Регуляция нитрогеназной активности и фотообразования водорода у пурпурных несерных бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Федоров, Александр Сергеевич

• Федоров, Александр Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Федоров, Александр Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1. Общая характеристика пурпурных несерных бактерий.

Глава 2. Азотфиксирующая система пурпурных бактерий.

2.1. Нитрогеназа: строение и свойства.

2.2. Гены, контролирующие процесс азотфиксации.

2.3. Регуляция нитрогеназной системы.

2.3.1. Регуляция экспрессии нитрогеназы.

2.3.2. Действие аммония на нитрогеназную активность in vivo.

2.3.3. Молекулярные механизмы посттрансляционной регуляции нитрогеназы.

Глава 3. Фотообразование водорода пурпурными несерными бактериями.

3.1. Факторы, влияющие на фотообразование Н2 у суспензионных культур.

3.1.1. Свет.

3.1.2. Доноры электронов и источники углерода.

3.1.3. Источники азота.

3.1.4. Температура, рН и другие факторы.

3.2. Иммобилизованные культуры. Особенности выделения водорода.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 4. Объекты и методы исследований.

4.1. Объекты исследований.

4.2. Среды для культивирования.

4.3. Определение нитрогеназной активности клеток.:.

4.4. Определение характеристик эффекта выключения нитрогеназы аммонием.

4.5. Определение АДФ-рибозилирования Fe-белка нитрогеназы.

4.6. Определение концентраций различных соединений.

4.6.1. Определение содержания лактата и пирувата.

4.6.2. Определение аммония.

4.6.3. Определение концентрации сухой биомассы, белка и бактериохлорофилла а.

4.6.4. Определение содержания пиридиннуклеотидов.

4.6.5. Измерение образования Н2 в ФБР.

4.7. Измерение интенсивности падающего света.

4.8. Активация поверхности стекла и иммобилизация фототрофных микроорганизмов.

4.9. Характеристика сточных вод.

4.10. Фотобиореакторы.

4.10.1. ФБР для суспензионных культур.

4.10.2. ФБР для изучения фотообразования водорода иммобилизованными культурами.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Глава 5. Влияние условий культивирования пурпурных бактерий на нитрогеназную активность и выключение нитрогеназы аммонием.

5.1. Влияние обеспеченности аммонием на нитрогеназную активность клеток Rba. capsulatus и Rba. sphaeroides и на эффект выключения нитрогеназы.

5.2. Влияние концентрации биомассы на нитрогеназную активность клеток Rba. capsulatus и на эффект выключения нитрогеназы.

5.3. Влияние рН на нитрогеназную активность и эффект выключения нитрогеназы у Rba. capsulatus.

5.4. Влияние азотного голодания и недостатка органического субстрата на нитрогеназную активность и эффект выключения нитрогеназы у Rba. capsulatus.

Глава 6. Возможные механизмы эффекта выключения нитрогеназы аммонием у пурпурных бактерий.

6.1. Связь эффекта выключения и АДФ-рибозилирования Fe-белка нитрогеназы.

6.1.1. Наличие эффекта выключения и АДФ-рибозилирования у некоторых пурпурных несерных бактерий.

6.1.2. Эффект выключения у Rba. capsulatus и ее мутантов с нарушенной системой модификации Fe-белка.

6.1.3. Эффект выключения нитрогеназы и АДФ-рибозилирование у Rba. sphaeroides и ее производных с внедрёнными генами nifHDK и draT/G из Rba. capsulatus.

6.2. Эффект выключения нитрогеназной активности аммонием и степень восстановленности пиридиннуклеотидов.

Глава 7. Оптимизация фотообразования водорода неперерывной культурой Rba. capsulatus.

7.1. Влияние концентрации аммония в подаваемой среде на выделение водорода хемостатной культурой Rba. capsulatus.

7.2. Влияние скорости протока на выделение водорода хемостатной культурой Rba. capsulatus.

7.3. Выявление факторов, снижающих скорость образования водорода хемостатной культурой Rba. capsulatus.

7.4. Фотообразование водорода хемостатной культурой amtB'-мутанта Rba. capsulatus, не обладающего эффектом выключения нитрогеназы аммонием.

Глава 8. Фотообразование водорода иммобилизованными культурами пурпурных бактерий.

8.1. Иммобилизация на стекле.

8.2. Получение водорода в ФБР с иммобилизованными на пористом стекле клетками пурпурных несерных бактерий.

8.3. Получение водорода в ФБР с иммобилизованными на пенополиуретане клетками пурпурных несерных бактерий.

8.4. Возможность использования сточных вод различными пурпурными несерными бактериями.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция нитрогеназной активности и фотообразования водорода у пурпурных несерных бактерий»

Актуальность проблемы. В последние годы в мире резко возрос интерес к альтернативным источникам энергии. Это обусловлено, прежде всего, размерами экологических последствий использования традиционных энергетических ресурсов (угля, нефти и природного газа) . Молекулярный водород является экологически чистым источником энергии, поскольку продуктом его сгорания является вода. В настоящее время рассматриваются несколько способов получения молекулярного водорода. Один из них - это биологическое преобразование энергии света в энергию молекулярного водорода.

Пурпурные бактерии способны в определённых условиях к светозависимому образованию водорода за счёт действия нитрогеназы. К наиболее активным азотфиксаторам относятся пурпурные несерные бактерии, обладающие к тому же высокими скоростями роста, подвижностью метаболизма и неприхотливостью питания. Однако для их практического использования необходимо решение ряда научных и технологических проблем.

В частности, нитрогеназная система подвержена сложной многоуровневой регуляции, причём аммоний - один из основных ее регуляторов. Во-первых, хорошо известно, что аммоний репрессирует синтез нитрогеназы, дерепрессия возможна лишь при низких, лимитирующих концентрациях. Во-вторых, аммоний быстро и обратимо ингибирует активность нитрогеназы у пурпурных бактерий (так называемый эффект выключения). Этот эффект относительно мало изучен, и пока неясно, как он зависит от условий роста, и какие механизмы лежат в его основе. Несмотря на наличие литературных данных о том, что АДФ-рибозилирование Fe-белка нитрогеназы ответственно за эффект выключения нитрогеназы аммонием у пурпурных бактерий, накапливаются данные, противоречащие этой гипотезе.

