РЦ 11-го (хинонового) типа, он содержит молекулы Бхл а (возможны варианты: Р840, Р865, Р870 (.Rhodobacter capsulatus), Р890) или Бхл b Р960 (Blastohloris viridis).

Светособирающие комплексы пурпурных бактерий локализованы во-внутриклеточных мембранах, поглощение света происходит с помощью системы внутренней и периферической антенн. Внутренняя светособирающая антенна (CCA I), окружает реакционный центр и состоит из 25-30 молекул Бхл а или Бхл Ь. В состав переферической вариабельной антенны (CCA I) входят белки, а также нековалентно связанные с ними молекулы Бхл а (более молекул) и каротиноидов, переплетенных с фитольными цепями Бхл а.

Светособирающими структурами зеленых бактерий являются хлоросомы, внутри которых находятся агрегаты молекул Бхл с, d или е, липиды и каротиноиды. На один РЦ приходится около 1000-1500 молекул Бхл с, d или е. Хлоросомы связаны с плазматической мембраной через базальную пластинку, содержащую Бхл а, который осуществляет перенос энергии возбужденного состояния от хлоросом на РЦ, расположенный в ЦПМ.

Процесс фотосинтеза у АФБ осуществляется следующим образом Световая энергия, поглощаемая светособирающими пигментами, передается от коротковолновых форм пигментов к длинноволновым, и далее в реакционный центр, где переводит в возбужденное состояние Бхл а. Это приводит к * окислению Бхл а и отдаче им одного электрона.

Высвободившийся электрон обладает высоким восстановительным потенциалом, он начинает мигрировать по циклической цепи переносчиков, последовательно вызывая окислительно-восстановительные реакции. Фотосинтетический перенос электронов приводит к созданию протонного мембранного градиента, который служит движущей силой фото синтетического фосфорилирования (регенерации АТФ).

У зеленых серобактерий величина отрицательного окислительно-восстановительного потенциала конечного акцептора (Ре-Б-кластера) реакционного центра достаточна для восстановления ферредоксина, который прямо или опосредованно используется для фиксации СО2 и НСОз" •

У пурпурных бактерий фиксация СО2 не сопряжена напрямую с фотосинтетическим транспортом электронов. Используемый для фиксации ССЬ КАБЫ образуется в результате обратного переноса электронов, протекающего с затратой АТФ (Современная микробиология, 2005).

2.4.2. Доноры электронов

Для пополнения цикла электронами АФБ нуждаются во внешних донорах электронов: сероводороде и др. восстановленных соединениях серы, водороде, простых органических-соединениях, и, как уже было сказано выше, не способны использовать воду в качестве донора электронов.

В результате окисления сульфида у зеленых бактерий в качестве промежуточного, продукта образуется сера, которая откладывается вне клеток и далее может окисляться до сульфатов (Тгирег, 1975). свет, сульфидоксидаза 2НС03" + 5Н28-► 2(СН20) + 4Н20 + 58°.

У пурпурных бактерий при низких концентрациях сероводорода в среде образование серы не происходит, и она сразу окисляется до сульфатов. свет, сульфидоксидаза 2С02 + Н28 + 2Н20 -► 2(СН20) + Н2804

Некоторые пурпурные и зеленые серобактерии утилизируют тиосульфат. свет

2С02 + На28203 + ЗН20-► 2(СН20) + Ма2804 + Н2804.

Известно пути метаболизма тиосульфата: 1. Расщепление до сульфида и сульфита: тиосульфатредуктаза

8203" + 2ё * Б2" + БОз2"

Этот процесс имеет основное значение, тиосульфатредуктаза обнаружена у значительного числа пурпурных серных и некоторых несерных бактерий.

2. Расщепление до сульфита и серы, происходит у всех исследованных пурпурных бактерий: родоназа (тиосульфат-сера-трансфераза) S2032" + CN" -► CNS" + S032"

3. У Rhodopseudomonas palustris и Allochromatium vinosum происходит окисление тиосульфата при участии тиосульфат-оксидоредуктазы, а акцепторами электронов могут быть FeS-белки или цитохром типа с: цитохром ооксидоредуктаза

2S2032" -► 2S4062" + 2e

Многие зеленые и пурпурные бактерии могут расти ассимилируя диоксид углерода и поглощая молекулярный водород. гидрогеназа

С02 + 2Н2-► (СН20) + Н20, (.Кондратьева, 1996).

2.5. Фиксация углекислоты и потребление органических веществ аноксигенными фототрофными бактериями

По способности использовать различные соединения углерода АФБ можно выстроить в ряд. Наиболее разнообразен метаболизм соединений углерода у ПНБ, в меньшей степени у ПСБ с мелкими клетками (Allochromatium vinosum, Thiocapsa roseopersicina), еще в меньшей у ПСБ с крупными клетками (Chromatium okenii, Thiospirillum jenense), на последнем месте в этом ряду находятся зеленые серобактерии (Тгирег, 1980). Последние две группы являются облигатно фотолитоавтотрофными, однако обладающими определенным миксотрофным потенциалом, то есть эти микроорганизмы нуждаются в СОг и сульфиде (или тиосульфате), даже если они используют ацетат или пируват (Autotrophic bacteria, 1989).

2.5.1. Фиксация углекислоты и потребление органических веществ пурпурными бактериями

Основным путем ассимиляции углекислоты пурпурными бактериями в. автотрофных условиях является рибулозобифосфатный цикл (восстановительный пентозофосфатный цикл, цикл Кальвина) с ключевыми ферментами рибулозобифосфткарбоксилазой (РБФК) и фосфорибулокиназой. Доказательства присутствия этого цикла получены для Allochromatium vinosum, Chromatium okenii, Thiocapsa roseopersicina, Thiococcus pfennigii, Ectothiorhodospira, shaposhnikovii, Halorhodospira halophila, Ectothiorhodospira mobilis, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palustris (Autotrophic bacteria, 1989). Bee перечисленные виды являются облигатными автотрофами, и у них фиксация углерода церез цикл Кальвина мало зависит от наличия органических веществ. У факультативно автотрофных видов фиксация СОг через цикл Кальвина часто резко снижается в присутствии органических веществ, которые они используют (Кондратьева, 1996) (Рис. 1).

