Биофармацевтический анализ прокаинамида в моче и слюне для оценки фенотипа ацетилирования организма человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Нугбиеньо Лоуренс Кабла Адану Бамиделе

• Нугбиеньо Лоуренс Кабла Адану Бамиделе
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Нугбиеньо Лоуренс Кабла Адану Бамиделе

Введение.................................................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы..........................................................................................11

1.1. Биофармацевтический анализ как основа персонализации фармакотерапии...............................................................................................11

1.2. Процессы ацетилирования лекарственных средств................................16

1.3. Фармакокинетика и метаболизм прокаинамида в организме человека....................................................................................24

1.4. Методы определения прокаинамида в биологических объектах и лекарственных средствах...................................................................................27

1.5. Проточные методы в фармацевтическом анализе.....................................36

Глава 2. Экспериментальная часть.............................................................................42

2.1. Используемые реактивы и растворы..........................................................42

2.2. Синтез К-ацетилпрокаинамида..................................................................42

2.3. Аппаратура и приборное обеспечение измерений...................................46

2.4. Автоматизированная проточная процедура пробоподготовки с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием...................................................48

2.5. Определение прокаинамида методом капиллярного электрофореза......................................................................................................50

2.6. Аппаратурная схема жидкостной экстракции в системе циклического инжекционного анализа......................................................................................51

2.7. Отбор проб мочи...........................................................................................51

2.8. Отбор проб слюны........................................................................................52

2.9. Критерии включения и исключения здоровых добровольцев при исследовании активности фермента К-ацетилтрансферазы.......................53

Глава 3. Хроматографическое определение прокаинамида в биологических

жидкостях.......................................................................................................................54

3.1. Хроматографическое разделение прокаинамида и его ацетильного метаболита в моче и слюне................................................................................54

3.2. Количественное определение прокаинамида и его ацетильного метаболита в моче, слюне и валидация

методики...........................................................................................................63

Глава 4. Проточное определение прокаинамида в биологических жидкостях...........................................................................................69

4.1. Проточное экстракционное извлечение прокаинамида из образцов мочи в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии........................69

4.1.1. Влияние природы высахаривающего реагента.......................................69

4.1.2. Влияние соотношения фаз, рН и времени извлечения................................................................................71

4.1.3. Мешающее влияние компонентов мочи и аналитические характеристики методики...............................................................74

4.2. Циклическое инжекционное определение прокаинамида в слюне с микроконцентрированием со спектрофлуориметрическим детектированием........................................................................76

4.2.1 Влияние разбавления и объема растворителя...........................................................................................79

4.2.2 Влияние соотношения объема растворителя и пробы, рН и времени смешивания фаз..........................................................................81

4.2.3 Мешающее влияние компонентов слюны и аналитические характеристики методики...............................................................82

Глава 5. Установление фенотипа ацетилирования на основе оценки экскреции прокаинамида с мочой и слюной................................................................................84

5.1 Методология оценки генетически детерминированных процессов ацетилирования прокаинамида........................................................84

5.2 Оценка фенотипа ацетилирования на основе экскреции прокаинамида мочой и слюной........................................................91

Заключение....................................................................................................................97

Список сокращений и условных обозначений..........................................................99

Список литературы...................................................................................................100

Приложения.....................................................................................128

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биофармацевтический анализ прокаинамида в моче и слюне для оценки фенотипа ацетилирования организма человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы и степень ее разработанности. Биофармацевтический анализ играет большую роль в обеспечении безопасности и эффективности применения лекарственных средств (ЛС) - важной части персонализированной медицины. При использовании методов биофармацевтического анализа возможно установление индивидуальных особенностей фармакокинетики и метаболизма ЛС для конкретных пациентов, а также оптимизация режимов их дозирования при проведении фармакотерапии различных заболеваний.

