Свойства целлюлолитических ферментов Penicillium verruculosum и их применение для осахаривания лигноцеллюлозного сырья тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Морозова, Валерия Владимировна

• Морозова, Валерия Владимировна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Морозова, Валерия Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Структура и свойства основных компонентов растительной биомассы.

1.1. Целлюлоза.

1.2. Гемицеллюлозы и пектины.

1.3. Лигнин.

1.4. Предобработка целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов.

Глава 2. Ферментативный гидролиз целлюлозосодержащего сырья.

2.1. Общие сведения о целлюлолитических ферментах.

2.2. Особенности строения целлобиогидролаз и эндоглюканаз.

2.3. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз.

2.4. Механизм действия целлюлазного комплекса.

2.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы

2.6. Применение целлюлаз в производстве этанола.

2.7. Ферментный комплекс гриба Penicillium verrnculosum.

Экспериментальная часть.

Глава 3. Объекты исследования и методы экспериментов.

3.1 Использованные ферменты.

3.2. Субстраты и реактивы.

3.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка.

3.4. Методы выделения и очистки ферментов.

3.5. Методы определения активности ферментов.

3.6. Определение адсорбционных характеристик ферментов.

3.7. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов.

3.8. Изучение термостабильности ферментов.

3.9. Ограниченный протеолиз ферментов папаином.

3.10. Гель-хроматографический анализ продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.

3.11. Исследование кинетики глубокого гидролиза МКЦ.

3.12. Гидролиз различных целлюлозосодержащих субстратов.

3.13. Масс-спектрометрический анализ пептидов и построение трехмерных моделей ферментов.

Результаты и их обсуждение.

Глава 4. Выделение и очистка ферментов целлюлазного комплекса P. verruculosum

Глава 5. Масс-спектрометрический анализ целлобиогидролаз, эндоглюканаз и р-глюкозидазы P. verruculosum и их аминокислотные последовательности.

5.1. ЦБГ II 6-й семьи гликозид-гидролаз.

5.2. ЦБГ I 7-й семьи гликозид-гидролаз.

5.3. ЭГ II 5-й семьи гликозид-гидролаз.

5.4. Р-Глюкозидаза 3-й семьи гликозид-гидролаз.

Глава 6. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз P. verruculosum.

6.1. Субстратная специфичность и каталитические свойства.

6.2. Адсорбционные характеристики.

6.3. Ограниченный протеолиз ферментов папаином.

6.4. Термостабилыюсть.

6.5. Температурный и рН-оптимум действия ферментов.

6.6. Состав низкомолекулярных продуктов гидролиза Р-глюкана эндоглюканазами

6.7. Выявление ключевых гидролитических ферментов.

Глава 7. Создание ферментных комплексов для эффективного гидролиза целлюлозосодержащих материалов.

7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз.

7.2. Гидролиз целлюлозосодержащих субстратов гомогенными ферментами и их смесями.

7.3. Изучение влияния различных эффекторов на гидролитическую способность целлюлаз.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свойства целлюлолитических ферментов Penicillium verruculosum и их применение для осахаривания лигноцеллюлозного сырья»

На сегодняшний день перед человечеством стоит проблема потенциального исчерпывания традиционного углеводородного сырья, из которого производят моторное топливо и продукты химического синтеза. Кроме того, с каждым годом увеличивается объем антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу, что приводит к изменению климата на Земле. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам энергии, одним из которых является возобновляемое растительное сырье -лигноцеллюлозная биомасса, отходы промышленности и сельского хозяйства. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза такой лигиоцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо -этанол или бутанол.

Природная древесина, различные виды сельскохозяйственных культур и другие целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию, так как целлюлоза в них имеет упорядоченную (кристаллическую) структуру, и во многих случаях субстрат содержит в своем составе сопутствующие вещества (в первую очередь лигнин), которые служат физическим барьером, затрудняющим доступ ферментов к гликозидным связям. Возникает необходимость поиска возможностей увеличения реакционной способности субстрата (предобработки растительного сырья). Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.

Эффективность процесса получения Сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени - от состава комплекса целлюлолитических ферментов и взаимодействия индивидуальных ферментов в нем, стабильности целлюлаз, ингибирующего влияния па них продуктов гидролиза. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Г. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatum и др.) играют ведущую роль [1]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Наиболее существенным недостатком данного продуцента целлюлаз является, низкое содержание Р-глюкозидазы [2], отвечающей за конверсию промежуточных продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы в конечный продукт — глюкозу.

