Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима для сайт-направленного изменения последовательности РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Иванов, Сергей Александрович

• Иванов, Сергей Александрович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Иванов, Сергей Александрович

Список сокращений

Введение б

I. Влияние структуры шпилечных рибозимов на их каталитическую 9 активность в реакциях расщепления и лигирования РНК обзор литературы)

1.1 Строение и свойства шпилечных рибозимов

1.1.1 Минимальный шпилечный рибозим

1.1.1.1 Происхождение минимального шпилечного рибозима

1.1.1.2 Первичная, вторичная и третичная структура минимального 13 шпилечного рибозима

1.1.1.3 Сворачивание рибозим-субстратного комплекса

1.1.1.4 Каталитический механизм действия шпилечных рибозимов

1.1.2 Обращенный шпилечный рибозим, его происхождение и свойства

1.2 Шпилечные рибозимы в реакциях расщепления и лигирования РНК

1.2.1 Природные рибозимы

1.2.1.1 Кинетика и термодинамика реакций расщепления и 36 лигирования РНК

1.2.1.2 Влияние стабильности и структуры рибозим-субстратного 41 комплекса на активность рибозима

1.2.2 Искусственные рибозимы

1.2.2.1 Вилочный шпилечный рибозим

1.2.2.2 Обращенный шпилечный рибозим

II. Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима 53 для сайт-направленного изменения последовательности РНК результаты и их обсуждение)

11.1 Дизайн двойного рибозима 54 как инструмента молекулярного воздействия

11.1.1 Стратегия сайт-направленного изменения 54 последовательности РНК

11.1.2 Двойной рибозим R-DRBV

11.1.2.1 Предполагаемый способ синтеза рибозима R-DRBV

11.1.2.2 Синтез РНК посредством удлинения праймера при 62 помощи РНК-полимеразы фага Т

11.1.2.3 Разветвленный рибозим R-RB

11.1.2.3.1 Строение рибозима R-RB

11.1.2.3.2 Химический синтез рибозима R-RB

11.1.2.3.3 Каталитические свойства рибозима R-RB

II.2 Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима 81 в реакциях расщепления и лигирования РНК

11.2.1 Влияние природы нуклеотида 81 в месте соединения доменов рибозима на его активность

11.2.2 Влияние длины полинуклеотидного линкера 87 на активность рибозима

0 II.3 Двойной обращенный рибозим R-DRV в реакции сайт-направленного изменения последовательности РНК

11.3.1 Модельная реакция изменения последовательности 90 субстрата S40F3F

11.3.2 Синтез двойного рибозима R-DRV

11.3.3 Свойства рибозима R-DRV в реакции расщепления РНК

11.3.4 Изменение последовательности РНК 103 при помощи рибозима R-DRV

11.3.5 Оптимизация условий 105 реакции изменения последовательности РНК

11.3.6 Каталитическая активность рибозима R-DRV 109 U.3.7 Внутреннее мечение РНК остатком молекулы-красителя Су

III. Экспериментальная часть

III.1 Реактивы и материалы

111.1.1 Реагенты и растворители

111.1.2 Ферменты

111.1.3 Буферные растворы

111.1.4 Разделяющие материалы

111.1.5 Приборы 117 111.2 Методы и методики

111.2.1 Физико-химические методы анализа

111.2.1.1 Анализ РНК при помощи A.L.F. секвенатора ДНК

111.2.1.2 Анализ РНК при помощи LiCor 4200 секвенатора ДНК

111.2.1.3 Методы при получении РНК и ДНК

111.2.2 Синтезы

111.2.2.1 Синтез амидофосфита Ы4-(6-гидроксигексил-0- 121 левулинил)-5-метил-5'-0-(4,4'-диметокситрифенил-метил)-1 -р-0-2'-дезоксицитидина (8)

111.2.2.2 Синтез субстратных РНК

111.2.2.3 Мечение субстратных РНК

111.2.2.4 Синтез разветвленного рибозима R-RB

111.2.2.5 Синтез немодифицированных рибозимов

111.2.2.6 Синтез РНК-фрагментов, 134 содержащих 2',3'-циклическуга фосфатную группу

11.2.3 Определение нуклеотидного состава рибозима R-RB

11.2.4 Получение РНК посредством удлинения праймера при 136 помощи РНК-полимеразь; фага

11.2.5 Расщепление РНК-субстратов

11.2.6 Лигирование РНК-фрагментов

11.2.7 Изменение последовательности РНК

И.2.8 УФ плавление дуплексов

II.2.9 Определение периода полураспада 141 2',3'-циклической фосфатной группы в составе РНК

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима для сайт-направленного изменения последовательности РНК»

