Выделение и свойства целлюлаз мицелиального гриба Chrysosporium Lucknowense тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Бухтояров, Федор Евгеньевич

• Бухтояров, Федор Евгеньевич
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Бухтояров, Федор Евгеньевич

Список сокращений.

Введение.

I. Литературный обзор.

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗА И р-ГЛЮКАНЫ.

ГЛАВА 2. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ.

2.1. Классификация, субстратная специфичность и биохимические свойства целлюлаз.

2.2. Механизм действия целлюлаз

2.3. Доменная структура целлюлаз.

2.4. Современные представления о классификации гликозил-гидролаз.

ГЛАВА 3. ГРИБНЫЕ И БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ «НЕЙТРАЛЬНЫХ»

ЦЕЛЛЮЛАЗ.

ГЛАВА 4. ПРИМЕНЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗ В ТЕКСТИЛЬНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ.

II. Экспериментальная часть.

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Ферментные препараты.

5.2. Субстраты и реактивы.

5.3. Определение концентрации белка.

5.4. Хроматографическое разделение ферментов.

5.5. Определение биохимических характеристик индивидуальных ферментов, титрование белков ферментного комплекса.

5.6. Методы определения активности ферментов.

5.6.1. Определение активности по отношению к полисахаридным субстратам.

5.6.2. Определение активности по полисахаридным субстратам с помощью планшетного метода.

5.6.3. Определение активности по л-нитрофенильным производным Сахаров.

5.6.4. Определение активности по и-нитрофенильным производным Сахаров на планшете.

5.7. Изучение зависимостей активности ферментов от рН и температуры.

5.8. Изучение термостабильности ферментов.

5.9. Определение состава низкомолекулярных продуктов гидролиза полимерных субстратов.

5.10. Адсорбционная способность ферментов.

5.11. Изучение кинетики гидролиза хлопка и МКЦ.

5.12. Определение тополитической активности целлюлаз.

5.13. Оценка влияния целлюлаз на ресорбцию индиго.

5.14. Масс-спектрометрический анализ пептидов.

5.15. Методы компьютерного моделирования структуры белка.

III. Результаты и их обсуждение.

ГЛАВА 6. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА С. LUCKNOWENSE

6.1. Определение компонентного состава ферментного комплекса С. lucknowensе.

6.2. Анализ увеличения экспрессии мультикопированных ферментов.

ГЛАВА 7. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ

ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА С. LUCKNOWENSE

ГЛАВА 8. СВОЙСТВА ЭНДОГЛЮКАНАЗ С. LUCKNOWENSE

8.1. Субстратная специфичность и классификация целлюлаз.

8.2. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа.

8.3. Основные биохимические свойства эндоглюканаз.

8.4. Кинетические параметры действия выделенных эндоглюканаз.

8.5. Состав низкомолекулярных продуктов при глубоком гидролизе р-глюкана.

8.6. Адсорбционная способность целлюлаз. Действие ферментов на МКЦ.

8.7. Тополитические свойства ферментов.

8.8. Изучение влияния целлюлаз С. lucknowense на ресорбцию индиго.

ГЛАВА 9. МОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРОЕНИЕ ЭГIIIИ ЭГ V С. lucknowense.

9.1. Аминокислотные последовательности ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense.

9.2. Моделирование вторичной и третичной структур ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и свойства целлюлаз мицелиального гриба Chrysosporium Lucknowense»

Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы, самого распространенного биополимера на Земле, занимают центральное место в круговороте органического углерода [1]. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. История исследования целлюлаз насчитывает уже более 50 лет. В течение этого периода важнейшим свойством, характеризующим целлюлазный комплекс, считалась его способность к глубокой деструкции целлюлозосодержащих субстратов (так называемая «сахаролитическая» активность). Поэтому исследования, в основном, были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы. Целлюлазы, выделенные из этих препаратов, как правило, проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4-5) [2], но различались по субстратной специфичности, адсорбционной способности и термостабильности [3,4, 5].