В отличие от Trichoderma, грибы рода Penicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты обладают высокой операционной стабильностью [3, 4]. Поэтому получение высокопродуктивных штаммов Penicilliiim является задачей, имеющей большое научное и прикладное значение.

Ключевые ферменты целлюлазного комплекса — эндоглюканазы и целлобиогидролазы, способные гидролизовать главным образом высокоупорядоченные области целлюлозы. Целлобиогидролазы I и II и эндоглюканазы I и II Г. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. Достаточно много информации опубликовано также о целлобиогидролазах и эндоглюканазах из таких грибных продуцентов целлюлаз, как Humicola wsolens, Phanerochaete chiysosporium, Т. emersonii, Т. aurantiacus и некоторых других, в тоже время о свойствах других грибных целлюлаз известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных белков имеется значительное количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов. Сведения, касающиеся пеницильных ферментов-карбогидраз, весьма противоречивы, а аминокислотных последовательностей, транслированных из. генов P. verruculosum, практически нет в белковых базах данных. Некоторые ферменты, продуцируемые P. verruculosum, уже изучены в нашей лаборатории. Создание новых мутантных штаммов привело к секреции новых ферментов: целлобиогидролазы 60 кДа и эндоглюканазы 70 кДа.

Целью диссертационной работы являлось изучение молекулярных и каталитических свойств целлобиогидролаз и эидоглюканаз, секретируемых" высокопродуктивным мутантпым штаммом гриба P. verruculosum В221-151, полученным в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН, а также разработка подхода для создания на основе ферментов P. verruculosum смесей, способных осуществлять глубокий гидролиз растительной биомассы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Выделить все секретируемые целлюлазы P. verruculosum;

• Исследовать биохимические и каталитические свойства целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа в сравнении с ранее описанными целлобиогидролазами и эндоглюканазами этого продуцента;

• Разработать подход для создания мультиферментных смесей на основе целлюлаз P. verruculosum для эффективного гидролиза различных целлюлозосодержащих субстратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Катализ», Морозова, Валерия Владимировна

выводы

1. Впервые выделены в гомогенном виде и изучены свойства внеклеточных целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа, продуцируемых грибом P. verruculosum. С помощью масс-спектрометрических методов осуществлена классификация этих ферментов как Се16А и Се17В соответственно.

2. На основе сравнения аминокислотных последовательностей выделенных ферментов P. verruculosum и известных гомологичных грибных целлюлаз, а также с использованием данных сравнительного моделирования трехмерной структуры белков, выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз I и II, а также эндоглюканазы II 39 кДа и Р-глюкозидазы 116 кДа.

3. Показано, что ЦБГ II 60 кДа и ЦБГ I 66 кДа P. verruculosum являются ключевыми ферментами для осахаривания целлюлозы: они обладают высокой гидролитической активностью и способны осуществлять глубокую конверсию кристаллической целлюлозы.

4. Разработан подход для формирования мультиферментных композиций, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов. Продемонстрирована принципиальная возможность создания на основе индивидуальных целлюлаз P. verruculosum мультиферментных композиций, которые превосходят по эффективности действия различные коммерческие ферментные препараты.

5. Установлено, что ключевыми компонентами ферментных смесей P. verruculosum, предназначенных для эффективного осахаривания целлюлозосодержащих субстратов, являются ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и 50 кДа, ЭГ I 70 кДа, ЭГ II 39 кДа и БГЛ 116 кДа. При гидролизе субстратов с высоким содержанием гемицеллюлозы возрастает роль ЭГ II 33 кДа. Присутствие в реакционной среде ферментов без ЦСМ наряду с ферментами, содержащими ЦСМ, способствует усилению гидролиза.

6. Показано, что при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов в присутствии в реакционной среде неионогенных поверхностно-активных веществ значительно возрастает выход глюкозы и восстанавливающих Сахаров. Использование неионогенных ПАВ позволяет сократить дозу используемых ферментов в 1,5-2,5 раза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Морозова, Валерия Владимировна, 2009 год

1. Godfrey Т., West S. Industrial enzymology, 2nd edition. Macmillan Press Ltd., Hampshire, 1996, 609 p.

2. Rosgaard L., Pedersen S., Langston J., Akerhielm D., Cherry J.R., Meyer A.S. Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulose mixtures on differently pretreated barley straw substrates. Biotechnol. Prog., 2007, v. 23, p. 1270-1276.