Другой проблемой, сдерживающей практическое применение пурпурных бактерий в биотехнологических системах получения водорода, является снижение скорости образования водорода периодическими культурами через несколько часов после начала процесса. Использование непрерывного культивирования может способствовать стабилизации этого процесса во времени. Однако в литературе имеются лишь отдельные работы, -использующие этот метод, основная же масса исследований проведена с периодическими культурами. Кроме того, информация о факторах, влияющих на скорость ■ образования водорода непрерывными культурами, ограничена.

К числу принципиальных проблем следует отнести и низкую удельную скорость процесса. Выделение водорода в расчёте на 1 л суспензии непрерывной культуры Rhodospirillum rubrum составляло 180 мл ч-1 (Zurrer and Bachofen, 1982). Вместе с тем, в литературе имеется описание непрерывного процесса получения водорода на свету с использованием Rhodobacter sphaeroides, иммобилизованной на пористом стекле. Скорость образования водорода в расчёте на 1 л матрицы достигала 1800 мл ч-1 (Tsygankov et al., 1994а). Пока неясно, насколько универсальной матрицей для фототрофных микроорганизмов является пористое стекло, какими дешёвыми материалами можно его заменить, и какие дешёвые субстраты могут использоваться для получения водорода. Цель и задачи работы. Целью данной работы было выяснить условия для максимального выделения водорода в фотобиореакторах (ФБР) с суспензионными и иммобилизованными непрерывными культурами пурпурных несерных бактерий и определить, какие факторы его ограничивают. Выяснить, каковы особенности действия аммония одного из ограничивающих факторов - на нитрогеназную активность. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1 - изучить особенности проявления эффекта выключения нитрогеназы аммонием в зависимости от параметров роста культуры, а также связь эффекта выключения с АДФ-рибозилированием Fe-белка нитрогеназы у пурпурных несерных бактерий Rba. capsulatus и Rba. sphaeroides;

2 - изучить основные факторы, влияющие на скорость фотообразования водорода и эффективность использования органического субстрата у непрерывной суспензионной культуры Rba. capsulatus;

3 - иммобилизовать пурпурные несерные бактерии на пористых матрицах; изучить процесс образования ими водорода и возможность его сопряжения с очисткой сточных вод от органических соединений.

Научная новизна работы. Впервые выявлены параметры роста культуры, влияющие на проявление эффекта выключения нитрогеназы аммонием у Rba. capsulatus. Установлено, что характеристики эффекта выключения (время выключения и степень ингибирования нитрогеназной активности в ответ на экзогенный аммоний) изменяются в зависимости от рН среды, длительности азотного голодания и доступности органического субстрата.

Показано, что Fe-белок нитрогеназы у Rba. sphaeroides не подвергается АДФ-рибозилированию ни при высокой обеспеченности клеток азотом, ни при импульсном добавлении аммония. Это обусловлено отсутствием DRAT/G системы, а не неспособностью Fe-белка присоединять АДФ-рибозил. С использованием draТ/G-мутантов Rba. capsulatus, а также мутантов Rba. sphaeroides с внедрёнными nifHDK и draT/G генами из Rba. capsulatus доказано, что эффект выключения нитрогеназы аммонием и АДФ-рибозилирование Fe-белка нитрогеназы являются двумя независимыми следствиями действия аммония.

Обнаружено, что скорость выделения водорода непрерывной суспензионной культурой Rba. capsulatus в ФБР понижена по сравнению с потенциально возможной, вследствие ингибирования процесса водородом и аммонием.

Практическаяценностьработы. Подобраны условия для фотообразования водорода в ФБР с непрерывной суспензионной культурой Rba. capsulatus с максимальной скоростью 97 мл ч-1 Лсуспензии-1 • При этом эффективность использования лактата для образования водорода составляла 2 9%.

Подобраны условия для фотообразования водорода непрерывными иммобилизованными культурами Rba. sphaeroides с максимальной скоростью 3800 мл ч-1 лмаТрИцЫ1, что превышает величины, известные из литературных данных. Максимальная эффективность преобразования лактата в водород в этом процессе достигала 7 9%.

Показана возможность совмещения процессов фотообразования водорода и очистки сточных вод молокоперерабатывающего завода от органического соединения (лактата) в ФБР с иммобилизованными клетками Rhodospirillum fulvum.

Показана способность широкого круга фотосинтезирующих микроорганизмов к иммобилизации на поверхности пористого стекла с целью дальнейшего использования их в системах биотехнологического преобразования солнечной энергии в ценные продукты. Кроме того, показана возможность иммобилизации Rba. sphaeroides на более дешёвой, чем пористое стекло, матрице -пенополиуретане (поролоне).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2ом всероссийском съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), 2ой, 3й и 5ой городских конференциях молодых учёных (Пущино, 1997; 1998; 2001), международной конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части (описание объектов и методов исследований), результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 187 наименований. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 7 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Федоров, Александр Сергеевич

выводы

1. Выявлены основные параметры роста культуры, влияющие на эффект выключения нитрогеназы аммонием у клеток Rba. capsulatus В10: концентрация биомассы, степень лимитирования азотом, рН среды, длительность азотного голодания и доступность органического субстрата.

2. Показано, что Fe-белок нитрогеназы у Rba. sphaeroides 2R не подвергается АДФ-рибозилированию ни при импульсном добавлении аммония, ни при увеличении обеспеченности культур азотом в процессе роста. Это обусловлено неспособностью Rba. sphaeroides к синтезу DRAT/G системы, ответственной за АДФ-рибозилирование .

3. Доказано, что у Rba. capsulatus и Rba. sphaeroides выключение нитрогеназы аммонием не является следствием АДФ-рибозилирования Fe-белка.

