Зависимость биологического действия ряда ПАУ от их структуры и характера метаболизма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Хитрово, Ирина Александровна

• Хитрово, Ирина Александровна
• кандидат биологических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хитрово, Ирина Александровна

I. ВВЕДЕНИЕ .Л.Л.*.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика ПАУ. •

2. Ферментная система» осуществляющая метаболизм ПАУ . .II

2Л. Система микросомальннх монооксигеназ . II

2.2. Щдукция микросомальннх монооксигеназ

3.3. Множественность форм цит.Р

2.4. Эпоксигидраза.

2.5. Ферменты конъюгации .V. •.•.'.

3. Метаболизм ПАУ

4. Теории канцерогенного действия ПАУ.

5. Мутагенное и цитотоксическое действие ПАУ.

6. Методы, применяемые при изучении метаболизма ПАУ .V.'.

Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДА

1У. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы количественного определения ряда ПАУ в сложных смесях и изучение структуры образующихся метаболитов •.••.••••••

1.1. Разработка методик количественного определения производных БП .*.

1.2. Разработка методик количественного определения ряда ПАУ спектрофяуориметри-ческим методом при селективном возбуздении.

1.3. Изучение метаболитов производных ЕП ••.•.

2. Изучение зависимости между скоростью метаболизма ряда ПАУ и их структурой .■

2.1. Скорость метаболизма ПАУ, имеющих различное число ароматических колец, в микросомах печени крысы Т. .V.V.T.'.V.V.V.

2.2. Изучение скорости метаболизма производных ЕЛ ;

2.2Д. Скорость метаболизма производных Ш в микросомах печени крысы

2.2.2. Скорость метаболизма производных Ш в культуре нормальных эмбриональных фибробластов мыши

3. Изучение роли свободных радикалов в канцерогенном действии БП .•

4. Сравнительное исследование канцерогенного, мутагенного и цитотоксического действий производных БП

4Д. Канцерогенное действие производных БП

4.2. Токсическое действие производных ЕЛ в культуре ткани .•.v.•♦.

4.3. Изучение мутагенного действия метаболитов

БП и производных БП в системе Эймса.

4.3.1." Мутагенное действие метаболитов БП

4.3.2. Изучение мутагенного действия производных БП

5. Сопоставление биологической активности производных БП с их способностью образовывать эпоксиды

У.' Обсуждение результатов •••••.•.•.•.•••.••.••.•. вывода .7.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Зависимость биологического действия ряда ПАУ от их структуры и характера метаболизма»

Полициклические ароматические углеводороды составлягот группу химичес1шх соединений, многие из которых обладают канцерогенным, мутагенным и токсическим действиями. Этот класс веществ относится к канцерогенам непрямого действия; проявление биологического эффекта обусловлено активацией их ферментной системой организма. Поэтому изучение процессов метаболизма ПАУ является весьма актуальной задачей.Изучению метаболизма ПА.У, выявлению действующего активного метаболита ПАУ, установлению связи между их химической структурой и биологической активностью посвящено большое количество исследований, и для ряда ПАУ удалось установить структуру конечного канцерогенного метаболита, которым является диолэпоксйд по "бэй"-области молекулы.Однако остается открытым вопрос о том, вызываются ли канцерогенный, мутагенный и токсический эффекты одними и теми же метаболитами.Особо ВБСшым представляется вопрос о том, какой метаболит ответственен за мутагенное действие, поскольку мутагенный тест широко рекомендуется как экспресс-метод определения канцерогенной активности веществ.Известно, что любые изменения в структуре молекулы ПАУ (введение заместителя в то или иное положение, разрыв двойной связи и т.д.) могут привести к сильному изменению биологического действия, его канцерогенных и мутагенных свойств, что, в свою очередь, может объясняться различиями в метаболизме этих соединений.* В настоящей работе сделана попытка обнаружить зависимость - 6 между биологическими эффектами ПАУ разного строения и юс способностью метаболизироваться в системе ММО. Сравнительный анализ метаболитов близких по структуре веществ и сопоставление спектра метаболитов этих ПАУ с их биологическим действием представляют большой интерес и весьма актуальны,' Благодаря такого рода сопоставлению можно выяснить, какие именно метаболиты ответственны за то или иное биологическое действие ПАУ (канцерогенное, мутагенное и токсическое).Согласно квантово-механическим расчетам, с увеличением числа бензольных колец в молекуле ПАУ растет реакционная способность образующихся эпоксидов. Поскольку предполагается, что для большинства ПАУ конечным канцерогеном являются эпоксиды, то, следовательно, их канцерогенная активность должна возрастать. Но в действительности, при увеличении числа бензольных колец свыше определенного предела (более 7) канцерогенная активность ПАУ резко уменьшается. Возможно, что это связано с уменьшением скорости метаболизма ПАУ в системе ШЛО. Б работе была предпринята попытка проверить это предположение.Известно, что при метаболизме ряца ПАУ, например, ЕП, наблюдается образование свободных радикалов ( ,1974).Ввиду высокой реакционной способности этого класса веществ предполагается, что они могут: играть существенную роль в биологическом действии ПАУ. В связи с важностью выяснения роли различных метаболитов в биологическом действии ПАУ мы исследовали роль свободных радикалов в канцерогенном и мутагенном действиях БП. Одной из важных проблем в химии и биохимии ПАУ является надежный и доступный способ определения соединений в смеси с его производными и метаболитами. Для этой цели были разработа- 7 ны методики количественного определения 1шда ПАУ на основе метода получения квазюшнейчатых спектров (эффект Шпольского; Э.В.Шпольский и др.,1952). Применение этих методик позволяет обходиться без меченых производных, синтез которых весьма затруднителен и не всегда возможен.Целью работы явилось изучение на примере двух групп ПАУ (с различным числом бензольных колец и производных БП с различными заместителями) связи меаду канцерогенным, мутагенным и токсическим действиями и метаболизмом этих ПАУ системой ММО. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: I) Разработать специфические и высокочувствительные методики количественного определения ряда ПАУ; 2) Изучить скорость метаболизма ряда ПАУ в системе ММО; 3) Изучить в эксперименте канцерогенное, мутагенное и токсическое действия производных Ш ; 4) Выделить и идентифицировать метаболиты; производных БП, образующихся при окислении в системе ММО печени крысы.Изучение по разработанным методикам скорости метаболизма ПАУ позволило объяснить причину снижения канцерогенной активности веществ с числом бензольных колец более 7. Параллельное изучение продуктов метаболизма ПАУ с одной стороны, и канцерогенного, мутагенного и токсического действий этих же веществ с другой, позволило выявить метаболиты, производных, изученных веществ^:;.ответственные за эти биологические действия, что осо- 8 бенно важно, поскольку экспресс-методы определения канцерогенной активности различных химических соединений, основанные на мутагенности и токсхгчности, применяются все более широко.Разработанные методики количественного определения ряда ПАУ могут быть использованы не только в биологических исследованиях, но и при анализе ПАУ в загрязнениях окружающей среды. - 9

Заключение диссертации по теме «Онкология», Хитрово, Ирина Александровна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики количественного определения производных БП по спектрам флуоресценции замороженных при 77°К растворов,

2. Изучена скорость ферментативной деградации ряда ПАУ с различным числом ароматических колец. Показано, что по мере увеличения площади молекулы скорость метаболизма падает. Сделано заключение, что отсутствие канцерогенной активности у ПАУ с числом ароматических колец более 7 объясняется низкой скоростью:; их ферментативной деградации.