Одним из путей биотрансформации ЛС являются генетически детерминированные процессы ацетилирования при участии фермента N-ацетилтрансферазы (NAT) печени, у человека при этом сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма. Путем N-ацетилирования происходит метаболизм прокаинамида (4-амино-Ы-[2-(диэтиламино)этил]бензамида, ПА) -лекарственного препарата, который широко применяется для лечения сердечной аритмии, различия в скорости метаболизма которого позволяют использовать его и в качестве тест-препарата для оценки активности NAT организма человека. Однако, в этом случае чаще всего фенотипирование проводят по оценке содержания ПА или его основного метаболита N-ацетилпрокаинамида (NAPA) в пробах крови, что имеет ограничения по применению этих способов на практике.

Перспективным направлением развития фармацевтической химии является разработка неинвазивных подходов по биофармацевтическому анализу для оценки индивидуальных особенностей фармакокинетики тест-препаратов ацетилирования в моче и слюне. При этом постоянно возрастающее число анализов этих биосред требует разработки новых автоматизированных и миниатюризированных методов, позволяющих повысить надежность, чувствительность и производительность анализа, а также снизить трудозатраты и расходы реагентов.

Научным консультантом по диссертационной работе являлся доктор хим. наук, профессор РАН Булатов А.В.

Для решения этих задач перспективно использование проточных методов анализа. Однако существуют проблемы, ограничивающие возможности проточных методов при анализе биологических жидкостей, как правило, это низкая селективность и недостаточная чувствительность определений. Эти проблемы могут быть устранены с помощью использования эффективных приемов пробоподготовки в условиях проточного анализа. При этом создание новых автоматизированных методов пробоподготовки является одним из трендов в области развития методологии проточного биофармацевтического анализа.

Диссертационная работа выполнялась при поддержке Гранта РФФИ № 1633-50090 «Микроэкстракционное концентрирование лекарственных средств для последующего проточного определения в биологических жидкостях».

Цель работы состояла в разработке хроматографических и спектрофлуориметрических способов определения ПА в биологических жидкостях, их автоматизации с помощью проточного анализа, а также оценке фармакокинетических параметров при выведении тест-препарата из организма человека для косвенного установления фенотипа ацетилирования.

Для достижения поставленых целей решались следующие задачи:

- изучить условия разделения и режимы элюирования в варианте обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), провести расчет и оценку параметров пригодности хроматографической системы при разработке методик хроматографического определения ПА и его ацетильного метаболита в моче и слюне;

- установить возможности применения жидкостной экстракции ПА с использованием высахаривающих реагентов для пробоподготовки мочи, на этой основе разработать процедуру автоматизированного проточного экстракционно-хроматографического определения ПА в моче при использовании системы обращенно-фазной ВЭЖХ;

- выявить факторы, обеспечивающие чувствительность и избирательность спектрофлуориметрического определения ПА в слюне, разработать простой подход для автоматизации процедуры жидкостной экстракции ПА с

использованием глубоко эвтектических растворителей в системе циклического инжекционного анализа (ЦИА) со спектрофлуориметрическим детектирированием;

- оценить влияние компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в условиях ВЭЖХ, спектрофлуориметрии и ЦИА аналитический сигнал, определить метрологические характеристики разработанных способов для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для фармацевтического анализа;

- провести расчет и оценку фармакокинетических параметров экскреции ПА с мочой и слюной у здоровых добровольцев, разработать на этой основе экспрессные способы установления активности КАТ.