4. Изучено влияние некоторых факторов на скорость фотообразования Н2 и эффективность преобразования лактата у хемостатных культур Rba. capsulatus В10. В оптимальных условиях стабильная скорость выделения Н2 достигала 97 мл ч-1 лСуспензии1л а. эффективность преобразования лактата в водород -29% .

5. Показано, что клетки Rba. sphaeroides GL-1, иммобилизованные на пористом стекле или пенополиуретане, способны к длительному образованию водорода (8 60 часов) с максимальной скоростью до 3800 мл ч-1 Лматрицы"1/- используя для этого лактат с эффективностью до 79%.

6. Показана возможность выделения водорода иммобилизованными культурами R. fulvum К5 при использовании сточных вод с удалением до 80% лактата.

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, доктору биологических наук Анатолию Анатольевичу Цыганкову за постоянную помощь и содействие в работе.

Глубоко признателен старшему научному сотруднику, кандидату биологических наук Татьяне Викториновне Лауринавичене, Вячеславу Евгениевичу Букатину и Юлии Васильевне Сениной за большое внимание к работе и всестороннюю помощь.

Искренне благодарю сотрудников лаборатории физиологии и биотехнологии фототрофных организмов и лаборатории биохимии и биотехнологии фототрофных микроорганизмов, под руководством профессора Ивана Николаевича Гоготова, за дружескую поддержку и содействие в работе.

Выражаю глубокую признательность моим близким за моральную поддержку и дружеское участие.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Федоров, Александр Сергеевич, 2002 год

1. Асатиани ВС (1969) Ферментные методы анализа. М.: Наука, 740с.

2. Гоготов ИН, Глинский ВП (1973) Сравнительное исследование азотфиксации у пурпурных бактерий. Микробиология 42:983-986.

3. Гоготов ИН, Зорин НА, Богоров JIB (1974) Метаболизм водорода и способность к азотфиксации у Thiocapsa roseopersicina. Микробиология. 43:5-10.

4. Зинченко ВВ (1999) Генетическая регуляция ассимиляции азота у фотосинтезирующих бактерий. Генетика 35:14 95-1510.

5. Кондратьева ЕН (1996) Автотрофные прокариоты. М.: Изд-во МГУ, 312 с.

6. Кондратьева ЕН, Малофеева ИВ (1972) Ассимиляция неорганических источников азота фототрофными бактериями. Биологические науки 12:87-98.

7. Лауринавичене ТВ, Васильева ЛГ, Цыганков АА, Гоготов ИН (1988) Пурпурная несерная бактерия Rhodobacter capsulatus, выделенная из почвы рисового поля южного Вьетнама. Микробиология 57:810815.

8. Львов НП (1983) Восстановление нитратов в растениях. В сб.: Молекулярные механизмы усвоения азота растениями. М: Наука, с.127-150.

9. Любимов ВИ, Львов НП, Кирштейне БЭ (1968) Модификация микродиффузионного метода определения аммиака. Прикл Биохим Микробиолог 4:120-121.

10. Серебрякова ЛТ, Тесля ЕА, Гоготов ИН, Кондратьева ЕН (1980) Нитрогеназная и гидрогеназная активности несерных пурпурныхбактерий Rhodopseudomonas capsulata и Rhodopseudomonas sphaeroides. Микробиология Т. XLIX, вып. 3:401-407.

11. Цыганков АА, Гоготов ИН (1990) Получение биомассы пурпурных несерных бактерий. Прикл. биох. и микробиол. 26:819-824.

12. Цыганков АА, Лауринавичене ТВ (1996) Зависимость роста и нитрогеназной активности от освещенности и рН у Rhodobacter capsulatus в присутствии и отсутствие Мо. Микробиология 65:499-504.

13. Цыганков АА, Лауринавичене ТВ, Гоготов ИН, Асада Я, Мияки Дж (1997) Влияние света на нитрогеназную активность хемостатных культур Rhodobacter capsulatus. Прикладная биохимия и микробиология 33:2 4-27.

14. Цыганков АА, Павлова ЕА, Гоготов ИН (1982) Активность некоторых ферментов, участвующих в метаболизме Н 2, у Rhodopseudomonas capsulata в зависимости от условий роста культур. Микробиология 51:188-192.

15. Якунин АФ, Цыганков АА, Трошина ОЮ, Гоготов ИН (1991) Рост и нитрогеназная активность непрерывных культур Rhodobacter capsulatus и Rhodobacter sphaeroides в зависимости от наличия в среде Mo, W и V. Микробиология 60:41-46.

16. Alef К, Arp DJ, and Zumft WG (1981) Nitrogenase switch-off by ammonia in Rhodopseudomonas palustris: loss under nitrogen deficiency and independence from the adenylation state of glutamine synthetase. Arch Microbiol 130:138-142.

17. Alef К and Kleiner D (1982) Regulatory aspects of inorganic nitrogen metabolism in the Rhodospirillaceae. Arch Microbiol 133:239-241.

18. Armengaud J, Meyer Ch, and Jouanneau Y (1994) Recombinant expression of the fdxD gene of Rhodobacter capsulatus and characterization of its product, a 2Fe-2S. ferredoxin. Biochem J 300:413-418.

19. Bishop PE and Premakumar R (1992) Alternative nitrogen fixation systems. In Biological nitrogen fixation, eds. Stacey G, Burris GH and Evans EJ, pp. 736-762, Chapan and Hall, New York.

20. Bolliger R, Zurrer H, and Bachofen R (1985) Photoproduction of molecular hydrogen from waste water of a sugar refinery by photosynthetic bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 23:147-151.

21. Bolton JR (1996) Solar photoproduction of hydrogen. Solar1. Energy 57:37-50.

22. Buck M, Gallegos MT, Studholme DJ, Guo Y, and Gralla JD (2000) The bacterial enhancer-dependent a54 (aN) transcription factor. J Bacterid 182:4129-4136.

23. Burris RH (1975) The acetylene reduction techniques. In Nitrogen fixation by free-living micro-organisms, ed. Stewart WDP, pp. 249-57, Cambridge Univ Press, Cambridge.