3. Изучены продукты деградации БП и его производных с заместителями в положении "6" в микросомах печени крысы. На основании спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции при низкой температуре определены структуры образующихся дигидроди-олов. Показано, что в зависимости от природы заместителя образуется от одного до трех дигидродиолов.

Исследована^ канцерогенная, мутагенная в бактериальной тест-системе, токсическая в культуре клеток активность ряда производных БП. Показано отсутствие корреляции между скоростью метаболизма изученных веществ и их биологическим эффектом.

5. На основании изучения канцерогенной и мутагенной в системе Эймса активности БП и его производных (б-окси- и 6-ацет-окси-БП), образующих свободные радикалы, сделано закашячение: а) в отличие от эпоксидов, которые вызывают мутации как сдвига рамки считывания, так и замены основания, свободные радикалы вызывают мутации только типа сдвига рамки считывания; б) свободные радикалы БП не играют существенной роли в проявлении канцерогенного и мутагенного действия БП.

6. В ряду производных БП обнаружена корреляция между мутагенной активностью! ПАУ и структурой метаболитов. Установлено, что практически немутагенные производные БП - б-хлор- и 6-метокси-БП не образуют дигидродиолов по "К^области. Сделано заключение, что за мутагенный эффект БП и его производных ответственен "К"-областной эпоксид.

Заключение.

Получены данные по канцерогенной, мутагенной активности и токсическому действию ряда производных БП с различными липо-фильными заместителями. Введение заместителя в положение "6" молекулы БП изменяет его канцерогенные и мутагенные свойства. Так, в наших опытах с подкожным введением вещества видно, что заместитель снижает канцерогенную активность БП.

При сравнении канцерогенной, мутагенной и цитотоксической активностей производных БП видно, что наименее канцерогенгое соединение (6-метокси-БП) оказывается и наименее мутагенным и токсичным. В то же время между канцерогенностью и мутагенностью этих ПАУ нет полной корреляции. Так, 6-хлор-БП обладает канцерогенной активностью, но не мутагенной.

Токсичность данных соединений на культуру клеток нормальных эмбриональных фибробластов мыши показывает, что БП наиболее токсичен в этой группе соединений, а наименее токсичным является 6-метокси-БП.

Различия в биологической активности производных БП не связаны с различной скоростью метаболизма системой ММО, так как скорость метаболизма этих соединений приблизительно одинакова в микросомальных препаратах из печени крнс, индуцированных 3-МХ.

Показано, что канцерогенная активность БП не связана с образованием свободных радикалов. Мутагенная активность БП также, очевидно, не связана с образованием свободных радикалов, хотя 6-окси-БП, котярый является источником свободных радикалов, -сильный прямой мутаген. За мутагенный и канцерогенный эффекты основную ответственность несут эпоксиды. Производные БП, не проявляющие мутагенных свойств, не образуют 4,5-дцо метаболитам присутствие которого говорит об образовании эпоксида по "Кп области. Такта образом, эпоксвд по "К" области может быть ответственен за мутагенный эффект данных соединений.

Значение ршш положения "6" в молекуле БП определяется двумя факторами. С одной стороны, окисление в это положение -путь детоксикации, поскольку образующийся 6-окси-ЕП является неканцерогенным метаболитом.

С другой стороны, блокирование этого положения приводит к тому, что изменяется способность образования эпоксвдов в соседние положения - иК"-область и "бэйи-область, что влечет, в свою очередь, изменение канцерогенной и мутагенной активности. Изменение окисления веществ в "К"-область и "бэйи-область при введении заместителя в положение "6" молекулы БП зависит от природы заместителя.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одной из важнейших задач в проблеме химического канцерогенеза является выяснение факторов, влияющих на образование конечного канцерогена при ферментативном распаде непрямого канцерогена в: клетке^Соглаана современным представлениям, канцерогены непрямого действия, к которым относятся ПАУ, превращаются в организме в электрофильные соединения, взаимодействие кото-pax с клеточными макромолекулами приводит к малигнизации Д2 V. Предполагается, что конечным канцерогеном для ПАУ являются эпоксиды /102/,

Канцерогенные ПАУ могут вызывать помимо канцерогенного, другие биологические эффекты, такие как мутации в бактериальной системе, токсический эффект в культуре клеток. Подобное действие канцерогенных веществ привлевает в последнее время широкое внимание исследователей, поскольку, в отличие от канцеро-генности, эти эффекты проявляются через короткий промежуток времени и могут быть использованы как система скрининга для определения канцерогенной опасности химических веществ.

Ферментативная активация - также необходимое условие для мутагенного и цитотоксического действия ПАУ.

В данной работе мы исследовали биологическое действие ПАУ в зависимости от структуры вещества и характера его метаболизма. Для решения поставленной задачи необходимо иметь надежный, высокочувствительный метод ппределения вещества в смеси с продуктами его метаболизма. Поэтому на первом этапе исследования был разработан подобный-метод.

I.1 Применение спектров низкотемпературной флуоресценции при изучении метаболизма ПАУ.

Первой задачей, поставленной в нашей работе, было выяснение зависимости скорости ферментативного окисления ПАУ от их биологической активности. Для этой цели необходимо было разработать оригинальный метод исследования метаболизма ПАУ, ввиду невозможности использования ранее описанных методов с мечеными веществами или использования эталонных метаболитов из-за отсутствия этих веществ.

Скорость ферментативного окисления определялась нами по убыли основного субстрата в исследуемой системе. Для этого необходимо было разработать методику качественного и количественного анализа субстрата, используя абсолютную специфическую характеристику исходного соединения, достоверно отличающую его как от других соединений, так и от продуктов его метаболизма. Такой метод был разработан нами на основе "эффекта Шпольского* (появление специфической тонкой структуры спектров флуоресценции ПАУ в услввиях замороженных поликристаллических н-парафиновых растворов /34 /.

Проведенные нами исследования показали, что спектры флуоресценции производных БП в замороженных при 77°К н-октановых растворах различны. На рисунках 6,7 приведены спектры флуоресценции исследованных замеденннхлцюизводных БП, выделены аналитические линии, использованные для идентификации и количественного анализа исходного соединения при изучении биотрансформации в системе ММО.

Из рисунков 6-7 отчетливо видно, что: I) Спектры флуоресценции исследованных производных БП специфичны в условиях замороженных при 77°К н-октановых растворов при возбуждении группой ртутных линий X =365 нм.

2) В спектре каждого соединения может быть выбрана интенсивная линия в качестве аналитической, специфичная для каждого соединения и не совпадающая по длине волны с линией вещества-стандарта.

3) Могут быть подобраны такие концентрации внутреннего стандарта, при которых интенсивность аналитической линии стандарта сравнима с интенсивностью аналитической линии исследуемого вещества и внетренний стандарт удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к нему.

Использование внутреннего стандарта необходимо, так как абсолютная интенсивность аналитической линии не модет однозначно характеризовать концентрацию исследуемого вещества в сложном экстракте из-за возможного влияния примесей и некоторой невоспроизводимости условий записи спектров. Одновременное использование принципа добавок позволяет устранить ошибку, связанную с возможным различным влиянием примесей на основной субстрат и вещество-стандарт.

Специальные исследования позволили установить интервал концентраций, в пределах которого интенсивность аналитической линии прямо пропорциональна концентрации определяемого вевдина-ния (табл.5 ,стр.59 ). Как озмечалось в главе, посвященной разработке методик, коэффициент вариации не превышает + 8$.

