Новые двухкомпонентные конструкции на основе ДНКзима "10-23" тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Фокина, Алеся Анатольевна

• Фокина, Алеся Анатольевна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Фокина, Алеся Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ДНКЗИМ «10-23»: КОНСТРУИРОВАНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. ДНКзим «10-23» как каталитически активная нуклеиновая кислота

1.1.1. Роль ионов двухвалентных металлов в расщеплении РНК ДНКзимом« 10-23»

1.1.2. Кинетическая схема расщепления РНК ДНКзимом «10-23»

1.2. Связь структуры ДНКзима «10-23» и его каталитической активности

1.2.1. Влияние последовательности оснований каталитического домена на активность ДНКзима «10-23»

1.2.2. Зависимость каталитической активности ДНКзима «10-23» от длины, последовательности и типа нуклеотидов субстрат-связывающих участков

1.2.3. Регуляция каталитической активности ДНКзима «10-23» при помощи его конъюгирования с функциональными молекулами

1.2.4. Использование олигонуклеотидов-эффекторов для регуляции каталитической активности ДНКзима «10-23»

1.3. Применение ДНКзимов «10-23»

1.3.1. Использование ДНКзимов «10-23» для подавления экспрессии генов на уровне мРНК

1.3.1.1. Выбор участков РНК, доступных для расщепления ДНКзимами

1.3.1.2. Повышение устойчивости ДНКзима «10-23» в биологических средах

1.3.1.3. Способы доставки ДНКзимов в клетки

1.3.1.4. Расщепление протяженных РНК in vitro и ингибирование экспрессии генов in vivo ДНКзимами «10-23»

1.3.1.5. Сравнение биологической активности ДНКзима «10-23» с другими антисенс-агентами

1.3.2. Нетерапевтическое применение ДНКзимов «10-23»

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и приборы

2.2. Основные методы работы

2.3. Методики эксперимента

2.3.1. Выделение и анализ олигонуклеотидов

2.3.2. Получение фрагмента IGF-I мРНК крысы (РНК364) транскрипцией in vitro

2.3.3. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды

2.3.4. Введение радиоактивной метки в протяженные РНК-транскрипты

2.3.5. Расщепление синтетических фрагментов MDR1 мРНК (РНК18 и РНК25) ДНКзимными конструкциями

2.3.6. Расщепление синтетических фрагментов IGF-I мРНК ДНКзимными конструкциями серий FRSGt/, FRSGc, KPT и GAEL

2.3.7. Расщепление протяженных транскриптов MDR1 и IGF-I мРНК ДНКзимными конструкциями

2.3.8. Определение констант скорости ассоциации комплексов, образованных двухкомпонентным ДНКзимом или его отдельными компонентами с РНК

2.3.9. Исследование расщепления РНК364 РНКазой Н в присутствии антисенс-олигодезоксирибонуклеотидов и «мутантных» версий ДНКзимов

2.3.10. Исследование устойчивости ДНКзимов в культуральной среде с сывороткой

3. СОЗДАНИЕ ДВУХКОМПОНЕНТНЫХ ДНКзимов «10-23» И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)

3.1. Разработка стратегии конструирования двухкомлонентных ДНКзимных систем. Модельные двухкомпонентные ДНКзимные конструкции и изучение их каталитической активности

3.1.1. Создание модельных систем двухкомпонентных ДНКзимов

3.1.2. Влияние строения олигонуклеотидов-эффекторов на эффективность расщепления синтетического РНК-субстрата двухкомпонентными ДНКзимами

3.1.3. Влияние «инвертированного» тимидина на 3'-конце ДНКзима на эффективность расщепления РНК двухкомпонентными конструкциями

3.2. Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена множественной лекарственной устойчивости MDR

3.2.1. Выбор участка MDR1 мРНК-транскрипта для расщепления двухкомпонентными ДНКзимами. Создание двухкомпонентных систем для расщепления протяженного транскрипта MDR1 мРНК

3.2.2. Расщепление протяженного 190-звенного структурированного фрагмента MDR1 мРНК созданными двухкомпонентными ДНКзимами

3.3. Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена инсулиноподобного фактора роста IGF-I

3.3.1. Выбор участков.IGF-I мРНК для расщепления ДНКзимными конструкциями. Оптимизация длины субстрат-связывающих участков ДНКзимов. Инозинсодержащие аналоги ДНКзимов

3.3.2. ДНКзимы «10-23» для расщепления IGF-I мРНК, содержащие модификации в каталитическом коре и субстрат-связывающих участках

3.3.3. Расщепление протяженного транскрипта IGF-I мРНК наиболее эффективными ДНКзимами

3.3.4. Конструирование двухкомпонентных ДНКзимов «10-23» для расщепления IGF-I мРНК-транскрипта и изучение кинетических аспектов связывания двухкомпонентной конструкции с РНК

3.3.5. Расщепление IGF-I мРНК-транскрипта двухкомпонентными ДНКзимами 138 ВЫВОДЫ 141 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и международного союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения: р - концевой фосфат В - гетероциклическое основание

