Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич

• Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Na/K-АТФаза: молекулярная структура, механизм функционирования и регуляция.

1.1.1. Основные кинетические характеристики Na/K-A ТФазы.

1.1.2. Состав и изоформы No/K-АТФазы.

1.1.3. Структура No/K-АТФазы, сайты связывания ионов и АТФ.

1.1.5. Регуляция No/K-АТФазы.

1.1.5. Ингибиторы Na/K-A ТФазы.

1.1.6. Эндогенные уабаин-подобные соединения (EOLS) и их роль в патогенезе гипертонической болезни.

1.2. Na/K-АТФаза как универсальный регулятор трансмембранного градиента натрия и калия.

1.2.1. Генерация мембранного потенциала.

1.2.2. Системы транспорта, сопряженные с переносом Na+ и 1С.

1.2.3. Регуляция объема клеток.

1.3. Na/K-АТФаза и внутриклеточная сигнализация.

1.3.1. Гены, экспрессия которых регулируется активностью No/K-АТФазы.

1.3.2. Сигнальные каскады, запускаемые ингибированием No/K-АТФазы.

1.4. Роль Na/K-АТФазы в развитии клеточной смерти.

1.4.1. Апоптоз и некроз - два вида клеточной смерти.

1.4.2. ИнгибированиеNo/K-АТФазы как фактор защиты клеток от апотоза.

1.4.3. Уабаин как инициатор клеточной смерти.

1.5. Основные положения следующие из обзора литературы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культура клеток.

2.1.1. Клетки гладких мышц сосудов (VSMC) (vascular smooth muscle cells).

2.1.2. Клетки гладких мышц, трансфицированные Е1А аденовирусом (Е1А VSMC).

2.1.3. Эпителиальные клетки С7 и СП MDCK.

2.1.4. Эндотелиальные клетки сосудов (РАЕС).

2.2. Морфологические методы оценки жизнеспособности клеток.

2.2.1. Фазово-контрастная микроскопия.

2.2.2. Сохранение связи клеток с подложкой.

2.2.3. Окраска клеток трипановым синим.

2.3. Биохимические критерии оценки жизнеспособности клеток.

2.3.1. Деградация МГГ.

2.4. Морфологические и биохимические критерии апоптоза и некроза.

2.4.2. Определение клеточного объема.

2.4.3. Определение количества фрагментированного хроматина.

2.4.4. Определение содержания низкомолекулярных фрагментов ДНК.

2.4.5. Активность каспазы-3.

2.5.методы изучения ионного гомеостаза клеток.

2.5.1. Определение активности Na*/1С-насоса.

2.5.2. Определение содержания обмениваемого калия и натрия

2.5.3. Определение свободного и обмениваемого внутриклеточного кальция.

2.5.4. Измерение внутриклеточногорН.

2.6. Молекулярно-биологические методы исследования.

2.6.1. Определение общей и меченой3Н-тимидином ДНК.

2.6.2. Определение экспрессии белков (Western Blot).

2.6.3. Определение экспрессии РНК (Northern Blot).

2.6.4. Измерение синтеза РНК и белка.

2.7. Реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Ингибирование Na/K-АТФлзы уабаином защищает клетки гладких мышц от апоптоза, вызванного радиоактивным мечением ДНК.

3.1.1. Ингибирование клеточного роста f Щ-тгшидином протекает через его включение в ДНК.

3.1.2. Сравнительный анализ эффекта [ Н]-тимидина на рост VSMC, эпителиальных и эндотелиальных клеток.

3.1.3. Влияние I3Н]-тимидина на синтез ДНК.

3.1.4. Обработка клеток [3Н]-тимидином вызывает их смерть.

3.1.5. Внедрение f HJ-тимидина в ДНК клеток вызывает их апоптоз.

3.2. Механизм экспрессии генов раннего ответа в vsmc сосудов, вызванный ингибированием Na/K-АТФлзы.