Таким образом, разработанные методики позволяют достаточно точно определять количественно остаток неизменного вещества-субстрата в исследуемом экстракте, не прибегая к его предварительному фракционированию.

Применение этой методики позволило определить для каждого из исследованных соединений скорость ферментативного распада по убыли исходного субстрата, экстрагируемого из инкубационной среды органическими растворителями.

Анализ продуктов метаболизма ПАУ представляет известные методические трудности, так как для идентификации их необходимы как набор синтезированных метаболитов, так и достаточное количество выделенного чистого метаболита для анализа на масс-спектрометре и получения ЯМР-спектра для установления структуры исследуемых соединений.

В работе / 25 / показана возможность определения молекулярной структуры неизвестного люминесцирующего соединения, дающего в условиях эффекта Шпольского квазилинейчатый спектр. Определение соединения основано на изучении особенностей этих спектров, таких как:

I) степень структурности спектра; 2) идентичность проявления электронно-колебательной структуры квазилинейчатых спектров родственных соединений.

Использование спектрофлуориметрических методов анализа органических соединений, которые отличаются врзможностью проведения последовательного сканирования не только спектров флуоресценции и фосфоресценции, но и спектров возбуждения люминесценции, совпадающих при малых концентрациях вещества со спектром поглощения позволяет анализировать неизвестные ПАУ.

Бенз(а)пирен, как уже отмечалось ранее, является одним из наиболее детально изученных ПАУ и в литературе имеется достаточно данных для отождествления продуктов его метаболизма в системе МО. Проевденные нами сравнительные исследования продуктов метаболизма БП и его производных показали, что метаболизм этих соединений имеет много общего. Значения и выход отдельных продуктов для БП были изучены в условиях использованной нами системы хроматографического разделения в тонком слое с последующей регистрацией спектров низкотемпературной флуоресценции и УФ поглощения и сопоставления с результатами, полученными другими авторами. Для производных Ш, исследованным нами впервые, значения Ер для продуктов метаболизма были близкими к соответствующим у БП; их спектральные характеристики находились в том же соответствии со спектрами исходного продукта,что и в случае БП и его метаболитов.

Таким образом, проведениве сравнительных исследований и изучений спектров УФ поглощения и люминесценции продуктов метаболизма в системе ММО позволяет определить^основные метаболиты для исследованных нами производных БП - фенолов, хинонов и ддо (см. таблицы 9,10).

Спектры флуоресценции и возбуждения ддо-производных БП сравнивались со спектрами дцо-БП, что позволило определить вид ддо-метаболитов производных БП. Спектральные характеристики дцо-метаболитов БП индивидуальны для каждого дцо, то есть каждый дцо имеет свой набор длин волн флуоресценции и возбуждения. Так, 4,5-ддо-ЕП имеет }физеновый тип спектра. Спектры возбуждения 9,10-ддо производных БП существенно отличаются от спектров возбуждения 7,8-дцо производных БП.

2. Эпоксцдн, как основной класс мутагенных н канцерогенных метаболитов ПАУ,

Наиболее распространено представление, что за канцерогенный эффект химических веществ ответственны электрофильные метаболиты. Однако, по аналогии с радиационным канцерогенезом, предполагается, что в некоторых случаях активным началом ПАУ могут быть свободные радикалы /128/. Наличие этого класса метаболитов показано для БП. Методом ЗПР доказано, что при окислении БП через стадию 6-окси-БП образуется 6-оксо-радикал БП по схеме:

Некоторые авторы считают 6-окси-радикал БП конечным канцерогеном /175/,

БП, помимо 6-окси-БП, образует большое число других метаболитов: эпоксиды, фенолы, диолэпоксиды. Трудно оценить, какое направление в ферментативном окислении ответственно за биологический эффект, когда используется сам БП. Вопрос значительно упрощается, когда используются производные, которые метаболизи-руются с образованием только одного соединения. Нами было показано, что 6-ацетокси-БП под действием эстераз клетки полностью превращается в 6-окси-БП. Изучение канцерогенной активности 6-окси-БП и 6-ацетоуси-БП преследовало цель узнать о роли свободных радикалов в канцерогенезе БП. Отсутствие канцерогенности у 6-окси-ЕП и 6-ацетокси-БП показывает, что свободные радикалы не играют существенной роли в проявлении канцерогенных свойств БП. Очевидно, как для замещенных ПАУ, так и для незамещенных, конечным канцерогеном являются эпоксиды.

6-окси-БП является сильным мутагенным соединением (таблица 18, стр. 98). Однако, в отличие от исходного ПАУ, он вызывает мутации только сдвига рамки считывания. Введение -токоферола, гасителя свободнорадикальных процессов, предотвращает появление мутаций 0Т>6яОкеи-ЕП, следовательно, этот эффект обусловлен свободными радикалами. В то хе время -токоферол не влияет на мутагенный эффект БП, следовательно, вклад свободных радикалов в мутагенный эффект самого БП незначителен.

Мутагенез БП обусловлен, видимо, эпоксидами, так как глу-татион, вещество, взаимодействующее с эпоксидами, уменьшает выход числа ревертантов как на штамме ТА 100, так и на штамме ТА 98 (таблица 18, стр. 98).

Для изучения механизма мутагенного действия веществ можно рекомендовать использование глутатиона и оС -токоферола. Если ^ -токоферол изменяет мутагенный эффект веществ, то это значит, что за мутагенный эффект могут быть ответственны свободные радикалы, и если глутатион снижает мутагенное действие вещества, то значит, эффект обусловлен действием эпоксипроизводных.

3. Зависимость метаболизма ряда ПАУ и биологического действия (канцерогенного, мутагенного, цитотокси-ческого).

Известно, что канцерогенной активностью обладают молекулы ПАУ с числом бензольных колец не более 7. Однако показано, что при увеличении числа ароматических колец в молекуле реакционная способность эпоксидов, образующихся из ПАУ, увеличивается /103/.

Так, из рисунка 14 видно, что активность диолэпоксидов по "бэй"-области, которые, по-видимому, для многих ПАУ являются конечными канцерогенами, увеличивается с увеличением размеров молекул* Соответственно усиливается и канцерогенность соединений. Если вещества 1,2- неканцерогенные; 3,4- слабо канцерогенные, то 5,6 - ПАУ с выраженной канцерогенной активностью.

Мы предположили, что отсутствие канцерогенной активности у ПАУ с большой площадью молекулы связано с падением скорости их метаболизма в ММО и, как следствие, с падением стационарной концентрации активного метаболита.

Для взятого нами ряда ПАУ - БА, БП, ДБП, БШЕ и коронен -молекулы которых отличаются числом бензольных колец, мы получили, что скорость метаболизма в микросомальннх препаратах из печени интактных крыс действительно уменьшается с увеличением числа бензольных колец (таблица II). реакционный ряд исслежованных незамещенных ПАУ можно представить следующим образом:

БА (4 кольца) ^БП (5 колец) ^ ДБП (6 колец) > БШЕ (6 колец) ^коронен (7 колец).

Таким образом, в рруппе ПАУ с различным числом ароматических колец в молекуле существует тенденция падения интенсивности метаболизма с увеличением числа колец. Это может быть одной из причин падения канцерогенной активности у больших молекул ПАУ.

Интенсивность метаболизма ПАУ различной структуры изучалась другими авторами в поисках корреляции между канцерогенной активностью и скоростью метаболизма. Авторами использовались микросомальные препараты из печени животных или клеток культуры, а также непрсредственно культура клеток. При этом авторы использовали в основном, 4,5-кольчатые молекулы ПАУ.

