Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: Фундаментальные и прикладные аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, доктор химических наук Гусаков, Александр Васильевич

• Гусаков, Александр Васильевич
• доктор химических наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор химических наук Гусаков, Александр Васильевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОМАССЫ.

1.1. Строение и свойства целлюлозы как главного компонента растительной биомассы.

1.2. Другие полисахариды растений и лигнин.

1.2.1. Гемицеллюлозы.

1.2.2. Пектины и Р-глюканы.

1.2.3. Лигнин.

ГЛАВА 2. ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ФЕРМЕНТЫ.

2.1. Распространение и классификация р-1,4-глюканаз (целлюлаз и ксилоглюканаз).

2.2. Особенности молекулярного строения и механизм действия целлюлаз.

2.2.1. Бифункциональная организация молекул грибных целлюлаз.

2.2.2. Механизм действия целлюлазного комплекса.

2.3. Микроскопические грибы как продуценты целлюлолитических ферментов.

2.4. Свойства грибных целлюлаз.

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ.

3.1. Осахаривание лигноцеллюлозного сырья.

3.1.1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его предобработка.

3.1.2. Аппаратурное оформление процессов ферментативного гидролиза целлюлозы.

3.2. Ферментная обработка текстильных материалов.

3.3. Применение целлюлаз и сопутствующих им ферментов в сельском хозяйстве и пищевой промышленности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

4.1. Использованные ферменты.

4.2. Субстраты и реактивы.

4.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка.

4.4. Методы определения активности ферментов.

4.5. Использование окрашенной целлюлозы для исследования ингибирования целлюлаз продуктами реакции.

4.6. Методы выделения и очистки ферментов.

4.7. Определение адсорбционных характеристик ферментов.

4.8. Исследование термостабильности ферментов.

4.9. Исследование трансгликозилирования ЦБГ1.

4.10. Масс-спектрометрический анализ пептидов и белков.

4.11. Анализ молекулярно-массового распределения продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.

4.12. Исследование кинетики ферментативного гидролиза целлюлозы в ячейках с перемешиванием и в реакторах различного типа.

4.13. Численные методы решения дифференциальных уравнений и определения кинетических параметров.

4.14. Методы иммобилизации р-глюкозидазы и использование иммобилизованного фермента.

4.15. Оценка способности целлюлаз к биодепигментации джинсовой ткани.

4.16. Определение индекса ресорбции индиго.

4.17. Исследование взаимодействия индиго с аминокислотами и белками.

4.18. Оценка способности ферментов к биоотварке («биоскорингу») суровой хлопчатобумажной ткани.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 5. ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЙ КОМПЛЕКС ГРИБА CHRYSOSPORIUM LUCKNOWENSE.

5.1. Общая характеристика ферментного комплекса С. lucknowense.

5.2. Субстратная специфичность, классификация и свойства эндоглюканаз и целлобиогидролаз.

5.3. Целлобиогидролазы 1а и lb (Се17А и Се17В) из 7-й семьи гликозид-гидролаз.

5.3.1. ЦБГ 1а (Се17А): аминокислотная последовательность, молекулярные

I характеристики, кинетика действия и свойства разных форм фермента.

5.3.2. ЦБГ lb (Се17В): пептидный «фингерпринт» фермента и гомология с другими целлюлазами.

5.4. Целлобиогидролазы На и lib (Се16А и Се16В) из 6-й семьи гликозид-гидролаз.

5.4.1. Аминокислотная последовательность и особенности молекулярного строения ЦБГ На (Се16А).

5.4.2. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ЦБГ lib (Се16В) и гомология с другими целлюлазами.

5.5. Низкомолекулярные эндоглюканазы ЭГIII (Се112А) и ЭГ V (Се145А): аминокислотные последовательности, гомология и моделирование трехмерных структур.

5.6. Масс-спектрометрический и пептидный анализ высокомолекулярных эндоглюканаз (Се15А, Се16С, Се17С).

5.7. Специфичные ксилоглюканазы С. lucknowense, Т. reesei и A.japonicus как представители нового класса гликозид-гидролаз.

5.7.1. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ксилоглюканаз.

5.7.2. Субстратная специфичность и основные свойства ксилоглюканаз.