В настоящее время в молекулярной биологии и смежных областях науки много внимания уделяется изучению клеточных процессов с участием рибонуклеиновых кислот - трансляции и функционированию рибосомы (мРНК, тРНК, рибосомальные РНК), регуляции экспрессии генов (малые интерферирующие РНК, siRNA), процессингу РНК, - а также каталитически активным РНК (интроны I и II группы, рибозимы различных видов). При установлении роли рибонуклеиновых кислот в этих процессах часто стоит задача сайт-направленного изменения их нуклеотидной последовательности или введения модификаций. Модификация может вводиться как на 5'- или З'-конец РНК, так и в ее центральную часть и представлять собой измененный по углеводному остатку, фосфатной группе или гетероциклическому основанию нукпеотид, флуоресцентный краситель, остаток какой-либо реакционно-способной или репортерной молекулы и т. п. В случае природных мутаций, вставок или делеций изменение последовательности РНК может быть произведено методом сайт-направленного мутагенеза [1, 2]. Задача изменения центральной части цепи РНК за счет введения неприродного фрагмента более трудна, так как синтезировать рибонуклеиновую кислоту, содержащую модификацию в заданной позиции цепи, при помощи ферментативного подхода невозможно. Для сайт-направленного введения модифицированного фрагмента в цепь РНК существует несколько подходов. Наиболее общий из них основан на методе твердофазного синтеза олигонуклеотидов. Однако с его помощью сегодня нельзя успешно получать молекулы РНК длиной более 100 звеньев [3]. Альтернативный подход заключается в сборке целевой РНК из олигорибонуклеотидных фрагментов, один из которых содержит модифицированное звено, методом ферментативного или химического лигирования. В работах Уленбека и сотр. [4, 5] по ферментативному лигированию РНК при помощи РНК-лигазы фага Т4 было показано, что эффективность такого процесса невысока (5 - 25 %) и зависит от нуклеотидного состава и длины соединяемых фрагментов. Невысокие выходы продуктов (4-16 %) наблюдали также З.А. Шабарова и сотр. в экспериментах по химическому лигированию РНК [6]. Очевидно, что при сборке молекулы РНК из нескольких фрагментов методом ферментативного или химического лигирования выход целевого продукта будет незначителен. Интересный способ получения модифицированных рибонуклеиновых кислот недавно был предложен Салленгером и сотр. [7]. Он основан на способности интрона группы I катализировать in trans сплайсинг РНК. Неприродный фрагмент вводится в З'-концевой экзон, соединенный с интроном -каталитическим мотивом. В процессе сплайсинга 3'- и 5'-концевой экзоны соединяются, образуя полноразмерную РНК. Однако этот подход не позволяет ввести модифицированный фрагмент в 5'-концевую часть рибонуклеиновой кислоты. Более того, чтобы им воспользоваться, необходимо сначала модифицировать З'-концевой экзон.

Из приведенных данных следует, что проблема сайт-направленного изменения центральной части протяженной РНК на настоящий момент полностью не решена. Поэтому разработка действенного метода, позволяющего направленно вводить во внутренний участок цепи РНК неприродный модифицированный фрагмент с требуемым функциональным свойством, является актуальной и важной задачей. Решение ее приблизит нас не только к пониманию механизмов протекания клеточных процессов с участием РНК, но и позволит получать рибонуклеиновые кислоты с заданными биологическими и физико-химическими свойствами. В связи с этим настоящая работа посвящена созданию инструмента молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение первичной структуры РНК, т.е. замещение внутреннего участка цепи РНК на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Такой инструмент предполагалось создать на основе шпилечных рибозимов.

Результатом проделанной работы было создание на основе обращенного и вилочного шпилечных рибозимов двойного обращенного рибозима -инструмента молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение нуклеотидной последовательности внутренней части молекулы РНК. Изменение первичной структуры РНК достигается путем замещения участка ее цепи на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Процесс состоит из двойного расщепления изменяемой РНК, замещении вырезанного участка цепи на новый, содержащий требуемую модификацию, и соединения модифицированного олигорибонуклеотида с полученными при расщеплении РНК 5'- и З'-концевыми фрагментами. В целях повышения эффективности лигирования оптимизирована структура обращенного рибозима, входящего в состав двойного рибозима. Показано, что выход продукта лигирования зависит как от природы нуклеотида в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов обращенного рибозима, так и длины полинуклеотидного линкера между ними. Рибозим, содержащий в месте соединения доменов аденозин и гептааденилатный линкер обладал наивысшей активностью. Найдены оптимальные условия проведения процесса изменения последовательности РНК: продолжительность этапов расщепления и лигирования РНК и концентрация кофакторов (ионов Мд2+ и полиамина спермина) и модифицированного олигорибонуклеотида. Даны рекомендации по выбору температуры проведения реакции.

Работа включает литературный обзор, посвященный влиянию структуры шпилечных рибозимов на их каталитическую активность в реакциях расщепления и лигирования РНК.

I. ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ШПИЛЕЧНЫХ РИБОЗИМОВ НА ИХ КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ В РЕАКЦИЯХ РАСЩЕПЛЕНИЯ И ЛИГИРОВАНИЯ РНК обзор литературы)

Настоящий литературный обзор посвящен рассмотрению зависимости каталитической активности шпилечных рибозимов в реакциях расщепления и лигирования РНК от их структуры. В связи с тем, что структура рибозима определяет строение и свойства образуемого им с субстратной РНК комплекса, реакции расщепления и лигирования рассматриваются с позиции особенностей строения рибозим-субстратных комплексов. В литературном обзоре значительное внимание уделяется комплексам, образованным рибозимами, имеющими шпилечную структуру, что обусловлено нашим решением создавать инструмент молекулярного воздействия на основе шпилечных рибозимов. С целью показать преимущество использования таких рибозимов для получения функционального инструмента и, следовательно, обосновать наш выбор каталитические свойства шпилечных рибозимов сравниваются со свойствами рибозимов других видов. Предлагаемый нами подход сайт-направленного изменения внутренней последовательности цепи РНК состоит из двух важных этапов: двойного расщепления исходной молекулы РНК при помощи инструмента молекулярного воздействия и последующего лигирования полученных 5'- и З'-концевого РНК-фрагментов с модифицированным олигорибонуклеотидом. Очевидно, что успешное применение разрабатываемого инструмента возможно при условии эффективного и быстрого протекания обоих этапов. Вследствие этого в литературном обзоре процессам расщепления и лигирования РНК шпилечными рибозимами уделяется основное внимание. Обсуждаются факторы, влияющие на каталитическую активность рибозимов, а именно: нуклеотидный состав рибозим-субстратного комплекса, особенности строения его вторичной и пространственной структуры, солевой состав реакционной смеси. Исследуется взаимосвязь между положением равновесия «расщепление - лигирование» и жесткостью структуры рибозим-субстратного комплекса, в связи с чем рассматриваются комплексы, образованные с участием не только природного минимального шпилечного рибозима, но и его природных аналогов и искусственных производных. Для сравнения каталитической активности рибозимов различных видов приводятся кинетические параметры осуществляемых ими реакций. Как с кинетической, так и термодинамической точек зрения обосновывается зависимость эффективности и скорости реакций расщепления и лигирования РНК от структуры рибозим-субстратного комплекса. На основании данных, представленных и обсуждаемых в настоящем литературном обзоре, предлагаются действенные пути воздействия на каталитическую активность шпилечных рибозимов.

1.1

Строение и свойства шпилечных рибозимов

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Иванов, Сергей Александрович

выводы

Впервые на основе обращенного и вилочного шпилечных рибозимов разработан и получен двойной обращенный рибозим - инструмент молекулярного воздействия, с помощью которого осуществлено сайт-направленное . введение во внутренний участок цепи РНК модифицированного фрагмента; изучена активность полученного рибозима; найдены оптимальные условия проведения процесса.

Впервые предложена и методом твердофазного олигонуклеотидного синтеза получена 81-звенная разветвленная молекула РНК, обладающая каталитической активностью в реакциях расщепления различных РНК-субстратов, - разветвленный обращенный шпилечный рибозим.

Оптимизирована структура обращенного шпилечного рибозима и изучены его каталитические свойства в реакциях расщепления и лигирования РНК.

Показана возможность синтеза модифицированных по 5'-концу рибонуклеиновых кислот посредством удлинения РНК-праймера на одноцепочечной матричной ДНК при помощи РНК-полимеразы фага Т7.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Иванов, Сергей Александрович, 2005 год

1. P. Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J. 1986, 237, 1-7.

2. A. Shimada, PCR-based site-directed mutagenesis, Methods Mol. Biol. 1996, 57, 157-65.

3. S. Muller, J. Wolf, S. A. Ivanov, Current strategies for the synthesis of RNA, Curr. Org. Synth. 2004, 1, 293-307.

4. M. Krug, P. L. de Haseth, О. C. Uhlenbeck, Enzymatic synthesis of a 21-nucleotide coat protein binding fragment of R17 ribonucleic acid, Biochemistry 1982, 21, 4713-4720.

5. P. J. Romaniuk, О. C. Uhlenbeck, Joining of RNA molecules with RNA ligase, Methods Enzymol. 1983, 100, 52-59.

6. N. G. Dolinnaya, N. I. Sokolova, D. T. Ashirbekova, Z. A. Shabarova, The use of BrCN for assembling modified DNA duplexes and DNA-RNA hybrids; comparison with water-soluble carbodiimide, Nucleic Acids Res. 1991, 19, 3067-3072.

7. M. B. Long, J. P. Jones 3rd, B. A. Sullenger, J. Byun, Ribozyme-mediated revision of RNA and DNA, J. Clin. Invest. 2003, 112, 312-318.

8. W. L. Gerlach, J. M. Buzayan, I. R. Schneider, G. Bruening, Satellite tobacco ringspot virus RNA: Biological activity of DNA clones and their in vitro transcripts, Virology 1986, 151, 172-185.

