Бинарные рибозимы "головка молотка" тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Воробьева, Мария Александровна

• Воробьева, Мария Александровна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Воробьева, Мария Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. КОНСТРУИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА РИБОЗИМОВ «ГОЛОВКА МОЛОТКА» (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Строение и свойства рибозима «головка молотка»

1.1.1. Разделение рибозима «головка молотка» на субстратную и каталитическую части

1.1.2. Субстратная специфичность рибозима

1.1.3. Пространственная структура рибозима «головка молотка»

1.1.4. Роль ионов двухвалентных металлов в расщеплении РНК рибозимом «головка молотка»

1.1.5. Кинетическая схема расщепления РНК рибозимом «головка молотка»

1.2. Создание искусственных рибозимов «головка молотка» для направленного расщепления РНК

1.2.1. Минимизация длины рибозима «головка молотка»

1.2.1.1. Минизимы

1.2.1.2. Димерные минизимы

1.2.1.3. Рибозимы, содержащие ненуклеотидные вставки

1.2.1.4. Двухкомпонентные рибозимы

1.2.2. Повышение устойчивости рибозимов в биологических средах

1.2.3. Регуляция каталитической активности рибозимов 32 1.2.3.1. Использование молекул-эффекторов для регуляции каталитической активности рибозима «головка молотка»

Олигонуклеотиды-эффекторы, комплементарные РНК-субстрату

Аллостерические эффекторы 35 Олигонуклеотиды-эффекторы, способные связываться с НК-энзимом и с субстратом одновременно 38 1.2.3.2. Подходы к увеличению эффективности расщепления структурированных природных РНК рибозимами

1.3. Применение рибозимов «головка молотка»

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и приборы

2.2. Основные методы работы

2.3. Методики эксперимента

2.3.1. Выделение и анализ олигонуклеотидов

2.3.2. Введение радиоактивной метки в синтетические РНК-субстраты

2.3.3. Введение радиоактивной метки в 190-звенный фрагмент

МБЮ мРНК (ША190)

2.3.4. Гидролиз 1ША190 в имидазольном буфере и с помощью РНКазы Т

2.3.5. Расщепление РНК бинарными и полноразмерными рибозимами 56 Расщепление синтетического фрагмента МОШ мРНК (1№А19) 56 Определение кинетических параметров (Км и ксаО расщепления 1№А19 рибозимами 56 Расщепление 190-звенного фрагмента МБЮ мРНК рибозимами 57 Определение кинетических параметров (Км и к^О расщепления 1МЧА190 рибозимами

2.3.6. Исследование сборки комплекса бинарный рибозим-РНК методом нативного гель-электрофореза

2.3.7. Исследование кинетических циклов бинарного и полноразмерного рибозимов

Определение констант скорости ассоциации рибозим-субстратных комплексов для полноразмерного рибозима, бинарного рибозима и компонентов бинарного рибозима

Определение констант скорости диссоциации рибозим-субстратных комплексов

Определение констант скорости диссоциации продуктов расщепления РНК от бинарного и полноразмерного рибозимов

2.3.8. Исследование устойчивости компонентов бинарного рибозима в культуральной среде

3. СОЗДАНИЕ БИНАРНЫХ РИБОЗИМНЫХ КОНСТРУКЦИЙ НА ОСНОВЕ

МОДЕЛИ «ГОЛОВКА МОЛОТКА» И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)

3.1. Немодифицированный бинарный рибозим: конструирование и каталитическая активность

3.2. Бинарные рибозимы с модифицированным стеблем II

3.3. Сравнение кинетических схем расщепления РНК бинарным и полноразмерным рибозимами

3.3.1. Исследование «сборки» комплексов рибозим-РНК и их диссоциации

3.3.2. Исследование скорости диссоциации продуктов расщепления РНК от рибозима

3.4. Модифицированные бинарные рибозимы, устойчивые в биологических средах

3.4.1. Устойчивость бинарных рибозимов к действию нуклеаз сыворотки

3.4.2. Каталитическая активность модифицированных бинарных рибозимов

3.5. Расщепление 190-звенного фрагмента МОШ мРНК бинарными и полноразмерными рибозимами

