Закономерности взаимодействия с РНК олигонуклеотидов, олигонуклеотидных конъюгатов и катализаторов гидролиза фосфодиэфирных связей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, доктор биологических наук Зенкова, Марина Аркадьевна

• Зенкова, Марина Аркадьевна
• доктор биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации доктор биологических наук Зенкова, Марина Аркадьевна

Список сокращений

Введение

1. Влияние структуры РНК на термодинамику и кинетику её взаимодействия с 11 олигонуклеотидами (Обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Методы исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК

1.3. Термодинамические параметры взаимодействия олигонуклеотидов с РНК

1.3.1. Влияние структуры РНК на взаимодействие с комплементарными 16 олигонуклеотидами

1.3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с тРНК

1.4. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с РНК

1.5. Теоретические подходы расчета сродства олигонуклеотидов к 38 структурированным участкам РНК

1.6. Сравнение активности антисмысловых олигонуклеотидов в бесклеточных 41 системах и культуре клеток in vitro с рассчитанными параметрами сродства к РНК-мишеням

2. Взаимодействие олигонуклеотидов с РНК: кинетические, 48 термодинамические и структурные аспекты

2.1. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с дрожжевой 48 фенилаланиновой тРНК

2.1.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов.

2.1.2. Равновесная гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНК

2.1.3. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с тРНК

2.2. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с 171-звенным 69 фрагментом 23S рРНК, содержащем а-сарциновую петлю

2.2.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов

2.2.2. Гибридизация олигонуклеотидов с ECAS171 РНК

2.2.3. Обсуждение данных по взаимодействию олигонуклеотидов с 78 фрагментом ECAS171 РНК

2.3. Взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с мРНК гена MDR 1 82 человека

2.3.1. Идентификация в структуре 5-концевого фрагмента MDR 1 мРНК 82 сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов

2.3.2. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с фрагментом MDR 1 91 РНК

2.3.3. Применение бис-пиренильных производных олигонуклеотидов для 109 детекции ДНК в растворе

2.4. Механизм гибридизации олигонуклеотидов с РНК 111 2.4.1. Гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКр"е

2.4.2. Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с 119 методов остановленной струи

2.4.3. Определение параметров Еа, ЛН и AS процесса гибридизации 128 олигонуклеотида S5 с ECAS171 РНК. Механизм гибридизации.

2.5. Сильно-связывающиеся аналоги олигонуклеотидов (SB-ON) - путь увеличения эффективности гибридизации олигонуклеотидов с РНК

2.5.1. Сравнение взаимодействия SB-ONs с тРНК™® из дрожжей с 133 немодифицированными олигонуклеотидами

2.5.2. Гибридизация SB-ONs с тРНК^6 в присутствии ионов магния

2.5.3. Определение минимального размера SB олигонуклеотида, 140 способного связываться с tPHK™

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С РНК IN VITRO В КУЛЬТУРЕ 145 КЛЕТОК

3.1. Обращение р-гликопротеин опосредованной множественной лекарственной 145 устойчивости (PGY/MDR1) с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и рибозимов (Литературное введение)

3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с MDR1 мРНК in vitro в культуре клеток

3.2.1. Выбор модели

3.2.2. Производные олигонуклеотидов, использованные для ингибирования 171 экспрессии MDR 1 мРНК в клетках линии КВ-8

3.2.3. Метод тестирования внутриклеточной активности олигонуклеотидов

3.2.4. Ингибирование экспрессии MDR 1 мРНК в клетках КВ-8-5 174 антисмысловыми олигонуклеотидами

3.3. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их 179 активности в культуре клеток

4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РНК С ХИМИЧЕСКИМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ

4.1. Расщепление РНК конъюгатами 1,4.-диазабицикло[2.2.2]октана и 181 имидазола

4.1.1. Дизайн химических рибонуклеаз

4.1.2. РНК модели и схема эксперимента

4.1.3. Расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз

4.1.3.1. Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm

4.1.3.2. Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и 189 эффективность ее расщепления соединениями ABL3Cm

4.1.3.3. Влияние концентрации искусственных рибонуклеаз на скорость 191 расщепления РНК

4.1.3.4. Кинетика расщепления РНК химическими рибонукпеазами 194 ABL3Cm

4.1.4. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК 202 соединениями ABL3Cm

4.1.4.1. Влияние природы буфера на эффективность расщепления РНК

4.1.4.2. Влияние температуры на эффективность расщепления РНК 204 соединениями ABL3Cm

4.1.5. Механизм расщепления РНК под действием химических рибонуклеаз

4.1.5.1. Определение продуктов, образующихся в месте расщепления 205 РНК соединениями ABL3Cm