3. Кастельянос О.Ф. Каталитические биохимические и биотехнологические свойства целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum и его компонентов. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1995, 204 с.

4. Скомаровский А.А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006,170 с.

5. Collmer A., Keen N.T. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. Ann. Rev. Phytopathol., 1986, 24, p. 383-409.

6. Albersheim P., Jones T.N. Biochemistry of the cell wall in relation to infective processes. Ann. Rev. Phytopathol., 1969, 7, p. 171-194.

7. Dey P.M. and Brinston K. Plant cell-walls. Adv. in carbohydrate chem. and biochem., 1984, 42, p. 265-382.

8. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М., Мир, 1986, 387с.

9. Stephen A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995,654 р.

10. Hopkins W.G. Introduction to Plant Physiology, 2nd edition. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999,512 р.

11. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., МГУ, 1995, 224 с.

12. Роговин З.А. Химия целлюлозы. М., Химия, 1972, 519 с.

13. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. John Willey & Sons, Inc., New York, 1998, 454 p.

14. Stone B.A, Clarke A.E. Chemistry and biology of 1,3-p-glucans. La Trobe University Press, Bundoora, Australia, 1992, 426 p.

15. Izydorczyk M.S., Macri L.J., MacGregor A.W. Structure and physicochemical properties of barley non-starch polysaccharides. I. Water-extractable 13-glucans and arabinoxylans. Carbohydr. Polym., 1998, 35, p. 249-258.

16. Read S.M., Currie G., Bacic A. Analysis of the structural heterogeneity of laminarin by electrospray-ionisation-mass spectrometry. Carbohydr. Res., 1996, 281, p. 187-201.

17. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press Research Monograph., London-Chapel Hill, 1993, 4, 120 p.

18. Hayashi T. Xyloglucans in the primary cell walls. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1989, 40, p. 139-168.

19. KoimanP. Amyloids of plant seeds. Nature, 1957, 179, p. 107-109.

20. Gidley M.J., Lillford P.J., Rowlands D.W., Lang P., Dentini M., Crescenzi V., Edwards M., Fanutti C., Reid J.S.G. Structure and solution properties of tamarind-seed polysacsharide. Carbohydr. Res., 1991, 214, p. 299-307.

21. Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Harris P.J., Curzon E.H. Linkage of p-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res., 1986, 148, p. 7185.

22. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu. Rev. Biochem., 1984, 53, 625 p.

23. Rombouts F.M., Thibault J.F. Feruloylated pectic substances from sugar beet pulp. Carbohydr. Res., 1986, 154, p. 177-187.

24. Закис Г.Ф., Крейцберг 3.H., Можейко JI.H., Сергеева В.Н. Лигнин. В сб.: Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии. Рига, Зинатне, 1972, с. 136-242.

25. Chang М., Chou Т., Tsao G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. In: Bioenergy (Fiechter A., ed.). Berlin, Heidelberg, New York, 1981, p. 15-32.

26. Gharpuray M.M., Lee Y.H., Fan L.T. Structural modification of lignocellulosics by pretreatments to enhance enzymatic hydrolysis. Biotechnol. Bioeng., 1983, 25, p. 157-172.

27. Lin K.W., Ladisch M.R., Voloch M., Patterson J. A., Noller C.H. Effect of pretreatments and fermentation on pore size in cellulosic materials. Biotechnol. Bioeng., 1985, 27, p. 1427-1433.

28. Thompson D.N., Chen H.C., Grethlein H.E. Comparison of pretreatment methods on the basis of available surface area. Bioresour. Technol., 1992, 39, p. 155-163.

29. Reshamwala S., Shavvky B.T., Dale B.E., Ethanol production from enzymatic hydrolysatcs of AFEX-treated coastal Bermuda grass and switchgrass. Appl. Biochem. Biotechnol., 1995, 51-52, p. 43-55.

30. Boominathan К., Reddy С.A. cAMP-mediated differential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89, p. 5586-5590.

31. Клесов A.A. Ферментативное превращение целлюлозы. В сб.: Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология, 1. М., ВИНИТИ, 1983, с. 63-150.

32. Синицын А.П., Клесов А. А. Влияние предобработки на эффективность ферментативного превращения хлопкового линта. Прикл. биохим. микробиол, 1981, 17, с. 682-695.

33. Rolz С., Arriola J., Villadares J. Effect of some physical and chemical pretreatmcnts on the composition, enzymatic hydrolysis and digestibility of lignocellulosic sugar cane residue. Process Biochem., 1987, 2, p. 17-23.