Наряду с РБФК пурпурные бактерии образуют другие карбоксилирующие ферменты (Таб. 6). Состав их у разных видов не всегда одинаков и может зависеть в какой-то степени от условий их роста. Некоторые карбоксилазы проявляют активность и в том случае, когда пурпурные бактерии растут в автотрофных условиях и активно фиксируют СО2 через цикл Кальвина. Чаще всего в таких условиях, наряду с РБФК, в ассимиляции СОг участвует фосфоенолпируват-карбоксилаза (ФЕП-карбоксилаза), поскольку часть образуемого 3-фосфоглицерата превращается в фосфоенолпируват, который может служить акцептором С02.

Рисунок 1. Рибулозобифосфатный цикл ассимиляции СО2.

Ассимиляция пурпурными бактериями некоторых органических соединений облигатно связана с участием в этом процессе углекислоты и ферредоксинзависимых карбоксилирующих ферментов. Разные виды пурпурных бактерий способны использовать как одноуглеродные органические соединения (формиат, метанол), так и многоуглеродные соединения.

Обычно те пурпурные бактерии, которые могут использовать органические вещества при фотосинтезе в качестве доноров электронов, одновременно ассимилируют их или продукты их неполного окисления как непосредственные источники углерода. В биосинтетические процессы может включаться углекислота, образуемая при окислении органических соединений.

У большинства пурпурных несерных бактерий, которые используют органические субстраты и в качестве доноров электронов, и как источники углерода, эта способность связана с функционированием цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Пурпурные серобактерии, как правило, имеют те ли иные дефекты в ЦТК. Чаще всего у них отсутствует

Таблица 6. Карбоксилирующие ферменты фототрофных микроорганизмов (.Кондратьева, 1996). фермент реакция ПБ ЗБ циано-бактерии водоросли

Рибулозо-бифосфат-карбоксилаза 0-рибулозо-1,5-бифосфат + СОг = 2,3-фосфо-0-глицерат + - + +

Фосфоенол- пируват- карбоксилаза Фосфоенолпируват +СОг + Н2О = оксалоацетат + Ф„ + + + +

Фосфоенолпи- руваткарбокси- киназа Фосфоенолпируват +СО2 + ГДФ = оксалоацетат + ГТФ + + + +

Фосфоенолпи- руваткарбокси- киназа (пирофосфат) Фосфоенолпируват +ССЬ + Фн = оксалоацетат + ФФН + - -

Пируват-карбоксилаза Пируват + С02 + АТФ + Н2О - оксалоацетат + АДФ + Фн + - + +

Пропионил-КоА-карбоксилаза Пропионил-КоА + СОг + АТФ + Н20 = метилмалонил-КоА + АДФ + Фн + + - +

Малатдегидро-геназа (декарбоксилиру ющая)* Пируват + С02 + НАД(Ф)Н = Ь-малат + НАД(Ф) * + - + +

Изоцитрат-дегидрогеназа* а-кетоглутарат + СО2 + НАД(Ф)Н = Ь-малат + НАД(Ф) * + + + +

Пируват-синтаза Ацетил-КоА + С02 + ФдВОсст = ПИруваТ + ФДоиисл + + - а-кетобутират-синтаза Пропионил-КоА+ СО2 + ФДвосст = а-кетобутират + ФДокисл + - - а-кетоглута-ратсинтаза Сукцинил-КоА+ СОг + ФДвосст = а-кетоглутарат + ФДокисл + + -

Фенилпируват-синтаза Фенилацетил-КоА + СОг + ФДвосст = фенилпируват + ФДокисл ± - - - фермент обнаружен у ряда видов группы + - фермент имеется лишь у одного или нескольких видов группы * - эти ферменты чаще участвуют в реакциях декарбоксилирования, а не карбоксилирования. а-кетоглутаратдегидрогеназа. Allochromatium vinosum и Allochromatium minutissimum не образуют малатдегидрогеназу.

Однако у них есть декарбоксилирующая малатдегидрогеназа, а также пируваткарбоксилаза, что позволяет им синтезировать оксалоацетат из малата в результате следующих реакций:

НАДФ +С02 +АТФ

Малат --► пируват -► оксалоацетат + АДФ + Фн

-С02

Кроме того, у них есть ферменты глиоксилатного шунта, поэтому эти бактерии могут использовать ацетат, а также ряд других органических соединений в качестве источников углерода и доноров электронов.

Ряд представителей родов Chromatium, Thiocapsa, а также некоторые другие виды Chromatiaceae, относятся к категории облигатных литоавтотрофов, у которых ни ЦТК, ни глиоксилатный шунт не функционирует. У таких бактерий большое значение имеет путь ассимиляции ацетата с образованием разных органических кислот: КоА +С02 + Фн

Ацетат * ацетил-КоА пируват

С02

-► фосфоенолпируват -► оксалоацетат ► малат.

Фумарат * сукцинат ^ сукценил-КоА а-кетоглутарат.

Однако и в случае ассимиляции С02 в цикле Кальвина, и в случае ассимиляции ацетата, рост культур этих микроорганизмов зависит от наличия углекислоты, а также сульфида или другого неорганического донора электронов, поскольку органические субстраты такую функцию выполнять не могут (Кондратьева, 1996).

2.5.2. Фиксация углекислоты и потребление органических веществ зелеными серобактериями

Основным механизмом фиксации углекислоты у зеленых серобактерий, по-видимому, является восстановительный цикл трикарбоновых кислот (ВЦТК, цикл Арнона) с ключевыми ферментами ферредоксин-зависимой а-кутоглутаратсинтазой, пируватсинтазой и АТФ-зависимой цитратлиазой, изученный у штаммов Chlorobium limicola forma thiosulfatophilum. Результатом ВЦТК является фиксация двух молекул С02 (с участием ферредоксинзависимой а-кетоглутаратдегидрогеназы и изоцитратдегидрогеназы) и образование ацетил-КоА из лимонной кислоты.

Далее ацетил-КоА может карбоксилироваться при участии ферредоксин-зависимой пируватсинтазы с образованием пирувата. Из ппрувата с затратой АТФ и при участии ФЕП-синтетазы образуется фосфоенолпируват, при карбоксилировании которого образуется оксалоацетат, одно из соединений ВЦТК. Таким образом, ВЦТК может дополняться фиксацией еще двух молекул С02 (Рис. 2).