4.1.5.2. Влияние рН на скорость расщепления РНК соединениями 208 ABL3Cm

4.1.5.3. Определение сродства соединений ABL3Cm к РНК

4.1.5.4. Доказательство каталитического характера расщепления РНК 210 под действием соединений ABL3Cm

4.2. Применение искусственных рибонуклеаз для исследований структуры РНК 212 в растворе

4.2.1. Пробинг вторичной структуры митихондриальных тРНК*""* дикого 212 Tnna(Kwt) и содержащей замену (А9-*С) (Krw)

4.2.2. Изучение вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа

4.3. Расщепление РНК с помощью конъюгатов пептида [LeuArg]4-Gly-NH2 и 223 олигонуклеотидов со случайной последовательностью

4.3.1. Дизайн олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и РНК-мишени

4.3.2. Эффективность и специфичность расщепления РНК олигонуклеотид- 224 пептидными конъюгатами

4.3.3. Контроль специфичности расщепления РНК

4.3.4. Исследование возможности взаимодействия между РНК и 235 олигонуклеотидом в составе конъюгата

4.3.5. Определение кинетических параметров расщепления РНК 237 конъюгатами pep-4, pep-7 и pep

4.3.6. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной части 245 конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК

4.3.7. Влияние длины пептидного остатка в составе конъюгатов на 247 эффективность и специфичность расщепления

4.3.8. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК 248 олигонуклеотид-пептидными конъюгатами

4.3.9. Природа специфичности к последовательности РНК олигонуклеотид- 253 пептидных конъюгатов

4.3.10. Влияние структуры конъюгатов на эффективность расщепления РНК

5. Направленная модификация или расщепление РНК с помощью реакционноспособных конъюгатов олигонуклеотидов

5.1. Сайт-направленная модификация лидерной области thrS мРНК с помощью 258 алкилирующих производных антисмысловых олигонуклеотидов

5.2. Сайт-направленная модификация фрагмента MDR1 мРНК конъюгатами 267 антисмысловых олигонуклеотидов с блеомицином, фталоцианином и перфторарилазидом

5.2.1. РНК-мишень и конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов

5.2.2. Исследование специфичности связывания олигонуклеотидов и 270 конъюгатов с РНК

5.2.3. Реакции фрагмента MDR1/PGY1 м РНК и ДНК с конъюгатами 271 олигонуклеотидов

5.2.4. Обсуждение результатов

5.3. Направленное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 280 пептидом

5.3.1. Исследование взаимодействия конъюгата рер-1 А с тРНК^з

5.3.2. Рибонуклеазная активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов

5.3.3. Обсуждение результатов по направленному расщеплению РНК 290 олигонуклеотид-пептидным конъюгатом

5.4. Направленное расщепление РНК с помощью конъюгатов антисмысловых 293 олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями

5.4.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов и выбор РНК-мишени

5.4.2. Направленное расщепление тРНКр>,е конъюгатами олигонуклеотидов, 295 содержащими моно- и бис-имидазольные конструкции, полученными методом постсинтетической модификации

5.4.3. Направленное расщепление тРНКР|,в конъюгатами олигонуклеотидов, 304 несущими дендримерные имидазолсодержащие конструкции

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Закономерности взаимодействия с РНК олигонуклеотидов, олигонуклеотидных конъюгатов и катализаторов гидролиза фосфодиэфирных связей»

Молекулы РНК выполняют множество функций, участвуя в переносе генетической информации, биокаталитических реакциях в ходе процессинга мРНК, трансляции, а также в регуляции экспрессии генов [1, 2, 3, 4]. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК. В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о существовании неизвестных ранее регуляторных клеточных процессов и систем взаимодействия клеток, в которых ключевую роль играет РНК [5, 6, 7, 8]. В связи с важной биологической ролью определенных РНК, актуальной является задача разработки методов направленного воздействия на РНК для регуляции биологических процессов в клетках в исследовательских целях и с целью создания терапевтических препаратов для инактивации геномов инфекционных агентов и подавления экспрессии генов, ответственных за развитие различных патологических состояний.

Эффективным способом регуляции количества определенных РНК в клетке может служить их избирательное расщепление с помощью специфических агентов, распознающих определенные нуклеотидные последовательности. Прямым подходом к созданию таких искусственных сверхспецифичных рибонуклеаз является конструирование конъюгатов олигонуклеотидов, образующих комплементарные комплексы с определенными нуклеотидными последовательностями РНК, с молекулами, расщепляющими фосфодиэфирные связи [9,10].