34. McMillan J.D. Pretreatment of lignocellulosic biomass. In: Himmel M.E., Baker J.O., Overend R.P. (Eds.), Enzymatic conversion of biomass for fuels production. American Chemical Society, Washington, DC, 1994, p. 292-324.

35. Kim Т.Н., Kim J.S., Sunwoo C., Lee Y. Y. Pretreatment of corn stover by aqueous ammonia. Bioresour. Technol., 2003, 90, p. 39-47.

36. Jeihanipour A., Taherzadeh M.J. Ethanol production from cotton-based waste textiles. Bioresour. Technol., 2009, 100, p. 1007-1010.

37. Schell D.J., Farmer J., Newman M., McMillan J.D. Dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover in pilot-scale reactor. Appl. Biochem. and Biotech., 2003, 105-108, p. 69-85.

38. Nguyen Q.A., Tucker M.P., Boynton B.L., Keller F.A., Schell D.J. Dilute acid pretreatment of softwoods. Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, 70, p. 77-87.

39. Esteghlalian A., Hashimoto A.G., Fenske J.J., Penner M.H. Modeling and optimization of the dilute-sulfuric-acid pretreatment of corn stover, poplar and switchhgrass. Bioresour. Technol., 1997, 59, p. 129-136.

40. Vidal P.F., Molinier J. Ozonolysis of lignin improvement of in v/Jrodigestibility of poplar sawdust. Biomass, 1988, 16, p. 1-17.

41. Brownell H.H., Yu E.K.C., Saddler J.N. Steam-explosion pretreatment of wood: Effect of chip size, acid, moisture content and pressure drop. Biotechnol. Bioeng., 1986, 28, p. 792-801.

42. Sassner P., Martensson C.G., Galbe M., Zacchi G. Steam pretreatment of H2SC>4-impregnated Salix for the production of bioethanol. Bioresour. Technol., 2008, 99, p. 137-145.

43. Stenberg K., Tengborg C., Galbe M., Zacchi G. Optimisation of steam pretreatment of S02~impregnated mixed softwoods for ethanol production. J. Chem. Tech. Biotechnol., 1998, 71, p. 299-308.

44. Rosgaard L., Pedersen S., Meyer A.S. Comparison of different pretreatment strategies for enzymatic hydrolysis of wheat and barley straw. Appl. Biochem. Biotechnol., 2007, 143, p. 284296.

45. Duff S J.B., Murray W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Bioresour. Technol., 1996, 55, p. 1-33.

46. Holtzapple M.T., Humphrey A.E., Taylor J.D. Energy requirements for the size reduction of poplar and aspen wood. Biotechnol. Bioeng., 1989, 33, p. 207-210.

47. Clark T.A., Mackie K.L. Steam explosion of the soft-wood Pinus radiata with sulphur dioxide addition. I. Process optimization. J. Wood Chem. Technol., 1987, 7, p. 373-403.

48. Holtzapple M.T., Jun J.H., Ashok G., Patibandla S.L., Dale B.E. The ammonia freeze explosion (AFEX) process: a practical lignocellulose pretreatment. Appl. Biochem. Biotechnol., 1991,28, p. 59-74.

49. Sharma S.K., Kalra K.L., Grewal H.S. Enzymatic saccharification of pretreated sunflower stalks. Biomass. Bioenergy., 2002, 23, p. 237-243.

50. Holtzapple M., Lundeen J.E., Sturgis R., Lewis J.E., Dale B.E. Pretreatment of lignocellulosic municipal waste by ammonia fiber explosion (AFEX). Appl. Biochem. Biotechnol., 1992, 34-35, p. 5-21.

51. Clarke A.J. Biodegradation of cellulose. Enzymology and biotechnology, Technomic Publishing Company Inc., Lancaster, 1997, 272 p.

52. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 1993, 293, p. 781-788.

53. Henrissat В., Teeri Т., Warren R.A.J. A scheme for designating enzymes that hydrolase the polysaccharides in the cell walls of plants. FEBS Lett., 1998, 425, p. 352-354.

54. Xu В., Janson J.-C., Sellos D. Cloning and sequencing of a molluscan endo-p-l,4-glucanase gene from the blue mussel Mytilus edidis. Eur. J. Biochem., 2001, 268, p. 3718-3727.

55. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends Biotechnol., 1997, 15, p. 160-167.