3.2.1. Ингибирование No/K-АТФазы вызывает резкое увеличение экспрессии c-Fos.

3.2.2. Уабаин вызывает экспрессию c-Fos через увеличение соотношения [Na*]/[iC]i.

3.2.3. Вызванная уабаином экспрессия c-Fos проходит через увеличение [Na*]t.

3.2.4. Роль клеточного объема, внутриклеточного рНи Са2* в инициированной у абаином экспрессии с-Fos.

3.3. Поиски начального сигнала, приводящего к гибели клеток эпителия почечных канальцев при действии уабаином.

3.3.1. Маркеры смерти C7-MDCK клеток при действии уабаина.

3.3.2. Роль No/K-АТФазы и внутриклеточных концентраций калия и натрия.

3.3.3. Роль кальция.

3.3.4. Роль макромолекулярного синтеза в смерти эпителиальных клеток, инициированнойуабаином

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Ингибирование уабаином Ыа/К-атфазы в VSMC подавляет апоптоз, вызванный радиоактивным мечением днк.

4.2. Экспрессия генов раннего ответа в VSMC сосудов, запускаемая уабаином: доказательства нового Ыа+,-опосредованного Са2+,-независимого механизма сопряжения возбуждения и транскрипции.

4.3. Некроз в клетках эпителия почечных канальцев, обработанных уабаином, не связан с ингибированием ионных потоков, опосредованных Ыа/К-АТФазой.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти»

В 1997 году Нобелевская премия по химии была присуждена профессору Иенсу Кристиану Скоу за открытие в 1957 году Ыа/К-АТФазы (Skou JC, 1957), фермента, который поддерживает баланс калия и натрия в клетке.

3941- f biociumica'кт biofhysica-; acta volii 23 (ig57)> the influence of some": cations on an adenosine; triphosphatase froms peripheral nerves? jens chr. skoui Institute of Physiology, Univtrsiiy oj Aarfius ^Denmarh)

В своей первой статье профессор Скоу показал, что в мембранной фракции, изолированной из нервных волокон краба Carcinus maenas, содержится аденозин-трифосфатаза, активируемая при совместной добавке натрия и калия. Вскоре было установлено, что этот фермент является универсальным молекулярным механизмом, который использует энергию гидролиза АТФ для поддержания неравновесного распределения этих катионов между клеткой и внеклеточной средой (Skou JC, 1965).

Последующие исследования показали, что Ыа/К-АТФаза - это интегрированный в клеточную мембрану белок, ответственный за транспорт 3Na+ и 2К+ против их электрохимических градиентов. Электрохимические градиенты моновалентных катионов, создаваемые Ыа/К-АТФазой, необходимы для поддержания мембранного потенциала, клеточного объема (Lang F et al., 2000; Mongin AA and Orlov SN, 2001) и транспорта других ионов и низкомолекулярных органических соединений за счет систем сопряженного транспорта, как то Na+/H+ и Ыа+/Са2+-обменники, Ыа+,К+,СГ-котранспорт, котранспорт Na+ с аминокислотами, глюкозой, фосфатами и нейротрансмиттерами (Blanco G and Mercer RW, 1998) (см. рис. 1).

Осмолиты

Системы активируемые при набухании

Системы активируемые при сжатии

Рис. 1. Взаимосвязь между объемом клетки и системами, регулирующих ионный гомеостаз