Рисунок 2. Восстановительный цикл трикарбоновых кислот у Chlorobium limicola forma thiosulfatophilum (Кондратьева, 1996).

К числу органических соединений, которые зеленые серобактерии могут ассимилировать, относятся ацетат, пируват, пропионат, фруктоза, глутамат и некоторые другие. Но даже при наличии любого нз органических субстратов большая часть (70-80 %) углерода в веществах клеток этих микроорганизмов образуется из СОг

Причиной ограниченной способности зеленых серобактерий использовать органические вещества, видимо, является отсутствие а-кетоглутаратдегидрогеназы и невозможность, в связи с этим, функционирования ЦТК (Кондратьева, 1996).

Наличие у зеленых серобактерий нескольких карбоксилирующих ферментов имеет значение не только для ассимиляции ими СОг, но позволяет использовать и некоторые органические соединения. Так, ассимиляция ацетата обычно происходит в результате карбоксилирования ацетил-КоА, а затем фосфоенолпирувата: КоА +С02 + Ф„

Ацетат ^ ацетил-КоА пируват *

НСО3Г фосфоенолпируват оксалоацетат. КоА С02 Пропионат -► пропионил-КоА -► метилмалонил-КоА

КоА сукцинил-КоА *

-> сукцинат. С02 а-кетоглутарат.

ГЛАВА 3

ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МАССОВОГО РАЗВИТИЯ АНОКСИГЕННЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В ВОДОЕМАХ

Выше уже говорилось о закономерностях развития АФБ под влиянием физико-химических факторов среды

глава обзора литературы). Также в развитии АФБ отмечена сезонная динамика (Таб. 7). Интенсивный рост разных серобактерий чаще всего наблюдается в летние и осенние месяцы, когда в водоемах активно идет разложение органических веществ, и образуется много сероводорода.

В зимние месяцы для роста пурпурных бактерий может не хватать света, а также может быть слишком низкая температура, но отдельных представителей АФБ все же находят в значительном количестве и под слоем льда. Ярким примером может служить цветение РгЬсИОуоп 1Шео1ит в феврале-марте 2003 г. в водной толще пруда Ботанического сада Самарского Государственного университета (г. Самара), а также в меромиктическом озере Бездонное (Национальный Парк "Самарская лука") в декабре 2001 г. {Горбунов, Уманская, 2003).

Таблица 7. Сезонные изменения продукции в меромиктических озерах {Горленко, 1981). оз. Беловодь, Владимирская область дата 02.06.71 14.07.71 24.07.71 22.03.72 водоросли мг С/ м~хсут

АФБ оз. Черный Кнчиер, Марий Эл дата 21.06.76 01.07.72 07.07.67 .08.74 06.08.69 01.10.70 водоросли мг С/ м2хсут 195 2500 20

АФБ 0 оз. Большой Кичиер, Марий Эл дата 19.06.76 01.07.72 07.07.67 .08.74 06.08.69 водоросли мг С/ м2хсут 2500 160

АФБ 0

3.1. Динамика сообщества аноксигениых фототрофных бактерий

Состав видов и их численное соотношение в хемоклине водоемов может меняться в течение года в зависимости от изменения световых и гидрохимических характеристик зоны хемоклина.

Динамика сообщества АФБ в зависимости от освещения наблюдалась Горленко, в карстовом меромиктическом (пресноводном) озере Беловодь (Владимирская обл.). Весной, после вскрытия озера ото льда происходила смена доминирующих видов. В мае-начале июня на глубине м появлялся слой коричнево-окрашенных консорциумов Ре1оскготайит гозеит, деятельность которых была ограничена низкой (2.5 м) прозрачностью воды. Зеленые серобактерии РеЬсНауоп \uieolum и консорциумы СЫогоскготайит а^ге^аШт появлялись в конце июня на глубине 6.5 м после увеличения прозрачности до 3.5 м и становились преобладающими видами в июле-августе. Расположение коричневого слоя в это время сохранялось на прежнем уровне. Также в озере присутствовало небольшое количество ПСБ Скготайит нр. и АтоеЬоЬаМег г о нет* (Горленко и др., 1977).

Совсем другая динамика сообщества АФБ происходила в хемоклине меромиктического сульфатного озера Каданьо (Швейцария) на глубине 11-13 м Здесь доминировали мелкие клетки ПСБ штаммов О или Р. В марте, июне и августе большую часть биомассы составлял штамм (67 %, %, % соответственно). В это время содержание клеток штамма Б находилось в пределах 18-30 % от общей биомассы. Другие организмы в это время составляли % (АтоеЬоЬааег ригригеиз') или меньше (СМогоЫит р!гаеоЬас1его¡йен 0-1 %, ЬатргосузШ гоъеореЫс'та 1-6 %, Скготайит окепп %). В октябре штамм Р был доминирующим и составлял % биомассы, штамм Б составлял %, Скготайит окепп — 16%, а АтоеЬоЬааег ригригеш — % (ТопоПа а1., 2003).

Интересная динамика сообщества АФБ во времени прослеживается в меромиктическом озере Могильное. Так, работы начала 20-го века (Исаченко, 1951) показывали, что этот слой был образован различными видами пурпурных серобактерий, в основном бактериями рода Скготайит. Однако, спустя лет, при исследованиях микробного состава слоя фототрофов, в нем были обнаружены только коричнево окрашенные зеленые серобактерии (Горленко и др., 1975; СоНепко е1 а1, 1978).

3.2. Влияние аноксигенных фототрофных бактерий на озерную экосистему

В отличие от цианобактерий, в массе развивающихся в эпилимнионе большинства водоемов, фототрофные бактерии нетоксичны и представляют собой прекрасную кормовую базу для зоопланктона (Горбунов, ¥ майская, 2003).

В результате апвеллинга, часто происходящего в озерах Махони (Канада), Сизо (Испания), Бухензее (Германия), когда биомасса фототрофных бактерий поднимается в миксолимнион, АФБ могут оказывать влияние и на развитие гетеротрофных бактерий в миксолимнионе (Оуегтапп е/ а1., 1996).