К настоящему времени наиболее обещающие результаты в области направленного воздействия на одноцепочечные нуклеиновые кислоты были получены при использовании аналогов антисмысловых олигонуклеотидов, которые образуют комплексы с комплементарными последовательностями РНК [11, 12]. Идентификация оптимальных последовательностей-мишеней для олигонуклеотидов является одной из основных проблем направленного воздействия на РНК [13].

Укладка РНК в сложную пространственную структуру, стабилизированную внутримолекулярными взаимодействиями между петлями, а также взаимодействиями с ионами двухвалентных металлов и белками, является основным фактором, препятствующим связыванию олигонуклеотидов с этими биополимерами. В физиологических условиях в составе природных РНК открытые, неструктурированные участки практически отсутствуют, и реальные мишени для олигонуклеотидов представляют собой элементы трехмерной укладки определенных нуклеотидных последовательностей [14, 15]. Наиболее распространенными элементами вторичной структуры РНК являются шпильки - короткие частично самокомплементарные нуклеотидные последовательности, состоящие из стебля и петли, взаимодействия между которыми, сопровождающиеся образованием псевдоузлов, определяют формирование биологически активной трехмерной структуры РНК [16, 17]. Шпилечные структуры являются сайтами узнавания для регуляторных белков в процессе транскрипции и трансляции. Взаимодействие между определенными шпильками РНК является ключевым этапом при узнавании РНК природными антисмысловыми РНК [18], а также в процессе димеризации ретровирусных РНК, приводящем к формированию биологически активного диплоидного генома ретровирусов [19, 20]. Характерной чертой этих взаимодействий является перестройка структур шпилек в процессе взаимодействия [21, 22]. Механизм взаимодействия различных шпилек определяется размерами и последовательностями петли шпильки и структурой ее стебля. Последовательность петли и положение участка связывания оказывают большое влияние на эффективность взаимодействия с ней комплементарного олигонуклеотида [23].

Исследование процесса гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК in vitro необходимо для выявления факторов, контролирующих эффективность этого процесса, и установления параметров, определяющих активность антисмысловых олигонуклеотидов в клетках. Прогресс в этой области осложнен рядом методических трудностей работы с высокомолекулярными РНК и требует разработки точных и нетрудоемких экспериментальных методов определения количественных характеристик гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК in vitro. Для выявления оптимальных сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов и выявления факторов, определяющих их эффективность, необходимо сравнение гибридизации олигонуклеотидов с РНК in vitro с их биологической активностью.

Проблема создания низкомолекулярных катализаторов, способных расщеплять РНК в физиологических условиях с высокой эффективностью, представляет самостоятельный интерес. Такие соединения могут быть применены для исследования структуры РНК и РНК-белковых комплексов, а также в качестве катализаторов разрушения РНК в ходе биотехнологических процессов. Известно значительное число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК. К ним относятся комплексы некоторых металлов [24, 25, 26], органические соединения, содержащие низкоосновные аминогруппы [27] и остатки имидазола [28, 29, 30], а также конструкции на основе олиго- и полипептидов [31, 32]. Однако, в физиологических условиях эти вещества расщепляют РНК с низкой эффективностью.

До сих пор не удалось установить механизмы, определяющие специфичность расщепления РНК олигонуклеотидными конъюгатами разной природы. По невыясненным причинам некоторые каталитические конструкции проявляют выраженное предпочтение к фосфодиэфирным связям, находящимся в определенных последовательностях [33, 34]. Исследование факторов, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеазами, является актуальным для создания высокоспецифичных соединений, способных расщеплять РНК с высокой эффективностью в физиологических условиях.

Целью настоящей работы являлось комплексное решение фундаментальной проблемы направленного воздействия на природные высокомолекулярные РНК с помощью низкомолекулярных соединений - катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей и конъюгатов олигонуклеотидов, специфически расщепляющих или модифицирующих РНК.

В ходе исследования решались следующие задачи:

-исследование закономерностей и механизма гибридизации олигонуклеотидов с природными высокомолекулярными РНК: дрожжевой тРНК^*, 171-звенным фрагментом 23S рРНК Е. coli, 678-звенным 5'-концеввм фрагментом MDR1 мРНК;

-выявление в структуре MDR 1 мРНК участков, доступных для взаимодействия с олигонуклеотидами; сопоставление данных об эффективности гибридизации олигонуклеотидов с мРНК MDR 1 in vitro и активности этих антисмысловых олигонуклеотидов в культуре клеток;

-исследование расщепления РНК под действием низкомолекулярных соединений, способных катализировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК; изучение влияния структуры конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК и возможности применения таких соединений для пробинга структуры РНК в растворе;

-изучение закономерностей протекания реакции направленной модификации/расщепления РНК под действием конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов различной природы; выяснение закономерностей протекания реакции и выявление факторов, определяющих эффективность модификации или расщепления РНК в комплексе с конъюгатом.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Зенкова, Марина Аркадьевна

выводы

Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование, направленное на решение фундаментальной задачи направленного воздействия на природные РНК.