Учитывая ключевую роль Ыа/К-А'ГФазы в регуляции ионного гомеостаза, неудивительно, что ингибирование этого фермента влияет на целый ряд клеточных параметров. Так, сердечные гликозиды (например, дигитоксин, уабаин), одни из наиболее сильных природных ингибиторов Na/K-АТФазы, использовались для лечения сердечной недостаточности, некоторых аритмий и отеков с конца XVIlI-ro столетия (Withering W, 1785;Hoffman and Bigger. Ic>85). Механизм их действия заключается в том, что, ингибируя Na/K-А'ГФазу, сердечные гликозиды деполяризуют клеточную мембрану и повышают внутриклеточный уровень Na\ Вслед за этим через NaVCa"' -обменник (Lang F et al., 1998а) и потенциал-активируемые Са2,-каналы (Lang F et aL, 1992) повышается концентрация внутриклеточного Са2+, что приводит к усилению сокращений кардномиоцитов и увеличивает чувствительность клеток гладких мышц к вазоконстрикторам (Glitsch, 200UBIaustein and Lederer, 1999). При этом увеличение [Са2+] часто вызывает активацию Са* -завйен мых К "-каналов, которые усиливают вызванный мотивированием Na/K-АТФэзы отток калия из клетки н, таким образом, приводят к ее сжатию. В клетках ряда тканей это может инициировать апоптоз. С другой стороны, увеличение концентрации натрия и отрицательно заряженных осмоднтт может привести к набуханию клетки и некрозу (рис. 2).

Ж"

Out

In оЯЩ1

Актив «лид NsK^O-котржнспорI1

Уабаин за? i

Na+

Апоптоз или его маркеры

Транзиеншое сжатие Т

Са-шливнруеыьг? К-каналы

Набухание

Некро* диссипация Ем Na/Ca::+ обменник

Потенциал-активируемые Са2+ каналы —

Са2+/ I

Сокращение кардиомиоцитов

Рис. 2. Ng/K-АТФаза как регулятор ионного гомеостаза и объема клетки

Наряду с этими явлениям»! в последнее время было обнаружено, что активность Ыа/К-АТФшы регулирует экспрессию некоторых генов, в том числе генов, контролирующих проведение сигналов, пролиферацию клеток и программируемую клеточную смерть (апоптоз) (Taurin S el al., 2002а). С использованием в качестве модели сердечных миоцитов было обнаружено, что частичное ингнбированне Na'K-АТФазы стимулировало рост клеток, синтез белка, вызывало активирование некоторых протоонкогенов и факторов транскрипции (McGowan МП el al., 1999; Xie Z et al , 1999). Несмотря на то, что вышеперечисленные эффекты уабакна на пролиферацию клеток и экспрессию генов изначально были приписаны изменению концентрации [Са~ (Peng М et al., 1996c), в данный момент установлено, что хотя увеличение [Са2+] и является необходимым, но не достаточным условием для протекания этих процессов. Более того, ряд наблюдений указывает на то, что уабаин может влиять на функционирование клеток в остутствие существенного изменения внутриклеточных концентраций натрия и калия (Xie Z and CaiT, 2003).

В соответствии со схемой, представленной на рис. 2, первоначальными сигналами, приводящими к формированию клеточного ответа на ингибирование Na/K-АТФазы уабаином, могут быть увеличение [Na+]j или уменьшение [К*];, изменение клеточного объема (связанное с перераспределением одновалентных ионов), [Na+]j -зависимое увеличение внутриклеточной концентрации свободного кальция и/или закисление цитоплазмы, деполяризация мембраны и изменение активности чувствительных к электрическому потенциалу (Ем) мембранносвязанных белков. Кроме того, нельзя исключить и тот факт, что достаточным условием для генерации сигнала являются конформационные превращения Na/K-АТФазы при ее взаимодействии с середечными гликозидами, а также наличие рецепторов этих соединений, отличных от Na/K-АТФазы. Целью нашего исследования являлось изучение вклада вышеперечисленных факторов, инициированных ингибированием Na/K-АТФазы уабаином, в регуляцию экспрессии генов и смерть клеток. При разработке стратегии нашего исследования мы исходили из следующих основополагающих данных.

В 1999 году в нашей лаборатории было установлено, что обработка клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) уабаином резко замедляет развитие апоптоза, вызванного устранением ростовых факторов (Orlov SN et al., 1999). Известно, что наряду с химическими соединениями, апоптоз может быть вызван, воздействием физических стимулов, наиболее универсальным из которых является ионизирующая радиация. В связи с этим в первой части исследования мы разработали модель запуска апоптоза при действии радиации на культуру клеток и исследовали влияние на этот процесс уабаина.