9. J. M. Buzayan, W. L. Gerlach, G. Bruening, P. Keese, A. R. Gould, Nucleotide sequence of satellite tobacco ringspot virus RNA and its relationship to multimeric forms, Virology 1986, 151, 186-199.

10. A. Hampel, R. Tritz, RNA catalytic properties of the minimum (-)sTRSV sequence, Biochemistry 1989, 28, 4929-4933.

11. J. M. Buzayan, W. L. Gerlach, G. Bruening, Non-enzymatic cleavage and ligation of RNAs complementary to a plant virus satellite RNA, Nature 1986, 323, 349-352.

12. J. Haseloff, W. L. Gerlach, Sequences required for self-catalysed cleavage of the satellite RNA of tobacco ringspot virus, Gene 1989, 82, 43-52.

13. M. Zuker, On finding all suboptimal foldings of an RNA molecule, Science 1989, 244, 48-52.

14. N. K. Tanner, Ribozymes: the characteristics and properties of catalytic RNAs, FEMS Microbiol. Rev. 1999, 23, 257-275.

15. A. C. Forster, R. H. Symons, Self-cleavage of plus and minus RNAs of a virusoid and a structural model for the active sites, Cell 1987, 49, 211-220.

16. D. M. J. Lilley, Structure, folding and catalysis of the small nucleolytic ribozymes, Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, 330-338.

17. P. A. Feldstein, J. M. Buzayan, G. Bruening, Two sequences participating in the autolytic processing of satellite tobacco ringspot virus complementary RNA, Gene 1989, 82, 53-61.

18. C. J. Hutchins, P. D. Rathjen, A. C. Forster, R. H. Symons, Self-cleavage of plus and minus RNA transcripts of avocado sunblotch viroid, Nucleic Acids Res. 1986, 14, 3627-3640.

19. U. C. Uhlenbeck, A small catalytic oligoribonucleotide, Nature 1987, 328, 596600.

20. A. Hampel, R. Tritz, M. Hicks, P. Cruz, «Hairpin» catalytic RNA model: evidence for helices and sequence requirement for substrate RNA, Nucl. Acids Res. 1990, 18, 299-304.

21. M. J. Fedor, Structure and function of the hairpin ribozyme, J. Mol. Biol. 2000, 297, 269-291.

22. A. Berzal-Herranz, S. Joseph, J. M. Burke, In vitro selection of active hairpin ribozymes by sequential RNA-catalyzed cleavage and ligation reactions, Genes Dev. 1992, 6, 129-134.

23. S. Joseph, A. Berzal-Herranz, В. M. Chowrira, J. M. Burke, Substrate selection rules for the hairpin ribozyme determined by in vitro selection, mutation, and analysis of mismatched substrates, Genes Dev. 1993, 7, 130-138.

24. A. Siwkowski, M. Humphrey, M. B. De-Young, A. Hampel, Screening for important base identities in the hairpin ribozyme by in vitro selection for cleavage, Biotechniques 1998, 24, 278-284.

25. В. H. Chowrira, J. M. Burke, Binding and cleavage of nucleic acids by the «hairpin» ribozyme, Biochemistry 1991, 30, 8518-8522.

26. A. Sekiguchi, Y. Komatsu, M. Koizumi, E. Ohtsuka, Mutagenesis and self-ligation of the self-cleavage domain of the satellite RNA minus strand of tobacco ringspot virus and its binding to polyamines, Nucl. Acids Res. 1991, 19, 6833-6838.

27. A. Berzal-Herranz, S. Joseph, В. M. Chowrira, S. E. Butcher, J. M. Burke, Essential nucleotide sequences and secondary structure elements of the hairpin ribozyme, EMBO J. 1993, 12, 2567-2573.

28. Y. Komatsu, M. Koizumi, H. Nakamura, E. Ohtsuka, Loop-Size Variation To Probe a Bent Structure of a Hairpin Ribozyme, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3692-3696.

29. Z. Cai, I. J. Tinoco, Solution structure of loop A from the hairpin ribozyme from tobacco ringspot virus satellite, Biochemistry 1996, 35, 6026-6036.

30. S. E. Butcher, F. H.-T. Allain, J. Feigon, Solution structure of the loop В domain from the hairpin ribozyme, Nat. Struct. Biol. 1999, 6, 212-216.

31. B. Sargueil, D. B. Pecchia, J. M. Burke, An improved version of the hairpin ribozyme functions as a ribonucleoprotein complex, Biochemistry 1995, 34, 7739-7748.

32. D. Porschke, J. M. Burke, N. G. Walter, Global structure and flexibility of hairpin ribozymes with extended terminal helices, J. Mol. Biol. 1999, 289, 799-813.

33. Y. Komatsu, I. Kanzaki, M. Koizumi, E. Ohtsuka, Modification of primary structures of hairpin ribozymes for probing active conformations, J. Mol. Biol. 1995, 252, 296-304.