56. Schou C., Rasmussen G., Kaltoft M.B., Henrissat В., Schiilein M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases. Eur. J. Biochem., 1993, 217, p. 947-953.

57. Rouvinen J., Bergfors Т., Teeri Т., Knowles J.K.C., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science, 1990, 249, p. 380-386.

58. Рабинович М.Л., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. Биохимия, 2002, 67, с. 1026-1050.66. binder М., Teeri T.T. The roles and function of cellulose-binding domains. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 15-28.

59. Linder M., Lindeberg G., Reinikainen Т., Teeri Т., Pettersson G. The difference in affinity between two fungal cellulose-binding domains is dominated by a single amino acid substitution. FEBS Lett., 1995, 372, p. 96-98.

60. Srisodsuk M., Lehtio J., Linder M., Margolles-Clark E., Reinikainen Т., Teeri T. Trichoderma reesei cellobiohydrolase I with an endoglucanase cellulose-binding domain: action on bacterial microcrystalline cellulose. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 49-57.

61. Gilkes N.R., Henrissat В., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A.J. Domains in microbal P-l,4-glycanases: sequence conservation, function and enzyme families. Microbiol. Rev., 1991, 55, p. 303-315.

62. Schiilein M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 71-81.

63. Karlsson J., Siika-aho M., Tenkanen M., Tjerneld F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. J. Biotechnol., 2002, 99, p. 63-68.

64. Schiilein M. Protein engineering of cellulases. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1543, p. 239252.

65. Imai Т., Boisset C., Samejima M., Igarashi K., Sugiyama J. Unidirectional processive action of cellobiohydrolase Cel7A on Valonia cellulose microcrystals. FEBS Lett., 1998, 432, p. 113116

66. Stahlberg J., Johansson G., Pettersson G. Trichoderma reesei has no true exo-cellulase: an intact and truncated cellulases produce new reducing end groups on cellulose. Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1157, p. 107-113.

67. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М„ МГУ, 2003, 201 с.

68. McCarter J.D., Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol., 1994, 4, p. 885-892.

69. White A., Rose D.R. Mechanism of catalysis by retaining p-glycosyl hydrolases. Curr. Opin. Struct. Biol., 1997, 7, p. 645-651.

70. Withers S.G., Aebersold R. Approaches to labeling and identification of active site residues in glycosidases. Protein Sci., 1995, 4, p. 361-372.

71. Davies G.J., Wilson K.S., Henrissat B. Nomenclature for sugar-binding subsites in glycosyl hydrolases. Biochem. J., 1997, 321, p. 557-559.

72. Divne C., Stahlberg J., Teeri T.T., Jones A. High-resolution crystal structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 A long tunnel of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. J. Mol. Biol., 1998, 275, p. 309-325.

73. Biely P., Vrsanska M., Claeyssens M. The endo-l,4-P-glucanase I from Trichoderma reesei. Action on p-l,4-oligomers and polymers derived from D-glucose and D-xylose. Eur. J. Biochcm., 1991, 200, p. 157-163.

74. Davies G.J., Ducros V., Lewis R.J., Borchert T.V., Schulein M. Oligosaccharide specificity of a family 7 endoglucanase: insertion of potential sugar-binding subsites. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 91-100.

75. Sandgren M., Shaw A., Ropp Т.Н., Wu S., Bott R., Cameron A.D., Stahlberg J., Mitchinson C., Jones A. The X-ray crystal structure of the Trichoderma reesei family 12 endoglucanase 3, ' Cell2A, at 1.9 A resolution. J. Mol. Biol., 2001, 308, p. 295-310.

76. Legio L.L., Larsen S. The 1,62A structure of Thermoascus aurantiacus endoglucanase: completing the structural picture of subfamilies in glycoside hydrolase family 5. FEBS Lett., 2002, 523, p. 103-108.

77. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure, 1995, 3, p. 853-859.

78. Murao S., Sakamoto R., Arai M. Cellulases of Aspergillus aculeatus. Methods Enzymol., 1988, 160, p. 274-299.

79. Tong C.C., Cole A.L., Shepherd M.G. Purification and properties of the cellulases from the thermophilic fungus Thermoascus auranticus. Biochem. J., 1980, 191, p. 83-94.

80. Шульга Т.Н. Свойства целлобиогидролаз из грибов Chrysosporium lucknowense и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2008, 125 с.

81. Schulein М. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 71-81.

82. Tuohy M.G., Walsh D.J., Murray P.G., Claeyssens M., Cuffe M.M., Savage A.V., Coughlan M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1596, p. 366-380.