При изучении механизма антиапоптотического действия уабаина на VSMC было установлено, что этот ингибитор Na/K-АТФазы резко активирует синтез РНК (Orlov SN et al., 2000b) и что его антиапоптотический эффект устраняется в присутствии ингибиторов РНК и белкового синтеза (Orlov SN et al., 2001). Эти результаты позволили предположить, что защита уабаином VSMC от клеточной смерти опосредована через экспрессию антиапоптотических генов, которые в свою очередь контролируются генами раннего ответа (early response genes - ERG). Это положение было подтверждено во второй части работы, где нам также удалось установить начальные звенья генерации сигнала, запускаемого ингибиторами Na/K-АТФазы.

В отличие от VSMC, долгосрочное воздействие уабаина приводит к некротическому типу смерти ряда других типов клеток, включая клетки эпителия почечных канальцев. В заключительной части работы мы исследовали механизм этого феномена на примере культуры клеток, полученных из собирательных канальцев почки собаки.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич

Выводы.

1. Длительное (более 48 часов) пребывание 3Н-тимидина в культуре клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC), эпителиальных клеток и клеток эндотелия, вызывает развитие апоптоза, что обусловлено включением источника ионизирующей радиации в структуру ДНК.

2. В VSMC ингибирование Na/K-АТФазы уабаином приводит к резкому подавлению апоптоза, запускаемого включением в ДНК меченого тимидина.

3. Двух-трехчасовая инкубация VSMC с уабаином приводит к шести-восьмикратному увеличению содержания белка c-Fos. Активация экспрессии этого белка вызвана увеличением внутриклеточной концентрации натрия и не связана с изменением объема клеток, внутриклеточного рН и концентрации кальция. Эти данные позволяют предположить существование нового механизма сопряжения возбуждения и транскрипции, в котором регулирующим фактором является изменение внутриклеточной концентрации Na+, а не Са2+.

4. В отличие от VSMC, 24-часовая инкубация клеток эпителия почечных канальцев в присутствии уабаина вызывает смерть клеток, которую, судя по быстрому увеличению клеточного объема и отсутствию чувствительности к ингибитору каспаз, можно классифицировать как некроз.

5. Токсическое действие уабаина на эпителиальные клетки опосредовано воздействием этого соединения на Na/K-АТФэзу, но не зависит от ингибирования ионных потоков, осуществляемых этим ферментом, равно как и от изменения внутриклеточных концентраций калия и натрия.

6. Уабаин оказывает двойственное действие на жизнедеятельность клеток. Защита этим соединением от программируемой смерти клеток, изученная на примере VSMC и связываемая с экспрессией антиапоптотических генов, опосредована через увеличение концентрации внутриклеточного натрия. Напротив, некротический тип смерти клеток вызван неидентифицированным сигналом, генерируемым при взаимодействии уабаина с Na/K-АТФэзой, не связанным с известной функцией этого фермента — поддержанием неравновесного распределения натрия и калия.

В заключении работы я пользуюсь возможностью выразить благодарность людям, без которых я никогда не смог бы ее выполнить.

Прежде всего я хотел бы поблагодарить своего научного руководителя Сергея Николаевича Орлова за возможность работать в его лаборатории, за огромное терпение и неиссякаемое присутствие духа, за его доброту и помощь, за то, что открыл для меня двери в мир науки, за все, чему он меня научил. Также я бы хотел выразить благодарность Георгию Владимировичу Максимову, в первую очередь, за его научное руководство моей диссертацией в Москве, за его советы и правки, за помощь и доброе отношение.

Не менее я благодарен Алексею Пшежецкому за помощь, ценные советы и предоставленную мне возможность приехать в Канаду и осуществить мою работу. Я также благодарен Себастьяну Торану, за то что он оказал мне большую поддержку и на первых порах был моим гидом в лаборатории, и многому меня научил. Я бы также хотел поблагодарить Александра Александровича Красновского за его ценные замечания в процессе подготовки этой работы, за его помощь в поиске данных.