5.7.3. Тип действия ксилоглюканаз на полимерные субстраты.

5.7.4. Кинетика гидролиза ксилоглюкана и состав конечных продуктов.

ГЛАВА 6. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТАМИ РЕАКЦИИ И ТРАНС-ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ПРИ КАТАЛИЗЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ.

6.1. Теоретический анализ ингибирования целлюлаз продуктами реакции: оценка влияния различных факторов.

6.2. Использование окрашенной целлюлозы для изучения ингибирования целлюлаз продуктами гидролиза.

6.3. Реакции трансгликозилирования, катализируемые целлобиогидролазой I из Т. longibrachiatum.

ГЛАВА 7. ПРИМЕНЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ.

7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз.

7.2. Математическое моделирование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы и оценка влияния различных факторов на кинетику процесса.

7.3. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторе с интенсивным массообменом на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора.

7.4. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторах с виброперемешиванием.

7.5. Применение иммобилизованной Р-глюкозидазы для обработки гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы.

ГЛАВА 8. ПРИМЕНЕНИЕ «ТОПОЛИТИЧЕСКИХ» ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ТЕКСТИЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ.

8.1. Сравнение осахаривающей и тополитической активности различных ферментных препаратов и очищенных индивидуальных целлюлаз.

8.2. Адсорбционная способность ферментов как основной фактор, влияющий на ресорбцию индиго в процессе биодепигментации джинсовой ткани.

8.3. Особенности молекулярного строения целлюлаз, определяющие эффективность их действия при ферментативной депигментации джинсовой ткани.

8.4. Эффективные ферментные препараты на основе ЭГ III P. verruculosum и ЭГ V С. lucknowense для депигментации джинсовых изделий.

8.4.1. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ III P. verruculosum.

8.4.2. Белковая инженерия ЭГ III P. verruculosum.

8.4.3. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ V С. lucknowense.

8.5. Биоотварка («биоскоринг») суровой хлопчатобумажной ткани с использованием препаратов целлюлаз.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: Фундаментальные и прикладные аспекты»

Современный этап развития физико-химической энзимологии имеет две характерные особенности. С одной стороны, происходит накопление и развитие фундаментальных знаний, осуществляется углубленное изучение механизма действия ферментов и ферментных систем, выявление характерных особенностей их функционирования. С другой стороны, активизируются усилия, направленные на поиск возможности использования биокатализаторов в различных областях технологии. Принципы биокатализа, биотрансформации веществ все более широко применяются для реализации новых биотехнологических процессов, решения насущных задач, связанных с переходом на новые источники сырья и энергии, для разработки прогрессивных методов утилизации отходов, а также для замены традиционных химических процессов на биокаталитические, которые протекают в более мягких условиях и гораздо более безопасны с точки зрения экологии.

Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы -самого распространенного биополимера на Земле, по праву занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. Поэтому не случайно, начиная с середины прошлого века, во многих странах мира стали проводиться исследования целлюлаз.

Резкое увеличение интенсивности подобных исследований произошло в 1970-е годы в США и странах Западной Европы из-за разразившегося энергетического кризиса, связанного с резким повышением цен на нефть и другие энергоносители

1]. Целлюлоза растительной биомассы представляет собой практически неисчерпаемый источник возобновляемого сырья, которое может быть конвертировано ферментативным путем в глюкозу. В свою очередь, глюкоза является незаменимым сырьем для микробиологических процессов получения жидких и газообразных видов топлива (этанола, бутанола, этилена и др.), органических и аминокислот, кормового белка и многих других полезных продуктов микробиологического синтеза. Общие запасы на Земном шаре возобновляемого сырья, представляющего собой растительную биомассу, оцениваются в 800-1000

11 млрд. т, причем ежегодно в результате фиксации 10 кал солнечной энергии образуется примерно 50 млрд. т биомассы, а также накапливается 4-5 млрд. т отходов или вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растений и древесины [1,2]. Таким образом, в будущем растительная биомасса может играть ту роль, которая в настоящее время принадлежит нефти.