1. Впервые показано, что в физиологических условиях процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК является многостадийным. На первой, быстрой стадии, образуется промежуточный комплекс с участием 2-4 оснований РНК, расположенных в петле или одноцепочечном участке, что вызывает изменение структуры РНК вблизи этого участка. На следующей стадии, лимитирующей скорость гибридизации, происходит внутримолекулярная перегруппировка структуры РНК с образованием полноразмерного гетеродуплекса с олигонуклеотидом, которая протекает по механизму последовательного замещения цепи. Скорость гибридизации олигонуклеотидов с РНК определяется стабильностью структуры РНК в участке связывания и не зависит от длины, последовательности и наличия модификаций в олигонуклеотиде. Связывание олигонуклеотида с РНК приводит к перестройке ее структуры и создает в РНК новый одноцепочечный участок, с которым происходит предпочтительное связывание второй молекулы олигонуклеотида с образованием несовершенного комплекса. Это приводит к дополнительной стабилизации олигонуклеотида связанного в полностью комплементарном сайте. Установленные принципы взаимодействия олигонуклеотидов с РНК позволили выбрать олигонуклеотиды, которые эффективно связываются с мРНК MDR 1 (константы ассоциации 106- 107 М~1 и константы скорости гибридизации 102 -103 М"1с1) и понижают на 90%, 50% и 40% уровень мРНК MDR 1 в клетках линии КВ-8-5, обладающих фенотипом множественной лекарственной устойчивости.

2. Разработаны новые зонды для исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК, которые представляют собой флуоресцентные производные олигонуклеотидов, содержащих на 5'-конце два остатка пирена, образующих эксимер. Продемонстрирована возможность использования вызванного гибридизацией увеличения интенсивности мономерной флуоресценции 5'-бис-пиренильных производных олигонуклеотидов для прямого определения количественных характеристик взаимодействия олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК в физиологических условиях (в режиме реального времени). Обнаружены характерные изменения эксимерной флуоресценции этих производных олигонуклеотидов при связывании в участках РНК, имеющих различную вторичную структуру, что позволяет использовать их в качестве структурных зондов.

3. Разработаны эффективные катализаторы расщепления фосфодиэфирных связей в РНК - конъюгаты 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана и имидазола и конъюгаты пептида [ArgLeu]4 с короткими олигонуклеотидами, не комплементарными РНК.

- Показано, что конъюгаты 1,4-диазабицикпо[2.2.2]-октана и имидазола с высокой эффективностью расщепляют фосфодиэфирные связи в СрА и UpA мотивах РНК в каталитическом режиме без формирования с ней стабильного комплекса; катализируют расщепление РНК в различных буферных растворах, включая растворы содержащие денатурирующие агенты (мочевину или гуанидин изотиоцианат), без изменения позиционной специфичности и потери эффективности. Расщепление РНК под действием этих конъюгатов происходит по одноцепочечным участкам РНК, что позволяет рассматривать эти соединения как перспективные зонды для исследования пространственной структуры РНК в растворе.

-Установлено, что олигонуклеотид-пептидные конъюгаты расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям в последовательностях GpX и РугА; расщепление РНК протекает в каталитическом режиме, в составе комплекса между РНК и конъюгатом, характеризующегося значением Км=1.5-10'4 М, образованным либо без, либо с незначительным вкладом комплементационных взаимодействий. Предложен механизм действия конъюгатов, согласно которому активная структура пептида, обладающая рибонукпеазной активностью, формируется в результате взаимодействия между олигонуклеотидной и пептидной частями конъюгата, возможно, при участии РНК субстрата.

4. Получено эффективное направленное расщепление РНК конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов и конструкций, содержащих остатки имидазола. Идентифицированы наиболее эффективные конструкции, катализирующие расщепление РНК: максимальную активность проявляли конъюгаты, содержащие 4 или 8 остатков имидазола в каталитической части, присоединенной к олигонуклеотиду через длинный (40 и более простых С-С или C-N связей) подвижный линкер и якорную группу, не участвующую участвующую во взаимодействии с прилегающими основаниями олигонуклеотида.