Мне также хотелось бы поблагодарить Андрея Борисовича Рубина и Татьяну Евгеньевну Кренделеву за ценные замечания по поводу моей диссертации, с их помощью мне удалось исправить много ошибок и привести мою работу к законченному виду.

И, наконец, хочу выразить огромную благодарность своим друзьям, близким и родным за ту помощь и поддержку, которую они мне оказали на протяжении последних лет.

Список использованных сокращений.

ANF - предсердный натрийуретический фактор ATF-2 - активирующий транскрипционный фактор AVD - апоптотическое уменьшение объема BSA - альбумин из бычей сыворотки [Ca+]j — внутриклеточная концентрация кальция [Са+]0 - внеклеточная концентрация кальция CAD - активируемая каспазами эндонуклеаза сАМР - цикло аденозинмонофосфат

CREB-1 - белок связывающийся с элементом ответа цАМФ-Са2+

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол дегидрохлорид

DD - домены смерти

DED - эффекторные домены смерти

DFF40 - фактор фрагментации ДНК

DMEM - модифицированная среда Дульбекко

EGF - ростовой фактор выделенный из эндотелия

EOLS - эндогенные уабаин-подобные стероиды

FADD - домены смерти ассоциированные с Fas

FGF - ростовой фактор фибробластов

IGF-1 - ростовой фактор инсулинового типа

K+]i — внутриклеточная концентрация калия

К+]0 - внеклеточная концентрация калия

MLC-2 — легкая цепь миозина

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид

Na+]j - внутриклеточная концентрация натрия

Na+]0 — внеклеточная концентрация натрия

NVI - некротическое увеличение объема

PBS — физиологический раствор забуференный фосфатом.

PGE2 - простагландин Е2

PI - иодид пропидия

PLC - фосфолипаза С

ROS - Активные формы кислорода

RVD - регуляторное уменьшение объема

RVI - регуляторное увеличение объема

SDS - додецилсульфат натрия skACT - скелетный актин TGFp — опухолевый фактор роста р

Заключение.

Данные, полученные в нашей работе, могут быть суммированы следующими основными положениями.

I. Включение в структуру ДНК низкоэнергетического изотопа (3Н) является достаточным условием запуска апоптоза в клетках ряда тканей, включая VSMC, клетки эпителия почечных канальцев и клетки сосудистого эндотелия. Это наблюдение имеет несколько важных последствий. Во-первых, обнаруженное нами явление следует учитывать, дабы избежать артефактов, возникающих при использовании 3Н-трития для измерения синтеза ДНК и образования фрагментов хроматина. Во-вторых, мы полагаем, что накопление мутации в структуруе ДНК при включении в него пуриновых и пиридиновых оснований, содержащих радиоактивные изотопы, и связанный с этим явлением апоптоз вносит вклад в развитие радиационных осложнений. В-третьих, быстроделящиеся опухолевые клетки должны накапливать большие количества радиоактивно меченных оснований и тем самым быть наиболее подвержены апоптозу. В связи с этим, разработка методов доставки этих соединений к местам скопления опухолевых, быстро делящихся клеток, минуя здоровые клетки, может быть полезной для их использования в противоопухолевой терапии.

II. Подобно апоптозу стимулированному химическими воздействиями, апотоз VSMC, вызванный радиоактивным распадом 3Н, подавляется при ингибировании Na/K-АТФазьг уабаином. Это наблюдение указывает на то, что сигнальный каскад, запускаемый ингибиторами Na/K-АТФазы, воздействует скорее на универсальное звено апоптотического мезанизма, нежели на процессы, которые связаны с более специфическими начальными сигналами, возникающими при действии индукторов апоптоза различной природы.

