Взаимодействие тРНКPhe с комплементарными олигонуклеотидами: кинетический механизм и влияние на функциональную активность тРНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Сериков, Роман Николаевич

• Сериков, Роман Николаевич
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сериков, Роман Николаевич

Список сокращений

Введение

1. Природные механизмы, обеспечивающие специфическое РНК-РНК 9 взаимодействие (Обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Методы исследования структуры РНК и их комплексов

1.2.1. Использование флуоресцентной спектроскопии для изучения 11 взаимодействия молекул РНК in vitro

1.2.2. Изучение гибридизации нуклеиновых кислот в культуре клеток in vitro

1.2.3. Использование методов магнитного резонанса в изучении структуры и 18 функций РНК

1.3. Природные механизмы РНК-РНК-взаимодействий

1.4. Взаимодействие антисмысловых РНК с РНК-мишенью

1.4.1. Регуляция репликации плазмиды Со1Е

1.4.2. Регуляция репликации плазмиды ColE

1.4.3. Механизм взаимодействия антисмысловой РНК и РНК-мишени при 28 регуляции репликации плазмиды IncB

1.4.4. Механизм регуляции репликации плазмиды R

1.4.5. Общие закономерности взаимодействия природных антисмысловых 31 РНК с РНК - мишенями

1.5. РНК-РНК взаимодействия, направляющие димеризацию ретровирусных 32 РНК

1.6. Механизм регуляции экспрессии генов при помощи miPHK

1.7. Факторы, обеспечивающие селективное взаимодействие рибозимов с их 39 субстратами

1.8. Взаимодействие олигонуклеотидов с РНК

1.9. Kissing-комплексы - природные механизмы специфического узнавания 47 РНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие тРНКPhe с комплементарными олигонуклеотидами: кинетический механизм и влияние на функциональную активность тРНК»

Технологии, основанные на использовании антисмысловых олигонукпеотидов различной природы или антисмысловых РНК для регуляции экспрессии генов или для подавления размножения вирусов, развиваются широким фронтом, начиная с середины 80-х. Несмотря на это, задача создания высокоспецифичных и селективно действующих производных олигонуклеотидов пока не была решена. На основе таких агентов могут быть созданы терапевтические препараты, способные инактивировать нуклеиновые кислоты инфекционных агентов и регулировать экспрессию определенных генов. Прямым подходом к получению соединений, избирательно действующих на определенные нуклеотидные последовательности, является синтез конъюгатов олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные группы [1-10].

Согласно современным представлениям любая молекула РНК имеет сложную пространственную структуру, стабилизированную третичными взаимодействиями между петлями или одноцепочечными участками. Межмолекулярные взаимодействия двух РНК также происходят за счет образования комплементарных пар между основаниями в петле одной РНК с основаниями петли или одноцепочечным участком другой РНК, что приводит к формированию пространственной структуры более высокого порядка [11-15].

В последнее время наметился переход от попыток использования немодифицированных антисмысловых олигонуклеотидов для подавления экспрессии генов к их более эффективным производным, такими как locked nucleic acids (LNA), пептидо-нуклеиновые кислоты (peptide nucleic acids, PNA), конъюгаты олигонуклеотидов с реакционноспособными группами или siPHK [16-20]. Следует отметить, что большинство реакционноспособных конъюгатов олигонуклеотидов, разработанных и исследованных к настоящему времени, были эффективны в реакции направленной модификации или расщепления только коротких синтетических ДНК-мишеней [3,4,9], реже эти конъюгаты испытывались в реакциях с короткими синтетическими РНК-мишенями и в направленной модификации или расщеплении природных РНК [21]. Чаще всего исследовали термодинамические параметры взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК- или РНК- мишенями, намного реже проводили исследование кинетического механизма образования комплексов. Детальный механизм взаимодействия олигонуклеотидов с природными высокоструктурированными РНК пока не был изучен в достаточной степени.