Так, для озера Махони (Канада), где апвеллинг наблюдался в течение лет подряд, было показано, что хотя аллохтонная органика и представляет значительную часть углерода для хемогетеротрофных бактерий миксолимниона, бактериальная продукция в миксолимнионе достигает максимальных значений только после апвеллинга развивающихся в хемоклине АтоеЬоЬаМег ригригетх. Результаты показывают, что огромная популяция АтоеЬоЬаМег рнгригет1 является главным источником фосфора для роста гетеротрофных бактерий в миксолимнионе озера Махони (Оуегтапп ег а1, 1996).

3.3. Вклад аноксигенных фототрофных бактерий в первичную продукцию водоемов

Продукция (первичная продукция) - количество органического вещества в граммах, создаваемого организмами в единице объема воды (или под единицей площади акватории) за единицу времени (Заварзин, 2003).

Пурпурные и зеленые бактерии обитают лишь в особых условиях и их вклад в фотосинтетическую продуктивность биосферы ничтожен, однако в рамках отдельных водоемов фотосинтетическая продукция этих бактерий может быть весьма значительной. В результате фотоассимиляции пурпурными бактериями углекислоты образование органических веществ в расчете на углерод в отдельных озерах во время их интенсивного роста достигает 5000 мг/м3 и более за день и превышает иногда первичную продукцию водорослей. Однако чаще первичная продукция АФБ составляет 100-200 мг/м3 в день (Таб. 8).

Таблица 8. Продукция органического вещества фотосинтезирующими бактериями в меромиктических озерах (Горле;¡ко, 1981). озеро доминирующие виды продукция АФБ в зоне максимума мг С/ м3хсут продукция АФБ мг С/ м2хеут % от суммарной продукции пресные озера

Беловодь СИготаНит окепи (300) 110(180) (40)

Грин Лейк СМогоЫит ркаеоЬас!его ¡¿¡ев 1600 2500 85

Вае де Сан Хуан Ре1осИсйит ркаеит 3 соленые озера

Фаро СМогоЫит ркаеоУ1Ьгю1с1ев 75 45

Сьюкесту СкготаНит вр. 50 (264) (34)

Кизаратсу СИготаНит лул 1000 60

Медицин-Лейк ЬатргосувПв говеорегвк-'та 2000 55

Канике СЬготаИит яр. 909 61

Определения продукции анаэробных фототрофных бактерий проводились во многих озерах и сравнивались с продукцией фитопланктона, но чаще они сводились к разовым анализам в период благоприятного развития серобактерий (Кузнецов и др., 1985) (Таб. 9).

Таблица 9. Вклад фототрофных бактерий в продукцию органического вещества в меромиктических озерах (Горленко, 1981; Кузнецов и др., 1985). озеро доминирующий вид АФБ продукция, мг С/м2 в сутки вклад АФБ в продукцию, % водорослей АФБ евтрофные озера

Беловодь, Владимирская обл. Ре!асИс(уоп 1Шео1ит 1450 14

Репное, Донецкая обл. СЫогоЫит ркаеоухЬгтйеъ 1407 14

Вейсово, Донецкая обл. Ре1ойШуоп ркаеит 213 19

Черный Кичиер, Марий Эл Ре1ойШуоп 1Шео1ит 7

Большой Кичиер, Марий Эл Ре1осНс(уоп 1Шео1ит 3 мезотрофные и олиготрофные озера

Гек-Гёль, Азербайджан СЫогоЫит ркаеоЪас1ег oid.es 15

Саково, Вологодская обл. Ре^ж1уоп Шео1ит 190 37

Могильное, о-в Кильдин СЫогоЫит phaeovibrioides 224 •43

Помярецкое, Донецкая обл. СЫогоЫит ch¡orovibrioides 224 52

Кузнечиха, Марий Эл СЫогосЬготайит aggregatum 100 39

Мышиньер, Марий Эл АтоеЬоЬаМег го5ешА 195 52

Конан-Ер, Марий Эл АтоеЬоЬаШг гояет^ 75

Марал-Гёль, Азербайджан ТЫосарза яр. 90 68

Судя по имеющимся данным, наибольший вклад зеленых и пурпурных бактерий в продукцию органического вещества отмечен при наличии сульфида в меромиктических озерах олиготрофного и мезотрофного типов, где создается благоприятный световой режим В периоды слабого развития фитопланктона в миксолимнионе меромиктических озер зеленые и пурпурные бактерии особенно активно развиваются в зоне хемоклина.

В период оптимального развития суточная продукция АФБ может составлять от до % от их годовой продукции. В евтрофных озерах скорости анаэробного фотосинтеза могут быть достаточно высокими, но фототрофные бактерии развиваются, как правило, в очень узком слое и непосредственной близости с водорослями. Поэтому лишь в озерах с признаками олиготрофии, где создается продолжительная или постоянная стратификация, пурпурные и зеленые бактерии играют ведущую роль в окислении H2S и являются основными продуцентами органического вещества из неорганического (Горленко, 1981; Кузнецов и др., 1985; Кондратьева и др., 1989).

При оценке первичной продукции следует учитывать тот факт, что численность сообщества АФБ может быть значительно ограничена выеданием. Так, в пробах воды из меромиктического озера Бездонное (Национальный Парк "Самарская лука") время удвоения биомассы АФБ в фильтрованных от зоопланктона пробах составляло 20.1 часов, а в нефильтрованных 66.5 часов (.Горбунов, Уманская, 2003).

Выше уже было сказано, что цветение АФБ происходит только в определенные периоды и интенсивность его изменяется от месяца к месяцу, поэтому для оценки вклада АФБ в экосистему водоема большое значение имеет измерение годовой продукции АФБ (Таб. 10).

Фотосинтетическая активность зависит от света, освещение in situ уменьшается с глубиной и с увеличением концентрации водорослей в поверхностных слоях, поэтому продукция фототрофных бактерий бывает больше в мелких водоемах (Сизо, Смит Хоул) или в более глубоких озерах, если они содержат мало водорослей (Фэйтвилл Грин). Существует корреляция между вкладом фототрофных серобактерий и количеством света, достигающим бескислородных слоев (Parkin, Brock, 1980). Сходная корреляция может быть получена между общим количеством фиксированной СО2 в процессе аноксигенного фотосинтеза (на м /день) и количеством освещения (в % от поверхностного освещения), достигающим слоев фототрофных бактерий (Montesinos, Van Gemerden, 1986). Экстраполяция кривой продукции АФБ к % поверхностного освещения показывает наличие верхнего предела продукции фототрофных серобактерий, который приблизительно составляет мг/м2 в день. Эта взаимосвязь не всегда означает, что развитие фототрофных бактерий лимитировано светом, однако показывает существование очевидной обратной связи между поглощением света и фиксацией диоксида углерода (Van Gemerden, 1995).