Прогрессирующий дефицит невозобновляемых источников энергии и материалов наблюдается и в настоящее время. В последние годы интерес к биоэтанолу и другим видам топлива из лигноцеллюлозного сырья вновь резко повысился из-за дальнейшего роста цен на нефть, а также в связи с Киотским соглашением 1997 г., направленным на снижение выброса в атмосферу газов, вызывающих парниковый эффект. В отличие от ископаемых видов топлива, биоэтанол и другие виды топлива из возобновляемого растительного сырья не приводят к накоплению углекислого газа в атмосфере, т.к. он вновь превращается в кислород в процессе фотосинтеза, осуществляемого растениями (т.е. происходит круговорот СО2/О2 при параллельном возобновлении целлюлозы и других компонентов растительной биомассы).

Таким образом, помимо фундаментальных исследований в области целлюлолитических ферментов, направленных на выяснение биохимических и # физико-химических закономерностей биодеградации целлюлозы в природе, механизмов действия грибных и бактериальных ферментов, в последние 30 лет наиболее активно развивались прикладные исследования в области ферментативного гидролиза целлюлозы, а также разработки, направленные на поиск и получение новых штаммов - суперпродуцентов целлюлаз. При этом основные усилия были направлены на поиск и изучение ферментов, способных наиболее эффективно и полно разрушать целлюлозу до растворимых Сахаров и в итоге - до мономера (глюкозы).

С конца 1980-х годов целлюлазы стали активно применяться для обработки текстильных изделий и материалов [3,4]. Первым таким процессом стала ферментная обработка джинсовых изделий, приводящая к частичному удалению красителя с поверхности ткани, в результате которой изделия приобретают внешний вид «вареных джинсов». В течение нескольких лет ферменты практически заменили пемзу и химические агенты, применявшиеся для этой цели ранее. Позднее целлюлазы стали широко использоваться для биополировки трикотажа и изделий на основе хлопчатобумажных и смесовых тканей. В результате такой обработки с поверхности материала удаляются ворсинки и неровности, в результате чего материал становится более гладким, приятным на ощупь, и после серии стирок на нем не происходит образования «катышков» (пилей), что повышает потребительские свойства изделий. Наконец, в последние годы стало развиваться направление применения целлюлаз (совместно с пектиназами) для биоотварки («биоскоринга») суровых хлопчатобумажных тканей с целью увеличения смачиваемости целлюлозных волокон, что облегчает окрашивание материала на последующих стадиях технологического процесса. Такая обработка является необходимой стадией в текстильной промышленности, однако в течение многих столетий отварка производится в горячем растворе щелочи, приводя к быстрой коррозии оборудования и вредным выбросам в окружающую среду.

В последнее десятилетие целлюлазы также стали активно использоваться в качестве добавок к детергентам и моющим средствам [3,4] для того, чтобы воздействуя при стирке на текстильные материалы, содержащие в своем составе целлюлозные волокна, облегчить удаление грязей за счет гидролиза части поверхностных волокон и предотвратить образование пилей.

В отличие от ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, где ферменты должны обладать максимальной «агрессивностью» по отношению к полимерному субстрату (высокой сахаролитической активностью), в процессах биообработки текстиля (в том числе, при стирке современными моющими средствами) требуются целлюлазы, способные мягко воздействовать на поверхность волокон, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы, т. е. так называемые «тополитические» ферменты.

Среди других областей применения целлюлолитических ферментов следует отметить их использование в качестве добавок к кормам животных и птиц для разрушения некрахмальных полисахаридов [3,4]. В данном случае, как правило, используются мультиферментные препараты, содержащие широкий спектр карбогидраз, т.е. не только целлюлазы, но и ксиланазы, Р-глюканазы, пектиназы. Например, добавка таких препаратов в составе премиксов к комбикормам в птицеводстве позволяет не только повысить их усвояемость, но и использовать кормовые диеты на основе таких трудноусвояемых видов злаков, как рожь и ячмень.

Специфика применения целлюлолитических ферментов в новых технологиях часто требует, чтобы ферменты обладали высокой активностью не только в кислой среде (при рН 4-5), что типично для грибных целлюлаз, но также и в нейтральной и слабощелочной среде. Поэтому в последнее время различными научными и производственными коллективами ведется интенсивный поиск нейтральных и щелочных целлюлаз.

Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Т. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatum) играют ведущую роль [3]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Препараты целлюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во многих странах ведущими компаниями -производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), Genencor International (США), Iogen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Rohm Gmbh (ФРГ), Meiji Seika Kaisha Ltd. и Shin Nihon Chemical Co. (Япония) и др. В последние годы в связи с бурным развитием «текстильного» направления целлюлаз некоторыми компаниями стали производиться ферментные препараты на основе других грибных продуцентов, оптимизированные для использования в конкретных биотехнологических процессах. Например, на основе грибного продуцента Humicola insolens фирмой Novozymes (Дания) производятся ферментные препараты серии Denimax для «биостонинга» джинсовых изделий. Для этой же цели выпускаются специальные ферментные препараты фирмой Meiji (Япония). В отличие от целлюлаз Trichoderma указанные ферменты функционируют в нейтральной области рН.

По оценкам зарубежных специалистов общий объем продаж промышленных ферментов на мировом рынке должен составить в 2005 г. от 1,7 до 2 млрд. долларов США, при этом доля целлюлаз может составить 15-20% [3,4].

В СССР в 1970-1980-е годы микробиологическая промышленность также производила в промышленных масштабах или в виде опытно-промышленных партий ферментные препараты целлюлаз - такие как Целловиридин ГЗх (Т. viride), Целлобранин ГЮх (Т. longibrachiatum), Целлолигнорин ШОх (Т. lignorum), Целлокандин ГЮх (Geotrichum candidum) и некоторые другие [5-7]. Несмотря на то, что по продуктивности секреции внеклеточного (целлюлолитического) белка и удельной целлюлазной активности указанные продуценты и ферментные препараты на их основе, как правило, уступали зарубежным аналогам, с точки зрения качества целлюлазного комплекса (т.е. набора целлюлаз с различной специфичностью) отечественные препараты мало чем от них отличались, а иногда обладали более интересными свойствами. К середине 1990-х годов из-за распада СССР и общего экономического кризиса производство ферментных препаратов на большинстве биохимических заводов стран СНГ прекратилось.

Начиная с конца 1980-х годов, в Лаборатории физико-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзим ологии МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН в рамках Государственной научно-технической программы «Новейшие направления биоинженерии» велись разработки, направленные на поиск новых перспективных продуцентов грибных целлюлаз, усовершенствование существующих штаммов микроорганизмов, повышение удельной активности секретируемых ферментных комплексов, а также использование препаратов целлюлаз для биоконверсии лигноцеллюлозного растительного сырья в различные полезные продукты. В 1991 г. на основе штамма Т. reesei 18.2КК на Приволжском биохимическом заводе при участии кафедры химической энзимологии МГУ было налажено производство ферментного препарата Целловиридин А (взамен менее продуктивного штамма Т. viride, на основе которого до этого производился Целловиридин ГЗх). Несмотря на то, что к середине 1990-х годов на Приволжском заводе производство данного ферментного препарата прекратилось, оно в дальнейшем было возобновлено на ряде биохимических заводов России и бывших республик СССР (препараты Целловиридин Г20х и Г2х). В течение последних 15 лет в ИБФМ РАН путем селекции и мутаногенеза были получены новые штаммы гриба Т. reesei TW-1 и TW-307 (отличающиеся повышенной секрецией целлюлаз), на основе которых были произведены ферментные препараты с улучшенной осахаривающей способностью при гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Были также получены новые промышленные штаммы гриба Penicillium verruculosum В40-221-6 и В40-221-151, дерепрессированные по глюкозе и способные секретировать на дешевых питательных средах до 40-50 г/л внеклеточного белка. Основным достоинством ферментных препаратов P. verruculosum по сравнению с целлюлазами Т. reesei является более сбалансированный состав целлюлазного комплекса, и, в частности, более высокий уровень Р-глюкозидазной активности, что, как будет показано в диссертационной работе, позволяет получать более высокий выход целевого продукта (глюкозы) при ферментативном гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Наконец, в результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз — гриб Chrysosporium lucknowense, на основе которого были получены новые штаммы (в частности, UV 18-25), отличающиеся крайне высокой секреторной способностью. По уровню секреции внеклеточного белка (50-80 г/л) С. lucknowense UV 18-25 не уступает, либо превосходит лучшие известные промышленные продуценты целлюлаз (например, различные штаммы Т. reesei). Серьезным преимуществом С. lucknowense также является то, что некоторые из целлюлаз данного продуцента обладают высокой активностью в нейтрально-щелочной среде, что делает данные ферменты перспективными для использования в ряде биотехнологических процессов (в частности, для обработки текстиля, а также для применения в моющих средствах).