Научная новизна работы:

- установлены условия хроматографического разделения ПА и его ацетильного метаболита в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ, выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих веществ в биологических жидкостях организма человека;

- найдены и обоснованы рабочие условия чувствительного и избирательного определения ПА и его ацетильного метаболита в моче и слюне методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрированием;

- впервые разработаны автоматизированные способы экстракции ПА из мочи с использованием высахаривающих реагентов в условиях проточного анализа с последующим ВЭЖХ определением, обеспечивающие высокую степень извлечения и чувствительность определений тест-препарата процессов ацетилирования;

- установлены условия чувствительного спектрофлуориметрического определения ПА в слюне, и впервые показана возможность применения глубоко эвтектических растворителей для микроэкстракционного концентрирования ПА из проб слюны при циклическом инжекционном анализе со спектрофлуориметрическим детектированием;

- разработаны способы косвенного определения активности N ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров ПА при его экскреции с мочой, оценке уровня его содержаний в слюне с применением ВЭЖХ, ЦИА со спектрофлуориметрическим детектированием и обосновано их использование для персонализации лекарственной терапии.

Теоретическая и практическая значимость состоит в том, что разработаны новые способы оценки активности ферментной системы ацетилирования на основе спектрофлуориметрического и хроматографического определения, в том числе с автоматизированной пробоподготовкой в проточной системе, циклического инжекционного определения содержания ПА в моче и слюне. На их основе предложены неинвазивные диагностические тесты для оценки индивидуальной активности метаболической системы ацетилирования организма человека, которые могут быть рекомендованы при персонализированном применении лекарственных средств.

Результаты исследования внедрены в медицинских учреждениях Управления здавоохранения г. Казани, Научно-образовательном центре фармацевтики ФГАОУ ВО «Казанский (Привожский) федеральный университет» и в учебный процесс ФГБОУ ВО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» в дисциплинах «Контроль качества и стандартизация лекарственных средств и биологически активных соединений» и «Основы токсикологии и фармакологии».

Методология и методы исследований. При проведении биофармацевтического анализа использовали обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию, спектрофлуориметрию, капиллярный электрофорез, проточные системы циклического инжекционного анализа. Для установления структуры синтезированного метаболита гидрохлорида и основания NАРА использованы методы ИК- и ЯМР 1Н спектроскопии.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографического разделения ПА и его ацетильного метаболита в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ;

- результаты изучения влияния состава и рН подвижной фазы, условий элюирования, валидационных данных по оценке пригодности предложенных хроматографических систем и свойств ЛВ на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования ПА и его ацетильного метаболита при их анализе в моче и слюне;

- результаты по экстракции ПА из мочи и выбору высахаривающего реагента, влиянию его концентрации, рН, соотношения и времени контакта фаз в условиях проточного анализа на степень извлечения лекарственного вещества;

- обоснование и подбор оптимальных условий микроэкстракционного концентрирования ПА из проб слюны в проточной системе при использовании глубоко эвтектического растворителя на основе холина хлорида и глицерина, их соотношения, а также объемов и времени контактирующих фаз, влияния рН на эффективность извлечения, чувствительность и избирательность ЦИА со спектрофлуориметрическим детектированием;

- результаты исследования метрологических характеристик разработанных способов определения, полученные путем обработки экспериментального материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для биофармацевтических методов анализа;

- результаты расчета и анализа фармакокинетических параметров ПА и его ацетильного метаболита в биологических жидкостях и оптимизации критериев фенотипирования для экспрессной и точной оценки индивидуальной активности ферментных систем ацетилирования;

- способы определения индивидуальной активности К-ацетилтрансферазы, основанные на биофармацевтическом анализе фармакокинетических параметров ПА в моче и слюне.

Степень достоверности и апробация результатов работы. Достоверность полученных результатов обеспечена использованием современных методов

высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрофлуориметрии в условиях ЦИА, капиллярного электрофореза, ИК- и ЯМР 1Н спектроскопии, а также математической статистики при обработке экспериментальных результатов.

Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на I Mеждисциплинарной конференции «Современные решения для исследования природных, синтетических и биологических материалов» (Санкт-Петербург, 2014), III Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы химической науки и фармации» (Чебоксары, 2014), I Всероссийской конференции с международным участием «Химический анализ и медицина» (Москва, 2015), X Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой (Уфа, 2015), Вьетнамо-российской международной научной конференции (Вьетнам, Ханой, 2015), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 2015), 20th Международной конференции «International Conference on Flow Injection Analysis and Related Techniques» (Spain, Mallorca, 2016), ХХ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 2016), ХХШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2016), ХХ Всероссийской конференции молодых учёных-химиков с международным участием (Нижний Новгород, 2017).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно п. 4 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Публикации: Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 15 печатных изданиях, включая 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых для размещения материалов диссертаций, 1 статью и 10 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 226 источников. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и 13 таблицами.

Личный вклад автора в опубликованных в соавторстве работах состоит в выборе и обосновании методик эксперимента, непосредственном его проведении, в участии во всей процедуре анализа и обобщении полученных экспериментальных результатов, расчете фармакокинетических параметров, установлении закономерностей и формулировке выводов.

Благодарности. Автор работы выражает глубокую благодарность научному руководителю д.х.н., профессору Гармонову С.Ю. и научному консультанту д.х.н., профессору Булатову А.В. за руководство и помощь при выполнении и написании работы; д.х.н., профессору Бухарову С.В. за помощь в синтезе метаболитов; к.х.н. Салахову И.А за помощь в проведении хроматографических исследований.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биофармацевтический анализ как основа персонализации

фармакотерапии

Биофармацевтический анализ является одним из видов фармацевтического анализа, включающий извлечение, концентрирование, определение лекарственных веществ (ЛВ) и их метаболитов в биологических объектах (биологических жидкостях, тканях внутренних органов), а также предусмотривающий исследования генетически детерминированных процессов метаболизма ЛВ в организме человека (таблица 1.1) [1].

Таблица 1.1 - Генетический контроль над ферментными системами

Ферментная система Лекарственные вещества Процесс метаболизма

Низкая активность N ацетилтрансферазы Амины, амиды, индолы, гидразины, гидразиды Ацетилирование

Низкая активность каталазы Пероксиды Распад пероксидов

Низкая активность глюкуронилтрансферазы Антибиотики, барбитураты, опиаты, сульфаниламиды Образование глюкуронидов

Низкая активность арилэстеразы Сложные эфиры Гидролиз эфиров

Низкая активность монооксигеназной системы печени Разнообразные лекарственные средства Микросомальное окисление

Биофармацевтический анализ позволяет получать информацию о действии лекарственных средств в организме в зависимости от физико-химических свойств и степени дисперсности компонентов лекарственного препарата, а также

вспомогательных веществ лекарственной формы и технологических процессов её изготовления. Количественная оценка процессов биотрансформации и знание ее механизма позволяет персонализировать дозы лекарственных препаратов, оценивать риск возможных нежелательных побочных эффектов, а также проводить правильное комбинирование лекарств. Основным подходом изучения механизмов биотрансформации ЛС в организме человека является установление структуры метаболитов, расчет и оценка фармакокинетических параметров.

Биофармацевтический анализ широко применяется в персонализированной медицине для диагностики генетически детерминированных особенностей пациентов с помощью тест-маркеров и последующему назначению индивидуальной терапии, соответствующей молекулярному профилю больных [2]. В связи с этим персонализированная медицина имеет перспективы улучшения качества медицинской помощи и, в некоторых случаях, сокращения расходов на здравоохранение в целом [3]. Знание молекулярных основ заболеваний позволяет идентифицировать биомишени, отвечающие за биотрансформацию соединений и усовершенствовать назначение лекарственных препаратов, что фундаментально изменяет фармацевтическую практику [4]. В настоящее время разработка индивидуальных подходов к лекарственной терапии представляет собой важную часть персонализированной медицины, которая применяется все чаще во многих областях клинической практики, поскольку обнаруживаются гены, связанные с определенными заболеваниями. В настоящее время в некоторых областях медицины систематически применяется прогнозирование рисков для пациентов непосредственно в процессе лечения, в то время как в других областях требуется гороздо больше исследований для выяснения молекулярных основ заболеваний для индивидуального лечения [5].

