Анализ участия хлорных каналов плазматических мембран в процессах активации и программированной гибели лимфоидных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Баев, Денис Владимирович

• Баев, Денис Владимирович
• кандидат физико-математических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Баев, Денис Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. . КЛАССИФИКАЦИЯ И РОЛЬ ХЛОРНЫХ КАНАЛОВ

Фоновые хлорные каналы.

Кистозный фиброз.

Двуствольные" хлорные каналы.

Высокопроводящие хлорные каналы.

Лиганд-зависимые хлорные каналы.

Физиологические процессы в лимфоцитах, связанные с активностью хлорных каналов.

ГЛАВА 2. АПОПТОЗ.

Общие сведения о процессах апоптоза.

Природа апоптогенных сигналов.

Внутриклеточные регуляторы апоптоза.

Механизмы регуляции клеточного объема и апоптоз.

ГЛАВА 3. БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА.

Общая характеристика белков теплового шока.

Индукторы белков теплового шока.

Система белков теплового шока.

ГЛАВА 4. КЛЕТОЧНЫЙ СТРЕСС.

Регуляция антистрессорного ответа клетки.

Факторы теплового шока как детекторы стресса.

Роль БТШ в регуляции антистрессового ответа.

Плазматическая мембрана и клеточный стресс.

Сигнальные пути, регулирующие стресс-индуцируемый апоптоз.

Проапоптотические сигнальные пути.

Антиапоптотические сигнальные пути БТШ и апоптоз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Дозозависимый эффект действия ИХК.

Влияние плотности клеточных культур на действие ИХК.

Опыты с клетками в бесхлорной среде.

Возможный механизм действия: изменение уровня свободного внутриклеточного кальция.

Влияние ИХК на апоптоз в культурах Т-клеточных линий.

Влияние ИХК на жизнеспособность и рост культуры клеток EL-4 Влияние ИХК на экспрессию БТШ70.

Влияние осмотического шока и ИХК на жизнеспособность клеток EL-4.

Влияние осмотического стресса и ИХК на уровень экспрессии БТШ70.

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ участия хлорных каналов плазматических мембран в процессах активации и программированной гибели лимфоидных клеток»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Данная работа направлена на исследование роли трансмембранных потоков ионов хлора в функционировании лимфоидных клеток. Актуальность указанной проблемы стала очевидной после выявления в цитоплазматических мембран ах ^многих типов клеток (в том числе и у лимфоцитов) селективных хлорных каналов (ХК) и последующего появления данных о важной роли этих каналов в реакциях клеток на разнообразные стимулы. Большинство работ по изучению эффектов, связанных с изменением проницаемости хлорных каналов клеточных мембран, проведено на клетках нелимфоидных тканей, поэтому в настоящее время вопрос о роли анионов хлора в функционировании иммунокомпетентных клеток остается малоисследованным. Один из наиболее интересных аспектов данной проблемы связан с выяснением функций хлорных каналов в развитии и дифференцировке лимфоидных клеток, так как было установлено, что процесс созревания недифференцированной зародышевой ткани существенно зависит от присутствия ионов хлора. С этой позиции, клетки иммунной системы являются уникальным объектом для сравнительного исследования, т.к. в любой момент времени они представлены в организме как совокупность пулов незрелых предшественников иммунокомпетентных клеток и клеточных популяций разной степени дифференцированности.

Также важным моментом является выяснение роли хлорных каналов лимфоцитов в процессах программированной клеточной гибели (апоптоза) и антистрессорного ответа. Согласно литературным данным, предапоптотическое уменьшение клеточного объема и процессы накопления внутриклеточных осмолитов в ответ на изменение ионной силы внешнего окружения напрямую связаны с активностью трансмембранных ионных каналов (в основном- хлорных и калиевых). Сигнальные пути, ответственные за регуляцию данных процессов, до сих пор остаются невыясненными. Однако, существование хлор-зависимых протеинкиназ и выявленная взаимосвязь между регуляцией активности хлорных каналов и кальций-зависимыми внутриклеточными механизмами передачи сигнала позволяет предположить, что для хлорных каналов существует аналогичный каскад сигнальных молекул.