Таблица 10. Годовая продукция АФБ в различных водоемах (Van Gemerden, 1995; Overmann, 1997). водоем доминирующии организм продукция АФБ ссылки г С/м2 *год % от общей

Фэйтвилл Грин (США) СЫогоЫит phaeobacteroides Culver, Brunskill, 1969

Смит Хоул (США) Chromatium sp. 50 Wetzel, 1973

Вальдзеа (Канада) СЫогоЫит sp. 46 Lawrence et al., 1978; Parker etal., 1983

Дедмуз (Канада) Lamprocystis roseopersicina 17 Parker et al, 1983; Parker, Hammer, 1983

Большое Содовое (США) Ectothiorhodospira vacuolata 10 Cloern et al., 1983

Нэк (США) Pelodictyon sp., Clathrichloris sp. Parkin, Brock, 1981

Митлерер Бухензее (Германия) Amoebobacter purpureus Pelodictyon phaeoclathratiforme - Overmann, Tilzer, 1989

Вехьтен (Нидерлан-ды) Chloronema sp. Thiopedia sp. Chromatium sp. 4 Steenbergen, 1982; Steenbergen, Korthals, 1982

Вае Сан Жуан (Куба) Amoebobacter roseus4, Pelodictyon phaeum Romanenko et al., 1976

Сизо (Испания) Amoebobacter sp1. Chromatium minus 25 Garcia-Cortizano, 1992

Махони (Канада) Amoebobacter purpureus' 39.9 72.9 Overmann, 1997

ГЛАВА 4

ЯВЛЕНИЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ИЗОТОПОВ УГЛЕРОДА

Образование органических веществ живыми существами сопровождается фракционированием изотопов углерода, серы, азота, водорода и других элементов. Относительное содержание стабильных изотопов углерода является важным инструментом во многих биологических, геохимических и геологических исследованиях (Bender, 1972).

Фракционирование изотопов углерода особенно хорошо наблюдается у фотоавтотрофных организмов (Таб. 11).

Таблица 11. Изотопный состав существующих автотрофных организмов (Autotrophic bacteria, 1989).

Автотрофные организмы Изотопный состав относительно стандарта (5 13С °/00).

С-3 растения -(34-23)

С-4 растения -(23-6)

Эукариотические водоросли -(35-12)

Цианобактерии в природных водоемах -(21-8)

АФБ -(36-19)

Метаногенные археи -(38-6)

Фракционирование изотопов углерода у бактерий происходит как при автотрофном, так и при миксотрофном и гетеротрофном росте.

4.1. Изотопный состав углерода, степень фракционирования

Углерод в природе представлен тремя изотопами |2С, 13С, 14С. Изотоп 14С является радиоактивным и составляет незначительную часть от всего углерода, поэтому естественный углерод состоит на 98.9 % из изотопа 12С и на 1.1 % из изотопа С13. Равновесные и кинетические процессы слегка изменяют это соотношение.

Различия содержания изотопов !3С и 12С в материалах измеряется степенью фракционирования в частях на тысячу (°/00), по отношению к стандарту.

513С = (13С/12С)пробы - Г' 'С/12С)стандарта х1000 7оо (13С/12С) стандарта

За точку отсчета (стандарт) принято содержание 12С/13С белемнитов формации "Реес1ее" Южной Калифорнии, равное 88.99.

4.2. Механизмы фракционирования изотопов углерода

Существует два типа процессов, приводящих к фракционированию изотопов (углерода). Как было сказано выше, это равновесные и кинетические процессы.

4.2.1. Химическое фракционирование изотопов углерода

Химическое фракционирование изотопов является результатом равновесных химических процессов. В равновесных процессах изотопы углерода в двух химических соединениях находятся в равновесии и фракционирование происходит потому, что один изотоп относительно более стабилен в одном химическом соединении, чем в другом

При высокой температуре такое фракционирование происходит в гидротермах, константа равновесия этой реакции зависит от температуры. 13С02 + 12СН4 ► 12С02 + 13СН4

При низких температурах в естественных условиях очень медленное фракционирование происходит в системе НС0з"-С02 и в системе НСОз'-СаСОз. Константы этих реакций при обычных температурах едва больше единицы и поэтому равновесие очень слабо сдвинуто в сторону образования продуктов:

Н12С03 + 13С02 » Н13С03"+ 12С02 К-1.005 при °С.

Н13С03" + Са12С03 ► Н!2С03" + Са13С03 К-1.004 при °С, (Bender, 1972).

Благодаря химическому фракционированию соотношения изотопов углерода в различных природных материалах варьируют (Таб. 12).

Практически весь С02 в океане находится в форме бикарбоната. 13С в поверхностных водах океана -2 °/00. Термоклин и глубоководная часть обеднены 13С из-за присутствия обедненного 13С бикарбоната, образовавшегося в результате окисления органического материала, обедненного 13С.

Углекислый газ атмосферы находится в равновесии с бикарбонатом океана, его изотопный состав примерно на °/00 легче океанического бикарбоната и составляет около -7 7оо (Bender, 1972).

Экспериментально доказано, что фракционирование изотопов углерода между С02 атмосферы и водным бикарбонатом уменьшается с 9.2 + 0.4 при °С до 6.8 + 0.4 при

30 °С. Также отсутствует какой-либо измеримый эффект фракционирования между атмосферным ССЬ и С02, растворенным в воде (Deuser, Degens, 1967; Ouandt, 1977).