Как известно, эффективность методов медицинского лечения большинства заболеваний человека подтверждается доказательной медициной. Стратегия лечения, в том числе, применения ЛС, также определяется этими принципами и клиническими стандартами лечения заболеваний, разработанных на ее основе. Персонализированные подходы к терапии позволяют частично решать и

проблему развития нежелательных побочных лекарственных реакций. При этом, безопасность лекарственной терапии зависит от индивидуальных особенностей организма, поэтому применение ЛС требует персонализированного подхода к каждому индивидуальному человеку. Таким образом, персонализированная медицина позволяет повысить безопасность применения ЛС и сократить расходы на коррекцию нежелательных реакций. При этом помимо развития молекулярно-генетических подходов, в персонализированной медицине осуществляются исследования биомаркеров в биологических жидкостях (как правило, определенных белков), которые позволяют прогнозировать развитие тех или иных заболеваний. Также, в качестве современных инструментов персонализированной медицины появились такие направления, как изучение деятельности генов на основе изучения матричных РНК и метаболических процессов ЛВ [6]. Генетические особенности процессов метаболизма, возраст, пол, наличие заболеваний и другие средовые факторы существенно влияют на фармакодинамику и фармакокинетику, а также на терапевтический эффект применяемых ЛС. В связи с этим, их исследование является предпосылкой для персонализации терапии [7].

В результате метаболизма происходит изменение фармакологической активности ЛС по следующим направлениям:

- фармакологически активное вещество превращается в неактивное;

- фармакологически активное вещество превращается в другое активное вещество, т.е. образует активные метаболиты;

- фармакологически неактивные вещества, так называемые пролекарства, превращаются в активные.

Реакции метаболизма ЛС делятся на две фазы - I и II . Реакции фазы I — несинтетические реакции. При этом из лекарственных средств образуются гидрофильные соединения вследствие присоединения или освобождения активных функциональных групп. Основные реакции фазы I — реакции окисления, из них наиболее распространена реакция гидроксилирования. Катализаторами этих реакций служат оксидазы, субстратная специфичность

которых весьма низка. Следовательно, оксидазы участвуют в окислении лекарственных веществ различной химической структуры. Менее распространены реакции восстановления и гидролиза. Реакции II фазы метаболизма представляют собой конъюгацию ЛВ или их метаболитов с эндогенными веществами с образованием водорастворимых полярных конъюгатов, легко выводимых почками или с жёлчью. Наиболее распространённые реакции II фазы включают реакции ацетилирования, сульфатирования, глюкуронирования, метилирования и водной конъюгации. Ксенобиотики в результате реакций II фазы утрачивают биологическую активность, однако возможно образование и активных метаболитов [8]. Метаболизм ЛС может осуществляться путем реакции фазы I или II, одновременно обеих (одна часть ЛС — в первой, другая — во второй), или последовательно каждой из них [9].

Реакция ацетилирования под действием К-ацетилтрансферазы гепатоцитов является одним из важных путей биотрансформации ЛС. Скорость процесса ацетилирования является генетически детерминированной, причем полиморфизм генов фермента К-ацетилтрансферазы приводит к метаболическому полиморфизму по бимодальному распределению (медленный и быстрый фенотипы ацетилирования). Определение фенотипа ацетилирования служит в качестве фенотипического маркера оценкой предрасположенности человека к заболеваниям, а также для прогнозирования побочных эффектов ЛС [7].

Решение задач персонализированной медицины требует применения технологий и подходов биофармацевтического анализа [10] и молекулярно-генетических методов, которые применяются в фармакогенетике [11], фармакогеномике [12] и фармакопротеомике [13].

Методы биофармацевтического анализа позволяют детектировать генетически детерминированные процессы биотрансформации и регистрировать биохимический фенотип [14]. Следует отметить, что биологические жидкости организма человека в качестве основного объекта биофармацевтического анализа являются сложными многокомпонентными матрицами [15-17], что усложняет выполнение биофармацевтического анализа на практике.