Целлюлазы находят все более широкое применение в текстильной, целлюлозно-бумажной, пищевой и других отраслях промышленности [6]. В последнее время усилия щ исследователей направлены на поиск целлюлолитических ферментов, способных мягко воздействовать на поверхность целлюлозного субстрата, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы (для обозначения этой способности целлюлаз мы предлагаем использовать термин «тополитическая» активность) [7, 8]. Обнаружение ферментов с тополитической активностью открыло новые возможности их применения: например, для депигментации джинсовых изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой); для биополировки текстильных материалов с целью удаления микродефектов и ворса; как компонента моющих средств и т. д. [9, 10, И, 12]. Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.

Следует подчеркнуть, что для упомянутых выше целей предпочтительны ферменты, сохраняющие высокую активность и стабильность в условиях проведения процесса - как правило, это нейтральные или щелочные значения рН и повышенная температура [11, 13]. В связи с этим наиболее перспективными для использования являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, демонстрирующие высокую активность и стабильность при значениях рН, близких к нейтральным, (рН 6-8) и температурах 50°С и выше. Поэтому актуальными направлениями исследований в этой области становятся поиск новых штаммов-продуцентов «нейтральных» целлюлаз, получение мутантных штаммов при помощи методов классического мутагенеза или генной инженерии, а также выделение и исследование свойств ключевых тополитических ферментов.

В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН был осуществлен скрининг продуцентов целлюлаз, высокоактивных и стабильных при нейтральных и щелочных значениях рН, в результате чего был найден мицелиальный гриб Chrysosporium lucknowense, целлюлазный комплекс которого ранее не исследовался. Гриб С. lucknowense, относящийся к классу аскомицетов, был выделен из щелочной почвы Дальнего Востока, и далее путем классического мутагенеза были получены мутантные штаммы, отличающиеся повышенным уровнем секреции целлюлаз и гемицеллюлаз. Ферментные препараты на основе данного продуцента продемонстрировали высокую эффективность при обработке хлопчатобумажной ткани [14]. Однако данные, касающиеся состава и особенностей функционирования ферментного комплекса С. lucknowense, а также сведения по ферментам, продуцируемым другими видами грибов рода Chrysosporium, практически отсутствуют в научной литературе.

Основной целью данной работы было выделение и изучение свойств ферментов целлюлазного комплекса, продуцируемого мутантным штаммом гриба С. lucknowense. В цели работы также входило выявление ключевых целлюлаз, отвечающих за высокую эффективность ферментных препаратов С. lucknowense при обработке хлопчатобумажной ткани с целью создания ферментных препаратов с улучшенными биотехнологическими характеристиками.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Определить компонентный состав ферментного комплекса С. lucknowense

• Выделить в гомогенном виде все целлюлазные ферменты комплекса и изучить их свойства.

• Выявить ключевые тополитические целлюлазы С. lucknowense.

• Получить и проанализировать свойства ферментных препаратов на основе штаммов С. lucknowense с мультикопированными генами собственных целлюлаз, обладающих наибольшей тополитической активностью.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Катализ», Бухтояров, Федор Евгеньевич

Выводы.

Разработан экспресс-метод анализа компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью гриба С. lucknowense. Метод основан на двухстадийной ионообменной хроматографии. В составе ферментных препаратов С. lucknowense обнаружены шесть эндоглюканаз (25 кДа, р/ 4,0; 28 кДа, р/ 5,7; 44 кДа, р/ 6,0; 47 кДа, р/5,7; 51 кДа, р/4,8; 60 кДа, р/3,8) и три целлобиогидролазы (65 кДа, р/4,4; 52 кДа, р/4,4; 43 кДа, р/4,2).

Методом двухстадийной ионообменной хроматографии определен качественный и количественный состав ферментных препаратов, полученных с помощью разных штаммов С. lucknowense. Показано трехкратное увеличение биосинтеза ЭГ V 25 кДа в препарате на основе штамма С. lucknowense Eg5#27 с увеличенной экспрессией гена ЭГ V, а также десятикратное увеличение биосинтеза ЭГ III 28 кДа в препарате на основе штамма С. lucknowense Eg3#la с увеличенной экспрессией гена ЭГ III, по сравнению с препаратами на основе исходного штамма С. lucknowense UV 18-25. Разработана схема препаративного выделения гомогенных индивидуальных целлюлаз С. lucknowense. Изучены свойства очищенных целлюлаз - субстратная специфичность, температурные и рН-зависимости активности, термостабильность, адсорбционная способность на целлюлозе, кинетика глубокого гидролиза микрокристаллической целлюлозы, состав низкомолекулярных продуктов при исчерпывающем гидролизе р-глюкана.