Другими авторами /6, 163/ не было получено четкой зависимости между скоростью метаболизма и размером молекул, очевидно, вследствие того, что рассматривался ряд молекул, близи^по числу колец (4-5 колец). Для выявления такой зависимости нами был взят более широкий диапазон ПАУ (4-7 колец).

Другая группа ПАУ, имеющих одинаковое число ароматических колец, но разные заместители (производные БП),была взята нами с целью выяснения вопроса о причинах изменения канцерогенных свойств вещества при введении липофильного заместителя.

Были исследованы производные БП с заместителем в положении И6П молекулы. Это положение в молекуле ЕП соответствует наибольшей реакционной способности вещества в реакциях химического окисления /75, 128/.,

Так как для незамещенных ПАУ общая скорость метаболизма коррелировала с канцерогенной активностью ПАУ, то и для этой группы ПАУ мы попытались обнаружить такую зависимость.

В результате исследования скорости метаболизма производных ЕП в трех системах (нормальные микросомы, микросомы из 3-МХ-индуцированных крыс, культура клеток нормальных эмбриональных фибробластов мыши) было показано, что вид заместителя не оказывает влияния на скорость превращения молекул (различия не достоверны, р>0,5). Однако сам БП метаболизируется достоверно с большей скоростью, чем его производные в системе с нормальными микросомами и в культуре клеток. Таким образом, для ряда замещенных производных БП не столько общая скорость метаболизма, сколько вид и концентрация активного метаболита играет роль в канцерогенезе.1

Введение заместителя в положение "6" молекулы БП изменяет его канцерогенные свойства. Так, в наших опытах с подкожным

Биологическая активность и образование метаболитов - дигидродиолов производных БП.

Канцерогеннооть Мутагенность Токсичность Метаболиты т Вещество количество животных с опухолями (%) ТА 98 ТА 100 (относит^ед.О в культуре норм.эмб. йибробл. (% погибших клеток) 4,5-дцо 7,8-ддо

I. БП 83 II 10 44,0 ±1,9 + +

2. 6-метил-Ш 60 65 15 36,5+2,1 + +

3. 12-метил-ЕП ++ 4 4 35,0 +4,8 +

4. 6-хлор-БП 30 I 0 22,5 +0,5 - +

5. 6-метокси-БП 5 I 0 12,0 +6,0 - +

6. 6-фтор-БП ++ 10 5 25,0 +6,0 + + введением вещества видно, что введение заместителя в основном снижает канцерогенную активность БП, Канцерогенная активность зависит также от вида заместителя. Так, атом хлора в положении "6" ЕП значительно снижает канцерогенную активность соединения, а введение метокси-группы делает вещество практически неканцерогенным.

Изучение продуктов метаболизма производных БП, образующихся при окислении микросомальными препаратами из печени крыс, индуцированных 3-МХ, показало, чтовсе они, как сильные канцерогены, так и слабые, образуют дигидродиол по 7-8 связи молекулы, который является предшественником диолэпоксида по "бэй°-области. Очевидно, способность образовывать предканцероген еще не говорит о канцерогенных свойствах вещества. Хотя предшественник диолэпоксида и образуется для практически неканцерогенного 6-метокси-ЕП, очевидно, образование диолэпоксида из этого дигидродиола является запретным.

Известно, что канцерогенные, токсические и мутагенные свойства вещества взаимосвязаны. Так, в большинстве случаев канцерогенные вещества проявляют и токсические, и мутагенные свойства /4,46/. Так же, как и в случае канцерогенных свойств производных ЕП, токсическое действие и мутагенное действие в системе Эймса зависит от вида заместителя. Хлор- и метокси-производнне менее токсичны и менее мутагенны. В то же время для данной группы 2АУ не получено полного количественного соответствия между канцерогенным и мутагенным эффектами. Так, 6-хпор-БП проявлял канцерогенные свойства, но не проявлял мутагенные.

Проведенные ранее исследования /191/ и данные нашей работы с 7,8-дцо-ЕП (см. таблицу 18) показали, что образующийся при ферментативном окислении из дигидродиола - предканцерогена бэй"-областной диолэпоксвд является сильным мутагеном для бактерий в тесте Эймса. Можно было предположить, что этот эпоксид ответственен за мутагенность исходного ПАУ и, следовательно, мутагенный и канцерогенный эффекты вызываются одним метаболитом.

Сопоставление продуктов окисления с мутагенным и канцерогенным эффектами производных БП показало, что за мутагенный эффект ответственен в первую очередь мК"-областной эпоксид. Подтверждением того, что за мутагенный и канцерогенный эффекты могут быть ответственным разные метаболиты, является канцерогенная, но не мутагенная активность 6-хлор-БП.

Тот факт, что в случае ПАУ мутагенность вызывается первичными "К"-областными эноксидами, а не диолэпоксидами, подтверждается данными других авторов: I) Введение в среду инкубации фермента эпоксигидразы уменьшает мутагенный эффект ПАУ /85 /. Известно, что этот фермент мало эффективен в случае "бэй"-област~ ных диолэпоксидов /86/; 2) Введение атома фтора в молекулу БП в анпулярное кольцо не уменьшает мутагенный эффект ЕП /85/. Атом фтора в ангулярном кольце БП препятствует образованию ибэйп-областного диолэпоксида; 3) Метильная группа в ангулярном кольце БП уменьшает его канцерогенную активность, но при этом мутагенная активность соединения сохраняется /192/. Авторы этих работ делают заключение, что мутагенный эффект БП не связан с активацией соединения по "бэй"-области.

Несмотря на то, что канцерогенный и мутагенный эффекты, по-нидимому, вызываются разными метаболитами, корреляция между канцерогенностью и мутагенностью должна сохраняться. Так, Джерин и соавт./ЕОЗ/ показали корреляцию между реакционной способностью "бэйи-областного диолэпоксида и эпоксида по "К" обла

3,44

3,34

0,600

0,700

0,800

0,900

Рис.17. Зависимость междудЕ я делок величиной, характеризующей активность диолэпокси-да по ибэй"-области) и комбинированным "К"-областным индексом (величиной, характеризующей активность эпоксида по ^"-области) ДОЗ/.

По оси абсцисс - величина д Еделок>/£

По оси ординат - величина комбинированного "К°-областного индекса.

I - дибенз(а,I )пирен; 2 - дибенз(а,/г)пирен; 3 - бенз(с)-фенантрен; 4 - бенз(а)антрацен; 5 - хризен; 6 - дибенз (а,£)-пирен; 7 - фенантрен; 8 - пирен; 9 - бенз(а)пирен; 10 -нафто(2,3)пирен; II - дибенз(а.е)пирен; 12 - бенз(е)пирен; 13 - бенз (а)антрацен; 14 - дибенз (а,} )антрацен; 15 -бенз(/ч')хризен; 16 - дибенз (а, А)антрацен.

- 121 сти (рис.17). В тех случаях, когда образуются оба метаболита, корреляция между канцерогенным и мутагенным эффектами сохраняется. Отсутствие корреляции мы наблюдаем, видимо, тогда, когда один из метаболитов (канцерогенный или мутагенный) не образуется. Так, 6-хлор-Ш способен метаболизироваться до 7,8-дягидро-диола, что, очевидно, определяет его канцерогенные, но не мутагенные свойства.'

Показанное нами мутагенное (но не канцерогенное) действие свободных радикалов ПАУ также может быть в некоторых случаях причиной отсутствия корреляции между канцерогенным и мутагенным действиями изучаемых соединений.