Известно, что экспрессия генов, отвечающих за синтез ферментов метаболизма, влияет на фармакокинетику и фармакодинамику лекарственных веществ [18-20]. Процессы метаболизма ЛС в организме человека могут вызывать побочные эффекты для пациентов с высокой активностью ферментов стадии функционализации и низкой активностью ферментов стадии сопряжения по сравнению с пациентами с противоположной активностью ферментов [21].

Молекулярно-генетические методы позволяют выявлять вариации первичной структуры исследуемого участка ДНК путем идентификации последовательности азотистых оснований. При этом молекулярно-генетические анализы включают пробоподготовку образцов ДНК или РНК, рестрикцию ДНК на фрагменты и их последующую идентификацию различными физико-химическими методами [22]. Определение фенотипа метаболизма различается на уровне от продуктов гена до конечных метаболитов. Соответственно существенным фактором является дополнение молекулярно-генетических методов биофармацевтическими анализами, поскольку первые описывают генотип, а вторые определяют фенотип [23,24]. Следует отметить, что именно следствием фенотипа организма является особенности течения заболевания и токсические действия ЛС.

Методы биофармацевтического анализа должны обладать высокой чувствительностью, достаточной избирательностью, включать простую пробоподготовку, давать возможность работы с малыми объемами проб, отличаться универсальностью, производительностью и возможностью автоматизации [25]. Современные физико-химические методы анализа в основном отвечают требованиям, предъявляемым к биофармацевтическому анализу [26]. В настоящее время содержание ЛС и их метаболитов в биологических объектах достаточно быстро определяют с помощью хроматографических, спектрофлуориметрических, спектрофотометрических, иммуноферментных методов, капиллярного электрофореза и других методов [27-29].

Актуальную задачу представляют собой фармакокинетические исследования ЛС в целях расчета режимов дозирования препаратов, учитывая

индивидуальные вариабельности фенотипа генетически детерминированных систем биотрансформации [30]. Выбор оптимальных доз ЛС является одной из основных задач персонализированной медицины. Анализ фармакокинетических параметров позволяет прогнозировать, оценивать, рассчитывать и сопоставлять схемы дозирования ЛС, что обеспечивает их более безопасное применение [31].

1.2 Процессы ацетилирования лекарственных средств

У разных людей наблюдается различная активность N-ацетилтрансферазы (NAT) — фермента, катализирующего реакции конъюгации ариламинов, в том числе и ПА. Ацетилирование протекает с меньшей скоростью для медленных ацетиляторов, а у быстрых ацетиляторов реакция идет в несколько раз быстрее. Полиморфизм фермента может определить метаболизм ЛС, если он преимущественно протекает путем ацетилирования. В разных этнических группах имеются отличия соотношение быстрых и медленных ацетиляторов (таблица 1.2). Так, например, у японцев медленные ацетиляторы составляют 10-12 %, у египтян их доля до 82 %, а у негроидов и эвропеоидов соотношение быстрых и медленных ацетиляторов приблизительно равное [1,9].

На пациентах, применяющих гидразид изоникотиновой кислоты (ГИНК, изониазид), полиморфизм N-ацетилирования был идентифицирован в конце 40-х годов. Индивидуальные пациенты были фенотипированы как «быстрые» и «медленные» ацетиляторы. Изофермент NAT2 имеет в 10 раз меньшее значение константы Михаэлиса-Ментен (Км) для метаболизма ароматических аминов, чем NAT1. При этом доказано, что за фенотип быстрого и медленного ацетилирования ответственен ген NAT2, кодирующий фермент NAT2 [32].