Целью настоящей работы являлось детальное изучение механизма и эффективности направленного воздействия на природные структурированные РНК на примере модельной системы, в которой использовались TPHKPhe из дрожжей и ряд направленных к этой тРНК олигонуклеотидов.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1) Оценка влияния антисмысловых олигонуклеотидов на функциональную активность природной TPHKPhe из дрожжей в реакции аминоацилирования. Сравнение предельного уровня аминоацилирования тРНК с данными по взаимодействию с ней олигонуклеотидов, полученных при помощи метода задержки в геле.

2) Дизайн и препаративный синтез флуоресцентных производных олигонуклеотидов и РНК, которые позволили бы проводить прямой мониторинг взаимодействия олигонуклеотида с РНК. Оптимизация методики введения флуоресцентных групп в различные типы нуклеиновых кислот.

3) Детальное изучение кинетического механизма взаимодействия антисмыслового олигонуклеотида с дрожжевой тРНК с помощью комбинации методов остановленной струи ("stopped-flow") и резонансного переноса энергии флуоресценции (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). Разработка математической модели для анализа кинетических данных по взаимодействию антисмыслового олигонуклеотида с тРНК. Выявление всех промежуточных метастабильных состояний РНК, которые она может претерпевать в ходе взаимодействия с олигонуклеотидом.

ПРИРОДНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СПЕЦИФИЧЕСКОГО РНК-РНК ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ (Обзор литературы)

1.1. Введение

В течение последних нескольких десятилетий было разработано большое число методов направленного воздействия на ДНК и РНК с целью регуляции экспрессии генов [3,4,22-28]. Эти методы основаны, главным образом, на образовании специфических комплексов биологически активных олигомеров (например, олигонуклеотидов) с выбранной мишенью, в роли которой чаще всего выступают различные РНК, а также могут выступать ДНК, рис. 1. Антисмысловая технология регуляции экспрессии генов основана на использовании синтетических олигодезоксирибонуклеотидов длиной 15 - 25 оснований, комплементарных выбранной последовательности мРНК, пре-мРНК или вирусной РНК [2,29]. Образование стабильного комплементарного комплекса антисмысловой олигонуклеотид/РНК или блокировало трансляцию, вызывало альтернативный сплайсинг, или приводило к расщеплению этой РНК в составе гетеродуплекса клеточной РНКазой Н. Основными проблемами, с которыми сталкивались исследователи при создании антисмысловых и ген-направленных олигонуклеотидов, были отсутствие стабильности олигонуклеотидов в клеточной среде или организме, недостаточная стабильность комплекса, образуемого этим олигонуклеотидом с РНК или ДНК мишенью, а также проблема неэффективной самостоятельной доставки олигонуклеотидов внутрь клетки. Решение этих проблем привело к разработке широкого спектра модифицированных аналогов олигонуклеотидов с улучшенной нуклеазоустойчивостью [30], улучшенными гибридизационными свойствами (скорость связывания и равновесные константы образования комплексов) [31], реакционноспособных аналогов олигонуклеотидов [22], синтетических микроРНК и экспрессирующих их векторов [32], малых интерферирующих РНК [33], ДНКзимов и рибозимов [34,35].

Как хорошо известно, молекулы РНК обладают сложной пространственной структурой, которая стабилизирована внутримолекулярными взаимодействиями между петлями, стэкинг-взаимодействиями между основаниями в петлях или стеблях шпилек, связыванием с ионами двухвалентных металлов и белками [36-40]. Прочная пространственная структура РНК является основным фактором, снижающим эффективность действия как антисмысловых олигонуклеотидов и их реакционноспособных аналогов, так и ДНКзимов, рибозимов и других коротких нуклеиновых кислот, направленных к РНК-мишени. В физиологических условиях

Ганскрипция тРНК мРНК тРНК

Ядерная мемб(

Трансляция

Транскрипция

Цитоплазма

Рибосома

РНК полипептид и \ Пул аминокислот, тРНК.