24. Burris RH (1991) Nitrogenases. J Biol Chem 266:9339-9342.

25. Cejudo FJ and Paneque A (1988) Effect of nitrogen starvation on ammonium-inhibition of nitrogenase activity in Azotobacter chroococcum. Arch Microbiol 149:481-484.

26. Cejudo FJ, de la Torre A, and Paneque A (1984) Short-term ammonium inhibition of nitrogen fixation in Azotobacter. Biochem Biophys Res Commun 123:431-437.

27. Chan JM, Wu W, Dean DR, and Seefeldt LC (2000) Construction and characterization of a heterodimeric iron protein: Defining roles for adenosine triphosphate in nitrogenase catalysis. Biochem 39:7221-7228.

28. Chatterjee R, Allen RM, Ludden PW, and Shah VK (1997a) In vitro synthesis of the iron-molybdenum cofactor and maturation of the niif-encoded apodinitrogenase. J Biol Chem 272:2160421608.

29. Chatterjee R, Ludden PW, and Shah VK (1997bJ Characterization of VNFG, the □ subunit of the vnf-encoded apodinitrogenase from Azotobacter vinelandii. Implications for its role in the formation of functional dinitrogenase 2. J Biol Chem 272:3758-3765.

30. Cheng J, Johansson M, and Nordlund S (1999) Expression of Pii and glutamine synthetase is regulated by Pn, the ntrBC,and processing of the glnBA mRNA in Rhodospirillum rubrum. J Bacterid 181:6530-6534.

31. Choudhary M, Mackenzie C, Mouncey NJ, and Kaplan S (1999) Rs-GDB, the Rhodobacter sphaeroides genome database. Nucleic Acids Res 27:61-62.

32. Chrestiansen J, Cash VL, Seefeldt LC, and Dean DR (2000a) Isolation and characterization of an acetilene-resistant nitrogemase. J Biol Chem 275:11459-11464.

33. Chrestiansen J, Seefeldt LC, and Dean DR (2000b) Competitive substrate and inhibitor interactions at the physiologically relevant active site of nitrogenase. J Biol Chem 275:36104-36107.

34. Clayton RK (1966) Spectroscopic analysis of bacteriochlorophylls in vitro and in vivo. Photochem Photobiol 5:669-677.

35. Cordts ML, and Gibson J (1987) Ammonium and methylammonium transport in Rhodobacter sphaeroides. J Bacterid 169:16321638 .

36. Cullen PJ, Bowman WC, Hartnett DF, Reilly SC, and Kranz RG (1998) Translational activation by an NtrC enhancer-binding protein. J Mol Biol 278:903-914.

37. Cullen PJ, Bowman WC, and Kranz RG (1996) In vitro reconstitution and characterization of the Rhodobacter capsulatus NtrB and NtrC two-component system. J Biol Chem 271:6530-6536.

38. Davis R, Lehman L, Petrovich R, Shah VK, Roberts GP, and Ludden PW (1996) Purification and characterization of the alternative nitrogenase from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum. J Bacteriol 187:1445-1450.

39. Dean DR, Bolin JT and Zheng L (1993) Nitrogenase metalloclusters: Structures, organization, and synthesis. J Bacteriol 175:6737-6744.

40. Dilworth MJ, Eady RR, Robson RL, and Miller RW (1987) Ethane fotmation from acetylene as a potential let for vanadium nitrogenase. Nature 327:167-168.

41. Durner J, Bohm I, Hilz H, and Boger P (1994) Posttranslational modification of nitrogenase. Differences between the purple bacterium Rhodospirilium rubrum and the cyanobacterium Anabaena variabilis. Eur J Biochem 220:125-130.

42. Eady RR (1996) Structure-function relationships of alternative nitrogenases. Chem Rev 96:3013-3030.

43. Eroglu I, Asian K, Gunduz U, Yucel M, and Turker L (1998) Continuous hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. In Biohydrogen, ed. Zaborsky OR, pp. 143-149, Plenum Press, New York.

44. Fascetti E and Toddini О (1995) Rhodobacter sphaeroides RV cultivation and hydrogen production in a one- and two-stage chemostat. Appl Microbiol Biotechnol 22:300-305.

45. Fibler J, Schirra C, Kohring G-W, Giffhorn F (1994) Hydrogen production from aromatic acids by Rhodopseudomonas palustris. Appl Microbiol Biotechnol 41:395-399.

46. Francou N and Vignais (1984) Hydrogen production by Rhodopseudomonas capsulata cells entrapped in carrageenan beads. Biotechnol Lett 6:639-644.

47. Fu H-A, Wirt HJ, Burris RH, and Roberts GP (1989) Functional expression of a Rhodospirilium rubrum gene encoding dinitrogenase reductase ADP-ribosyltrasferase in enteric bacteria. Gene 85:153-160.

48. Fu H-A, Burris RH, and Roberts GP' (1990) Reversible ADP-ribosylation is demonstrated to be a regulatory mechanism .in prokaryotes by heterologous expression. Proc Natl Acad Sci USA 87:1720-1724.

49. Gallon JR, Cheng J, Dougherty LJ, Gallon VA, Hilz H, Pederson DM, Richards HM, Ruggeberg S, and Smith ChJ (2000) A novel covalent modification of nitrogenase in a cyanobacterium. FEBS Lett 468:231-233.

50. Haaker H, Laane С, Hellingwerf К, Houwer В, Konings WN, and Veeger С (1982) Short-term regulation of the nitrogenase activity in Rhodopseudomonas sphaeroides. Eur J Biochem 127:639-645.

51. Halbleib CM and Ludden PW (1999) Characterization of the interaction of dinitrogenase reductase-activating glycohydrolase from Rhodospirillum rubrum with bacterial membranes. Arch Microbiol 172:51-58.

52. Halbleib CM and Ludden PW (2000) Regulation of biological nitrogen fixation. J Nutr 130:1081-1084.

53. Hansen ТА and van Gemerden H (1972) Sulfide utilization by purple non-sulfur bacte ria. Arch Microbiol 86:49—56.

54. Hausinger RP and Howard J (1983) Thiol reactivity of the nitrogenase Fe-protein from Azotobacter vinelandii. J Biol Chem 258:13486-13492.