Tmv- остаток тимидина, присоединенный З'-З'-фосфодиэфирной связью

АТР - аденозинтрифосфат

UTP - уридинтрифосфат

Phn - остаток Ы-(2-гидроксиэтил)феназиния

DMSO - диметилсульфоксид

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

НК - нуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота мРНК - информационная РНК

LNA - locked nucleic acid ед. акт. - единица активности фермента

ОЕ - оптическая единица

SELEX - Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

КД - круговой дихроизм

ПААГ - полиакриламидный гель

ФДЭ - фосфодиэстераза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые двухкомпонентные конструкции на основе ДНКзима "10-23"»

Разработка эффективных подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты является актуальной проблемой современной молекулярной биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины. Большой интерес исследователей вызывает поиск агентов, способных избирательно взаимодействовать с определенными последовательностями мРНК, с целью создания на их основе инструментов молекулярно-биологических исследований и терапевтических средств для лечения вирусных, онкологических и других заболеваний.

Одним из перспективных подходов к селективному воздействию на РНК, имеющим как фундаментальное, так и прикладное значение, является использование каталитических нуклеиновых кислот - олигорибо- и олигодезоксирибонуклеотидов с характерной вторичной структурой, способных катализировать избирательное расщепление фосфодиэфирных связей в РНК.

Ярким представителем каталитически активных нуклеиновых кислот является ДНКзим «10-23», полученный методом SELEX в 1997 г. [1] и представляющий собой каталитический кор из 15 дезоксирибонуклеотидов, фланкированный двумя РНК-узнающими олигодезоксирибонуклеотидными участками. Пространственная структура активного комплекса ДНКзим'РНК еще не установлена, но тем не менее простота синтеза, высокая каталитическая активность и широкая субстратная специфичность (пурин-пиримидиновые сайты в РНК) позволили использовать ДНКзимы «10-23» для расщепления множества РНК-мишеней как in vitro, так и in vivo. За истекшие 10 лет опубликовано большое число работ, в которых продемонстрировано эффективное подавление этими ДНКзимами экспрессии генов, вызывающих инфекционные и онкологические заболевания, а также заболевания нервной и сердечно-сосудистой систем (см., например, обзоры [2 - 5]). Как примеры нетерапевтического применения ДНКзимов «10-23» следует упомянуть использование этих НК-энзимов для выявления однонуклеотидных полиморфизмов, выделения и наработки РНК-транскриптов, для количественной детекции РНК, для выявления участков связывания РНК с комплементарными олигонуклеотидами (см. обзоры [6, 7]), а также для создания молекулярных «нанодвигателей» (см. обзор [8]).

В настоящее время интенсивно ведется поиск новых вариантов каталитически активных конструкций на основе ДНКзима «10-23» с комплексом улучшенных физико-химических и биологических свойств. Решающими факторами, которые нужно учитывать при конструировании ДНКзимов «10-23», являются высокая эффективность расщепления, устойчивость к нуклеазам и способность воздействовать на природные РНК, имеющие сложную пространственную структуру.

Целью данной работы было создание новых устойчивых в биологических средах и эффективно расщепляющих протяженные структурированные РНК двухкомпонентных ДНКзимов, которые состоят из ДНКзима «10-23» и олигонуклеотидов-эффекторов, связывающихся с РНК-субстратом вблизи 3'- или 5'-конца ДНКзима.

В качестве терапевтически важных мишеней нами были выбраны мРНК гена множественной лекарственной устойчивости МБШ и мРНК гена инсулиноподобного фактора роста ЮР-1.

Появление у опухолевых клеток фенотипа множественной лекарственной устойчивости, заключающегося в приобретении клетками опухоли резистентности к целому ряду химиотерапевтических препаратов, часто обусловлено гиперэкспрессией гена ШЖ1, кодирующего трансмембранный белок Р-гликопротеин, выводящий из клетки широкий спектр соединений, в том числе и препараты, используемые в химиотерапии рака (см. обзор [9]). Ингибирование экспрессии гена МБШ является наиболее прямым подходом для преодоления синдрома множественной лекарственной устойчивости.

Инсулиноподобный фактор роста I представляет собой полипептид, непосредственно вовлеченный в процессы клеточной дифференциации и пролиферации. Показано, что этот фактор является потенциальным ингибитором апоптоза. Гиперэкспрессия гена ЮР-1 приводит к злокачественному перерождению клетки (см. обзор [10]).

Следует отметить, что использование ДНКзимов «10-23» для воздействия на МОЮ и ЮР-1 мРНК впервые предложено в данной работе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решение следующих задач:

• разработка стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимов, устойчивых в биологических средах;

• конструирование двухкомпонентных ДНКзимов, направленных на мРНК генов множественной лекарственной устойчивости 1уНЖ1 и инсулиноподобного фактора роста ЮР-1;

• исследование закономерностей расщепления протяженных структурированных фрагментов МОШ мРНК и ЮР-1 мРНК созданными двухкомпонентными конструкциями.