Таблица 12. Изотопный состав углерода в природных материалах (Bender, 1972). природные материалы изотопный состав относительно стандарта (8С13 °/00) каменные метеориты углеродосодержащие хондриты -13-+1 другие каменные метеориты -26 - -3 вулканические материалы изверженные горные породы -27--19

СО2 из вулканически газов -7--1

СН4 из вулканически газов -(20-29) - ? океанические материалы океанический бикарбонат -5--2 морской известняк -3-+3 морские растения -(25 - 30) -? наземные материалы атмосферный ССЬ -8--6 известняк пресных вод -10-+4 наземные растения -29 - -22 осадки и полезные ископаемые органический углерод в осадках -31 --18 каменный уголь -27--21 нефть -31--23 графит -27--1 алмазы -2-+3

4.2.2. Фракционирование изотопов углерода в биологических системах

Фракционирование углерода живыми организмами приводит к гораздо большему эффекту разделения изотопов углерода. Так, в озере Фэйтвилл Грин (США) изотопный состав биомассы пурпурных и зеленых АФБ составлял -(31-42) °/00, в то время, как изотопный состав биомассы растений и водорослей был тяжелее и составлял -(24-28) °/00 СFulton, 2006).

Фракционирование в биологических системах является результатом равновесных кинетических процессов, когда один изотоп реагирует немного быстрее или медленнее, чем другой. Закономерности фракционирования изотопов углерода в органических системах пока не вполне понятны, однако, очевидно, что фракционирование изотопов углерода обусловлено тремя кинетическими эффектами. Это:

1. Абсорбция СОг клеткой.

2. Захват СОг ферментативной карбоксилирующей системой и превращение в органический углерод, формирование липидной фракции из синтезированных клеткой низкомолекулярных органических веществ.

3. Скорость ферментативной реакции, т. к. известно, что в реакциях фиксации углекислоты изотоп С13 реагирует примерно на 1.7 °/00 медленнее, чем 12С, а при синтезе липидов на 0.5 °/00 медленнее, чем I2C (Bender, 1972; Zyakun et al., 1977).

Фотосинтезирующие бактерии способны фракционировать изотопы углерода субстрата как при фотоавтотрофном, так и при фотомиксотрофном росте. На величину и направленность фракционирования изотопов углерода при бактериальном фотосинтезе влияют физиологические и биохимические факторы (концентрация субстрата в среде, температура, pH, активности ферментных систем, ответственных за первоначальную фиксацию углекислоты, особенности метаболизма углерода, интенсивность "углекислотного дыхания")(Zyakun et al„ 1977).

При фотоавтотрофном росте одним из важных параметров, определяющих величину изотопного фракционирования, является удельная концентрация углекислоты в среде. С этим параметром связаны такие показатели, как соотношение скорости диссоциации бикарбоната до СОг и скорости потребления углекислоты бактериями, а также вклад в общий пул углекислоты в среде обитания бактерий их метаболической С02, образующейся в результате "углекислотного дыхания". При малых концентрациях фототрофных бактерий в среде и относительно высоких удельных концентрациях СОг в клетку поступает преимущественно СОг, обедненная 13С изотопом, если ее потребленная часть значительно меньше, чем содержание в системе НСО3-СО2 (при равновесии).

С увеличением биомассы бактерий возрастает суммарная скорость потребления СОг и, соответственно, возрастает количество метаболической углекислоты, поступающей в среду. Разность величин, характеризующих изотопный состав углерода биомассы и субстрата в среде, при этом будет снижаться, достигая почти нулевого значения (если фракционирование углерода отсутствует).

При повышении удельных концентраций углекислоты в среде вклад метаболической углекислоты в общий пул С02 снижается, и это сопровождается увеличением фракционирования изотопов углерода, т. е. разность в изотопном составе углерода биомассы и остаточной углекислоты в среде возрастает. Максимальное фракционирование изотопов углерода наблюдается при удельных концентрациях углекислоты, превышающих более чем на два порядка количество метаболической углекислоты, и определяется термодинамическим изотопным эффектом в равновесной системе НСО3-СО2, кинетическими изотопными эффектами при диффузии С02 в клетку и при ее фиксации с участием соответствующих ферментных комплексов. Только в этих условиях можно наблюдать различие в фракционировании изотопов углерода, связанное с влиянием ферментных систем, ответственных за первоначальную фиксацию углекислоты.

При фотомиксотрофном росте бактерий, где органическим субстратом является ацетат, изотопный состав углерода биомассы наследует изотопный состав органического субстрата. Метаболическая углекислота при этом может быть обеднена изотопом 13С относительно биомассы на 6-8 °/00. Это рассматривается как свидетельство реализации кинетического изотопного эффекта на стадии диффузии углекислоты из клетки. Таким образом, изотопный состав углерода фототрофных бактерий не является постоянным и может иметь различное значение в природной среде (Зякун, Ивановский, 2000).

4.3. Зависимость фракционирования от путей потребления углеродсодержащих соединений

Фракционирование определяется как разница в изотопном составе между углеродом биомассы и оставшимся углеродом в среде, и в первую очередь зависит от того, какие карбоксилирующие ферментные системы активны в клетках. Так, при ССЬ-ассимиляции у Thiocapsa roseopersicina штамма BBS5 может происходить карбоксилирование Сг, С3 и С4 кислот с участием фосфоенолпируват-карбоксилазы, пируват-карбоксилазы, пируват-синтазы и а-кетоглутарат-синтазы. Активность этих ферментов также позволяет клетке ассимилировать не только СО2, но и некоторые органические соединения, в первую очередь ацетат (Zhukov, Krasilnikova, 1977).

4.3.1. Рост в фотоавтотрофных условиях

Изотопный состав свободной углекислоты отличается от изотопного состава бикарбоната и в водном растворе бикарбонат-ион оказывается тяжелее газообразного СОг на 8-9 °/00 (Zyakun, et al., 1977; Бондарь и др., 1976). Поэтому, при росте в фотоавтотрофных условиях величина эффекта фракционирования в первую очередь определяется тем, в какой форме карбоксилирующие ферменты используют углекислоту (Таб. 13).

Таблица 13. Активные формы углекислоты, используемые разными карбоксилирующими ферментативными системами (с использованием Fuchs et al, 1979). фермент источник фермента субстрат для ферментов - ССЬ:

РБФК листья шпината

ФЕП-карбокси-киназа Rhodospirillum rubrum

ФЕП-карбокси-трансфосфорилаза Propionibacterium shermanii

Пируват-синтаза Clistridium pasteurianum

Пируват декарбоксилаза пивные дрожжи

Формиат-дегидрогеназа (СОг редуктаза) Clostidium pasteurianum, Vibrio succinogenes, Pseudomonas oxalaticus а-кетоглутарат-синтаза ?