5.3.4. Заключение

Результаты проведенного исследования показали, что разработка высокоэффективных искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидов катализирующих направленное расщепление фосфодиэфирных связей в РНК, требует комплексного подхода. При создании таких реагентов одну из определяющих ролей играет выбор последовательности в составе РНК мишени, которую предполагается подвергнуть расщеплению. В предыдущей главе, посвященной изучению расщепления РНК с помощью конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола, было экспериментально показано, что фосфодиэфирные связи в РНК обладают разной чувствительностью к действию соединений, несущих остатки имидазола. Чувствительность связей зависит от ряда факторов, в числе которых и природа оснований, фланкирующих связь, и ее положение во вторичной структуре. При расщеплении РНК с помощью конъюгатов олигонуклеотидов процесс усложняется гибридизацией адресующего олигонуклеотида и РНК, на которое также оказывает влияние вторичная структура в участке связывания. Данных о влияние структуры РНК мишени в области связывания конъюгата на последующую межмолекулярную реакцию на сегодняшний день известно мало. Кроме того, при связывании олигонуклеотидного адреса конъюгата с РНК может происходить изменение ее структуры в сторону более благоприятного или неблагоприятного пространственного расположения взаимодействующих групп каталитического центра реагента и РНК. Поэтому для получения эффективных искусственных рибонуклеаз, обладающих способностью расщеплять РНК направленно, важное значение имеет информация о строении комплекса конъюгат/РНК субстрат, а также поиск в структуре РНК оптимального сайта, эффективность гидролиза которого используемой расщепляющей группировкой наивысшая.

Конформационный анализ, проведенный с помощью молекулярного моделирования для бис- и тетраимидазолсодержащих конъюгатов, находящихся в комплексе с тРНК показал, что гидролитическую активность конъюгатов во многом определяется не только поведением РНК/ДНК гетеродуплекса, но также структурной организацией конъюгатов и динамическим поведением каталитической конструкции. В данной работе проведено исследование гидролитических свойств серии конъюгатов олигонуклеотида с имидазолсодержащими конструкциями, использованными в качестве каталитического домена. Конъюгаты были получены с помощью методики предшественников, применение которой позволило вносить существенные изменения в структуру каталитического центра, увеличивая число входящих в его состав имидазольных групп от 2-х до 32-х. Как оказалось, размер каталитического центра реагентов существенно влиял на их активность в реакции направленного расщепления. Анализ показал, что максимальной гидролитической активностью обладали конъюгаты, несущие 4-8 остатков имидазола, а увеличение или уменьшение числа имидазольных групп в расщепляющей конструкции и, соответственно, размера каталитического центра, не способствовало повышению эффективности процесса. Для оптимизации структуры конъюгатов исследовали влияние якорных групп на эффективность расщепления. Оптимальной оказалась якорная группа на основе остатка цикогексана. Использование в качестве якорных групп остатка тимидина или ненуклеотидной вставки оказалось неэффективным, поскольку остаток тимидина участвовал в стэкинг взаимодействии с прилегающими основаниями РНК/ДНК гетеродуплекса, что способствовало ограничению пространственной подвижности расщепляющей конструкции и снижению РНК-гидролизующей активности. Согласно полученным данным и проведенным расчетам, для эффективного направленного гидролиза РНК конъюгат должен обладать достаточно длинным линкером, обеспечивающим достижение каталитической группировкой расщепляемой связи. Кроме того, гибкость линкера и подвижность расщепляющей конструкции должны быть достаточно высокими, чтобы иметь возможность сформировать оптимальную для расщепления конформацию относительно расщепляемой фосфодиэфирной связи.

В ряде исследований, посвященных созданию искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидов, были предприняты попытки оценить влияние подвижности и длины линкеров на эффективность расщепления и было показано, что при ориентации РНК-гидролизующей конструкции в большую бороздку необходимо использовать более длинные линкеры, чем при ее ориентации в малую [555]. При увеличении длины линкера приблизительно до 16 связей в большинстве случаев наблюдали возрастание эффективности расщепления РНК мишени за счет увеличения подвижности расщепляющей конструкции [524]. Результаты данного исследования показали, что только при длине линкера, составляющей не менее 40 связей, возможно сближение имидазольных групп расщепляющей конструкции и цепи РНК в области расщепляемой связи, достаточное для эффективного протекания реакции. Исследованные в данной работе конъюгаты проявляли достаточно высокую гидролитическую активность в отношении тРНК мишени. Даже в тех случаях, когда согласно результатам молекулярного моделирования, расщепление рассматривалось, как случайное событие, общая степень расщепления тРНК была высокой. Исходя из этого, можно заключить, что непосредственно реакция расщепления протекает с высокой скоростью, которая ограничивается неоптимальным строением расщепляющей конструкции в целом.