34. A. I. H. Murchie, J. B. Thomson, F. Walter, D. M. J. Lilley, Folding of the hairpin ribozyme in its natural conformation achieves close physical proximity of the loops, Mol. Cell 1998, 1, 873-881.

35. P. B. Rupert, A. R. Ferre-D'Amare, Crystal structure of a hairpin ribozyme-inhibitor complex with implications for catalysis, Nature 2001, 410, 780-786.

36. D. J. Earnshaw, B. Masquida, S. MQIIer, S. T. Sigurdsson, F. Eckstein, E. Westhof, M. J. Gait, Inter-domain cross-linking and molecular modelling of the hairpin ribozyme, J. Mol. Biol. 1997, 274, 197-212.

37. S. P. Ryder, S. A. Strobel, Nucleotide analog interference mapping of the hairpin ribozyme: implications for secondary and tertiary structure formation, J. Mol. Biol. 1999, 291, 295-311.

38. K. J. Young, J. S. Vyle, T. J. Pickering, M. A. Cohen, S. C. Holmes, O. Merkel, J. A. Grasby, The role of essential pyrimidines in the hairpin ribozyme-catalysed reaction, J. Mol. Biol. 1999, 288, 853-866.

39. D. Klostermeier, D. P. Millar, Energetics of hydrogen bond networks in RNA: hydrogen bonds surrounding G+1 and U42 are the major determinants for the tertiary structure stability of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2002, 41, 1409514102.

40. R. Pinard, D. Lambert, N. G. Walter, J. E. Heckman, F. Major, J. M. Burke, Structural basis, for the guanosine requirement of the hairpin ribozyme, Biochemistry 1999, 38, 16035-16039.

41. N. G. Walter, J. M. Burke, D. P. Millar, Stability of hairpin ribozyme tertiary structure is governed by the interdomain junction, Nat. Struct. Biol. 1999, 6, 544-549.

42. В. M. Chowrira, J. M. Burke, Novel guanosine requirement for catalysis by the hairpin ribozyme, Nature 1991, 354, 320-322.

43. J. A. Grasby, K. Mersmann, M. Singh, M. J. Gait, Purine functional groups in essential residues of the hairpin ribozyme required for catalytic cleavage of RNA, Biochemistry 1995, 34, 4068-4076.

44. S. E. Butcher, J. E. Heckman, J. M. Burke, Reconstitution of hairpin ribozyme activity following separation of functional domains, J. Biol. Chem. 1995, 270, 29648-29651.

45. C. Shin, J. N. Choi, S. I. Song, J. T. Song, J. H. Ahn, J. S. Lee, Y. D. Choi, The loop В domain is physically separable from the loop A domain in the hairpin ribozyme, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 2685-2689.

46. V. Grum-Tokras, M. Milanovic, J. E. Wedekind, Crystallization and X-ray diffraction analysis of an all-RNA U39C mutant of the minimal hairpin ribozyme, Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2003, 59, 142-145.

47. R. Pinard, J. E. Heckman, J. M. Burke, Alignment of the two domains of the hairpin ribozyme-substrate complex defined by interdomain photoaffinity crosslinking, J. Mol. Biol. 1999, 287, 239-251.

48. F. U. Hartl, M. Hayer-Hartl, Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein, Science 2002, 295, 1852-1858.

49. A. Horovitz, Y. Fridmann, G. Kafri, O. Yifrach, Review: allostery in chaperonins, J. Struct. Biol. 2001, 135, 104-114.

50. Т. Н. W. Koning, D. Schumperli, RNAs and ribonucleoproteins in recognition and catalysis, Eur. J. Biochem. 1994, 219, 25-42.

51. J. Hsieh, A. J. Andrews, C. A. Fierke, Roles of protein subunits in RNA-protein complexes: lessons from ribonuclease P, Biopolymers 2004, 73, 79-89.

52. E. L. Bertrand, J. J. Rossi, Facilitation of hammerhead ribozyme catalysis by the nucleocapsid protein of HIV-1 and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, EMBO J. 1994, 13, 2904-2912.

53. T. Coetzee, D. Herschlag, M. Belfort, Escherichia coli proteins, including ribosomal protein S12, facilitate in vitro splicing of phage T4 introns by acting as RNA chaperones, Genes Dev. 1994, 8, 1575-1588.

54. G. Mohr, M. Caprara, Q. Guo, A. Lambowitz, A tyrosyl-tRNA synthetase can function similarly to an RNA structure in the Tetrahymena ribozyme, Nature 1994, 370, 147-150.

55. J. A. Esteban, A. R. Banerjee, J. M. Burke, Kinetic mechanism of the hairpin ribozyme. Identification and characterization of two nonexchangeable conformations, J. Biol. Chem. 1997, 272, 13629-13639.

56. G. Bokinsky, D. Rueda, V. K. Misra, M. M. Rhodes, A. Gordus, H. P. Babcock, N. G. Walter, X. Zhuang, Single-molecule transition-state analysis of RNA folding, Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA 2003, 100, 9302-9307.