Особый интерес представляет также связь активности хлорных каналов с экспрессией белков теплового шока (БТШ). Данные белки участвуют в различных процессах, таких как фолдинг, рефолдинг, транспорт, утилизация других внутриклеточных протеинов, внутриклеточная сигнализация, защита клеток от повреждающих воздействий. Наряду с этим, БТШ являются поверхностными маркерами трансформированных и инфицированных клеток, участвуют в презентации антигенов и в регуляции иммунного ответа. Хорошо охарактеризована взаимосвязь процессов антистрессового ответа с усилением уровня экспрессии данных белков. В случае же осмотического стресса, активирующего объем-регулирующие хлорные каналы, было показано, что повышенный уровень экспрессии БТШ в комплексе с регуляцией уровня содержания осмолитов является необходимыми условиями выживаемости клеток.

Сказанное выше свидетельствует о том, что анализ взаимосвязи процессов жизнедеятельности лимфоидных клеток и активности ХК является актуальной темой исследования для современной науки. Расширение существующих представлений о механизмах активации лимфоцитов и о возможной связи их с процессами ионного обмена между клеткой и ее микроокружением может предоставить новые возможности для поиска новых методов эффективной регуляции данных процессов. Не менее важным представляется изучение взаимосвязанного участия хлорных каналов и БТШ в антистрессовом ответе. Понимание причин и механизмов этого явления будет существенным дополнением не только к описанию фундаментальной системы протективных белков, но также может пролить свет на возможную универсальность данных механизмов не только для лимфоидных, но и для других типов клеток.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы является анализ взаимосвязи активности хлорных каналов плазматических мембран лимфоидных клеток различной степени зрелости с процессами их энергетического метаболизма, пролиферации, программированной гибели и антистрессового ответа.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Используя селективные ингибиторы хлорных каналов (ИХК) и культуральную среду, не содержащую ионов хлора, охарактеризовать влияние модуляции трансмембранных потоков хлора на процессы энергетического метаболизма (ЭМ) и пролиферации нормальных и опухолевых лимфоидных клеток в модельной системе in vitro.

2. В модели in vitro исследовать влияние клеточного микроокружения (факторов среды и аутокринных/паракринных факторов) на эффекты, связанные с модуляцией трансмембранных потоков ионов хлора у лимфоидных клеток.

3. Проанализировать возможную взаимосвязь влияния модуляции трансмембранных потоков хлора на процессы энергетического метаболизма и пролиферации лимфоидных клеток с активацией кальций-зависимых сигнальных путей.

4. Проанализировать взаимосвязь активности ХК с процессом программированной клеточной гибели лимфоцитов (в моделях спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоидных клеток).

5. Охарактеризовать влияние блокирования хлорных каналов на экспрессию БТШ70 лимфоидными клетками.

6. Провести анализ влияния активности ХК на процессы антистрессового ответа лимфоидных клеток в модели их осмотического шока.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Как было уже отмечено выше, большинство работ по изучению эффектов, связанных с активностью хлорных каналов клеточных мембран, проведено на клетках нелимфоидных тканей и вопрос о роли анионов хлора в функционировании иммунокомпетентных клеток остается малоисследованным.

В рамках данной работы был впервые получен ряд результатов, расширяющих существующие представления о роли трансмембранных потоков ионов хлора в процессах жизнедеятельности различных популяций лимфоидных клеток. В частности, в ходе исследования влияния различных доз ИХК на процессы ЭМ и пролиферации лимфоидных клеток разной степени зрелости было зарегистрировано стимулирующее действие малых и средних доз ИХК на ЭМ и пролиферацию незрелых форм клеток (клеток костного мозга, КМ), но в то же время, действие ИХК характеризовалось угнетением данных процессов в популяциях высокодифференцированных лимфоцитов; бесхлорная среда обладала выраженным ингибирующим действием на ЭМ лимфоидных клеток. Это свидетельствует о важной роли ионов хлора в созревании и функциональной активности лимфоцитов. Наряду с этим, полученные результаты продемонстрировали прямую связь стимулирующего действия ИХК на незрелые формы лимфоцитов с модуляцией концентрации внутриклеточного Са2+. Было также зарегистрировано протективное действие ИХК как в условиях спонтанного и индуцированного апотоза , так и в условиях гипотонического стресса. Впервые (для иммунокомпетентных клеток) была выявлена связь вышеупомянутых эффектов с увеличением уровня экспрессии протективных БТШ 70.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Хлорные каналы играют важнейшую роль в процессах, связанных с жизнедеятельностью практически всех типов клеток. Нарушение функционирования данного типа каналов приводят (в рамках организма) к целому ряду серьезных патологий, таких например, как кистозный фиброз (связанный с нарушением функционирования цАМФ-зависимых хлорных каналов мембран клеток легочного эпителия) и врожденная миотония (связанная с нарушением работы компенсаторных фоновых каналов в мембранах клеток поперечно-полосатой скелетной мускулатуры). Аналогичные каналы существуют и в мембранах иммунокомпетентных клеток, причем, согласно последним данным, развитие некоторых опухолей (вплоть до стадии активного метастазирования) связано с активностью ХК. Также постулируется взаимосвязь некоторых аутоиммунных заболеваний с нарушениями работы мембранных анионных каналов (в том числе и ХК).