Все конъюгаты, изученные в данной работе, при связывании с РНК мишенью образовывают прочный комплекс, стабильность которого практически не меняется и после расщепление связи, поэтому они работают только находясь в избытке по отношению к РНК мишени. Возможным способом повышения эффективности направленного расщепления РНК конъюгатами является перевод осуществляемой ими реакции в каталитический режим, и в этой связи важен вопрос, связанный с размером олигонуклеотидной части конъюгатов. Структурно-функциональные корреляции, найденные с помощью молекулярного моделирования, позволили определить основные закономерности построения искусственных рибонуклеаз, как с точки зрения специфичности реакции, так и эффективности катализа. Безусловно, необходимо дальнейшее детальное изучение факторов, влияющих на чувствительность фосфодиэфирных связей в РНК к гидролизу, оптимизация структуры каталитических конструкций конъюгатов, поиск методов селекции оптимальных для гидролиза последовательностей. Рациональный подход к конструированию каталитических конструкций с учетом данных этой работы открывает возможности для существенного улучшения каталитических свойств искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидов для достижения ими биологической активности сравнимой с природными ферментами, что может ускорить создание на их основе высокоэффективных терапевтических препаратов нового поколения

ГЛАВА 6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

6.1. МАТЕРИАЛЫ

6.1.1. Реактивы и препараты

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия); рибонуклеозидтрифосфаты, акриламид, N-N'-метиленбисакриламид, LiCI04, минеральное масло, DTT, MgCI2, EDTA, HEPES, Трис, TEMED, BSA, бромфеноловый синий, ксиленцианол, краситель "Stains-All" производства "Sigma" (США); глицерин ("Serva", Германия); SDS, имидазол, формамид, персупьфат аммония ("Fluka", Швейцария); Л/,Л/-диметиламинопиридин, трифенилфосфин, 2,2'-дипиридилдисульфид фирмы "Aldrich" (Германия); агарозу ("Chemapol", Чехия), мочевину ("ICN", США). Пиренил-1 -метиламин был синтезирован в Лаборатории органического синтеза с.н.с. Ивановой Т.М. (НИБХ СО РАН). Бактериальная среда LB, бакто-агар, винбластин, трипсин, культуральная среда DMEM, FCS были производства "Sigma" (США). Ацетон, мочевина, DMSO, сопи хлористый калий, калий йодистый, хлористый натрий и хлористый магний были квалификации "осч", остальные реактивы имели квалификацию не ниже «хч» или «чда». DMFA, DMSO, ацетон, ацетонитрил, диэтиловый эфир были очищены и высушены согласно стандартным процедурам.

Ферменты: Т4 РНК-лигаза, Т4 ДНК-лигаза, Т4 лолинуклеотид киназа, РНКаза Н были производства "Fermentas" (Литва); РНКаза Т1, РНКаза А, РНКаза Т2, РНКаза CL3 были фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия), РНКаза V1, РНКаза ONE, ДНКаза I (без РНКаз) фирмы «Рготеда» (США), РНКаза U2 фирмы «Pharmacia» (Швеция), обратная транскриптаза AMV фирмы "Life science" (США); бактериальная щелочная фосфатаза производства "Boehringer Mannheim" (Германия); все эндонуклеазы рестрикции, использованные в работе были производства "Сибэнзим" (Россия), РНК попимераза фага Т7, ДНК-попимераза Thermus aquatiqus, обратная транскриптаза MoMLV производства Лаборатории биохимии ферментов НИБХ СО РАН, набор для секвенирования Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit "Perkin Elmer" (США). y-32P]ATP, 5'-[32P]pCp, [a-32P]dCTP и [a-32P]ATP с удельной активностью - 4000 Кю/ммоль были производства "Биосан" (Россия).

TPHKPhe из дрожжей была любезно предоставпена д-ром. Ж. Кайтом (IBMC du C.N.R.S., Страсбург, Франция). In vitro транскрипты митохондриальной тРНК1"*5 дикого типа и с точечной мутацией А9-*С, а также дрожжевой тРНК**" быпи пюбезно предоставлены профессором К. Флоранц (IBMC du C.N.R.S., Страсбург, Франция).

