Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Осипов, Дмитрий Олегович

• Осипов, Дмитрий Олегович
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Осипов, Дмитрий Олегович

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его состав

Глава 2. Состав, строение и основные свойства компонентов растительной клеточной стенки

2.2. Целлюлоза

2.2. Гемицеллюлозы

2.3. Пектины и лигнин

Глава 3. Ферментативная деградация целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ)

3.1. Общие сведения о гликозил-гидролазах, участвующих в гидролизе ЦСМ

3.2. Целлюлазы

3.3. Гемицеллюлазы

3.4. Механизм действия целлюлазного комплекса

3.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы

Глава 4. Штамм Pénicillium verruculosum и компоненты секретируемого им ферментного комплекса

Экспериментальная часть

Глава 5. Объекты исследования и методы экспериментов

5.1. Ферментные препараты

5.2. Субстраты

5.3. Прочие реактивы

5.4. Хроматографические сорбенты

5.5. Проведение полимеразной цепной реакции и получение генетических конструкций

5.6. Окрашивание агаризованной среды с аморфной целлюлозой конго красным

5.7. Культивирование трансформантов P. verruculosum в 3-л ферментерах

5.8. Метод определения концентрации белка

5.9. Методы определение биохимических характеристик ферментов

5.10. Методы определения активности ферментов

5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков

5.12. Определение температурного и pH-оптимума действия ферментных препаратов

5.13. Изучение термо- и pH-стабильности ферментных препаратов

5.14. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза целлюлозосодержащего сырья

5.15. Хроматографическое фракционирование препаратов Р. verruculosum

5.16. Гидролиз цсллюлозосодержащих материалов

Результаты и их обсуждение

Глава 6. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Р. verruculosum

6.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций

6.2. Трансформация штамма-реципиента Р. verruculosum

6.3. Первичный скрининг полученных трансформантов

6.3.1. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные целлюлазы

6.3.2. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные гемицеллюлазы

6.4. Получение рекомбинантных ферментных препаратов

Глава 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum

7.1. Анализ ферментных препаратов с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования

7.2. Активность ферментных препаратов по отношению к различным субстратам

7.3. рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов

Глава 8. Гидролиз полисахаридных субстратов лабораторными мультиферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов Р. уеггисиЬяит

8.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины

8.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины 97 8.2. Результаты гидролиза измельченной багассы

8.4. Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы (МКЦ)

8.5. Сравнение эффективности гидролиза растительных субстратов ферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов Р. уеггисьАотт и коммерческими ферментными препаратами

8.6. Влияние рН и температуры на эффективность гидролиза ЦСМ

Глава 9. Состав рекомбинантных ферментных препаратов 128 Выводы 131 Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты

ЦБГ целлобиогидролаза

ЭГ эндоглюканаза

БГЛ р-1,4-глюкозидаза

Ксил ксиланаза

КГ ксилоглюканаза

Прочие сокращения

М№«Ю 1 -мети л-3 -нитро-1 -нитрозогуанин

МАЬШ-ТОГ МБ Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация ч времяпролетная масс-спектрометрия а.к. аминокислота

ВС восстанавливающие сахара

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ДДС-ЭФ электрофорез в денатурирующих условиях

КЖ культуральная жидкость

ИК индекс кристалличности

ИЭФ изоэлектрофокусирование

КМЦ Иа-соль карбоксиметилцеллюлозы

МКЦ микрокристаллическая целлюлоза

ПААГ полиакриламидный гель

ПАВ поверхностно-активные вещества я-НФ-Р-Глюк и-нитрофенил-р-Б-глюкопиранозид

ПЭГ полиэтиленгликоли

СП степень полимеризации

УФ, иУ ультрафиолетовое излучение

ФП Ферментный препарат

ЦСД целлюлозосвязывающий домен

ЦСМ целлюлозосодержащие материалы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов»

Исчерпывание традиционного углеводородного сырья, загрязнение окружающей среды отходами производств, а также увеличение объема антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу является в современном мире актуальной проблемой. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам сырья и энергии, одним из которых является возобновляемые растительные материалы - лигноцеллюлозная биомасса, целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства. Гидролиз лигноцеллюлозной биомассы с помощью ферментов микроорганизмов позволяет получать глюкозу и другие сахара, которые могут быть использованны далее для превращения в спирты (биотопливо), органические и аминокислоты и многие другие полезные продукты.

Главным компонентом растительной биомассы являются природные полисахариды целлюлоза и гемицеллюлоза. Ферменты, осуществляющие их биодеградацию, занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими такие ферменты, являются микроскопические грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий.

Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (T. reesei, T. viride, T. longibrachiatum и др.) играют ведущую роль. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием внеклеточных ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования в различных отраслях биотехнологической промышленности. Однако стоит отметить, что одним из недостатков данного продуцента целлюлаз является низкое содержание (З-глюкозидазы, отвечающей за конверсию целлобиозы (промежуточного продукта ферментативного гидролиза целлюлозы) в конечный продукт - глюкозу. В отличие от Trichoderma, грибы рода Pénicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз более сбалансированного состава, которые эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты обладают высокой операционной стабильностью.

В лаборатории Биотехнологии ферментов ИНБИ РАН ведутся работы со штаммом гриба Pénicillium verruculosum - одним из наиболее активных продуцентов карбогидраз. Однако в ферментном комплексе, продуцируемом этим грибом недостаточно гемицеллюлазной активности, необходимой для гидролиза богатой гемицеллюлозой биомассы. Поэтому создание новых штаммов, продуцирующих ферментные комплексы, обладающих повышенными уровнями целлюлазных и гемицеллюлозных активностей, могло бы способствовать усовершенствованию процессов переработки лигноцеллюлозного сырья.