55. Herrero A, Muro-Pastor AM, and Flores E (2001) Nitrogen control in cyanobacteria. J Bacterid 183:411-425.

56. Hillmer P and Gest H (1977) H2-metabolism in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata: H2 production by growing cultures. J Bacterid 129:724-731.

57. Howard JB and Rees DC (1996) Structural basis of biological nitrogen fixation. Chem Rev 96:2965-2 982.

58. Huang JF, Wang DY, Dong ZG, Wang ZP, Zhang HF, Lu YB, Xu XM, Zhao Y (2001) Purification and characteristics of Mn-containing nitrogenase component I. Acta Bot Sin 43:918-922.

59. Hwang JC, Chen CH, and Burris RH (1973) Inhibition of nitrogenase-catalyzed reactions. Biochem Biophys Acta 292:256• 270.

60. Imhoff JF (1995) Taxonomy and physiology of phototrophic purple bacteria and green sulfur bacteria. In Anoxygenic photosynthetic bacteria, eds. Blankenship RE, Madigan MT and Bauer CE, pp. 1-15, Kluwer Acad Publ, Dordrecht, the Netherland.

61. Jeong H-S and Jouannau Y (2000) Enhanced nitrogenase activity in strains of Rhodobacter capsulatus that overexpress the rnf genes. J Bacteriol 182:1208-1214.

62. Jiang P and Ninfa AJ (1999) Regulation of autophosphorylation of Escherichia coli nitrogen regulator II by the Pn signal transduction protein. J Bacteriol 181:19061911.

63. Joerger RD and Bishop PE (1988) Bacterial alternative nitrogen fixation systems. Crit Rev Microbiol 16:1-14.

64. Joerger RD, Jacobson MR, Premakumar R, Wolfinger ED, and Bishop PE (1989) Nucleotide sequence and mutational analysis of the structural genes (anfHDGK) for the second alternative nitrogenase from Azotobacter vinelandii. J Bacterid 171:10751086.

65. Joerger RD, Loveless TM, Pau RN, Mitchenall LA, Simon BH,' and Bishop PE (1990) Nucleotide sequence and mutational analysis of the structural genes for nitrogenase 2 of Azotobacter vinelandii. J Bacterid 172:3400-3408.

66. Johansson M and Nordlund S (1997) Uridylylation of the PII protein in the photosynthetic bacterium Rhodospirilium rubrum. J Bacterid 179:4190-4194.

67. Johansson M and Nordlund S (1999) Purification of Pn and Pn-UMP and in vitro studies of regulation of glutamine synthetase in Rhodospir ilium rubrum. J Bacterid 181:65246529.

68. Jouanneau Y, Meyer Ch, Asso M, Guigliarelli B, and Willison JC (2000) Characterization of a nif-regulated flavoprotein (FprA) from Rhodobacter capsulatus. Redox properties and molecular interaction with a 2Fe-2S. ferredoxin. Eur J Biochem 267:780-787.

69. Jouanneau Y, Roby C, Meyer ChM, and Vignais PM (1989) ADP-ribosylation of dinitrogenase reductase in Rhodobacter capsulatus. Biochem 28:6524-6530.

70. Kamberov ES, Atkinson MR, and Ninfa AJ (1995) The Escherichia coli Pn signal transduction protein is activated upon binding 2-ketoglutarate and ATP. J Biol Chem 270:1779717807 .

71. Kaplan S (2002) http://www-mmg.med.uth.tmc.edu/sphaeroides/

72. Kawaguchi H, Hashimoto K, Hirata K, and Miyamoto К (2001) H2 production from algal biomass by a mixed culture of Rhodobium marinum A-501 and Lactobacillus amylovorus. J Biosci Bioeng 91:277-282.

73. Kern M, Kamp PB, Paschen A, Masepohl B, and Klipp W (1998) Evidence for a regulatory link of nitrogen fixation and photosynthesis in Rhodobacter capsulatus via HvrA. J Bacteriol 180:1965-1969.

74. Kern M, Klipp W, and Klemme J-H (1994) Increased nitrogenase-dependent H2 photoproduction by hup mutants of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol 60:1768-1774.

75. Kern M, Koch H-G, and Klemme J-H (1992) EDTA activation of H2 photoproduction by Rhodospirilium rubrum. Appl Microbiol Biotechnol 37:496-500.

76. Khanna S, Kelley CB, and Nicolas DJD (1980) The effect of carbon dioxide on nitrogenase-related activities of Rhodopseudomonas capsulata. J Gen Microbiol 119:281-284.

77. Khatipov E, Miyake M, Miyake J, and Asada Y (1998) Polyhydroxybutirate accumulation and hydrogen evolution by Rhodobacter sphaeroides as a function of nitrogenavailability. In Biohydrogen, ed. Zaborsky OR, pp. 157-161, Plenum Press, New York.

78. Kim J, Ito K, Izaki K, and Takahashi H (1987) Production of molecular hydrogen by a semi-continuous outdoor culture of Rhodopseudomonas sphaeroides. Agric Biol Chem 51:1173-1174.

79. Kim J and Rees DC (1992) Crystallographic structure and functional implication of the nitrogenase molybdenium-iron protein from Azotobacter vinelandii. Nature 360:553-560.

80. Kim J and Rees DC (1994) Nitrogenase and biological nitrogen fixation. Biochem 33:389-397.

81. Kleiner D (1981) The transport of NH3 and NH4+ across biological membranes. Biochem Biophys Acta 639:41-52.

82. Kleiner D (1982) Ammonium/methylammonium transport by Klebsiella pneumoniae. Biochem Biophys Acta 688:702-708.

83. Kleiner D (1985) Bacterial ammonium transport. FEMS Microbiol Rev 32:87-100.

84. Klugkist J, and Haaker H (1994) Inhibition of nitrogenase activity by ammonium chloride in Azotobacter vinelandii. J Bacteriol 157:148-151.