III. При исследовании апоптоза, вызванного лишением VSMC ростовых факторов и защиты клеток ингибированием Na/K-АТФазы, было показано, что она опосредована через индукцию экспрессии антиапоптотичееких генов (Orlov SN et al., 2000b), включая ген морталина (Taurin S et al., 2002b). Однако начальные звенья этого процесса оставались невыясненными. Мы исследовали этот вопрос на примере экспрессии c-Fos, относящегося к суперсемейству генов раннего ответа. В этой части работы нами было установлено, что ингибирование уабаином No/K-АТФазы вызывает индукцию экспрессии c-Fos через увеличение внутриклеточной коцентрации натрия. Этот сигнальный каскад не был опосредован через модификацию внутриклеточного рН, объема клеток и [Са2*], Последнее наблюдение является наиболее важным, т.к. позволяет предложить новый опосредованный Са' -независимый механизм сопряж ения возбуждения и транскрипции, вовлеченный в подавление апоптоза,

IV. В заключительной части нашей работы мы исследовали механизм токсического действия уабаина, зарегистрированный в ряде клеток, включая эпителиальные клетки С7, выделенные нз днетального отдела нефрона. Нами было впервые обнаружено, тго некроз эпителиальных клеток, развивающгп/ся при действии уабаина не связан с инмюировиние и ионных потоков, опосредованных Ыа К-АТФазой, и с резким увеличение.* соотношения [No J/fK }„ наблюдающимся при действии yafxiuna.

Рассмотренные в совокупности, полученные нами данные позволяют предположить модель, объясняющую различный характер вовлечения сердечных глнкозндов в развит? апоптоза и некроза.

Гипотеза

2Кнекроз

1 Г апоптоз . каспаза-З

Рис. 48. Процессы, вовлеченные в блокирование апоптоза и инициирование некроза, вызванные воздействием уабаина

В клетках эпителия почечных канальцев уабаин вызывает конформационое изменение а-субъединпцы Na/K-АТФазы, что является достаточным условием для ее взаимодействия с неидснтифицированным белком, приводящим к активации сигнального каскада, завершающегося некрозом клеток. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о наличии ряда белков, напрямую связывающихся с Ыа/К-АТФазой, обнаруженных группой О.Д. Лопиной (Akimova OA et al., 2003). Так как некроз С7 клеток, обработанных уабаином, наблюдался в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белков (рис. 45), можно заключить, что все компоненты этого сигнального каскада уже присутствуют в этих клетках, и он не требует дополнительной экспресии белков, вовлеченных в передачу сигнала, приводящего к некрозу. VSMC лишены одного или нескольких компонентов этого сигнального каскада, что и определяет их устойчивость к уабаину. Именно благодаря этой особенности, удалось исследовать механизм ингибирования апоптоза в присутствии уабаина. Было обнаружено что антиапоптотический эффект этого соединения связан с увеличением соотношения [Na+]j/[K+]i (Orlov SN et al., 1999) и опосредован экспрессией супрессоров апоптотического механизма (Orlov SN et al., 2001), включая морталии (Taurin S et al., 2002b). Данные, полученные в нашем иследовании, позволяют предположить, что начальным фактором этого процесса является прирост внутриклеточной концентрации натрия, нежели потеря калия.

Предложенная модель включает несколько основных нерешенных аспектов. Какова природа белка, взаимодействующего с Na/K-АТФазой в присутствии уабаина и ответственного за начальные звенья сигнального каскада, завершающегося некрозом? При ряде заболеваний, включая гипертонию, обнаружено увеличенное содержание циркулирующих эндогенных соединений, идентичных уабаину и другим сердечным гликозидам (см. 1.1.6.). Каков вклад этих соединений в развитие некроза и нарушение фурнционирования ряда органов, включая развитие почечной недостаточности? Какова природа [Na+]i-ceHCopa, ответственного за экспрессию генов, вовлеченных в подавление апоптоза? Взаимодействует ли этот сенсор напрямую с промотором c-Fos невозможно, других генов, включая морталин, либо это взаимодействие опосредовано неидентифицированным фактором транскрипции? Наряду с уабаином и его эндогенными аналогами, активность Na/K-АТФазы регулируется целым спектром гормонов и нейромедиаторов. Кроме того, увеличение [Na+][ может быть следствием активации каналов и переносчиков, осуществляющих поступление этого катиона в клетку. Способны ли эти воздействия подобно уабаину подавлять развитие апоптоза? Мы надеемся, что эти вопросы станут предметом предстоящих исследований.