Тот факт, что за мутагенный эффект в системе Эймса для некоторых производных Ш ответственен не тот метаболит, котррый является конечным канцерогеном, на наш взглнд весьма важен, так как эта тест-система используется для скрининга канцерогенных веществ. Очевидно, в случае ПАУ результаты, полученные в системе Эймса, необходимо интерпретировать с большей осторожностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хитрово, Ирина Александровна, 1985 год

1. Алексеева Т.А., Теплицкая Т.А. - Разработка принципов определения типа молекулярной структуры неизвестных соединений сложных смесей. Изв.АН СССР. Сер.физич. 1978, т.42, № 3, с.669-674.

2. Алексеева Т.А., Леквейшвили Э.Г., Тевдорашвили М.Н. и др. -Спектрофлуориметрическое изучение ароматических углеводородов Норийской нефти. Сообщ.АН ГССР, 1979, т.96, № I, с.93-96.

3. Алексеева Т.А., Теплицкая Т.А. Спектрофлуориметрические методы анализа ароматических углеводородов в природных и техногенных средах. М., Гидрометеоиздат,. 1981.

4. Андрианов Л.А., Белицкий Г.А., Васильев Ю.М. и др. Действие канцерогенных углеводородов на клетки. М., 1971.

5. Арнаков А.И. Микросомальное. окисление. М., Медицина, 1975.

6. Белицкий Г.А., Хесина А.Я. Метаболизм ряда полициклических углеводородов в культуре нормальных эмбриональных фибробластов. Вопр.онкол., 1970, т.26, W А, с.113-117.

7. Белицкий Г.А. Действие канцерогенных углеводородов на нормальные и опухолевые клетки в культуре ткани. Дисс.докт., М., 1973.

8. Васильев Ю.М., Гелыптейн В.И. 0 взаимных отношениях предраковых изменений и реактивной пролиферации. Вестник АМН СССР, 1962, т.6, с.7-16.

9. Гельбойн Г.В. Канцерогены, индукция ферментов и действие генов. В кн.: Успехи, в изучении, рака, М., 1971, т.Х, с.9-91.

10. Дикун П.П. Количественное определение малых концентраций 3,4-бензпирена с помощью тонкой структуры спектров флуоресценции. Вопр.онкол., 1961, т.7, № 7, с.42-53.

11. Каминский JI.C. Статистическая обработка лабораторных и клинических данных. JL, 1964.

12. Кобляков В.А., Ягужинский Л. С. 0 механизме начальных стадий превращений полициклических углеводородов при канцерогенезе. Успехи современной биологии, 1983, т.XI.

13. Литвин Ф.Ф., Персонов Р.И. Тонкая структура спектров поглощения и флуоресценции некоторых пигментов при- 77°К. ДАН СССР, 1961, т.136, № 4, с.798-800.

14. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков. Новосибирск, Наука, 1981, 240 с.

15. Метелица Д.И. Механизмы гидроксилирования ароматических соединений. Успехи химии, 1971, т.30, с.1175-1210.

16. Методические рекомендации по применению теста Эймса salmonella/ микросомы.' /Фонштейн Л.М., Абилев С.К.Бобринёв Е.В. и др'./. МЗ СССР, 19.83.

17. Мостков М.И:. Практикум по вариационно-статистической обработке клинического материала. Ашхабад, 1954.

18. Паальме Л.П., Кобляков В.А., Губергриц М.Я. Кинетика фотоини-циированного окисления нёкоторых 6-замещенных производных бенза/пирена. В сб.: Окисление канцерогенных полициклических углеводородов производных бенз/а/пирена. Таллин," 1978, с.92-96.

19. Паханиль Ю.А. Квазилинейчатые спектры флуоресценции и возбуждения некоторых метилпроизводных 3,4БП. Ж.прикладная спектроскопия, 1973, т. 18, вып.2.

20. Пульман А., Пульман Б. Электронная структура и канцерогенная активность молекул ароматических веществ. В кн.: Успехи в изучении рака, 1955, т.З, с.305-352.

21. Райхман 'Л.М., Белова В.И., Борукаева М.Р., Лихтенштейн А.В. -Кинетика гидроксилирования. Биохимия, 1971, т.36, вып.4, с.674

22. Рябых Т.П. Действие химических канцерогенов и их метаболитов на энергетические функции клетки. Дисс.канд., 1976.

23. Сергеев Б.Л'. Окисление бенз/' /пирена в некоторых физико-химических и ферментативных системах. Дисс.канд., 1984.

24. Теплицкая Т.А. Квазилинейчатые спектры люминесценции как метод исследования сложных природных органических смесей. - М., Изд. МГУ,' 1971.

25. Теплицкая Т.А., Алексеева Т.А., Вальдман М.М. Атлас квазилинейчатых спектров люминесценции, ароматических молекул. М., Изд. МГУ, 1978.

26. Федосеева Г.Е., Хесина А.Я. Использование квазилинейчатых спектров люминесценции, для количественного определения ряда полициклических углеводородов. Ж.прикладная спектроскопия, 1968,т.9', № 2', с.282-288.

27. Хесина А.Я. Спектрально-люминесцентные методы в изучении, некоторых механизмов химического канцерогенёза и в профилактике злокачественных новообразований. Дисс.докт., М., 1974.

28. Шабад JI.M., Ильницкий А.П. Некоторые итоги изучения загрязнения водоемов канцерогенными углеводородами. Сб. "Вопросы профилактики загрязнения внешней среды, в частности водоемов, канцерогенными веществами", Горький, 1972, с.5-13.

29. Шабад JI.M. 0 циркуляции канцерогенов в окружающей среде. М., Медицина, 1973.

30. Шабад JI.M. Международная конференция по изучению загрязнения окружающей среды канцерогенными веществами. Вопр.онкол, 1976, № 5, с.109-113.

31. Шпольский Э.В., Ильина А.А.,' Климова Л.А. Спектры флуоресценции коронена в замороженных растворах. ДАН СССР, 1952, т.87,6, с.935-938.

32. Штерн Э., Тиммонс К. Электронная абсорбционная спектроскопия в органической химии. М., Мир, 1974. •

33. Яворская С.Ф., Аваер Б.Н. Газохроматографический анализ природных и сточных вод. ЖАХ, 1977, т.32, вып. 10, с.2044-2079.

34. Alvares A., Schilling G., Levin W. et al. Studies on the induction of СО-binding pigments in liver microsomes. Biochem.Biophys. Res.Comm. 1967, v.29, p.521-526.

35. Alvares A., Schilling G., Kuntzman R. Alteration of the microsomal hemoprotein by 3-methylcholanthrene: effects of ethionine and actino mycin D. J. Pharmacol .Exp. The г. 1968, v. 163, p. 417-424.

36. Ames B.N., Mc Cann, J.I., Yamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the. Salmonella/mammalian - microsome mutagenicity test. Mutat.Res., 1975, v.31, p.347-364.

37. Ames B.N. Mutagens, carcinogens and anti-carcinogens. Genet. Toxicol'.: Agr.Proc.Symp.,,Davis, Calif. 1-5 Now. ,'1981, NY; London, 1982, p.499-5Q8.

38. Arnott M.S., Yamauchi Т., Johnston D.A. Aryl hydrocarbon hydroxylase in normal and cancer populations. "Carcinogens: Iden-tif.and Mech.Act. 31st Annw.Simp.Fundam.Cancer Res., 1978" New York, N.Y., 1979, p.145-156.