85. Kobayashi M and Kurata SI (1978) The mass culture and cell utilization of photosynthetic bacteria. Proc Biochem 13:27-30.

86. Kranz RG and Cullen PJ (1995) Regulation of nitrogen fixation genes. In Anoxygenic photosynthetic bacteria, eds. Blankenship RE, Madigan MT and Bauer CE, pp. 1191-1208, Kluwer Acad Publ, Dordrecht, the Netherland.

87. Kranz RG and Foster-Hartnett D (1990) Transcriptional regulation cascade of nitrogen-fixation genes in anoxygenic photosynthetic bacteria: oxygen- and nitrogen-responsive factors. Mol Microbiol 4:1793-1800.

88. Kush A, Elmerich C, and Aubert J-P (1985) Nitrogenase of Sesbania rhizobium ORS571: purification, properties and "switch-off" by ammonia. J Gen Microbiol 131:1765-1777.

89. Laemmli UK, and Favre M (1973) Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events. J Mol Biol 80:575599.

90. Lanzilotta WN and Seefeldt LC (1997) Changes in the midpoint potentials of the nitrogenase metal centers as a result of iron protein-molybdenum-iron protein complex formation. Biochem 36:12976-12983.

91. Lehman LJ and Roberts GP (1991) Identification of an alternative nitrogenase system in Rhodospirilium rubrum. J Bacterid 173:57 05-5711.

92. Lei Sh, Pulakat L, and Gavini (2000) Activation of vanadium nitrogenase expression in Azotobacter vinelandii DJ54 revertant in the presence of molybdenum. FEBS Let 482:149-153100. Lowry OH, Rosenbrough WJ, Farr AL, and Randall RJ (1951)

93. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193:265-275.

94. Ludden PW and Roberts GP (1989) Regulation of nitrogenase activity by reversible ADP ribosylation. Curr Top Cell Regul 30:23-56.

95. Ma Y and Ludden RW (2001) Role of the dinitrogenase reductase arginine 101 residue in dinitrogenase reductase ADP-ribosyltransferase binding, NAD binding, and cleavage. J Bacteriol 183:250-256.

96. Mack EE, Mandelco L, Woese CR, and Madigan MT (1993) Rhodospir ilium sodomense, sp. п., a Dead Sea Rhodospir ilium species. Arch Microbiol 160:363-367.

97. Madigan MT (1995) Microbiology of nitrogen fixation by anoxygenic photosynthetic bacteria. In Anoxygenicphotosynthetic bacteria, eds. Blankenship RE, Madigan MT and Bauer CE, pp. 915-928, Kluwer Acad Publ, Dordrecht, the Netherland.

98. Madigan MT, Cox SS, and Gest H (1984) Nitrogen fixation and nitrogenase activity in members of the family Rhodospirillaceae. J Bacteriol 157:73-78.

99. Masepohl В and Klipp W (1996) Organization and regulation of genes encoding the molybdenum nitrogenase and the alternative nitrogenase in Rhodobacter capsulatus. Arch Microbiol 165:80-90.

100. Masepohl B, Klipp W, and Puhler A (1988) Genetic characterization and sequence analysis of the duplicated nifA/nifB gene region of Rhodobacter capsulatus. Mol Gen Genet 212:27-37.

101. Masepohl B, Krey R, and Klipp W (1993b) The draTG gene region of Rhodobacter capsulatus is required for post-translation regulation of both the molybdenum and the alternative nitrogenase. J Gen Microbiol 139:2 667-2 67 5.

102. Matin A, and Gottschal JC (1976) Influence of dilution rate on NAD(P) and NAD(P)H concentrations and ratios in a

103. Pseudomonas sp. grown in continuous culture. J Gen Microbiol 94:333-341.

104. Meijer WG and Tabita FR (1992) Isolation and characterization of the nifUSVW-rpoN gene cluster from Rhodobacter sphaeroides. J Bacteriol 174:3855-38 66.

105. Merrick MJ (1992) Regulation of nitrogen fixation genes in free-living and symbiotic bacteria. In Biological nitrogen fixation, eds. Stacey G, Burris RH, and Evans HJ, pp. 835-876, Chapman and Hall, New York.

106. Miyake J (1994) Photosynthetic bacteria for solar energy conversion. In Proc 6th Eur Cong Biotechnol, eds. Alberghina L, Frontali L, and Sensi P, pp. 1019-1025, Elsevier Science B.V.

107. Miyake (1998) The science of biohydrogen. In Biohydrogen, ed. Zaborsky OR, pp. 7-18, Plenum Press, New York.

108. Miyake J and Kawamura S (1987) Efficiency of light energy conversion to hydrogen by the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. Int J Hydrogen Energy 12:147-14 9.

109. Miyake J, Tomizuka N, and Kawamura S (1982) Effect of glutamate on the production of hydrogen by Rhodospirillum rubrum. Rep Ferment Res Inst 58: 25-31.

110. Muallem A, Bruce D, and Hall DO (1983) Photoproduction of H2 and NADPH2 by polyurethane-immobilized cyanobacteria. Biotechnol Lett 5:365-368.

111. Noren A and Nordlund S (1994) Changes in the NAD(P) concentration caused by addition of nitrogenase 4 switch-off" effectors in Rhodospirillum rubrum G-9, as measured by fluorescence. FEBS Lett 356:43-45.

112. Noren A, Soliman A, and Nordlund S (1997) The role of NAD+ as a signal during nitrogenase switch-off in Rhodospirillum rubrum. Biochem J 322:829-832.

113. Oelze J and Klein G (1996) Control of nitrogen fixation by oxygen in purple nonsulfur bacteria. Arch Microbiol 165:219225,

114. Ormerod JG, Ormerod SK, Gest H (1961) Light-dependent utilization of organic compounds and photoproduction of molecular hydrogen by photosynthetic bacteria: relationship with nitrogen metabolism. Arch Biochem Biophys 64:449-463.