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Бинарные рибозимы "головка молотка"»

Селективное ингибирование экспрессии определенных генов на уровне их мРНК является одной из актуальных задач молекулярной биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины. В последние десятилетия интенсивно ведется поиск агентов, способных специфично взаимодействовать с определенными последовательностями мРНК, и их апробация в качестве инструментов функциональной геномики и диагностики, а также терапевтических средств, подавляющих экспрессию генов, ответственных за развитие различных заболеваний. В основе конструирования таких агентов - антисенс-олигонуклеотидов, малых интерферирующих РЖ и каталитических нуклеиновых кислот (НК-энзимов) - лежит использование последовательностей НК, комплементарных определенным участкам выбранной мРНК-мишени [1-3].

Одним из перспективных направлений в этой области является конструирование НК-энзимов - олигорибо- и олигодезоксирибонуклеотидов с характерной вторичной структурой, способных высокоспецифично расщеплять РНК [4,5]. Среди НК-энзимов особый интерес вызывают рибозимы типа «головка молотка». Эти рибозимы обладают высокой каталитической активностью при сравнительно небольшой длине олигонуклеотидной цепи и широкой субстратной специфичностью, благодаря чему в любой мРНК можно найти последовательности - мишени для рибозимного расщепления. Подробно исследованы пространственная структура рибозима «головка молотка», механизм расщепления фосфодиэфирной связи в РНК и каталитический цикл расщепления РНК этим рибозимом, что позволяет конструировать новые варианты рибозимов на основе модели «головка молотка» с использованием этих данных. К настоящему времени опубликовано очень большое число работ, посвященных конструированию рибозимов «головка молотка» как искусственных ингибиторов экспрессии генов на уровне мРНК; показано, что они способны эффективно подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других терапевтически важных генов (см. обзоры [2,5-7]). Тем не менее, до настоящего времени не прекращается поиск вариантов рибозимов «головка молотка», обладающих улучшенными каталитическими свойствами в сочетании с устойчивостью к действию нуклеаз и способностью ингибировать экспрессию генов не только на уровне культур клеток, но и в живых организмах.

Целью данной работы являлось создание на основе модели «головка молотка» бинарных рибозимных конструкций, способных к «самосборке» из отдельных олигонуклеотидов на РНК-субстрате и обладающих высокой каталитической активностью и устойчивостью в биологических средах.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• выбор оптимальной структуры бинарных рибозимов, исследование их способности расщеплять РНК в сравнении с аналогичным полноразмерным рибозимом;

• исследование кинетики различных стадий расщепления РНК бинарным рибозимом «головка молотка», сравнение каталитических циклов бинарного и полноразмерного рибозимов;

• создание бинарных рибозимов, обладающих повышенной устойчивостью в биологических средах в сочетании с высокой каталитической активностью;

• исследование расщепления протяженного структурированного фрагмента природной мРНК новыми бинарными рибозимами.

В результате проделанной работы были созданы новые бинарные рибозимы «головка молотка», обладающие высокой каталитической активностью и устойчивостью в биологических средах. Уникальной особенностью бинарных рибозимов является способность одной из цепей рибозима первой связываться с РНК, ускоряя тем самым связывание второй цепи. Благодаря улучшенному соотношению скоростей ассоциации и диссоциации в каталитическом цикле бинарные рибозимы расщепляют протяженную структурированную РНК значительно эффективнее, чем их полноразмерные аналоги. Сочетание этих свойств позволяет рассматривать бинарные рибозимы «головка молотка» как перспективные высокоспецифичные ингибиторы экспрессии генов на уровне мРНК.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Воробьева, Мария Александровна