39. Arcos J., Argus M. Chemical induction of cancer. Structure basis and biological mechanisms. N.Y. 1974, v.2a.

40. Arkhipov G.N. Induction of cancer by 20-methylcholanthrene in different regions of the rat stomach. Cancer Res., 1970, v.30, p.2739-2743.

41. Autrup H. Carcinogen metabolism in human tissues and cells. Drug.Metab.Rev., 1982, v.13, p.603-646.

42. Baird W., Chern C., Diamond L. Formation of benzo (a)pyrene-cjlucuronic acid conjugates in hamster embryo cell cultures. Cancer Res., 1977, v.37, p.3190-3197.

43. Bartsch H. Predictive value of mutagenicity tests in chemical carcinogenesis. Mutat.Res., 1976, v.38, p.177-190.

44. Bartsch H., Mallaveille C. et al. Validation and comparative studies on 180 chemicals with S.typhimurium Strains and V79 Chinese hamster cells in the presence, of various metabolizing system. Mutat.Res., 1980, v.76, p.T-50.

45. Berezriey R., Macaulay L., Crane F. The purification and biochemical characterisation of bovine liver nuclear membrane. J. Biol.Chem., 1972, v.247 , p.5549-5561.

46. Bidleman К., Mannering G. Induction of drug metabolism. Y. Independent formation of cytochromes P-450 and P-450.J. in rats treated with phenobarbital and 3-methylchrolanthrene simultaneously. Mol.Pharmacol., 1970, v.6, p.679-691.

47. Borgen A., Darvey H., Castagnoli N. et al. Metabolic conversion of benzo(a)pyrene by Syrian hamster liver microsomes and binding of metabolites to deoxyribonucleic acid. Journ.Med.Chem., 1973, v.I6, N 5, p.502-506.

48. Boyland E., Sims P. Metabolism of polycyclic compounds. The metabolism of 7 ,12-dimethylbenz (й.) anthracene by rat-liver homo-genates. Bioch.J., 1965 , v.95, p.78(> 787.

49. Brunstrom A. , Ingelman M. Benzo (й-) pyrene metabolism by purified forms of rabbit liver microsomal cytochrome P/-450, cytochrome b^ and epoxide hydrase in reconstituted phospholipid vesicles. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1980, v.95, p.431-439.

50. Brusick D. Bacterial mutagenesis and its role in the identic fication of potential animal carcinogens. Carcinogens: Identif . and Mech.Act. 31st Annu.Symp.Fundam.Cancer Res., 1978, New York, N.Y., 1979, p.93-105.

51. Buhler D.R. , Unlti F., Thakker D.R. et al. Effect of a 6-fluo-rosubstituent on the metabolism and biological activity of benzo (a,) pyrene. Cancer Res., 1983, v.43, p.I54l-I549.

52. Buening M.K., Chang R.L., Huang M.T. Activation and inhibition of benzo(л)pyrene and aflatoxin B-j. in human liver microsomes by naturally acurring flavonoids. Cancer Res., 1981, v.41, p.67-72.

53. Buhler D., Unlu F., Thakker D. et al. Metabolism and tumorige-nicity of 7-,8-,9- and I0--f luorobenzo {a.) pyrenes. Cancer Res., 1982, v.42, N II, p.4779-4783.

54. Burke M.D. Cytochrome P-450: a pharmacological necessity or a biochemical curiosity. Biochem.Pharmacol., 1981, v.30, p.I8I-I87.

55. Cavalieri E. , Roth R., Grandjean C. et al. Carcinogenicity and metabolic profiles of 6 substituted benzo(a)pyrene derivatives on mouse skin. Chem.Biol.Interaction, 1978, v.22, p.53-67.

56. Chang R., Levin W., Wood A. et al. Tumorigenicity of the dias-tereomeric bay- region benzo(a)pyrene 9,10-diol-II,12-epoxides in new born mice. Cancer Res., 1981, v.41, p.916-918.

57. Chang R.L., Levin W., Wood A.W. et al. Tumorigenicity of Bay-Region Diol-Epoxides and other Benzo-Ring Derivatives of Diben-zo (a,h)pyrene and Dibenzo (В-Д)pyrene on Mouse Skin and in Now-born Mice. Cancer Res., 1982, v.42, p.25-29.

58. Chou M.W., Yang S., Sydor W., Yang Ch. Metabolism of 7,12-dimethylbenz (IX) anthracene and 7-hydroxymethy 1-12-methylbenz (&.) -anthracene by rat liver nuclei and microsomes. Cancer Res., 1981, v.41, p.1559-1564.

59. Cohen G.M. , Hans S.M., Moore B.P. , Bridges Y.W. Benzo(L)pyrene -3-yl hydrogen sulfhate, major ethyl acetate - extractable metabolite of benzo (П.) pyrene in human, hamster and rat lung cultures. В.Ph., 1976, v.25, p.2561-2570.

60. Conney A., Levin W., Wood A. et al. Biological activity of po-lycyclic hydrocarbon metabolites and bay-region theory. Toxicol.V

61. Proc. 7th Int.Congress Pharm., Paris, .1979, p.41-52.

62. Canney А. Induction of microsomal enzymes by foreign chemicals and carcinogenesis by polycyclic aromatic hydrocarbons: G.H.A. Clowes memorial lecture. Cancer Res., 1982, v.42, p.4875-4917.

63. Cooper C.S., Ral K. , Hewer A. et al. The metabolism and activation of polycyclic aromatic hydrocarbons in epithelial cell aggregates and fibroblasts prepared from rat mammary tissue-Carcinogenesis, 1982, v.3, N 2, p.203-210.

64. Chouroulinkow I., Gentil A., Grover P. et al. Tumour-initiating activities on mouse skin, of dihydrodiols derived from Benzo ('&) pyrene. Brit .J. Cancer, 1976, v.34, p.523-532.

65. Croy R., Selkirk J., Harvey R. Engel J., Gelboin H. Separation of ten benzo(a)pyrene phenoles by recycle highe pressure liquid chromatography and identification of four phenols as metabolites. Biochem.Pharmacol. , 1976, v.25, p.,227-230.

66. Dehnen W., Tomingas R., Roos J. A modified method for the assay of benzpyrene hydroxylase. Analyt.Biochem. , 1973, v.53, p.373-383.

67. Diamond L. — Metabolism of polycyclic hydrocarbons in mammalian cell cultures. Int.J.Cancer, 1971, v.8, N 3, p.451-462.

68. DePierre J. W. , Moron M.S., Johannesen K.A.M. , Ernster G. A reliable, sensitive and convenient radioactive assay for benzopy-rene monooxygenase. Anal.Biochemistry, 1975, v.63, p.470-484.

69. Digiovanni. Y. , Juchau M. Biotransformation and biactivaticn of 7,12-dimethylbenz (B-) anthracene. Drug Metab.Rev., 1980 , v. II, p.61-103.

70. Diner S. Electronic aspects of biochemical hydroxylation. In: Electronic Aspects of Biochemistry, N.Y.Acad.Press Inc., 1964, p.237-281.

71. Donald R. Buhler, Figen Uhlu, Dhiren R. Thakker, Thomas Y. et al. Metabolism and Tumorigenicity of 7-,8-,9- and IO-Fluoro-benzo(a)pyrenes. C.R., 1982, v.42, p.4779-4783.