57. D. Thirumalai, N. Lee, S. A. Woodson, D. Klimov, Early events in RNA folding, Annu. Rev. Phys. Chem. 2001, 52, 751-762.

58. P. Brion, E. Westhof, Hierarchy and dynamics of RNA folding, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997, 26, 113-137.

59. K. J. Hampel, J. M. Burke, A conformational change in the «loop Е-like» motif of the hairpin ribozyme is coincidental with domain docking and is essential for catalysis, Biochemistry 2001, 40, 3723-3729.

60. Y. Komatsu, I. Kanzaki, E. Ohtsuka, Enhanced folding of hairpin ribozymes with replaced domains, Biochemistry 1996, 35, 9815-9820.

61. D. M. J. Lilley, Folding and catalysis by the hairpin ribozyme, FEBS Lett. 1999, 452, 26-30.

62. N. G. Walter; K. J. Hampel, К. M. Brown, J. M. Burke, Tertiary structure formation in the hairpin ribozyme monitored by fluorescence resonance energy transfer, EMBO J. 1998, 17, 2378-2391.

63. S. A. McKinney, E. Tan, T. J. Wilson, M. K. Nahas, A.-C. Declais, R. M. Clegg, D. M. J. Lilley, T. Ha, Single-molecule studies of DNA and RNA four-way junctions, Biochem. Soc. Trans. 2004, 32, 41-45.

64. S. E. Butcher, F. H. Allain, J. Feigon, Determination of metal ion binding sites within the hairpin ribozyme domains by NMR, Biochemistry 2000, 39, 21742182.

65. M. J. Fay, N. G. Walter, J. M. Burke, Imaging of single hairpin ribozymes in solution by atomic force microscopy, RNA 2001, 7, 887-895.

66. P. B. Rupert, A. P. Massey, S. T. Sigurdsson, A. R. Ferre-D'Amare, Transition state stabilization by a catalytic RNA, Science 2002, 298, 1421-1424.

67. X. Zhuang, H. Kim, M. J. Pereira, H. P. Babcock, N. G. Walter, S. Chu, Correlating structural dynamics and function in single ribozyme molecules, Science 2002, 296, 1473-1476.

68. A. Hegg, M. J. Fedor, Kinetics and thermodynamics of intermolecular catalysis by hairpin ribozymes, Biochemistry 1995, 34, 15813-15828.

69. N. G. Walter, D. A. Harris, M. J. Pereira, D. Rueda, In the fluorescent spotlight; global and local conformational changes of small catalytic RNAs, Biopolymers 2001, 61, 224-242.

70. T. J. Wilson, D. M. Lilley, Metal ion binding and the folding of the hairpin ribozyme, RNA 2002, 8, 587-600.

71. В. М. Chowrira, A. Berzal-Herranz, J. М. Burke, Ionic requirements for RNA binding, cleavage, and ligation by the hairpin ribozyme, Biochemistry 1993, 32, 1088-1095.

72. Z. Y. Zhao, T. J. Wilson, K. Maxwell, D. M. J. Lilley, The folding of the hairpin ribozyme: dependence on the loops and the junction, RNA 2000, 6, 1833-1846.

73. F. Walter, A. I. H. Murchie, D. M. J. Lilley, Folding of the four-way RNA junction of the hairpin ribozyme, Biochemistry 1998, 37, 17629-17636.

74. U. Mayor, N. R. Guydosh, С. M. Johnson, J. G. Grossmann, S. Sato, G. S. Jas, S. M. Freund, D. O. Alonso, V. Daggett, A. R. Fersht, The complete folding pathway of a protein from nanoseconds to microseconds, Nature 2003, 421, 863-867.

75. D. M. J. Lilley, Origins of RNA catalysis in the hairpin ribozyme, ChemBioChem 2001, 2, 729-733.

76. M. I. Page, W. P. Jencks, Entropic contributions to rate accelerations in enzymic and intramolecular reactions and the chelate effect, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971, 68, 1678-1683.

77. A. Hampel, J. A. Cowan, A unique mechanism for RNA catalysis: the role of metal cofactors in hairpin ribozyme cleavage, Chem. Biol. 1997, 4, 513-517.

78. F. Basolo, R. G. Pearson in Mechanisms of Inorganic Reactions. A Study of Metal Complexes in Solution, Wiley, New York, 1967, pp. 164-165.

79. J. A. Cowan, Metallobiochemistry of RNA. Co(NH3)6]3+ as a probe for Mg2+(aq) binding sites, J. Inorg. Biochem. 1993, 49, 171-175.

80. S. Nesbitt, L. A. Hegg, M. J. Fedor, An unusual pH-independent and metal-ion-independent mechanism for hairpin ribozyme catalysis, Chem. Biol. 1997, 4, 619-630.

81. K. J. Young, F. Gill, J. A. Grasby, Metal ions play a passive role in the hairpin ribozyme catalysed reaction, Nucleic Acids Res. 1997, 25, 3760-3766.