83. McCarthy J.K., Uzelac A., Davis D.F., Eveleigh D.E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-P-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem., 2004, 279, p. 11495-11502.

84. Wong Y., Fincher G.B., McLachlan G.M. Kinetic properties and substrate specificities of two cellulases from Auxin treated Pea Epicolyls. J. Biol. Chem., 1977, 252, p. 1402-1407.

85. Reese E.T., Siu R.G.H., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J. Bacteriol., 1950, 59, p. 485-497.

86. Wood T.M., McCrae S.I. Purification and some properties of a 1,4-P-D-glucan glucohydrolase associated with the cellulase from the fungus Penicillium funiculosum. Carbohydr. Res., 1982, 110, p. 291-303.

87. Wood T.M., McCrae S.I. Synergism between enzymes involved in the solubilization of native cellulose. Adv. Chem. Ser., 1979,181, p. 181-209.

88. Ryu D.D.Y., Kim C., Mandels M. Competition and sorption of cellulase components and its significance in a synergistic mechanism. Biotechnol. Bioeng., 1984, 26, p. 488-496.

89. Henrissat В., Driguez H., Viet C., Schulein M. Synergism of cellulase from Trichoderma reesei in degradation of cellulose. Bio. Technology, 1985, 3, p. 722-726.

90. Fujii M., Shimizu M. Synergism of endoenzyme and exoenzyme on hydrolysis of soluble cellulose derivatives. Biotechnol. Bioeng., 1986, 28, p. 878-882.

91. Синицын А.П., Митькевич О.В., Калюжный С.В., Клесов А.А. Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса. Биотехнология, 1987, 3, с. 39-46.

92. Рабинович M.JL, Клесов А.А., Черноглазов В.М., Вьет В.Н., Березин И.В. Эффективность адсорбции целлюлолитических ферментов — фактор, определяющий реакционную способность нерастворимой (кристаллической) целлюлозы. Докл. АН СССР, 1981,260, с. 1481-1486.

93. Клесов А.А., Черноглазов В.М., Рабинович M.JL, Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы. Биоорг. химия, 1982, 8, с. 643-651.

94. Синицын А.П., Наджеми Б., Митькевич О.В., Клесов А.А. Взаимное усиление гидролитического действия прочно и слабо адсорбирующихся целлюлазных препаратов. Прикл. биохим. микробиол., 1986, 22, с. 333-336.

95. Klyosov А.А. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation. Biochem., 1990, 129, p. 10577-10585.

96. Гусаков А.В. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: фундаментальные и прикладные аспекты. Диссертация на соискание ученой степени д-ра. хим. наук, М., МГУ, 2005, 385 с.

97. Сипицын А.П., Митькевич О.В. Различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целлюлолитических ферментов. Биотехнология, 1987, 3, с. 227-233.

98. Eriksson Т., Karlsson J., Tjerneld F. A model explaining declining rate in hydrolysis of lignocellulose substrates with cellobiohydrolase I (Cel7A) and endoglucanase I (Cel7B) of Trichoderma reesei. Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 101, p. 41-60.

99. Bothwell M.K., Wilson D.B., Irwin D.C., Walker L.P. Binding reversibility and surface exchange of Thermomonospora fusca E3 and E5 and Trichoderma reesei CBH I. Enzyme Microb. Technol., 1997, 20, p. 411-417.

100. Jervis E.J., Haynes C.A., Kilburn D.G. Surface diffusion of cellulases and their isolated binding domains on cellulose. J. Biol. Chem., 1997, 272, p. 24016-24023.

101. Beldman G., Voragen A.G.J., Rombouts F.M., Searle-van-Leeuven M.F., Pilnik W. Adsorption an kinetic behavior of purified endoglucanases and exoglucanases from Trichoderma reesei. Biotechnol. Bioeng., 1987, 30, p. 251-257.

102. Ong E., Greenwood J., Gilkes N., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.AJ. The cellulase-binding domains od cellulases: tools for biotechnology. Trends Biotechnol., 1989, 7, p. 239-243.

103. Milward-Sadler S.J., Poole D., Henrissat В., Hazlewood G., Clarke J.H., Gilbert H.J. Evidence for a general role for high-affinity non-catalytic domains in microbial plant cell wall hydrolases. Mol. Microbiol., 1994, 11, p. 375-382.