выводы

1. Впервые созданы бинарные рибозимы, состоящие из двух частично комплементарных олигорибонуклеотидов, которые после связывания с РНК-субстратом формируют каталитически активную структуру «головка молотка» без петли-коннектора. Проведено исследование расщепления модельного РНК-субстрата бинарными рибозимами в сравнении с их полноразмерным аналогом. Показано, что:

• в условиях избытка бинарные рибозимы расщепляют РНК практически с той же эффективностью, что и полноразмерный аналог;

• в условиях недостатка по отношению к РНК при оптимальном соотношении концентраций двух компонентов бинарные рибозимы расщепляют РНК более эффективно, чем полноразмерный рибозим; при этом максимальная эффективность расщепления достигается при использовании избытка «правой» цепи рибозима по отношению к «левой» цепи.

2. Проведено сравнительное исследование кинетики различных стадий взаимодействия бинарного и полноразмерного рибозимов «головка молотка» с РНК-субстратом и продуктами расщепления. Показано, что:

• разделение рибозима «головка молотка» на два отдельных олигомера не снижает скорость ассоциации рибозим-субстратного комплекса и практически не влияет на стадию расщепления фосфодиэфирной связи;

• скорость диссоциации продуктов расщепления РНК от бинарного рибозима зависит от типа продукта (5'-концевой или З'-концевой), при этом оба продукта расщепления диссоциируют от бинарного рибозима значительно быстрее, чем от полноразмерного;

• повышенная эффективность расщепления РНК бинарным рибозимом обусловлена улучшенным соотношением скоростей ассоциации и диссоциации в каталитическом цикле.

3. Сконструированы устойчивые в биологических средах модифицированные бинарные рибозимы, в которых защищены 2'-гидроксилы всех неконсервативных рибонуклеотидов и З'-концы обоих компонентов рибозима. Показано, что оптимальным соотношением стабильность/активность обладают З'-модифицированные рибозимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды во всех неконсервативных положениях и остатки 2'-аминоуридина в полуконсервативных положениях 4 и 7.

4. Исследовано расщепление бинарными и полноразмерными рибозимами 190-звенного 5-концевого фрагмента мРНК гена множественной лекарственной устойчивости т<Лг1, обладающего выраженной вторичной структурой. Показано, что бинарные рибозимы расщепляют структурированную природную РНК значительно эффективнее, чем их полноразмерные аналоги, как в условиях избытка, так и в условиях недостатка рибозимов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Воробьева, Мария Александровна, 2007 год

1. Kurreck J. Antisense technologies. 1.provement through novel chemical modifications. // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. № 8. P. 1628-1644.

2. Rayburn E., Wang H., He J., Zhang R. RNA silencing technologies in drug discovery and target validation. // Lett. Drug Design Discov. 2005. V. 2. № 1. P. 1-18.

3. Scherer L., Rossi J. Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA.//Nat. Biotechnol. 2003. V. 21.№ 12. P. 1457-1465.

4. Peracchi A. Prospects for antiviral ribozymes and deoxyribozymes. // Rev. Med. Virol. 2004. V. 14. № 1. P. 47-64.

5. Schubert S., Kurreck J. Ribozyme- and deoxyribozyme-strategies for medical applications. // Curr. Drug Targets. 2004. V. 5. № 6. P. 667-681.

6. Citti L., Rainaldi G. Synthetic hammerhead ribozymes as therapeutic tools to control disease genes. // Curr. Gene Ther. 2005. V. 5. № 1. P. 11-24.

7. Grassi G., Dawson P., Guarneri G., Kandolf R., Grassi M. Therapeutic potential of hammerhead ribozymes in the treatment of hyper-proliferative diseases. // Curr. Pharm. Biotechnol. 2004. V. 5. № 4. P. 369-386.

8. Cech T. R., Zaug A. J., Grabowski P. J. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. // Cell. 1981. V. 27. № 3. Pt 2. P. 487-496.

9. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh T., Pace N., Altman S. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. // Cell. 1983. V. 35. № 3 Pt 2. P. 849-857.

10. Doherty E. A., Doudna J. A. Ribozyme structures and mechanisms. // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. № 1. P. 597-615.

11. Doudna J. A., Cech T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. // Nature. 2002. V. 418. № 6894. P. 222-228.

12. Kuimelis R. G., McLaughlin L. W. Mechanisms of ribozyme-mediated RNA cleavage. // Chem. Rev. 1998. V. 98. № 3. P. 1027-1044.

13. Salehi-Ashtiani K., Szostak J. W. In vitro evolution suggests multiple origins for the hammerhead ribozyme. // Nature. 2001. V. 414. № 6859. P. 82-84.

14. Conaty J., Hendry P., Lockett T. J. Selected classes of minimised hammerhead ribozymes have very high cleavage rates at low Mg2+ concentration. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 11. P. 2400-2407.

15. Uhlenbeck 0. C. A small catalytic oligoribonucleotide. // Nature. 1987. V. 328. №6131. P. 596-600.

16. Haseloff J., Gerlach W. L. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activities. //Nature. 1988. V. 334. № 6183. P. 585-591.

17. Hertel K. J., Pardi A., Uhlenbeck 0. C., Koizumi M., Ohtsuka E., Uesugi S., Cedergren R., Eckstein F., Gerlach W. L., Hodgson R. Numbering system for the hammerhead. // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. № 12. P. 3252.

18. Martick M., Scott W. G. Tertiary contacts distant from the active site prime a ribozyme for catalysis. // Cell. 2006. V. 126. № 2. P. 309-320.

19. Penedo J. C., Wilson T. J., Jayasena S. D., Khvorova A., Lilley D. M. Folding of the natural hammerhead ribozyme is enhanced by interaction of auxiliary elements. // RNA. 2004. V. 10. № 5. P. 880-888.

20. De la Pena M., Gago S., Flores R. Peripheral regions of natural hammerhead ribozymes greatly increase their self-cleavage activity. // EMBO J. 2003. V. 22. № 20. P. 5561-5570.

21. Canny M. D., Jucker F. M., Kellogg E., Khvorova A., Jayasena S. D., Pardi A. Fast cleavage kinetics of a natural hammerhead ribozyme. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. №35. P. 10848-10849.

22. Burke D. H., Greathouse S. T. Tertiary stabilizing elements form a natural type III cis-cleaving hammerhead ribozyme direct trans-cleavage at physiological divalent magnesium. // BMC Biochemistry. 2005. V.6.14.

23. Weinberg M. S., Rossi J. J. Comparative single-turnover kinetic analyses of trans-cleaving hammerhead ribozymes with naturally derived non-conserved sequence motifs. // FEBS Letters. 2005. V. 579. № 7. P. 1619-1624.

24. Perriman R., Delves A., Gerlach W. L. Extended target-site specificity for a hammerhead ribozyme. // Gene. 1992. V. 113. № 2. P. 157-163.

25. RufFner D. E., Stormo G. D., Uhlenbeck O. C. Sequence requirements of the hammerhead RNA self-cleavage reaction. // Biochemistry. 1990. V. 29. № 47. P. 10695-10702.

26. Shimayama T., Nishikawa S., Taira K. Generality of the NUX rule: kinetic analysis of the results of systematic mutations in the trinucleotide at the cleavage site of hammerhead ribozymes. // Biochemistry. 1995. V. 34. № 11. P. 3649-3654.

27. Zoumadakis M., Tabler M. Comparative analysis of cleavage rates after systematic permutation of the NUX consensus target motif for hammerhead ribozymes. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. № 7. P. 1192-1196.

28. Symons R. H. Small catalytic RNAs. // Annu. Rev. Biochem. 1992. V. 61. P. 641-671.

29. Kore A. R., Vaish N. K., Kutzke U., Eckstein F. Sequence specificity of the hammerhead ribozyme revisited; the NHH rule. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 18. P.4116-4120.