Таблица 1.2 - Частотность медленных ацетиляторов различных этнических групп

Популяция Частотность медленного фенотипа, %

Амхара (Эфиопия) 83

Арабы Египта 83

Афроамериканцы 51

Белое население США 58

Бушмены 30

Индийцы 58

Итальянцы США 64

Китайцы 15

Корейцы 10

Немцы 44

Норвежцы 52

Русские 52

Саами 28

Скандинавы США 67

Судан 65

Финны 64

Эскимосы Канады 5

Эскимосы Северной Аляски 27

Эскимосы Южной Аляски 18

Японцы 11

Фенотипирование полиморфизма ацетилирования чаще всего проводится фармакокинетическими исследованиями сульфаниламидов, производных п-амино- салициловой кислоты, ГИНК и диафенилсульфона в крови или при их экскреции с мочой. Определение активности NAT осуществляется тест-маркерами процесса ацетилирования, в качестве которых используют ЛС, содержащие аминные функциональные группы (рисунок 1.1), а также продукты их метаболизма и ацетилирующиеся эндогенные соединения организма человека — гистамин, холин и серотонин [33].

Сульфадимезин Фенелзин Дапсон

Рисунок 1.1 — Структура основных лекарственных препаратов, метаболизирующихся путем ацетилирования в организме человека

Оценка активности фермента NАТ и фенотипирование процесса ацетилирования у конкретных пациентов важно для выявления возможных возникающих побочных эффектов ЛС и персонализации лекарственной терапии. При этом значительно меньшая доза данного лекарственного препарата должна назначаться для медленных ацетиляторов, а большая доза того же препарата предпочтительна для пациентов с быстрым фенотипом ацетилирования [34]. По методу Браттона-Маршала [35] определение активности системы ферментов NAT2 широко осуществляется с помощью тест-маркера сульфадимезина. При этом проводилась оценка содержания не метаболизировавшегося тест-препарата в моче за 6 часов после его однократного приема (500 мгper os) [36,37]. Также, для определения фенотипа ацетилирования, в плазме крови было определено отношение концентрации моноацетилдапсона к дапсону методом ВЭЖХ в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Нугбиеньо Лоуренс Кабла Адану Бамиделе, 2017 год

АКТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

результатов научно-исследовательских работ

Настоящим актом подтверждается, что результаты кандидатской диссертации НУГБИЕНЬО Лоуренс Кабла Адану Бамиделе «Биофармацевтический анализ прокаинамида в моче и слюне для оценки фенотипа ацетилирования организма человека» на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия (научный руководитель - д.х.н., профессор Гармонов С.Ю.) могут быть использованы при проведении фармакокинетических исследований и оптимизации доз лекарственных средств.

Автором разработан комплекс методик ВЭЖХ анализа, в том числе с автоматизированной пробоподготовкой в проточной системе, спектрофлуориметрического и циклического инжекционного определения прокаинамида в моче и слюне. На основе этих методик предложены неинвазивные диагностические тесты для оценки индивидуальной активности метаболической системы ацетилирования организма человека которые могут быть рекомендованы как лабораторные исследования при персонализированном применении лекарственных средств.

УТВЕРЖДАЮ Проректор по научной деятельности и интеграции с производством Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Казанский национальный

АКТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ

Комиссия в составе: председателя, заведующего кафедрой аналитической химии, сертификации и менеджмента качества, д.х.н., профессора Сопина В.Ф., членов: д.х.н., профессора Юсупова P.A., д.х.н., профессора Гармонова С.Ю. подтверждает, что результаты кандидатской диссертации НУГБИЕНЬО Лоуренс Кабла Адану Бамиделе «Биофармацевтический анализ прокаинамида в моче и слюне для оценки фенотипа ацетилирования организма человека» использованы в учебном процессе ФГБОУВО «КНИТУ» при изучении студентами дисциплин «Контроль качества и стандартизация лекарственных средств и биологически активных соединений» и «Основы токсикологии и фармакологии».

11редседатель комиссии:

Сопин В.Ф.

Юсупов P.A. Гармонов С.Ю.