Таким образом, увеличение эффективности гидролиза целлюлозосодержащего сырья с использованием новых комплексных ферментных препаратов, обладающих высокими значениями целлюлазных и гемицеллюлазных активностей, полученных на основе высокопродуктивных рекомбинантных штаммов Р. verruculosum является актуальной целью.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены гемицеллюлаз (эндо-1,4-Р-ксиланазы А (xylA), эндо-1,4-р-ксил апазы III (ху13), эндо-1,4-Р-маннаназы В (тапВ), эндо-1,4-р-ксиланазы III (ху13)) и целлюлаз (эндо-1,4-Р-глюканазы IV (egl4), эндо-1,4-Р-глюканазы I (egll) и целлобиогидролазы II (cbhll)) Т. reesei и Р. canescens под контролем сильного индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (cbhl);

• провести трансформацию штамма-реципиента Р. verruculosum 537 (niaD'J и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности (ксиланазную, маннаназную, КМЦ-азную, авицелазную), удостовериться в стабильности новых рекомбинантных штаммов;

• исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными рекомбинантными штаммами;

• проанализировать осахаривающую способность новых ферментных комплексов карбогидраз по отношению к различным видам целлюлозосодержащих материалов (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью имеющихся коммерческих и лабораторных ферментных препаратов;

• определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой осахаривающей способностью.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Осипов, Дмитрий Олегович

выводы

1. Методами генетической инженерии сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гетерологичные гены из Trichoderma reesei и Pénicillium canescens, созданные на основе векторов, содержащих регуляторные области — промотор и терминатор гена cbhl P. veiraculosum.

2. Созданы новые рекомбинантные штаммы P. verruculosum, продуцирующие мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной целлюлазной активностью (за счет экспрессии ондо-р-1,4-глюканазы IV T. reesei), а также с увеличенной гемицеллюлазной активностью (за счет экспрессии эндо-Р-1,4-ксилапаз P. canescens и Т. reesei или эндо-Р-1,4-маннаназы Т.reesei)

3. На основе рекомбинантных штаммов P. verruculosum получены ферментные препараты карбогидраз и проанализирована их осахаривающая способность по отношению к различным видам растительных субстратов. Установлено, что наибольший выход Сахаров при осахаривании измельченной багассы, а также микрокристаллической целлюлозы обеспечивают ферментные препараты, имеющие в своем составе рекомбинантную эндо-Р-1,4-глюканазу IV; при осахаривании измельченной осиновой древесины - имеющие рекомбинантную эндо-Р-1,4-ксиланазу, при гидролизе измельченной сосновой древесины - рекомбинантную эндо-Р-1,4-маннаназу. Увеличение выхода Сахаров составило 10-130% по сравнению с действием контрольного ферментного препарата, полученного с помощью исходного штамма P. verruculosum.

4. Определен компонентный состав новых ферментных препаратов и установлено, что наиболее высокой осахаривающей способностью обладают препараты ЭГ1У-2, КсилА-4, КсилШ-1, МанВ-2, в которых вместе с высоким содержанием целевого привнесенного фермента (эндо-Р-1,4-глюканазы IV, эндо-Р-1,4-ксиланазы, эндо-Р-1,4-маннанзы) сохраняются ключевые целлюлолитические ферменты P. verruculosum (целлобиогидролазы I и II).

5. Исследованы физико-химические и биохимические свойства ферментных препаратов, обладающих наибольшей осахаривающей способностью. Установлено, что оптимумы действия ферментных препаратов располагаются в области рН 3,5-5,5 и при температурах от 50 до 80°С, а также стабильны в широком температурном диапазоне (Т5о% 30-85 °С).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Осипов, Дмитрий Олегович, 2011 год

1. Тиунова Н.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов. Под ред. Кретовича В.Л. М., 1981, с. 40-73.

2. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., 1980, с. 83-90

3. Шарков В.И., Куйбина И.И., Соловьева Ю.П. и др. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1976, с. 203.

4. Евилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982, с. 4-40.

5. Максимов В.Ф., Вольф И.В., Яковлева О.И. Борьба с загрязнениями окружающей среды в целлюлозно-бумажной промышленности. М., 1976, с. 30

6. Roger М. Rowell, Tor P. Schultz, Ramani Narayan. Emerging Technologies for Materials and Chemicals from Biomass. ACS Symposium Series, 1992, v. 476, p. 12-27.

7. Reshamwala S., Shawky B.T., Dale B.E., Ethanol production from enzymatic hydrolysatcs of AFEX-treated coastal Bermuda grass and switchgrass. Appl. Biochem. Biotechnol., 1995, v. 51-52, p. 43-55.

8. Collmer A., Keen N.T. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. Ann. Rev. Phytopathol., 1986, v. 24, p. 383-409.

9. Albersheim P., Jones T.N. Biochemistry of the cell wall in relation to infective processes. Ann. Rev. Phytopathol., 1969, v. 7, p. 171-194.

10. Dey P.M. and Brinston K. Plant cell-walls. Adv. in carbohydrate chem. and biochem., 1984, v. 42, p. 265-382.

11. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М., Мир, 1986, 387 с.

12. Stephen A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995, 654 p.

13. Hopkins W.G. Introduction to Plant Physiology, 2nd edition. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999, 512 p.

14. Роговин З.А. Химия целлюлозы. M., Химия, 1972, 519 с.

15. Горшкова Т.А. Растительная клеточная стенка как динамичная система. М., Наука, 2007, с. 21.

16. Клесов А.А. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы. Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. 1988, М., ВИНИТИ, т. 12, с.53.

17. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. John Willey & Sons, Inc., New York, 1998, 454 p.18.