30. Hammann C., Lilley D. M. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. // ChemBioChem. 2002. V. 3. № 8. P. 690-700.

31. Tanner N. K. Ribozymes: the characteristics and properties of catalytic RNAs. // FEMS Microbiol. Rev. 1999. V. 23. № 3. P. 257-275.

32. Scott W. G. Biophysical and biochemical investigations of RNA catalysis in the hammerhead ribozyme. // Quart. Rev. Biophys. 1999. V. 32. № 3. P. 241-284.

33. Blount K. F., Uhlenbeck O. C. Internal equilibrium of the hammerhead ribozyme is altered by the length of certain covalent cross-links. // Biochemistry. 2002. V. 41. №21. P. 6834-6841.

34. Bravo C., Woisard A., Fourrey J. L., Laugaa P., Favre A. A Y form of hammerhead ribozyme trapped by photo-cross-links retains full cleavage activity. // Biochimie. 1999. V. 81. № 3. P. 201-212.

35. Murray J. B., Szoke H., Szoke A., Scott W. G. Capture and visualization of a catalytic RNA enzyme-product complex using crystal lattice trapping and X-ray holographic reconstruction. // Mol. Cell. 2000. V. 5. № 2. P. 279-287.

36. Pley H. W., Flaherty K. M., McKay D. B. Three-dimensional structure of a hammerhead ribozyme. // Nature. 1994. V. 372. № 6501. P. 68-74.

37. Scott W. G., Finch J. T., Klug A. The crystal structure of an all-RNA hammerhead ribozyme: a proposed mechanism for RNA catalytic cleavage. // Cell. 1995. V. 81. №7. P. 991-1002.

38. Sigurdsson S. T., Tuschl T., Eckstein F. Probing RNA tertiary structure: interhelical crosslinking of the hammerhead ribozyme. // RNA. 1995. V. 1. № 6. P. 575-583.

39. Wang L., Ruffner D. E. An ultraviolet crosslink in the hammerhead ribozyme dependent on 2- thiocytidine or 4-thiouridine substitution. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. №21. P. 4355-4361.

40. Takagi Y., Warashina M., Stec W. J., Yoshinari K., Taira K. SURVEY AND SUMMARY: Recent advances in the elucidation of the mechanisms of action of ribozymes. //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № 9. P. 1815-1834.

41. Bassi G. S., Mollegaard N. E., Murchie A. I., von Kitzing E., Lilley D. M. Ionic interactions and the global conformations of the hammerhead ribozyme. // Nat. Struct. Biol. 1995. V. 2. № 1. P. 45-55.

42. Hammann C., Cooper A., Lilley D. M. Thermodynamics of ion-induced RNA folding in the hammerhead ribozyme: an isothermal titration calorimetric study. //Biochemistry. 2001. V. 40. № 5. P. 1423-1429.

43. Torres R. A., Bruce T. C. The mechanism of phosphodiester hydrolysis: near in-line attack conformations in the hammerhead ribozyme. // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. №5. P. 781-791.

44. Markley J. C., Godde F., Sigurdsson S. T. Identification and characterization of a divalent metal ion-dependent cleavage site in the hammerhead ribozyme. // Biochemistry. 2001. V. 40. № 46. P. 13849-13856.

45. Leclerc F., Karplus M. Two-metal-ion mechanism for hammerhead-ribozyme catalysis. //J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. № 7. P. 3395-3409.

46. Curtis E. A., Bartel D. P. The hammerhead cleavage reaction in monovalent cations. // RNA. 2001. V. 7. № 4. P. 546-552.

47. Murray J. B., Seyhan A. A., Walter N. G., Burke J. M., Scott W. G. The hammerhead, hairpin and VS ribozymes are catalytically proficient in monovalent cations alone. // Chem. Biol. 1998. V. 5. № 10. P. 587-595.