Следует отметить, что к настоящему времени ферменты целлюлазного комплекса Т. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. За последние 50 лет опубликовано более тысячи статей, патентов и монографий, а также проведены десятки международных конференций, посвященных микробиологическим, биохимическим и биотехнологическим аспектам гриба Т. reesei (Т. viride), а также продуцируемых данным грибом целлюлаз. Тем не менее, полный геном Т. reesei до сих пор не расшифрован, и далеко не все карбогидразы данного гриба были выделены и охарактеризованы. В литературе имеется также немалое количество публикаций по целлюлазам, продуцируемым различными видами грибов рода Penicillium, однако сведения, касающиеся пеницилльных ферментов-карбогидраз (и целлюлаз в частности), весьма противоречивы. Что касается ферментов, продуцируемых грибом С. lucknowense и другими видами грибов рода Chrysosporium, то сведения по ним практически отсутствуют в научной литературе, а также в белковых и других базах данных.

Учитывая актуальность исследования целлюлазных комплексов, продуцируемых различными микроорганизмами, как главных разрушителей растительной биомассы в природе, а также принимая во внимание все более широкое применение целлюлолитических ферментов в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах, в данной работе были поставлены следующие задачи и цели:

• детально охарактеризовать внеклеточный целлюлазный комплекс, продуцируемый грибом С. lucknowense, включая выделение всех секретируемых эндоглюканаз и целлобиогидролаз, изучение их субстратной специфичности, основных биохимических и физико-химических свойств, а также получение информации по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов из данных белков), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения их принадлежности к той или иной семье гликози д-ги дрол аз; изучить закономерности трансгликозилирования и ингибирования продуктами реакции при катализе целлюлолитическими ферментами (как важных факторов, влияющих на эффективность гидролиза природных субстратов целлюлаз); провести сравнение осахаривающей способности широкого круга отечественных и зарубежных целлюлазных препаратов на основе различных грибных продуцентов при гидролизе реальных видов целлюлозосодержащего сырья и выявить наиболее эффективные целлюлазные комплексы и штаммы-продуценты; найти возможности интенсификации процесса ферментативного осахаривания целлюлозы в лабораторных гидролиз-аппаратах различной конструкции; с помощью экспериментальных подходов, а также используя методы математического моделирования, выявить основные факторы, влияющие на кинетику ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов; выявить наиболее перспективные «тополитические» целлюлазы, обладающие высокой эффективностью при действии на текстильные материалы - в таких процессах, как ферментативная депигментация джинсовой ткани и биоотварка («биоскоринг») суровых хлопчатобумажных тканей; разработать теоретические основы действия «тополитических» целлюлаз; получить и испытать новые ферментные препараты, наиболее подходящие для применения в процессах биообработки текстильных материалов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Катализ», Гусаков, Александр Васильевич

выводы

Впервые охарактеризован внеклеточный целлюлазный комплекс, секретируемый грибами рода Chrysosporium, а именно - грибом Chrysosporium lucknowense, который является важным промышленным продуцентом целлюлаз и гемицеллюлаз. В состав комплекса входят, как минимум, девять целлюлаз, кодируемых различными генами: четыре целлобиогидролазы (ЦБГ la, lb, На, ИЬ) и пять эндо-1,4-р-глюканаз (ЭГ I, II, III, V и VI). Все ферменты выделены в гомогенном виде, подробно изучены их свойства. На основании анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей указанные ферменты классифицированы по их принадлежности к различным семьям гликозид-гидролаз, а именно ЦБГ la, lb, Ila, ПЬ классифицированы как Се17А, Се17В, Се16А, Се16В, а ЭГ I, II, III, V, VI - как Се17С, Се15А, Cell2А, Се145А, Се16С. Показано, что ЦБГ 1а и ЭГ II существуют в виде различных форм. Высокомолекулярные формы ЦБГ 1а и ЭГ II, а также ЦБГ НЬ представляют собой типичные (полноразмерные) целлюлазы, которые состоят из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером. У низкомолекулярных форм ЦБГ 1а и ЭГ И, образующихся в результате ограниченного протеолиза полноразмерных ферментов, а также у всех остальных целлюлаз С. lucknowense ЦСМ отсутствует.