104. Esteghlalian A.R., Srivastava V., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Warren R.A.J., Saddler J.N. Do cellulose binding domains increase substrate accessibility? Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93, p. 575-592.

105. Krull L.H., Dintzis F.R., Griffin H.L., Baker F.L. A microfibril-generating factor from the cellulase of Trichoderma reesei. Biotechnol. Bioeng., 1988, 31, p. 321-327.

106. Banka R.R., Mishra S., Ghose Т.К. Fibril formation from cellulose by a novel protein from Trichoderma reesei'. a non-hydrolytic cellulolytic component. World J. Microbiol. Biotechnol., 1998, 14, p. 551-558.

107. Banka R.R., Mishra S. Adsorption properties of the fibril forming protein from Trichoderma reesei. Enzyme Microb. Technol., 2002, 31, p. 784-793.

108. Din N., Gilkes N.R., Tekant В., Miller R.C., Warren R.A.J., Kilburn D.K. Non-hydrolytic disruption of cellulose fibers by the binding domain of a bacterial cellulase. Bio Technology, 1991, 9, p. 1096-1099.

109. Xiao Z., Gao P., Qu Y., Wang T. Cellulose-binding domain of endoglucanase III from Trichoderma reesei disrupting the structure of cellulose. Biotechnol. Lett., 2001, 23, p. 711-715.

110. Рабинович М.Л., Мельник M.C., Болобова A.B. Целлюлазы микроорганизмов. Прикл. биохим. микробиол., 2002, 38, с. 355-373.

111. Клесов А.А., Рабинович M.JL, Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. П. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников. Биоорг. химия, 1980, 6, с. 1225-1241.

112. Gusakov A.V., Sinitsyn А.Р., Manenkova J.A., Protas O.V. Enzymatic sacharification of industrial and agricultural lignocellulosic wastes. Appl. Biochem. Biotechnol., 1992, 34, p. 625637.

113. Клесов А.А., Синицын А.П. Ферментативный гидролиз целлюлозы. IV. Влияние физико-химических и структурных факторов на эффективность ферментативного гидролиза Биоорг. химия, 1981, 7, с. 1801-1812.

114. Nystrom J.M., Andren R.K., Allen A.L. Enzymatic hydrolysis of cellulosic waste: the status of process technology and economic accessment. AIChE Symp. Ser., 1978, 74, p. 82-88.

115. Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов A.A. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса. Биохимия, 1982, 47, с. 1322-1331.

116. Синицын А.П., Митькевич О.В., Клесов А.А. Инактивация препаратов ферментов целлюлазного комплекса при перемешивании и стабилизация целлюлозой. Прикл. биохим. микробиол., 1986, 2, с. 759-765.

117. Prior В.А., Day D.F. Hydrolysis of ammonia-pretreated sugar cane bagasse with cellulase, beta-glucosidase, and hemicellulase preparations. Appl. Biochem. Biotechnol., 2008, 146, p. 151-164.

118. Sukumaran R.K., Singhania R.R., Mathew G.M. and Mathew P.A. Cellulase production using biomass feed stock and its application in lignocellulose saccharification for bio-ethanol production. Renewable Energy, 2009, 34, p. 421-424.

119. Saddler J.N. Screening of highly cellulolitic fungi and the action of their cellulase enzyme systems. Enzyme Microb. Technol., 1982,4, p. 414-418.

120. Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов A.A. Влияние состава целлюлазного препарата на эффективность ферментативного гидролиза хлопкового линта. Химия древесины, 1982, 2, с. 91-96.

121. Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов А.А. Ферментативное получение глюкозы из целлюлозы: влияние ингибирования продуктами и изменение реакционной способности субстрата на скорость ферментативного гидролиза. Прикл. биохим. микробиол., 1981, 17, с. 315-321.

122. Морозов A.M., Рабинович M.JI., Клесов А.А. Биотехнология непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозы. II. Гидродинамическое сопротивление аппарата колоночного типа. Биотехнология, 1986, 5, с. 52-59.

123. Chen Н., Jin S. Effect of ethanol and yeast on cellulase activity and hydrolysis of crystalline cellulose. Enzyme Microb. Technol., 2006, 39, p. 1430-1432.

124. Wu Z., Lee Y.Y. Inhibition of the enzymatic hydrolysis of cellulose by ethanol. Biotechnol. Lett., 1997, 19, p. 977-979.

125. Клесов А.А., Черноглазое B.M., Ермолова O.B., Елкин B.B. Влияние лигнина на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов. Биотехнология, 1985, 3, с. 106112.