Субъединицы рибосомы к ри6осониых субъединиц

ТОК ДНК

Ядерные V

РНК-транскрипта О мяРНК или

-и

Рис. 1. Пути регуляции экспрессии генов при помощи синтетических олигонуклеотидов [18]. Связывание опигомера с ДНК, пре-мРНК или мРНК в ядре клетки, с мРНК или белком в цитоплазме приводит к селективному подавлению экспрессии данного гена или ингибированию функции белка (в случае использования аптамеров). открытые для взаимодействия участки в составе природных РНК практически отсутствуют, и реальные мишени для олигонуклеотидов или антисмысловых РНК представляют собой элементы трехмерной укладки определенных нукпеотидных последовательностей [41,42]. Наиболее распространенными элементами вторичной структуры РНК являются шпильки - короткие частично самокомплементарные нуклеотидные последовательности, состоящие из стебля и петли, взаимодействия между которыми, сопровождающиеся образованием псевдоузлов, определяют формирование биологически активной трехмерной структуры РНК [43,44]. Шпилечные структуры являются сайтами узнавания для регуляторных белков в процессе транскрипции и трансляции. Взаимодействие между определенными шпильками РНК является ключевым этапом при узнавании РНК природными антисмысловыми РНК [45], а также в процессе димеризации ретровирусных РНК, приводящем к формированию биологически активного диплоидного генома ретровирусов [46,47]. Характерной чертой этих процессов является перестройка структур шпилек во время взаимодействия [48,49]. Механизм взаимодействия различных шпилек определяется размерами и последовательностями их петель и структурой её стеблевых участков. Последовательность петли оказывает большое влияние на эффективность взаимодействия с ней комплементарного олигонуклеотида [50].

В данном обзоре будут рассмотрены природные механизмы, обеспечивающие селективное РНК - РНК взаимодействие. Особое внимание будет уделено работам, в которых определены структурные детерминанты специфичности таких взаимодействий.

1.2. Методы исследования структуры РНК и её комплексов

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сериков, Роман Николаевич

4. Выводы

В настоящей работе проведено детальное изучения механизма и эффективности направленного воздействия на природные структурированные РНК на примере модельной системы, в которой использовались тРНКРМе из дрожжей и ряд направленных к этой РНК олигонуклеотидов.

1) Изучено влияние антисмысловых олигонуклеотидов на функциональную активность природной тРНКРМе из дрожжей и транскрипта этой тРНК в реакции аминоацилирования. Впервые показано, что значительное подавление уровня аминоацилирования в присутствии 15 мМ ионов магния наблюдается только для транскрипта фенилаланиновой дрожжевой тРНК в присутствии сильно связывающегося аналога олигонуклеотида 1К. В случае аминоацилирования природной тРНКр,1е из дрожжей уровень подавления реакции аминоацилирования этими же антисмысловыми олигонуклеотидами не превышал 40%. Стабильность пространственной структуры природной тРНКРЬе в присутствии 15 мМ ионов магния является главным фактором, препятствующим подавлению её функциональной активности комплементарными олигонуклеотидами.

2) Оптимизована процедура введения флуоресцентных меток в РНК, основанная на окислении З'-концевого остатка рибозы периодатом натрия с последующим присоединением аминолинкера, восстановлением цианоборгидридом натрия и реакцией с флуоресцеин изотиоцианатом. Предложено проводить эту многостадийную реакцию в "одной пробирке" без выделения продуктов превращения РНК. С использованием разработанного протокола были получены конъюгаты тРНК и олигорибонуклеотидов с флуоресцентными красителями с выходами до 85%.