Изоцитратдегидрогеназа ? субстрат для ферментов — НСОз":

ФЕП-карбоксилаза арахис, маис

Пируват-карбоксилаза печень цыпленка

Пропионил-КоА карбоксилаза свиное сердце

АФБ отличаются разнообразием путей фиксации СО2 при автотрофном росте: восстановительный пентозофосфатный цикл (пурпурные бактерии, зеленые нитчатые бактерии), ВЦТК (зеленые серобактерии), 3-гидроксипропионатный цикл (зеленая нитчатая бактерия Chloroflexus aurantiacus ОК-70) и восстановительный цикл дикарбоновых кислот (Chloroflexus aurantiacus В-3) (Ivanovsky et al., 1999; Holo, 1989; Ivanovsky et al, 1993; Угольлъникова, Ивановский, 2000).

При фотоавтотрофном росте у пурпурных бактерий, в отличие от зеленых серобактерий, кроме основного рибулозобифосфатного пути могут быть одновременно задействованы и другие способы фиксации СО2, однако доля фиксируемой в них углекислоты мала. Было показано, что у пурпурных бактерий активность РБФК в раз выше активности ФЕП-карбоксилазы, в то время как у зеленых бактерий отмечена высокая активность ФЕП-карбоксилазы и отсутствует активность РБФК.

У микроорганизмов, содержащих активную РБФК (Ectothiorhodospira shaposhnikovii, Rhodopseudomonas palustris) в фотоавтотрофных условиях достигается наибольший эффект фракционирования, он в среднем составляет -(30-32) 700- У микроорганизмов, содержащих активную ФЕП-карбоксилазу (СЫогоЫит limicola), в тех же условиях достигается меньший эффект фракционирования: -(19-20) (Holo, 1989; Ivanovsky et al., 1993; Ivanovsky et al., 1999; Уголъкова, Ивановский, 2000). Сходные результаты получены для СЫогоЫит thiosulfatophilum, Rhodospirillum rubrum и Chromatium (Waygood et al, 1969; Cooper, Wood, 1971), а также при исследовании изотопного состава природных экосистем

Так, в хемоклине соленого меромиктического озера Kaiike, Япония, 4.5-5 м, изотопный состав окенона Halochromatium sp. составлял -31 °/00, в то время как изотопный состав Бхл е и изорениератина из СЫогоЫит phaeovibrioides -22 °/00. Изотопный состав неорганического углерода воды на этой же глубине - -2.1 (Ohkouchi, 2005).

Снижение эффекта фракционирования у ЗСБ по сравнению с ПБ объясняется тем, что при фиксации углекислоты в ВЦТК оказываются задействованными четыре карбоксилирующие системы, одна из которых (фиксация СО2 на ФЕП при участии ФЕП-карбоксилазы) использует в качестве субстрата углекислоту в форме НСОз".

Большая величина фракционирования у пурпурных серобактерий объясняется работой единственного входящего в цикл фиксации карбоксилирующего фермента (РБФК), который использует углекислоту в форме ССЬ.

4.3.2. Фракционирование при фотомиксотрофном росте

При фотомиксотрофном росте бактерий на ацетате и бикарбонате в среднем около % углерода их биомассы связано с утилизацией углекислоты, при этом, как было показано на экспериментах с Ectothiorhodospira shaposhnikovii, существенно возрастает фиксация углекислоты на фотсфоенолпирувате и пирувате по сравнению с фотоавтотрофным ростом (Зякун и др., 1998). Изотопный состав углерода поглощаемых органических соединений почти полностью наследуется.

Так, при фотомиксотрофном росте Ectothiorhodospira shaposhnikovii на ацетате изотопный состав клеток относительно бикарбоната был обеднен 13С на -(8-25) °/00. При этом на начальной стадии роста биомасса была тяжелее, чем ацетат среды на +2.5 °/00. В конце роста при полном потреблении ацетата биомасса была чуть легче потребленного ацетата -0.2 %0, то есть изотопный состав ацетата наследовался. С метаболической углекислотой из клетки уходил легкий углерод, который был легче ацетата среды на -(8-14) °/00 (Зякун и др., 1996).

4.3.3. Легкие и тяжелые клеточные фракции

При фотосинтезе одновременно происходит большое число химических реакций -синтез углеводородов, белков и липидов. Исследования изотопного состава клеток и внутриклеточных компонентов фотосинтезирующих организмов показывают, что различные клеточные фракции неодинаково обогащаются изотопом 12С. Углеводная и особенно липидная фракции клетки всегда оказываются обедненными 13С, в то время как углерод карбоксильной группы аминокислот сравнительно мало отличается от исходного СО? среды (Таб. 14).

Это происходит потому, что при синтезе гексоз используется углерод, фиксированный в РБФК-цикле, а при синтезе аспартата происходит фиксация двух молекул С.02, одна из которых фиксируется в РБФК-цикле, а вторая - с помощью ФЕП-карбоксилазы.

С02 +НС02" РБФ^ ФГА ^ ФЕП ^ OAK ^ асп

При фиксации С02 в РБФК-цикле при температуре от до °С образующаяся разница изотопного состава углерода между биомассой и неорганической средой находится в пределах значений -(33.7-18.3) 700.

Таблица 14. Содержание С13 в основных фракциях фотосинтезирующих организмов по данным (Abelson, Hoering, 1961). организм клетки целиком лнпиды аминокислоты карбоксильная группа аминокислот

Chlorella (одноклеточные зеленые водоросли) -18.9 -22.8 -16.0

Anacystis (цианобактерии) -14.8 -18.9 -13.0 +1.3

Scenedesmus (зеленые ценобиальные водоросли) -11.9 -17.3 -10.1 +0.9

Chromatium (ПСБ) -17.8 -20.6 -17.3 -6.4

Euglena (простейшие) -16.4 -18.5 -15.4 -1.9

Ochromonas (одноклеточные золотистые водоросли) -19.5 -22.7 -15.6 -5.4

Таблица 15. Содержание изотопа 13С в аминокислотах фотосинтезирующих микроорганизмов. По данным {Abelson, Hoering, 1961). аминокислота Chlorella pyrenoidosa Chromatium sp. Euglena gracilis Gracilaria sp. (красные водоросли)