Разработка стратегии конструирования устойчивых в биологических средах двухкомпонентных ДНКзимов «10-23», основанной на «разворачивании» пространственной структуры природной РНК одним из компонентов с последующим ее эффективным расщеплением другим компонентом, открывает возможность создания новых перспективных ингибиторов экспрессии генов на уровне мРНК.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Фокина, Алеся Анатольевна

выводы

Предложена и апробирована стратегия конструирования устойчивых в биологических средах двухкомпонентных ДНКзимов для эффективного расщепления протяженных структурированных РНК-мишеней, основанная на использовании ДНКзима «10-23» и олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов, которые связываются с РНК «встык» с 3'- или 5'-концом ДНКзима, «разворачивая» ее вторичную структуру и облегчая тем самым присоединение ДНКзима к мишени.

1. Созданы двухкомпонентные ДНКзимы, направленные на короткий и протяженный структурированный фрагменты мРНК гена множественной лекарственной устойчивости МОШ. Изучено влияние типа эффектора и наличия в нем концевых модификаций на расщепление этих фрагментов созданными конструкциями. Определены кинетические параметры расщепления. Показано:

• общая каталитическая эффективность ДНКзимов и их 3'-«инвертированных» аналогов в присутствии олигонуклеотидов-эффекторов возрастает на 1-2 порядка;

• роль олигонуклеотидов-эффекторов заключается в значительном усилении сродства ДНКзима к РНК-мишени;

• оптимальным вариантом эффекторов являются олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) с дополнительным З'-концевым тимидином, присоединенным З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью;

• двухкомпонентные ДНКзимы эффективно расщепляют 190-звенный фрагмент МОГи мРНК, при этом наиболее высокой каталитической активностью обладает система, содержащая З'-эффектор.

2. Созданы четыре серии модифицированных ДНКзимов «10-23», направленных на различные участки мРНК гена инсулиноподобного фактора роста ЮГЧ с неизвестной вторичной структурой. Исследована каталитическая активность созданных ДНКзимов в реакциях расщепления коротких фрагментов и протяженного транскрипта ЮР-1 мРНК. Найдены две серии ДНКзимов «10-23» с наиболее высокой эффективностью расщепления.

Показано, что наиболее эффективными в расщеплении протяженного 364-звенного транскрипта ЮР-1 мРНК являются 3'-«инвертированные» ДНКзимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды в субстрат-связывающих участках и неконсервативных позициях каталитического кора.

3. Созданы двухкомпонентные конструкции, направленные на ЮР-1 мРНК, состоящие из 3'-«инвертированного» ДНКзима «10-23», содержащего 2-0-метилрибонуклеотиды, и 3'-«инвертированных» 20-звенных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов. Изучено связывание двухкомпонентных ДНКзимов с 364-звенным ГСР-1 мРНК-транскриптом и определены кинетические параметры расщепления протяженной РНК созданными конструкциями. Показано:

• эффекторы обладают более высокой скоростью ассоциации со структурированной РНК по сравнению с ДНКзимами;

• в присутствии эффектора скорость связывания ДНКзима со структурированным РНК-транскриптом повышается в 10-20 раз;

• двухкомпонентные конструкции расщепляют протяженный ЮР-1 мРНК-транскрипт с высокой эффективностью. Общая каталитическая эффективность ДНКзимов повышается в 3-20 раз в присутствии эффекторов за счет снижения значения константы Михаэлиса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Фокина, Алеся Анатольевна, 2008 год

1. Santoro S. W., Joyce G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94. № 9. P. 4262-4266.

2. Tritz R., Habita C., Robbins J. M., Gomez G. G., Kruse C. A. Catalytic nucleic acid enzymes for the study and development of therapies in the central nervous system: Review Article. // Gene Ther. Mol. Biol. 2005. V. 9A. P. 89-106.

3. Isaka Y. DNAzymes as potential therapeutic molecules. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2007. V. 9. №2. P. 132-136.

4. Joyce G. F. RNA cleavage by the 10-23 DNA enzyme. // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 503-517.

5. Silverman S. K. In vitro selection, characterization, and application of deoxyribozymes that cleave RNA. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 19. P. 61516163.

6. Lu Y., Liu J. Functional DNA nanotechnology: emerging applications of DNAzymes and aptamers. // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. V. 17. № 6. P. 580-588.

7. Ставровская А. А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. // Биохимия. 2000. Т. 65. № 1. С. 112-126.

8. Pollak М. N., Schernhammer Е. S., Hankinson S. Е. Insulin-like growth factors and neoplasia. // Nat Rev Cancer. 2004. V. 4. № 7. P. 505-518.

9. Cech T. R., Zaug A. J., Grabowski P. J. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. // Cell. 1981. V. 27. № 3. Pt 2. P. 487-496.

10. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh Т., Pace N., Altman S. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. // Cell. 1983. V. 35. № 3. Pt 2. P. 849-857.1314,15,16