72. Elshourhagy N., Guselian P. Separation, purification and characterisation of a novel form of hepatic cytochrome P-450 from rats treated with pregnelone-I6a-carbonitrile. J.Biol. Chem., 1980, v.255, p.I279-I285.

73. Estabrook R.W., Matsubara Т., Mason J.I., Werringleer J., Baron J. Molecular function of cytochrome P-450 during drug metabolism. Drug Metab.Dispos., 1973, v.I, p.98-110.

74. Estabrook R., Werringleer J., Capdevila J. et al. -The role of cytochrome P-450 and the microsomal electron trancport system: the oxidative metabolism of benzo (D/)pyrene. In: Polycyclic hydrocarbons and cancer, N.Y., 1978, p.285—19.

75. Flesher J. , Sydnor F. Possible role of 6-hydroxymethylbenzo-(£t) pyrene as a proximate carcinogen of benzo (L) pyrene and 6-methylbenzo(a)pyrene. Int.J.Cancer, 1973, v.II, p.433-437.

76. Flesher J., Harvey R., Sydnor F. Oncogenicity of K-region epoxides of benzo (й) pyrene and 7 ,12-dimethyl benz (D* (anthracene. Int.J.Cancer, 1976, v.18, p.351-353.

77. Fox M., Staley S. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in stmospheric particulate matter by high pressure luquid chromatography coupled with fluorescence techniques. Anal.Chem., 1976, v.48, N 7, p.992-998.

78. Frommer U., Ulrich V. Influence of inducers and inhibitirs on the hydroxylation pattern of n-hexane in rat liver microsomes. - F-EBS Lett., 1974, v.41, p.14-16.

79. Freudenthal Ralph I., Leber A. Philip, Emmerling Don, Clarke Rauline The use of high passure liquid chromatography to study chemically induced alterations in the pattern of benzo (&•) pyrene metabilism. Chem.-Biol.Interact., 1975, v.II, N 5, p.449-459.

80. Gairola C., Geass J. Mutagenicity of some fluoro derivatives of benzo (&) pyrene. Cancer Lett., 1980, v.II, p.51-56.

81. Gazukora E., Belvedere G., Robinson R. et al. The effect of epoxide hydratase. on benzo (.a) pyrene diolepoxide hydrolisis and binding to DNA and mixed-function oxidase proteins. Mol.Pharmacol., 1981, v.19, p.I53-I6I.

82. Gelboin H.V., Huberman E., Sachs Enzymatic hydroxylation of benzopyrene and its relationship to cytotoxicity. Proc.Nat.Acad. Sci., 1969, v.64, N 4, p.II88-II94.

83. Giger W., Blumer M. Polycyclic aromatic hydrocarbons in the environment: isolation and characterization by chromatography, visible, ultraviolet and mass spectromethy. Anal.Chem., 1974, v.46, N 12, p.I663-I67I.

84. Grover P., Sims P. Interaction of K-region epoxides of phen-anthrene and dibenzo (o.h) anthracene with DNA and histone. Biochem. Pharmacol., 1970., v. 19, p.2251-2259.

85. Grover P., Sims P. Epoxides as microsomal metabolites of polycyclic hydrocarbons. - FEBS Lett., 1971, v.16, p.76-80.

86. Grover P., Hewer, Sims Formation of K-region epoxides as microsomal metabolites of pyrene. and benzo (n.)pyrene. Bioch.Ph. , 1972, v.2l, p.2713-2726.

87. Guenthner Т., Hammock В., Vogel U. et al. Cytosolic and microsomal epoxide hydrolases are immunologically distinguishable from each other in the rat and mouse. J.Biol.Chem., 1981, v.256, N 7, p.3163-3166.

88. Hecht S., Loy M., Mazzaress R. et al. On the carcinogenicity of 5-methylchrysene: structure activity studies and metabolism. In: Polycyclic hydrocarbons and cancer, 1978, N.Y. , p.II8-I3I.

89. Heimann R., Rice R.H. Polycyclic aromatic hydrocarbons toxicity and induction of metabolism in cultivated esophageal and epidermal keratinocytes. Cancer Res., 1983, v.43, N 10, p.4856-4862.

90. Hethcote H.W. Mutational models of carcinogenesis. Environmental Health, A.Whittemable, 1977, p.172-182.

91. Hildenbrandt A., Leibman K., Estabrook K. Metyrapone interaction with hepatic microsomal cytochrome P-450 from rats treated with phenobarbital. - Biochem.Biophys.Res.Cimmun., 1969, v.37, p.477-485.

92. Hoffman D., Bendinell W., Wynder E„ Carcinogenicity of methyl-chrysenes;. Science, 1974, v.18, p.215-218.

93. Holder G. , Yagi H., Dansette P., Jerina D. et al. Effects of inducers and epoxide, hidrase on the metabolism of benzo(a)pyrene by liver microsomes and a reconstituted system. Analysis by HPLC. Proc.Natl.Acad.Sci., 1974, v.71, p.4356-4360.

94. Holder G.M., Yagi H. , Jerina D.M. Metabolism of benzo (IL) pyrene effect of substate concentration and 3-methylcholanthrene pre-treatment on hepatic metabolism by microsomes from rats: and mice. Arch.Bioch.Bioph. , 1975, v. 170., p.557-566.

95. Huberman E. , Sachs L. Cell-mediated mutagenesis of mammalian cells with chemical carcinogens. Inter.J.Cancer, 1974, v.13, p.326-333.

96. IARC monographs on the Evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. 1982, v.1-29, supplement 4.

97. Jerina D.M. , Daly J.W. Arene oxides. A new aspect of drug metabolism. Science )Wash.D.C.), 1974, v.185, p.573-582.

98. Jerina D., Lehr R. The bay-region theory: a quantum mechanism approach to aromatic hydrocarbon induced carcinogenicity. In: Microsomal and drug oxidation, Oxford, 1977, p.709-720.

99. Jernstrom В., Vadi H., Orrenius S. Formation in isolated rat liver microsomes and nuclei of benz (&■) pyrene metabolites that bind to DNA. Cancer Res., 1976, v.36, p.4I07-4II3.

100. Johnson E. Isolation and haracterisati en of a consititutive. form of rabbit liver cytochrome P-450. J.Biol.Chem., 1980, v.255, p.304-309.

101. Kamatoki Т., Kitada M., Shigematsu H. et al. The involvement of cytochrome P-448 and P-450 in NADH O-demetilation of p-nitroanisole in rat liver microsomes. Japan J.°harmacol.,1979, v.29, p.191—201.

102. Khan M. Induction of drug-metabolizing enzymes by insecticides. and other xenobiotics. Pharmac.Ther., 1980., v.II, p.43-107.

103. King H.W.S., Thompson M.H., Brookes P. The role of 9-hydro-xybenzо (й-) pyrene. in the microsome mediated binding of benzo(D*)-pyrene. to DNA. In.J.Cancer, 1976, v.18, p.,339-344.

104. Lacassogne A., Zajdela F., Buu-Hoi N.P., Chalver O. Activite cancerogene. elevee des: monodi—, et trimethylbenzo (O-) pyrenes. Int.J.Cancer, 1968, v.3, p.,238.

105. Lehr R., Yagi H., Thakker D. et al. The bay region theory of polycyclic aromatic hydrocarbon-induced carcinogenesis. In: "Carcinogenesis", 1978, v.3, N.Y., p.231-241.

106. Lesko S., Caspary W. , Lorentren R., Ts'o P.O.P. Formation of б-Oxobenzo(H)pyrene Radical in Rat Liver Homogenates from Carcinogenic Benzo (IL) pyrene. Biochemistry, 1975, v. 14,p.3978-3984.