Основываясь на вышеперечисленных фактах, можно утверждать, что понимание механизмов работы ХК лимфоцитов и их участия в различных процессах на клеточном уровне может в дальнейшем привести к разработке новых, более эффективных диагностических и терапевтических методик и препаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации представлены на международном иммунологическом конгрессе (Нью-Дели, 1998), на четвертой научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург,2000), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на пятой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2000), на пятой научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург,2001), на четырнадцатой международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва,2002), на шестой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2002).

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (глава 1, 2, 3 и 4), материалов и методов (глава 5), результатов исследований и обсуждения (глава 6), выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков, 5 таблиц. Список литературы включает 136 источников, из которых 129 иностранных.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Баев, Денис Владимирович

выводы

1. Подавление активности ХК их селективными ингибиторами сопровождается дозозависимым снижением уровня пролиферации лимфоидных клеток, но приводит к усилению ЭМ клеток КМ в диапазоне низких и средних концентраций ИХК; бесхлорная среда обладает выраженным ингибирующим действием на ЭМ лимфоидных клеток. Это свидетельствует о важной роли ионов хлора в функциональной активности популяций лимфоцитов.

2. Влияние блокирования трансмембранных потоков хлора ингибиторами хлорных каналов и бесхлорными условиями культивирования на ЭМ лимфоидных клеток существенно зависит от плотности клеточной культуры и от содержания в среде фетальной сыворотки, что указывает на взаимосвязь регулирующих эффектов анионов хлора, аутокринных/паракринных и сывороточных факторов.

3. Стимулирующее действие ИХК на ЭМ клеток КМ связано с увеличением внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция, что подтверждает предположение о возможной опосредованности эффектов блокирования ХК активацией других ионных каналов плазматических мембран.

4. Блокирование ХК селективными ингибиторами может препятствовать развитию спонтанного и церамид-индуцированного апоптоза в культуре клеток EL-4. Этот эффект ИХК связан, вероятнее всего, с супрессией данными ингибиторами одной из наиболее ранних стадий прграммированной клеточной гибели - стадии уменьшения клеточного объема, в которую вовлечены ХК.

5. Блокирование хлорных каналов индуцирует повышенную экспрессию протективных БТШ70 в культуре клеток лимфомы EL-4, что может свидетельствовать о существенной роли этих протеинов в механизме предотвращения программированной гибели лимфоидных клеток ингибиторами хлорных каналов плазматических мембран.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Баев, Денис Владимирович, 2002 год

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков М. Мир (1989)

2. Молотковская И.М., Разинков В.И., Молотковский Юл. Г., Бергельсон Л.Д. Биол. мембраны. (1992) 9, 1,32-39.3

3. Новиков В.С."Программированная клеточная гибель",(1996) Санкт-Петербург, "Наука"

4. Скоблина М. Н., Хухтаниеми И. Роль ионов хлора в образовании прогестерона и созревании ооцитов в фолликулах травяной лягушки, индуцированных суспензией гипофизов. Онтогенез(1995) 26, 1-7.

5. Скоблина М.Н., Кондратьева О.Т., Никифорова Т.П., Хухтаниеми И.

6. Влияние ингибитора хлорных каналов и сред со сниженной концентрацией ионов хлора на спонтанное созревание ооцитов травяной и шпорцевой лягушек. Онтогенез (1996), 27.Г

7. Скоблина М.Н., Никифорова Г.П., Кондратьева О.Т., Хухтаниеми И.