В составе ферментных комплексов, секретируемых грибами С. lucknowense и Trichoderma reesei, впервые обнаружены специфичные ксилоглюканазы (гомологичные между собой ферменты, принадлежащие к 74-й семье гликозид-гидролаз), которые представляют новый класс карбогидраз. Характерными особенностями ксилоглюканаз С. lucknowense и Т. reesei являются высокая удельная активность по отношению к ксилоглюкану, которая более чем в 10 раз превышает целлюлазную и р-глюканазную активности, а также необычный экзо-тип действия на полимерный субстрат, в результате которого от концов молекулы ксилоглюкана последовательно отщепляются олигосахаридные блоки, содержащие 4 глюкозидных остатка в основной цепи.

Проведен детальный анализ ингибирования целлюлаз продуктами ферментативного гидролиза целлюлозы — целлобиозой и глюкозой. С помощью математического моделирования на ЭВМ показано, что из-за особенностей гетерогенной системы «целлюлоза-целлюлазы» на практике могут наблюдаться различные типы ингибирования: неконкурентный, конкурентный или смешанный. Установлено, что тип наблюдаемого ингибирования зависит от константы адсорбции и величины максимальной адсорбции фермента, его концентрации, используемого диапазона концентраций субстрата, а также р-глюкозидазной активности; при этом критическим параметром является отношение «фермент/субстрат» (E/S) в реакционной смеси, т.к. при высоких значениях E/S имеет место лимитирование адсорбции фермента доступной площадью поверхности целлюлозы. Предложен подход для изучения ингибирования целлюлаз продуктами реакции, основанный на использовании окрашенной целлюлозы.

Впервые показано, что целлобиогидролазы способны катализировать реакции трансгликозилирования. При использовании 4-метилумбеллиферил-Р-0-целлобиозида, целлотриозы или микрокристаллической целлюлозы в качестве субстратов (доноров) и 4-метилумбеллиферильных производных целлобиозы и глюкозы в качестве акцепторов обнаружена способность ЦБГ I из Т. longibrachiatum (7-я семья гликозид-гидролаз) к переносу гликозидного остатка на указанные акцепторы с образованием продуктов трансгликозилирования.

Проведено сравнение осахаривающей способности ряда коммерческих и лабораторных целлюлазных препаратов при ферментативном гидролизе различных видов целлюлозосодержащего сырья. Показано, что отечественные промышленные препараты серии "Целловиридин" (штамм Т. reesei 18.2КК), лабораторные препараты на основе нового мутантного штамма Т. reesei TW-307 (ИБФМ РАН) и, в особенности, лабораторные препараты на основе новых штаммов Penicillium verruculosum В40-221-6 и В40-221-151 (ИБФМ РАН) не уступают или превосходят по эффективности гидролиза аналогичные препарату от зарубежных производителей ферментов. В большинстве случаев целлюлазные препараты P. verruculosum продемонстрировали максимальную эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих материалов.

Предложены подходы для интенсификации процесса ферментативного гидролиза целлюлозы, основанные на использовании (а) реактора ^с интенсивным перемешиванием на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора (ПДИ), где перемешивание осуществляется за счет хаотического движения ферромагнитных частиц во вращающемся магнитном поле, и (б) реакторов с виброперемешиванием. Показана возможность ускорения процесса гидролиза в 1,5-8 раз в указанных реакторах. В реакторе на базе ПДИ за 1 ч ферментативного гидролиза целлюлозы достигнута концентрация Сахаров (глюкоза + целлобиоза) 30-50 г/л при дозах целлюлазной активности 10-20 ед. по фильтровальной бумаге на 1 г субстрата, т.е. продуктивность реактора составила 30-50 г/(л-ч). Подобная продуктивность ферментативного гидролиза целлюлозы является наиболее высокой из описанных в литературе.