82. Справочник по аналитической химиии. 1 Под ред. Ю. Ю. Лурье. М.: Химия, 1979.

83. S. Nakano, D. М. Chadalavada, Р. С. Bevilacqua, General acid-base catalysis in the mechanism of a hepatitis delta virus ribozyme, Science 2000, 287, 14931497.

84. D. B. McKay, J. E. Wedekind in The RNA World (Ed.: R. F. Gesteland, T. R. Cech, J. F. Atkins), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1999, chapter 11.

85. D. J. Earnshaw, M. J. Gait, Hairpin ribozyme cleavage catalyzed by aminoglycoside antibiotics and the polyamine spermine in the absence of metal ions, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 5551-5561.

86. S. Ravindranathan, S. E. Butcher, J. Feigon, Adenine protonation in domain В of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2000, 39, 16026-16032.

87. P. C. Bevilacqua, T. S. Brown, S. Nakano, R. Yajima, Catalytic roles for proton transfer and protonation in ribozymes, Biopolymers 2004, 73, 90-109.

88. T. J. Wilson, Z.-Y. Zhao, K. Maxwell, L. Kontogiannis, D. M. J. Lilley, Importance of specific nucleotides in the folding of the natural form of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2001, 40, 2291-2302.

89. R. Pinard, K. J. Hampel, J. E. Heckman, D. Lambert, P. A. Chan, F. Major, J. M. Burke, Functional involvement of G8 in the hairpin ribozyme cleavage mechanism, EMBO J. 2001, 20, 6434-6442.

90. S. P. Ryder, S. A. Strobel, Comparative analysis of hairpin ribozyme structures and interference data, Nucleic Acids Res. 2002, 30, 1287-1291.

91. Pauling, Molecular architecture and biological reactions, Chem. Eng. News 1946, 24, 1375-1377.

92. Р. С. Bevilacqua, Mechanistic considerations for general acid-base catalysis by RNA: revisiting the mechanism of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2003, 42, 2259-2265.

93. Y. Komatsu, M. Koizumi, A. Sekiguchi, E. Ohtsuka, Cross-ligation and exchange reactions catalyzed by hairpin ribozymes, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 185-190.

94. S. M. Nesbitt, H. A. Erlacher, M. J. Fedor, The internal equilibrium of the hairpin ribozyme: temperature, ion and pH effects, J. Mol. Biol. 1999, 286, 1009-1024.

95. M. J. Fedor, Tertiary structure stabilization promotes hairpin ribozyme ligation, Biochemistry 1999, 38, 11040-11050.

96. M. K. Nahas, T. J. Wilson, S. Hohng, K. Jarvie, D. M. J. Lilley, T. Ha, Observation of internal cleavage and ligation reactions of a ribozyme, Nut. Struct. Mol. Biol. 2004, 11, 1107-1112.

97. K. J. Hertel, D. Herschlag, О. C. Uhlenbeck, A kinetic and thermodynamic framework for the hammerhead ribozyme reaction, Biochemistry 1994, 33, 3374-3385.

98. J. A. Gerlt, F. H. Westheimer, J. M. Sturtevant, The enthalpies of hydrolysis of acyclic, monocyclic, and glycoside cyclic phosphate diesters, J. Biol. Chem. 1975, 250, 5059-5067.

99. K. J. Hertel, О. C. Uhlenbeck, The internal equilibrium of the hammerhead ribozyme reaction, Biochemistry 1995, 34, 1744-1749.

100. N. G. Walter, J. M. Burke, Real-time monitoring of hairpin ribozyme kinetics through base-specific quenching of fluorescein-labeled substrates, RNA 1997, 3, 392-404.

101. Y. Komatsu, M. Shirai, S. Yamashita, E. Ohtsuka, Construction of hairpin ribozymes with a three-way junction, Bioorg. Med. Chem. 1997, 5, 1063-1069.

102. Y. Komatsu, I. Kanzaki, M. Shirai, I. Kumagai, S. Yamashita, E. Ohtsuka, Functional domain-assembly in hairpin ribozymes, J. Biochem. 2000, 127, 531536.

103. M. Zacharias, P. J. Hagerman, Bulge-induced bends in RNA: quantification by transient electric birefringence, J. Mol. Biol. 1995, 247, 486-500.

104. D. Klostermeier, D. P. Millar, Helical junctions as determinants for RNA folding: origin of tertiary structure stability of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2000, 39, 12970-12978.

105. P. A. Feldstein, G. Bruening, Catalytically active geometry in the reversible circularization of «mini-monomer» RNAs derived from the complementary strand of tobacco ringspot virus satellite RNA, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 1991-1998.

106. C. Schmidt, R. Welz, S. Muller, RNA double cleavage by a hairpin-derived twin ribozyme, Nucleic Acids Res. 2000, 28, 886-894.