115. Perego P, Fabiano B, Ponzano GP, and Palazzi E (1998) Experimental study of hydrogen kinetics from agroindustrial by-product: optimal conditions for production and fuel cell feeding. Bioproc Eng 19:205-211.

116. Pierrard J, Ludden PW, and Roberts GP (1993) Posttranslational regulation of nitrogenase in Rhodobacter capsulatus: existence of two independent regulatory effects of ammonium. J Bacterid 175:1358-1366.

117. Planchard A, Mignot L, Jouenne T, and Junter G-A (1989) Photoproduction of molecular hydrogen by Rhodospirillum rubrum immobilized in composite agar layer/microporous membrane structures. Appl Microbiol Biotechnol 31:49-54.

118. Pope MR, Murrel SA, and Ludden PW (1985) Covalent modification of the iron protein of nitrogenase from Rhodospirillum rubrum by adenosine diphosphoribosylation of a specifis arginine residue. PNAS 82:317 3-317 7.

119. Qian Y and Tabita FR (1998) Expression of glnB and a glnB-like gene (glnK) in a ribulose biphosphate carboxylase/oxygenase-deficient mutant of Rhodobacter sphaeroides. J Bacteriol 180:4 64 4-4 64 9.

120. Rangaraj P, Shah VK, Ludden PW (1997) ApoNifH functions in iron-molybdenum cofactor synthesis and apodinitrogenase maturation. Proc Natl Acad Sci USA 94:11250-11255.

121. Rao KK and Hall DO (1996) Hydrogen production by cyanobacteria: potential, problems and prospects. J Mar Biotechnol 4:10-15.

122. Rees DC and Howard JB (2000) Nitrogenase: standing at the crossroads. Cur Opin Chem Biol 4:559-566.

123. Ribbe MW, Bursey EH, and Burgess BK (2000) Identification of an Fe protein residue (Glu-146) of Azotobacter vinelandii nitrogenase that is specially involved in FeMo cofactor insertion. J Biol Chem 275:17 631-17 638.

124. Robson RL, Eady RR, Richardson TH, Miller RW, Hawkins M, and Postgate JR (1986) The alternative nitrogenase of

125. Azotobacter chroococcum is a vanadium enzyme. Nature (London) 322:388-390.

126. Rodionov VV, Lebedeva NV, and Kondratieva EN (1986) Ammonia inhibition of nitrogenase activity in purple and green bacteria. Arch Microbiol 143:345-347.

127. Sasaki К (1998) Hydrogen and 5-aminolevulinic acid production by photosynthetic bacteria. In Biohydrogen, ed. Zaborsky OR, pp. 133-142Plenum Press, New York.

128. Sasaki К, Tanaka T, Nishizawa Y, and Hayashi M (1990) Production of a herbicide, 5-aminolevulenic acid, by Rhodobacter sphaeroides using the effluent of swine waste from an anaerobic digestor. Appl Microbiol Biotechnol 32:727-731.

129. Sasikala K, and Ramana ChV (1991) Photoproduction of hydrogen from waste water of a lactic acid fermentation plant by a purple non-sulfur photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. Indian J Exp Biol 29:74-75.

130. Sasikala K, and Ramana ChV (1995) Biotechnological potentials of anoxigenic phototrophic bacteria. II. Biopolyesters, biopesticide, biofuel, and biofertilizer. Adv Appl Microbiol 41:227-278.

131. Sasikala К, Ramana ChV, Rao PR (1992) Photoproduction of hydrogen from the waste water of a distillery by Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. Int J Hydrogen Energy 17:23-27.

132. Sasikala K, Ramana ChV, Rao PR, and Kovacs KL (1993) Anoxygenic phototrophic bacteria:physiology and advances in hydrogen production technology. Adv Appl Microbiol 38:211-295.

133. Sasikala K, Ramana ChV, Rao PR, and Subrahmanyam M (1990) Effect of gas phase on the photoproduction of hydrogen and substrate conversion efficiency in the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. Int J Hydrogen Energy 115:795-797.

134. Schlindelin H, Kisker C, Schlessman JL, Howard JB and Rees DC (1997) Structure of ADP •AlF4~-stabilized nitrogenase complex and its implications for signal transduction. Nature 387:370-376.

135. Schneider K, Gollan U, Drottboom M, Selsemeier-Voigt S, and Muller A (1997) Comparative biochemical characterization of the iron-only nitrogenase and the molybdenum nitrogenase from Rhodobacter capsulatus. Eur J Biochem 244:789-800.

136. Seefeldt LC and Dean DR (1997) Role of nucleotides in nitrogenase catalysis. Acc Chem Res 30:260-266.

137. Seefeldt LC, Rasche ME, and Ensing SA (1995) Carbonyl sulfide and carbon dioxide as new substrates, and carbon-disulfide as a new inhibitor, of nitrogenase. Biochem 34:53825389.

138. Shah VK, Allen JR, Spangler NJ, and Ludden PW (1994) In vitro Synthesis of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. Purification and characterization of NifB cofactor, the product of NIFB protein. J Biol Chem 269:11541158 .

139. Sharak Genthner BR, and Wall JD (1985) Ammonium uptake in Rhodopseudomonas capsulata. Arch Microbiol 141:219-224.

140. Shen J, Dean DR, and Newton WE (1997) Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered of Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein. Biochem 36:4884-4894.

141. Soliman A and Nordlund S (1992) Studies on the effect of NAD(H) on nitrogenase activity in Rhodospirilium rubrum. Arch Microbiol 157:431-435.

142. Stackebrandt E, Rainey FA, Ward-Rainey N (1996) Anoxygenic phototrophy across the phylogenetic spectrum: current understanding and future perspectives. Arch Microbiol 166:211223.

143. Sweet WJ and Burris RH (1981) Inhibition of nitrogenase activity by NH4+ in Rhodospirilium rubrum. J Bacteriol 145:824831.

144. Tauguchi F, Chang JD, Takiguchi S, and Morimoto M (1992) Efficient hydrogen production from starch by a bacterium isolated from termites. J Ferment Bioeng 73:244-245.