Показано, что ЭГ 51 кДа и ЭГ 44 кДа представлют собой две формы одного фермента. ЭГ 44 кДа является каталитическим доменом полноразмерной ЭГ 51 кДа, лишенной ЦСД.

Для некоторых из выделенных целлюлаз установлена их принадлежность к известным семьям гликозид-гидролаз: Се16А (ЦБГ II 43 кДа), Се17А (ЦБГ I, две формы: 65 кДа и 52 кДа), Се112А (ЭГ III28 кДа), Се145А (ЭГ V 25 кДа). Используя метод компьютерного моделирования, предложены модели трехмерных структур ЭГ III 28 кДа и ЭГ V 25 кДа. Основываясь на гомологии аминокислотных последовательностей ЭГ III 28 кДа и ЭГ V 25 кДа с известными последовательностями эндоглюканаз 12 и 45 семей гликозил-гидролаз, установлены каталитические аминокислотные остатки указанных ферментов: Glu-120 и Glu-204 (ЭГ III) и Asp-13 и Asp 124 (ЭГ V).

Проведено сравнение эффективности депигментации джинсовой ткани очищенными целлюлазами С. lucknowense в процессе депигментации джинсовой ткани (тополитической активности). Показано, что наиболее высокой

110 индивидуальной тополитической активностью обладает ЭГ V 25 кДа. Продемонстрирована более высокая эффективность депигментации джинсовой ткани под действием ферментного препарата, полученного с помощью штамма С. lucknowense с увеличенной экспрессией гена ЭГ V 25 кДа по сравнению с препаратом, полученным на основании исходного штамма С. lucknowense UV 18-25.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Бухтояров, Федор Евгеньевич, 2004 год

1. Рабинович МЛ., Мельник М.С., Болобова А.В. (2002) Прикл. биохим. микробиол., 38,355-373.

2. Клесов А.А. (1988) В кн. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы, т.12, ВИНИТИ, Москва, с.53-59.

3. Клесов А.А., Рабинович М.Л., Чурилова И.В., Синицын А.П. и др. (1980) Ферментативный гидролиз целлюлозы П. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников. Биоорган, химия, 6, с. 1377-1395.

4. Клесов А.А., Черноглазое В.М., Рабинович М.Л., Синицын А.П. и др. (1982) Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации аморфной и кристаллической целлюлозы. Биоорган, химия, 8, с. 643-651

5. Рабинович М.Л., Черноглазое В.М., Клесов А.А. (1983) Изоферменты эндоглюканазы в целлюлазных комплексах: различное сродство к целлюлозе и неодинаковая роль в гидролазе нерастворимого субстрата. Биохимия, 48, с. 369379

6. Bhat М.К. (2000) Biotechnol. Adv., 18, 355-383.

7. Берлин А.Х., Тихомиров Д.Ф., Гутьеррес Б.Р., Попова Н.Н., Синицын А.П. (1998)

8. Оценка топоферментной активности целлюлаз и ксиланаз. Прикл. биохим. и микробиол., 34, с.382-387

9. Гусаков А.В., Синицын А.П. (1998) О механизме действия ферментов-целлюлаз на текстильные материалы: взгляд энзимологов. Текстильная химия, 2(14), с. 68-72

10. Tikhomorov, D.F., Baraznenok, V.A., Becker, E.G., Sinitsyn, A.P. (1996) Novel Enzymes and Technologies in Denim Wash. 213th ACS National Meeting, Abstracts of papers, part I, #105.

11. Traore, and Buschle-Diller, G. (1996) Cellulase activity and effect of mechanical action during enzymatic hydrolysis of dyed cotton fabrics. 213th ACS National Meeting, Abstracts of papers, part I, #106.

12. Rasmussen G., Mikkelsen J., Schulein M. (1991) A Cellulase Preparation Comprising an Endoglucanase Enzyme. International Application published under the Patent Cooperation Treaty, International Publication Number WO 91/17243.