8. Роль хлорных каналов и ионов хлора в созревании ооцитов шпорцевой лягушки. Онтогенез( 1995) 26, 356-360.7

9. Ярилин А.А."Апоптоз и его место в иммунных процессах" (1996), Иммунология.

10. All A., Bharadwai S., О'Carroll R. and Ovenek N. "HSP90 interacts with and regulate the activity of heat shock factor 1 in Xenopus oocytes " (1998) Mol. Cell. Biol., 18, 4949-4960.

11. Arata S., Hamaguchi S. and Nose K. "Effects of the overexpression of the small heat shock protein, HSP27, on the sensitivity of human fibroblast cells exposed to oxidative stress" J. Cell. Physiol. (1995), 163, 458.

12. Arellano R.O., Miledi R. Osmo-dependent CI- currents activated by cyclic AMP in follicle-enclosed Xenopus oocytes. Proc. R. Soc. Lond.( 1994) 258, 229-235.

13. Arellano R.O., Miledi R. Functional role of follicle cells in the generation of osmolarity-dependent CI- currents in Xenopus follicles Short review. J. Physiol., (1995)488, 351-357.12

14. Arellano R.O., Miledi R. Novel Cl-currents elicited by follicle-stimulating hormone and acetylcholine in follicle-enclosed Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol., (1993) 102, 833-857.

15. Barbiero G, Duranti F, Bonelli G, Amenta JS, Baccino FM. Intracellular ionic variations in the apoptotic death of L cells by inhibitors of cell cycle progression. Exp Cell Res., (1995)217, 410-418.

16. Bear C.E., Li C.H., Kartner N, Bridges R.J., Jensen T.J., Ramjeesingh M., Riordan R. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell (1992) 68, 809-818.

17. Beck FX, Grunbein R, Lugmayr K, Neuhofer W. Heat shock proteins and the cellular response to osmotic stress. Cell Physiol. Biochem., (2000) 10, 303-306.

18. Ben C. Tilly, M. Gaestel, K. Engel, M.J. Edixhoven, H.R. de Jonge Hypo-osmotic cell swelling activates the p38 MAP kinase signalling cascade. FEBS Letters (1996)395, 133-136

19. Benjamin I. J., McMillan D. R. "Stress protein in cardiovascular System" Circ. Res., (1998) 83, 117-132.1 о

20. Benny Spira and Haim Breitbart The role of anion channels in the mechanism of acrosome reaction in bull spermatozoa.Biochimica et Biophysica Acta (1992) 1109,65-73

21. Benson RS, Heer S, Dive C, Watson AJ. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. Am J Physiol, (1996) 270, CI 190-C1203.

22. Bortner CD, Hughes FM Jr, Cidlowski JAA primary role for K+ and Na+ efflux in the activation of apoptosis. J Biol Chem., . (1997) 272, 3243632442.

23. Bretag AH, Physiology Rev. (1987), 67,618-724

24. Buttke TM and Sandstrom PA "Oxidative stress as a mediator of apoptosis" Immunol. Today, (1994) 15, 7-10.

25. Buttyan R., Zakeri Z., Lockshin Q., Wolgemuth D."Cascade induction of c-fos, c-myc and heat shock protein 70 transcripts during regression of the rat ventral prostate gland" Mol. Endocrinol. (1988) 2, 650

26. Buzzard K. A., Giaccia A. J., Killender M., Anderson R. L. "Heat Shock Protein 72 Modulates Pathways of Stress-induced Apoptosis" J. Biol. Chem., (1998) 273:27,17147-17153.27

27. Cardin A.D.,Philip L.Smith, Lorna Hyde,Dale T. Blankenship ets. CD4 antagonists that block human immunodeficiency virus type-1 growth at multiple stages of the life cycle.The Journal of Biological Cemistry (1991) 266, 0.20, 13355-13363,28

28. Carman S.Melendrez ,Stanley Meizel Studies of Porcine and Human Sperm Suggesting a Role for a Sperm Glycine Receptor/Cl- Channel in the Zona Pellucida-Initiated Acrosome Reaction.Biology of Reproduction (1995) 53,676-683

29. Chant ID, Rose PE and Morris AG "Susceptibility of AML cells to in vitro apoptosis correlates with heat shock protein 70 (HSP70) expression" British J. Haematol. (1996) 93: 898-902.30