145. Thomas G, Coutts G, and Merrick M (2000) The glnKamtB operon: a conserved gene pair in prokaryotes. Trends Genet. 16:11-14.

146. Thorneley RN and Lowe DJ (1983) Nitrogenase of Klebsiella pneumoniae. Kinetics of the dissociation of oxidized iron protein from molybdenum-iron protein: identification of the rate-limiting step for substrate reduction. Biochem J 215:393403.

147. Tsygankov AA, Hirata Y, Asada Y, and Miyake J (1993) Immobilization of the purple non-sulfur bacterium Rhodobacter sphaeroides on glass surfaces. Biotechnol Techn 7:283-286.

148. Tsygankov AA, Hirata Y, Miyake M, Asada Y, and Miyake J (1994a) Photobioreactor with photosynthetic bacteria immobilized on porous glass for hydrogen photoproduction. J Ferment Bioeng 77:575-578.

149. Tsygankov AA, and Laurinavichene TV (1996) Influence of the degree and mode of light limitation on growth characteristics of the Rhodobacter capsulatus continuous cultures. Biotechnol Bioeng 51:605-612.

150. Tsygankov AA, Laurinavichene TV, and Gogotov IN (1994b) Laboratory scale photobioreactor. Biotechnol Tech 8:575-578.

151. Vincenzini M, Materassi R, Sili C, and Florenzano G (1986) Hydrogen production by immobilized cells. Ill Prolonged and stable H2 photoevolution by Rhodopseudomonas palustris in light-dark cycles. Int J Hydrogen Energy 11:623-626.

152. Vrati S (1984) Single cell protein production by photosynthetic bacteria grown on the clarified effuents of biogas plant. Appl Microbiol Biotechnol 19:199-202.

153. Wang G, Angermuller S, and Klipp W (1993) Characterization of Rhodobacter capsulatus genes encoding a molybdenumtransport system and putative molybdenum-pterin-binding proteins. J Bacteriol 175:3031-3042.

154. Warthmann R, Pfenning N, and Cypionka H (1993) The quantum requirements for H2 production by anoxygenic phototrophic bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 39:358-362.

155. Waugh SI, Paulsen DM, Mylona PhV, Maynard RH, Premakumar R, and Bishop PE (1995) The genes encoding the delta subunits of dinitrogenases 2 and 3 are required for Mo-independent diazotrophic growth by Azotobacter vinelandii. J Bacteriol 177:1505-1510.

156. Wesch R, and Klemme J-H (1980) Catalytic and molecular differences between assimilatory nitrate reductases isolated from strains of Rhodopseudomonas capsulata. FEMS Microbiol Lett 8:37-41.

157. Willison JC (1993) Biochemical genetics revisited: The use of mutants to study carbon and nitrogen metabolism in the photosynthetic bacteria. FEMS Microbiol Rev 104:1-38.

158. Xu P, Qian XM, Wang YX, and Xu YB (1996) Modelling for waste water treatment by Rhodopseudomonas palustris Y6 immobilized on fibre in a columnar bioreactor. Appl Microbiol Biotechnol 44:676-682.

159. Yakunin AF and Hallenbeck PC (1998a) Short-term regulation of nitrogenase activity by NH4+ in Rhodobacter capsulatus: multiple in vivo nitrogenase responses to NH4+ addition. J Bacteriol 180:6392-6395.

160. Yakunin AF and Hallenbeck PC. (1998b) A luminol/iodophenol chemiluminescent detection system for Western immunoblots. Anal Biochem 258:146-149.

161. Yakunin AF and Hallenbeck PC (2002) AmtB is necessary for NH4+-induced nitrogenase switch-off and ADP-ribosylation in Rhodobacter capsulatus. J Bacterid 184:4081-4088.

162. Yakunin AF, Laurinavichene TV, Tsygankov AA, and Hallenbeck PC (1999) The presence of ADP-ribosylated Fe protein of nitrogenase in Rhodobacter capsulatus is correlated with cellular nitrogen status. J Bacterid 181:1994-2000.

163. Yamada A, Hatano T, and Matsunaga T (1998) Convertion efficiencies of light energy to hydrogen by a novel Rhodovulum sp. And its uptake-hydrogenase mutant. In Biohydrogen, ed. Zaborsky OR, pp. 167-171, Plenum Press, New York.

164. Yates MG (1992) The enzymology of molybdenum-dependent nitrogen fixation. In Biological nitrogen fixation, eds. Stacey G, Burris GH and Evans EJ, pp. 685-735, Chapan and Hall, New York.

165. Yoch DC, Li J, Hu C-Z, and Scholin С (1988) Ammonia switch-off of nitrogenase from Rhodobacter sphaeroides and Methylosinus trichosporium: no evidence Fe-protein modification. Arch Microbiol 150:1-5.

166. Zhang Y, Burris RH, Ludden PW, and Roberts GP (1996) Presence of a second mechanism for the posttranslational regulation of nitrogenase activity in Azospirillum brasilense in response to ammonium. J Bacterid 178:2948-2953.

167. Zhang Y, Cummings AD, Burris RH, Ludden PW, and Roberts GP (1995) Effect of an ntrBC mutation on the posttranslational regulation of nitrogenase activity in Rhodospirilium rubrum. J Bacterid 177:5322-532 6.

168. Zhang Y, Pohlmann EL, Ludden PW, and Roberts GP (2000) Mutagenesis and functional characterization of the glnB, glnA, and nifA genes from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum. J Bacteriol 182:983-992.

169. Zhang Y, Pohlmann EL, Ludden PW, and Roberts GP (2001b) Functional characterization of three GlnB homologs in the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum: roles in sensing ammonium and energy status. J Bacteriol 183:6159-6168.

170. Zorin NA, Lissolo Th, Colbeau A, and Vignais PM (1996) Increased hydrogen photoproduction by Rhodobacter capsulatus strains deficient in uptake hydrogenase. J Mar Biotechnol 4:28-33.

171. Zumft WG and Castillo F (1978) Regulatory properties of the nitrogenase from Rhodopseudomonas palustris. Arch Microbiol 117:53-60.