В нашей работе мы сфокусировали свое внимание на дуалистической роли ингибирования Na/K-АТФазы в клеточной смерти. Действительно, множество болезней связаны с патологией в клеточной пролиферации или смерти. При изучении гипертонии, болезни, являющейся одной из основных причин человеческой смерти, было показано, что нарушение функции сосудистой стенки и увеличение отношения толщины стенки к ширине сосуда влияет на патологию этого заболевания (Folkow В, 1982;Heagerty et al., 1993). Подобные нарушения являются следствием интенсивной клеточной смерти в стенке сосуда, и ее механизм играет ключевую роль в этом процессе (Hamet, 1995). Некомпенсированный пролиферацией апоптоз принимает также большое участие в таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, тератогенез, ухудшение регуляции иммунной системы и многих других. С другой стороны, потеря клетками способности к апоптозу приводит к возникновению раковых заболеваний, где экпрессия антиапоптотических генов в клетках приводит к их трансформации с образованием злокачественных структур (Hockenbery DM et al., 1990). Мы полагаем, что полученные в нашей работе данные о двояком механизме действия ингибиторов Na/K-АТФазы на апоптоз и некроз будут использованы при разработке новых фармакологических подходов коррекции болезней, связанных с нарушением процессов регуляции клеточной смерти.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич, 2004 год

1. Варфоломеев С.Д., 1981, Конверсия энергии био-каталитическими системами., (Моск. Ун-т., Москва).

2. Орлов СН, 1985, "Транспорт моновалентных ионов через плазматическую мембрану клеток электрически невозбудимых тканй," Усп, Совр. Биол. 100,47-65.

3. Рубин А.Б., 1984, Термодинамика биологических процессов., (Моск. Ун-т., Москва).

4. Скулачев В.П., 1989, Энергетика Биологических мембран., (Изд. Наука, Москва).

5. Торан С, Хамет П, and Орлов СН, 2003b, "Na/K насос и внутриклеточные моновалентные катионы: новый механизм сопряженния возбуждения с транскрипцией, участвующий в подавлении апоптоза.," Мол. Биология 37, 371.

6. Aizman О, Uhlen Р, Lai М, Brismar Н, and Aperia А, 2001, "Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations.," PNAS 98, 13420-13424.

7. Akera T, Yuk-Chow NG, Shieh IS, Bero E, Brody TM, and Braselton WE, 1985, "Effects of К on the interaction between cardiac glycosides and Na,K-ATPase.," Eur J Pharmacol 111, 147-157.

8. Akimova OA, Dolgova NV, Mast NV, Rubtsov AM, and Lopina OD, 2003, "Revealing of Proteins Interacting with Na,K-ATPase," Biochemistry in press.

9. Alvarez-Leefmans FJ, Gamino SM, and Reuss L, 1992, "Cell volume changes upon sodium pump inhibition in Helix aspersa neurones.," J Physiol 458, 603-619.

10. Amarente-Mendes GP, Finucance DM, Martin SJ, Cotter T, Salvesen GS, and Green DR, 1998, "Antiapoptotic oncogenes prevent caspase-dependent and independent commitment for cell death.," Cell Death and Differentiation 5,298-306.

11. Ameisen JC, 2002, "On the origin, evolution and nature of programmed cell death: a timeline of four billion years.," Cell Death and Differentiation 9,367-393.

12. Anderson, M. E., 2000, "Connections count. Excitation-contraction meets excitation-transcription coupling," Circ. Res. 86, 717-719.