Глутаминовая кислота целиком(1) -18.7 -15.6 -17.3 -17.2

СОО-t2) -8.8 +2.2 -0.2 -8.4 остальной^ -21.1 -20.1 -21.5 -19.3

Аспарагиновая кислота целиком -6.6 -21.8 -9.6 -14.4

СОО- +2.2 -15.9 +1.0 -5.3 остальной -15.6 -27.6 -20.3 -18.4

Серии целиком -5.7 -6.6 -8.3 -14.1

СОО- +2.5 -2.9 -6.1 -8.8 остальной -9.9 -8.4 -9.5 -16.8

Лейцин целиком -22.7 -23.5 -23.5 -22.5

СОО- -16.3 -22.5 -13.6 -24.1 остальной -26.0 -23.7 -25.6 -22.1

1) - целиком - молекула аминокислоты целиком

2) -СОО- - углерод карбоксильной группы - остальной — остальной углерод молекулы

Степень фракционирования углерода при карбоксилировании ФЕП с помощью ФЕП-карбоксилазы -2.7 ± 4.4 (\Vong, ЗаскеИ, 1975).

Исследования состава аминокислот показывают, что углерод карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот всегда тяжелее, чем остальной углерод этих молекул. В то же время карбоксильная группа лейцина всегда легче, чем у любых других аминокислот САЬеЬоп, Иосг'ищ, 1961) (Таб. 15).

Показано, что углерод С02, включенный в ВЦТК из среды на пируват в конечном счете оказывается в карбоксильной группе глутаминовой кислоты, в 4-м положении аспарагиновой кислоты и частично может оказываться в карбоксильной группе аспарагиновой кислоты.

Липиды происходят из углерода, фиксированного в рибулозобифосфатном цикле. Однако поскольку липидная фракция легче, чем углеводороды и чем некарбоксильная часть протеинов, вероятно, происходит дополнительное фракционирование при образовании липидов (АЪе1$оп, Ноег1961).

Как для биомассы АФБ в целом, так и для отдельных клеточных фракций показано, что величина фракционирования зависит от условий выращивания культур. При фотоавтотрофном росте липидная фракция биомассы ЕсШЫогкос1о$ри-а нЬарозкткох'й была легче биомассы клеток на -(3.7-4.2)700, при фотомиксотрофном росте - только на -(0.1-1.9)%0. При фотоавтотрофном росте аминокислоты и углеводы были тяжелее биомассы на +0.47оо, при фотомиксотрофном на +(0.1-3.7) (Зякун и др., 1996).

4.4. Физиологические последствия наличия в клетках углерода с повышенным содержанием изотопа 1ЭС

При росте ПСБ на средах, содержащих повышенные количества ,3С в углекислоте, было показано, что наличие 13С в углекислоте, превышающее природную распространенность этого изотопа, оказывает заметное влияние на развитие этих бактерий.

13

При росте Ectothiorhodospira shaposhnicovii на средах с бикарбонатом, обогащенным С, происходило увеличение размера клеток, удлинение времени нахождения клеток во взвешенном состоянии, изменение характера фракционирования изотопов углерода. При

13 росте клеток Rhodospirillum rubrum на средах с бикарбонатом, обогащенным С, обнаруживалось уменьшение объема клеток по сравнению с контролем (Ладыгина, 2003).

4.5. Изотопный состав органического углерода взвеси в водоемах

До сих пор в литературе встречались лишь единичные сведения о фракционировании изотопов углерода микробным сообществом, развивающимся на границе окисленных и восстановленных вод в меромиктических водоемах.

Известно, что в Черном море в зоне хемоклина наблюдалось появление более легкой органической взвеси (значения 5пСорг варьировали от -27 до -28 °/00) по сравнению со взвесью выше- и нижерасположенных слоев воды (от -24 до -25 700,) (Иванов и др., 2000). Авторами показано, что пики легкой органики были связаны с активностью хемоавтотрофного сообщества, развивающегося в зоне одновременного присутствия кислорода и сероводорода.

В озере Могильное было отмечено значительное изменение изотопного состава органической взвеси и минерального углерода в зоне развития АФБ. Значения Д=(513СМШ1

13

8 Сорг) на глубине 8-9 м составляли 15.1-21.4 (Иванов и др., 2001) (Рис. 3).

Рисунок 3. Изотопный состав органического и минерального вещества в воде озера Могильное, июнь, 1999 г. (по данным Иванов и др., 2001).

В этом озере в верхних слоях сероводородной зоны происходило мощное развитие коричневоокрашенных зеленых серобактерий, и продукция аноксигенного фотосинтеза в несколько раз превышала продукцию оксигенного фотосинтеза. Максимум аноксигенного фотосинтеза был отмечен на глубине 9.25 м

В пресном меромиктическом озере Каданьо (Cadagno) в Швейцарии в зоне хемоклина наблюдалось появление легкой биомассы (-(36-39) °/00) по сравнению с выше и ниже расположенными слоями воды (-27 °/00). Легкая биомасса была представлена в основном клетками АФБ развивающимися в этой зоне и служащими пищей для зоопланктона из эпилимниона (Camacho et al„ 2001).

Имеются сведения о заметном изменении изотопного состава органического углерода взвеси в хемоклине соленого меромиктического озера Кейки (Kaiike) в Японии под влиянием развивавшихся там ПСБ Halochromatium sp. и ЗСБ Chlorobium. phaeovibrioides (Ohkouchi et al., 2003, 2005). Сообщается, что в зоне развития АФБ (на глубине 4.5-5 м) изотопный состав окенона из ПСБ составлял -31 7оо, изотопный состав Бхл е и изорениератина из ЗСБ составлял 700, в то время, как изотопный состав неорганического углерода воды на этой же глубине составлял -2.1 700.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биоразнообразие аноксигенных фототрофных бактерий и их роль в продукции органического вещества в меромиктических водоемах»

Актуальность работы.6

Цели и задачи работы.7

Научная новизна.8

Практическая ценность работы.8

Апробация работы.9

Объем работы.9

Место проведения работы.9

Благодарности.10

Принятые сокращения и обозначения.11

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Лунина, Ольга Николаевна

ВЫВОДЫ.149

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.147