Олигонуклеотиды были синтезированы в технологической лаборатории НИБХ СОРАН с помощью стандартного фосфитамидного метода и выделены с помощью ионообменной и обращеннофазовой ВЭЖХ. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие модифицированные основания, были синтезированы с.н.с. к.х.н. В.К. Потаповым (ИБХ РАН им. Шемякина и Овчинникова, г. Москва). Рибоолигонуклеотиды, 2'-0-метилрибо- и 2'-0-тетрагидропиранилрибо-олигонуклеотиды были синтезированы сотрудниками Группы рибоолигонуклеотидного синтеза под руководством вед.н.с .к.х.н. Веньяминовой А. Г. (НИБХ СО РАН). З'-Аминогексильные производные олигодезоксирибонуклеотидов были синтезированы в технологической лаборатории НИБХ СОРАН с помощью стандартного фосфитамидного метода с использованием модифицированного носителя Сб CPG 500 ("Glean Research", США), содержащего аминогексильную группу, и выделены с помощью ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Олигорибонуклеотид r-tgB был синтезирован в "TriLnk Bitechnologies" (США).

Все искусственные рибонуклеазы и контрольные конструкции, использованные в работе, были синтезированы н.с. Д. А. Коневцом, под руководством, с.н.с. к.х.н В. Н. Сильникова в НИБХ СО РАН.

Конъюгаты олигонуклеотидов, содержащие моно- бис- и тетраимидазольные конструкции были синтезированы непосредственно или под руководством с.н.с. к.х.н В.Н. Сильникова в НИБХ СО РАН. Конъюгаты олигонуклеотидов с присоединенными дендримерными конструкциями, несущие от 2 до 48 остатков имидазола, были синтезированы и охарактеризованы к.х.н. Н. Н. Полушиным (Fidelity Systems Inc., Gaitherburg, MD, США). Олигонуклеотид-пептидные конъюгаты, использованные в работе, были синтезированы к.х.н. н.с. Д. В. Пышным (НИБХ СО РАН). Конъюгаты олигонуклеотидов с блеомицином и фталоцианином были синтезированы м.н.с. Воробьевым П.Е и н.с. Коваль В.В., соответственно. Конъюгаты олигонуклеотидов (tK-Аz, mK-Az, dK-Az), содержащие п-азидотетрафторбензамидную группу, были синтезированы сотрудниками Группы рибоолигонуклеотидного синтеза М.А. Кузнецовой и Д.С. Новопашиной под руководством вед.н.с .к.х.н. Веньяминовой А. Г. (НИБХ СО РАН)

Для приготовления всех буферных растворов и реакционных проб использовали воду MilliQ. Все буферы подвергали стерилизации фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр (0,22 мкм).

В работе использовали амплификатор OMN-E фирмы "Hybaid" (США), спектрофотометр "Миллихром" (НПО "Научприбор", г. Орел, Россия); спектрофотометр «СФ-46» (НПО «ЛОМО» г. Санкт-Петербург); флуориметр MPF-40 фирмы "Hitachi" (Япония), рН-метр «Orion 410А» (США); вакуумную сушку для акриламидных гелей

LABCONCO" (США), рН-метр "Orion 41 OA" (США), счетчик радиоактивности "Canberra Packard" (США), центрифуги "Contron Т-42К" (Франция) и "Eppendorf 5415" (Германия), "J21-Beckman" (США). Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской пленки "РЕНЕКС (Россия). В работе использовали культуральный пластик фирмы "Costar" (США).

6.2. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И ПЛАЗМИДЫ

Для клонирования фрагмента кДНК гена MDR 1 человека использовали вектор pBlueskriptSKU фирмы "Invitrogene" (США) и клетки E.coli штамма XL-Blue, любезно предоставленные к.б.н. Филиппенко М. Л. (НИБХ СО РАН). Для клонирования кДНК гена белка М2 вируса гриппа использовали вектор pSVK3 фирмы "Invitrogene" (США). Плазмида pYF-90, содержащая последовательность дрожжевой фенилаланиновой тРНК было любезно предоставлена с.н.с. к.х.н. Н.А. Моор (НИБХ СО РАН) Плазмиды pHtk(wt) и pHIV, содержащие последовательности тРНК^з человаека и фрагмент HIV1 РНК под промотором РНК-полимеразы фага Т7, были любезно предоставлены профессором Г. Дж. Гроссом (Институт биохимии, Университет г. Вюрзбурга, Германия). Плазмиды pTFMLys, содержащие последовательности митохондриальной tPHK*-*8 дикого типа (Kwt) и с точечной мутацией А9-»С (Krw) под промотором ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7, были любезно предоставлены профессором К. Флоранц (IBMC du C.N.R.S., Страсбург, Франция).

6.3. ЛИНИИ КЛЕТОК

Клетки эпидермоидной карциномы человека родительской линии КВ-3-1 и линии КВ-8-5, обладающей фенотипом множественной лекарственной устойчивости, [598, 599] были любезно предоставлены профессором М. Готтесманом (NIH, США). Клетки линии КВ-3-1 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FCS, в атмосфере 5%-ного СОг, при 37°С. Клетки линии КВ-8-5 культивировали в тех же условиях в присутствии винбластина в концентрации 120 нг/мл.