Получены высокоактивные препараты иммобилизованной на макропористых кремнеземах Р-глюкозидазы (целлобиазы) из Aspergillus foetidus и A. japonicus, которые могут быть использованы для обработки ферментативных гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы. При использовании препаратов в реакторе колонного типа при 40°С в течение двух недель иммобилизованный фермент сохранял не менее 95% активности, при этом продуктивность реактора достигала 250-300 г/(л-ч).

Проведены лабораторные испытания широкого круга целлюлазных препаратов в процессах биообработки текстильных материалов - депигментации («биостонинга») джинсовой ткани и биоотварки («биоскоринга») суровой хлопчатобумажной бязи с целью увеличения ее смачиваемости. Выявлены «тополитические» целлюлазные препараты и индивидуальные целлюло-литические ферменты, способные наиболее мягко и эффективно воздействовать на поверхность целлюлозных волокон без их существенной деструкции. Разработаны научные основы действия «тополитических» целлюлаз в процессах ферментативной обработки текстиля. Продемонстрирована высокая эффективность действия на джинсовую ткань ферментных препаратов на основе новых штаммов P. canescens, несущих ген рекомбинантной ЭГ III (Се112А) Р. verruculosum, и штаммов С. lucknowense, содержащих мультикопированный ген гомологичной ЭГ V (Се145А).

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Гусаков, Александр Васильевич, 2005 год

1. Bungay, H.R. Energy: the biomass options, Wiley and Sons, New York, 1981, 347 p.

2. Целлюлоза и ее производные (ред. И.Байклз, Л.Сегал), М., Мир, 1974, в 2-х томах, т.1 -500 е., т.2 510 с.

3. Godfrey, Т., West, S. (eds.) Industrial enzymology, 2nd edition, Macmillan Press Ltd., Hampshire, 1996, 609 p.

4. Bhat, M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnol. Adv., 2000, v.18, p.355-383.

5. Калунянц K.A., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты, М., Пищевая промышленность, 1979, 118 с.

6. Морозова Е.С. Основные достижения и направления селекции продуцентов целлюлаз в СССР и за рубежом. В сб.: Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты, Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология, т. 10, М., ВИНИТИ, 1988, с.6-71.

7. Родионова Н.А. Ферментативное расщепление целлюлозы. В сб.: Целлюлазы микроорганизмов (ред. В.Л.Кретович), М., Наука, 1981, с.4-40.

8. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений, М., Мир, 1986, 387с.

9. Stephen, A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995,654 p.

10. Роговин З.А. Химия целлюлозы, M., Химия, 1972, 519 с.

11. Блинов И.П. Химия микробных полисахаридов, М., 1984. с.162.

12. Никитин В.М., Оболенская А.В., Щеголев В.П. Химия древесины и целлюлозы, М., 1978,363 с.

13. Кленкова Н.И. Структура и реакционная способность целлюлозы, Л., 1976, 367 с.

14. Калунянц К.А., Шаненко Е.Ф., Зайцева Л.В. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, Итоги науки и техники, Сер. Химия и технология пищевых продуктов, т.1, М., ВИНИТИ, 1988, 187 с.

15. Азаров В.И., Буров А.В., Оболенская А.В. Химия древесины и синтетических полимеров, СПб., СПбЛТА, 1999, 628 с.

16. Сихтола X., Макконен X. Целлюлоза. В сб.: Химия древесины (ред. В.Йенсен), М., Мир, 1982, с.96-129.

17. Ranby, B.G. Celluloses and their applications, Washington, 1969, p.139-210.

18. Coughlan, M.P., Hazlewood, G.P. Hemicellulose and hemicellulases, Portland Press Research Monograph, London-Chapel Hill, 1993, v.4,120 p.

19. Scalbert, A., Monties, В., Lallemand, J.Y., Guitted, E., Rolando, C. Ether linkage between phenolic acids and lignin fractions from wheat straw. Phytochemistry, 1985, v.24, p.l359-1362.

20. Mueller-Harvey, I., Hartley, R.D., Harris, P.J., Curzon, E.H. Linkage ofp-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res., 1986, v.148, p.71-85.21.