107. S. Muller, R. Welz, S. A. Ivanov, K. Bossmann in Highlights in Bioorganic Chemistry: Methods and Applications (Ed.: C. Schmuck, H. Wennemers), Wiley-VCH, Weinheim, 2004, pp. 404-421.

108. R. Welz, C. Schmidt, S. Muller, Spermine supports catalysis of hairpin ribozyme variants to differing extents, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, 283, 648654.

109. S. Muller, докторская диссертация, 2002, Humboldt-Universitat zu Berlin, Берлин

110. S. Joseph, J. M. Burke, Optimization of an anti-HIV hairpin ribozyme by in vitro selection, J. Biol. Chem. 1993, 268, 24515-24518.

111. R. Welz, S. Muller, 5-(Benzylmercapto)-1/-/-tetrazole as activator for 2'-0-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis, Tetrahedron Lett. 2002, 43, 795-797.

112. D.K. Muller, С.Т. Martin, J.E. Coleman, Processivity of proteolytically modified forms of T7 RNA polymerase, Biochemistry 1988, 27, 5763-5771.

113. S. S. Daube, P. H. von Hippel, Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes, Science 1992, 258, 1320-1324.

114. A. J. Carpousis, J. D. Gralla, Cycling of ribonucleic acid polymerase to produce oligonucleotides during initiation in vitro at the lac UV5 promoter, Biochemistry 1980, 19, 3245-3253.

115. С. T. Martin, D. K. Muller, J. E. Coleman, Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase, Biochemistry 1988, 27, 3966-3974.

116. W. Y. Yin, T. A. Steitz, Structural basis for the transition from initiation to elongation transcription in T7 RNA polymerase, Science 2002, 298, 1387-1395.

117. T. Wada, A. Kobori, S. Kawahara, M! Sekine, Synthesis and hybridization ability of oligodeoxyribonucleotides incorporating A/-acyldeoxycytidine derivatives, Eur. J. Org. Chem. 2001, 4583-4593.

118. J. R. Wyatt, G. T. Walker, Deoxynucleotide-containing oligoribonucleotide duplexes: stability and susceptibility to RNase V1 and RNase H, Nucleic Acids Res. 1989, 17, 7833-7842.

119. T. Horn, C. A. Chang, M. S. Urdea, An improved divergent synthesis of comb-type branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) containing multiple secondary sequences, Nucleic Acids Res. 1997, 25, 4835-4841.

120. B. S. Sproat, B. Beijer, M. Grotli, U. Ryder, K. L. Morand, A. I. Lamond, Chem. Soc. Perkin. Trans. 1 1994, 419-431.

121. S. Iwai, E. Ohtsuka, 5'-Levulinyl and 2'-tetrahydrofuranyl protection for the synthesis of oligoribonucleotides by the phosphoramidite approach, Nucleic Acids Res. 1988, 16, 9443-9456.

122. M. D. Sorensen, M. Meldgaard, V. К. Rajwanshi, J. Wengel, Branched oligonucleotides containing bicyclic nucleotides as branching points and DNA or LNA as triplex forming branch, Bioorg. Med. Chem. Let. 2000, 10, 1853-1856.

123. К. K. Oligvie, M. J. Nemer, G. H. Hakimelahi, Y. A. Proba, M. Lucas, N-levulination of nucleosides, Tetrahedron Lett. 1982, 23, 2615-2618.

124. K. Ganeshan, T. Tadey, K. Nam, R. Braich, W. C. Purdy, J. D. Boeke, M. J. Damha, Novel approaches to the synthesis and analysis of branched RNA, Nucleosides Nucleotides 1995, 14, 1009-1013.

125. T. Wu, К. K. Oligvie, R. T. Pon, Prevention of chain cleavage in the chemical synthesis of 2-silylated oligoribonucleotides, Nucleic Acids Res. 1989, 17, 3501-3517.

126. M. J. Damha, K. Ganeshan, R. H. E. Hudson, S. V. Zabarylo, Solid-phase synthesis of branched oligoribonucleotides related to messenger RNA splicing intermediates, Nucleic Acids Res. 1992, 20, 6565-6573.

127. F. Wincott, A. DiRenzo, C. Shaffer, S. Grimm, D. Tracz, C. Workman, D. Sweedler, C. Gonzalez, S. Scaringe, N. Usman, Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes, Nucleic Acids Res. 1995, 23, 2677-2684.

128. J. F. Milligan, О. C. Uhlenbeck, Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase, Methods Enzymol. 1989, 180, 51-62.

129. R. Welz, кандидатская диссертация, 2003, Humboldt-Universitat zu Berlin, Берлин.

130. S. Hohng, C. Joo, T. Ha, Single-molecule three-color FRET, Biophys. J. 2004, 87, 1328-1337.

131. R. Welz, K. Bossmann, C. Klug, C. Schmidt, H.-J. Fritz, S. Muller, Site-directed alteration of RNA sequence mediated by an engineered twin ribozyme, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 2424-2427.