6.4. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Зенкова, Марина Аркадьевна, 2003 год

1. Yarns М. Boundaries for an RNA world // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3. P. 260267.

2. Doudna J.A., Rath V.L. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier// Cell. 2002. V. 109. P. 153-156.

3. Doherty E.A., Doudna J.A. Ribozyme structures and mechanisms // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2001. V. 30. P. 457-475.

4. L/ave C., Xie 2., Kasschau K.D., Carrington J.C. Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA // Science. 2002. V. 297. P. 20532056.

5. Sharp P.S. RNA interference-2001 // Genes & Development. 2001. V.15. P. 485-490.

6. Mattick J.S., Gagen M.J. The evolution of controlled multitasked gene networks: the role of introns and other noncoding RNAs in the development of complex organisms // Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 1611-1630.

7. Patel D.J. Molecular insights into the RNA world // Biopolymers. 1998. V. 48. P. 97100.

8. Trawick B.N., Danicher A.T., Bashkin J.K. Inorganic mimics of ribonucleases and ribosymes: from random cleavage to sequence-specific chemistry to catalytic antisense // Drugs. Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 939-960.

9. Сильников B.H., Власов B.B. Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кимлот// Успехи химии. 2001. Т. 70. С. 562-580.

10. Crooke S.T. Potential roles of antisense technology in cancer chemotherapy // Oncogene. 2000. V. 19. P. 6651-6659.

11. Sczakiel G. Theoretical and experimental approaches to design effective antisense oligonucleotides//Front. Biosci. 2000. V. 5. P. D194-D201.

12. ScherrM., Rossi J. J., Sczakiel G., Patzel V. RNA accessibility prediction, a theoretical approach is consistent with experimental studies in cell extracts // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 2455-2461.

13. Battle D.J., Doudna J.A. Specificity of RNA-RNA helix recognition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 11676-11681.

14. Tinoco I., Jr. Physical chemistry of nucleic acids // Annu. Rev. Phys. Chem. 2002. V. 53:1-15. P. 1-15.

15. Chastain M., Tinoco I., Jr. Structural elements in RNA // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1991. V. 41. P. 131-177.

16. Wyatt J.R., Puglisi J.D., Tinoco I., Jr. RNA pseudoknots. Stability and loop size requirements // J. Mol. Biol. 1990. V. 214. P. 455-470.

17. Brunei C., Marquet R., Romby P., Ehresmann C. RNA loop-loop interactions as dynamic functional motifs // Biochimie. 2002. V. 84. P. 925-944.

18. Marquet R., Paillart J.C., Skripkin E., Ehresmann C., Ehresmann B. Dimerization of human immunodeficiency virus type 1 RNA involves sequences located upstream of the splice donor site // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 145-151

19. Dirac A.M., HuthoffH., Kjems J., Berkhout B. Requirements for RNA heterodimerization of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and HIV-2 genomes II J. Gen. Virol. 2002. V. 83. P. 2533-2542.

20. Komiyama M. Sequence-specific and hydrolytic scission of DNA and RNA by lanthanide complex-oligoDNA hybrids // J. Biochem. 1995. V. 118. P. 665-670.

21. Kazakov S.A. Nucleic acid binding and catalysis by metal ions // Bi'oorg. Chem. 1995. V. 446. P. 244-285.

22. Sugimoto N., Ohmichi T. Site-specific cleavage reaction catalyzed by leadzyme is enhanced by combined effect of lead and rare earth ions H FEBS Lett. 1996. V. 393. 234-237.

23. Komiyama M., Sumaoka J. Progress towards synthetic enzymes for phosphoester ^ hydrolysis II Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V. 2. P. 751-754.

24. Hovinen J., Guzaev A., Azhayeva E., Azhaev A., Lonnberg H. Imidazole tethered oligodeoxyribonucleotides: synthesis and RNA cleaving activity // J. Org. Chem. 1995. V. 60. P. 2205-2209.

25. Lima W.F., Crooke S.T. Highly efficient endonucleolytic cleavage of RNA by a Cys(2)His(2) zinc-finger peptide// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1001010015.

26. Zagarovska I., Kuuzela S., Lonnberg H. Metal ion-dependent hydrolysis of RNA phosphodiester bonds within hairpin loops. A comparative kinetic study on chimeric ribo 2'-0-methylribo oligonucleotides// Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3392-3395.

27. Politz J.C., Taneja K.L., Singer R.H. Characterization of hybridization between synthetic oligodeoxynucleotides and RNA in living cells // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P.4946-4953. *32.