3) Впервые показано, что процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК в физиологических условиях является четырёхстадийным. На первой, быстрой стадии, образуется промежуточный комплекс с участием нескольких оснований тРНКРЬе, расположенных в Т-петле. Образование комплекса олигонуклеотида с последовательностью в Т-петле вызывает дестабилизацию акцепторного стебля и, возможно, Т-стебля тРНК, делая структуру этих стеблей, находящихся в коаксиальном стэкинге друг с другом, более подвижной, "дышащей". Вслед за этим начинается формирование "правильного" промежуточного комплекса между второй молекулой олигонуклеотида и ставшим более доступным одноцепочечным участком на З'-конце тРНК (З'АССАб'), формирование этого метастабильного комплекса инициирует структурные перестройки, приводящие к формированию полноразмерного гетеродуплекса тРНКЮЫ путем последовательного вытеснения из взаимодействия цепи тРНК, комплементарной участку связывания олигонуклеотида.

4) Компьютерное моделирование процесса комплексообразования тРНК с олигонуклеотидом подтвердило предложенный механизм взаимодействия, показав, что первичное взаимодействие олигонуклеотида с тРНК, происходящее в области Т-петли, дополнительно стабилизировано формированием неканонических пар оснований, что способствует формированию полноразмерного дуплекса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сериков, Роман Николаевич, 2009 год

1. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized photomodification of single-stranded DNA by a binary system of oligonucleotide conjugates. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 309317.

2. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F. Reactive oligonucleotide derivatives and sequence-specific modification of nucleic acids. // Biochimie. 1985. V. 67. P. 785-789.

3. Knorre D.G., Vlassov V.V. Reactive oligonucleotide derivatives as gene-targeted biologically active compounds and affinity probes. // Genetica. 1991. V. 85. P. 53-63.

4. Sela M., Arnon R., Jacob C.O. Synthetic peptides with antigenic specificity for bacterial toxins. // Ciba Found Symp. 1986. V. 119. P. 184-199.

5. Yang X., Meng X., Li В., Chen Z., Zhao D., Tan X., Yu Q. Inhibition of in vitro amplification of targeted DNA fragment and activity of exonuclease I by a fullerene-oligonucleotide conjugate. // Biologicals. 2008. V. 36. P. 223-226.

6. Zhou Q., Pande P., Johnson A.E., Rokita S.E. Sequence-specific delivery of a quinone methide intermediate to the major groove of DNA. // Bioorg Med Chem. 2001. V. 9. P. 2347-2354.

7. Zhou Q., Rokita S.E. A general strategy for target-promoted alkylation in biological systems. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100. P. 15452-15457.

8. Grineva N.I., Karpova G.G. Complementarily addressed modification of rRNA with p-(chloroethylmethylamino)benzylidene hexanucleotides. // FEBS Lett. 1973. V. 32. P. 351-355.

9. Holbrook S.R. Structural principles from large RNAs. // Annu Rev Biophys. 2008. V. 37. P. 445-464.

10. Li P.T., Vieregg J., Tinoco I., Jr. How RNA unfolds and refolds. // Annu Rev Biochem. 2008. V. 77. P. 77-100.

11. Bevilacqua P.C., Blose J.M. Structures, kinetics, thermodynamics, and biological functions of RNA hairpins. // Annu Rev Phys Chem. 2008. V. 59. P. 79-103.

12. Schwalbe H., Buck J., Furtig В., Noeske J., Wohnert J. Structures of RNA switches: insight into molecular recognition and tertiary structure. // Angew Chem Int Ed Engl. 2007. V. 46. P. 1212-1219.

13. Spirin A.S. The ribosome as an RNA-based molecular machine. // RNA Biol. 2004. V. 1. P. 3-9.

14. Cook P.D. A brief history, status, and perspective of modified oligonucleotides for chemotherapeutic applications. // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2001. Chapter 4. Unit 4.1.

15. Korshun V.A., Stetsenko D.A., Gait M.J. Uridine 2'-carbamates: facile tools for oligonucleotide 2'-functionalization. // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2004. Chapter 4. Unit 4.21.18.