126. Yang В., Willies D.M., Wyman С.Е. Changes in the enzymatic hydrolysis rate of avicel cellulose with conversion. Biotechnol. Bioeng., 2006, 94, p. 1121-1128.

127. Neilson M.J., Kelsey R.G., Shafizadeh F. Enhacement of enzymatic hydrolysis by simultaneous attrition of cellulose substrates. Biotechnol. Bioeng., 1982, 24, p. 293-304.

128. Berlin A., Balakshin M., Gilkes N., Kadla J., Maximenko V., Kubo S., Saddler J. Inhibition of cellulase, xylanase and beta-glucosidase activities by softwood lignin preparations. J. Biotechnol., 2006, 125, p. 198-209.

129. Palonen H., Tjerneld F., Zacchi G., Tenkanen M. Adsorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin. J. Biotechnol., 2004, 107, p. 65-72.

130. Kristensen J.B., Borjesson J., Bruun M.H., Tjerneld F., Jorgensen H. Use of surface active additives in enzymatic hydrolysis of wheat straw lignocellulose. Enzyme Microb. Technol., 2007, 40, p. 888-895.

131. Boijesson J., Engqvist M., Sipos В., Tjerneld F. Effect of poly(ethylene glycol) on enzymatic hydrolysis and adsorption of cellulase enzymes to pretreated lignocellulose. Enzyme Microb. Technol., 2007, 41, p. 186-195.

132. Dunnett A.J., Adjiman C.S. and Shah N. A spatially explicit whole-system model of the lignocellulosic bioethanol supply chain: an assessment of decentralised processing potential. Biotechnol. Biofuels., 2008, 1, p. 13.

133. Lin Y., Tanaka S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Appl. Microb. Biotechnol., 2006, 69, p. 627-642.

134. Olofsson К., Bertillson M., Liden G. A short review on SSF an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks. Biotechnology for Biofuels, 2008, 1, p. 7.

135. Severian D.: Polysaccharides: Structural diversity and functional versatility. Marcel Dekker, New York, 2005, p. 957-984.

136. Chung K.C., Kawai K., Yashima S., Eguchi Y. Purification of cellulolitic enzymes by Penicillium verruculosum. Hakkokogaki-kaishi., 1982, 60, p. 363-367.

137. Берлин A.X. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1999, с.

138. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М., Элвар, 2000, с. 13-288.

139. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1998,156 с.

140. Гутиеррес Родригес Б. Каталитические, биохимические и биотехнологические свойства эндоглюканазы В4 целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1997, 116 с.

141. Сахаров И.Ю., Зоров И.Н., Синицын А.П. Выделение эндоглюканазы Penicillium verruculosum методом иммуноафшшой хроматографии. Биохимия, 1996, 61, с. 1658-1663.

142. Устинов Б.Б. Свойства ксиланаз Chrysosporium lucbiowense. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006, 148 с.

143. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1944, 153, p. 375-379.

144. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1952, 195, p. 19-23.

145. Ghose, Т.К. Measurement of cellulase activity. Pure Appl. Chem., 1987, 59, p. 257-268.

146. Doner L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate. Anal. Biochem., 1992, 202, p. 50-53.

147. Березин И.В., Рабинович M.JI., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, 42, с. 1631-1636.

148. Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to modern liquid chromatography (2nd ed.). New York, Wiley-Interscience, 1979, 863 p.

149. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, 543 с.

150. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Биотехнология, 25, 152 с.

151. Рабинович M.JL, Клесов А.А., Григораш С.Ю., Калнина И.А., Черноглазов В.М. Ферментативный гидролиз целлюлозы. VI. Адсорбция целлобиазы целлюлазного комплекса на целлюлозе. Биоорг. химия, 1982, 8, с. 84-94.

152. Peitsch М.С. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling. Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, p. 274-279.

153. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modelling. Electrophoresis, 1997, 18, p. 2714-2723.

154. Yattes J.R. Mass-spectrometry and age of proteome. J. Mass Spectrom., 1998, 33, p.1-19

155. Varghese J.N., Hrmova M., Fincher G.B. Three-dimensional structure of a barley P~D-glucan exohydrolase, a family 3 glycosyl hydrolase. Structure, 1999, 7, p. 179-190.

156. Dan S., Marton I., Dekel M., Bravdo B.-A., He S., Withers S.G., Shoseyov O. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger P-glucosidase. J. Biologic. Chem., 2000, 275, p. 4973-4980.