107. Lu A., Jacobson M., Levin W., West S. et al. Reconstituted liver microsomal enzyme system that hydroxylates drugs, otheryy foreign compounds and endogenous substrates. Arch.Bioch. Biophys., 1972, v.153, p.294-297.

108. Lu A., Thomas P., Ryan 0., Jerina D., Levin W. Purification of human liver microsomal epoxide, hydrase Differences in the properties of the human and rat enzymes. J.Biol.Chem., 1979, v.254, p.5878-5881.

109. Lu A., West S. Multipliaty mammalian microsomal cytochromes P-450. Pharmacol.Rev., 1980, v.31, p.277-295.

110. Lubert R., Cardelia J., Prough. R. The metabolis activation of benzo (a.) pyrene and 9-hydroxybenzo (й.) pyrene by liver microsomal fraction. Int. J.Cancer, 1979, v.23, p.353-357.

111. Lubert R. , Connoly M. , Nebert D., Kouri R. Debenz (S»,h)anthracene-induced subcutaneous tumours in mice. Strain sensitivity and role of carcinogen metabolism. Carcinogenesis, 1983, v.4,1. N 5, p.513-517.

112. Macleod M.C., Cohen G.M., Selkirk. J.K. Metabolism and mac-romolecular binding of the. carcinogen benzo (ОЛ pyrene and its relatively inert isomer benzo(e)pyrene by hamster embryo cells. Cancer Res., 1979, v. 39, p. 3463-3470.

113. Macleod M.C., Levin W. , Conney A.H. et al. Metabolism of benzo (e)pyrene by rat liver microsomal enzymes. Carcinogenesis, 1980, v.I, p.165-173.

114. Marquardt H., Kuroki Т., Huberman E. , Selkirk J.K. et al. -Malignant transformation of cells derived from mouse prostate by epoxides and other derivatives of polycyclic hydrocarbons. Cancer Res., 1972, v.32, p.716-720.

115. Masuda R., Mikawa R., Tashira Y. et al. Purification and patial characterosation of hepatic microsomal cytochrome P-450 from phenobarbital and 3-methylchrolanthrene - treated rats. J.Biochem., 1979, v.8I, p.I383-I394.

116. Mayhew J.W., Lombardi P.E., Fawaz K. Increased oxidation of a chemical carcinogen, benzo (iL) pyrene , by colon tissue hiopsy specimens from patients with ulcerative colitis. Gastroenterology, 1983, v. 85, N 2, p.,328-334.

117. Mc Lann Y., Spingarn N., Kabory Y. et al. -Detection of carcinogens as mutagens. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1975, v.72,p.979-989.

118. Mc Cann Y. , Choi E., Yamasaki. E. et al. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonells/microsoma test: assayof 300 chemicals. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1975, v.72, p.5135-5139.

119. Miller J.A. Carcinogenesis by chemicals: An overview. Cancer Res., 1970, v.30, N 3, p.559-576.

120. Morgan R.W. , Choi. B.C.K. , Corey P.N. Mutagens, carcinogens and probability. "Vitro Toxicity Test.Environ.Agents.Curr. and Future Possibil.PtB.Proc.NATO Adv.Res.Inst., Monte Carlo, 23-28, Sept., 1979".New York; London, 1983, p.319-327.

121. Mochel R., Baird W., Dipple A. Metabolic activation of the carcinogen 7 ,12-dimethylbenzo (&-) anthracene for DNA binding. Biochem.Biophis.Nes.Comm., 1977, v.76, p.I092-I098.

122. Nagata C., Tagashira Y., Kadama M. et al. Effect of hydrogen peroxide, Fenton's reagent, and iron ions on the carcinogenicity of 3,4-benzopyrene. Gann, 1973, v.64, p.277-285.

123. Nagata C., Tagashira L., Kodama M. Metabolic activation of benzo (D/)pyrene: signification of the free radical. In: Chemical Carcinogenesis, N.Y., 1974, p.87-III.

124. Nebert D.W. , Gelboin H.V. Substrate inducible microsomal aryl hydrohylase in mammalian cell culture. I Assay and properties of induced enzyme. J.Biol.Chem., 1968, v.243, N 23, p.6250-6261.

125. Nebert D.W., Gelboin H.V. The in vivo and in vitro induction of aryl hydrocarbon hydroxylase, in mammalian cells of different species, tissues, strains, and developmental and hormonal states. Arch.Biochem.Biophys., 1969, v.134, p.76-89.

126. Nemoto N., Gelboin H.V. Assay and properties of glutathione—S—benzo (OL) pyrene—4, 5oxide transferase. Arch.Biochem.Bio-phys., 1975, v.170, p.736-742.

127. Nemoto N., Takayama S., Gelboin H.V. Enzymatic conversion of benzo (tt.)pyrene phenols., dihydrodiols and quinones to sulfate conjugates. B.Ph., 1977, v.26, p.I825-I83I.

128. Nemoto N., Takayama S., Gelboin H.V. Sulfate conjugationof benzo (0») pyrene metabolites, and derivates. Chem. Biol. Inter. , 1978, v.23, p.19-30.

129. Nemoto N., Hirakawa Т., Takayama S. Glucuronidation of benzo (CL) pyrene in hamster embryo cells. Chem.Biol.Inter., 1978, v.23, p.1-5.

130. Nilson 0., Tofigard R., Eng L. et al. Regioselectivity of pyrified forms of rabbit liver microsomal cytochrome P-450 in the metabolism of benzo (XU) pyrene, n-hexane , 7-ethoxyreso-rufin. Acta Pharmac., 1981, v.48, p.369-376.

131. Oesch F. Microsomal epoxide hydralase. Enzymatic basis of detoxication. v.II, Ed.W.Jackoly, 1980, p.277-290.

132. Oesch F. Drug detoxification epoxide hydrolase. Developmental pharmacology, 1983, p.81-105.

133. Oesch F. Mammalian epoxide hydrase: inducible enzymes catalyzing the inactivation of carcinogenic and cytotoxic metabolites derived from aromatic and olefinic compounds. Xenobio-tica, 1973, v. 3, p.305-340.

134. Oesch. F., Kaulish N., Jerina D. et al. Hepatic epoxide hydrase, structure activity relationship for substrates and inhibitors. Biochemistry, I.97I, v.10, p.4858-4866.

135. Oesch. F., Jerina D., Daly J. A radiometric assay for hepa3tic epoxide, hydrase activity with 7- H. styrene oxide. Bio-chem.Biophys.Acta, 19.71, v.227, p.685-691.

136. Oesch. F., Bentley P., Glatt H. Prevention of benzo(a)pyrene induced mutagenicity by homogenous epoxide hydratase. Int.

137. J.Cancer, 1976, v.18, p.448-452.

138. Oesch. F. , Golan M. Speci.fi.ty of mouse liver cytosolic epoxide hydrolase for K-region epoxides derived from polycyclic aromatic hydrocarbons. Cancer Lett., 1980, v.9, N 3, p.165-175.

139. Oesch F. , Tiinmi C. , Walker C. et al. Existence of multigle forms of microsomal epoxide hydrolases with radically different substrate specifities. Carcinogenesis, 1984, v.5, N I, p.7-9.

140. Park S., Person A., Coon M. et al. Monoclonal antibodies to rabbit liver cytochrome P-450 LM2. FEBS Lett., 1980, v.116, p.231-235.

141. Pelkonen 0., Vainio H. Spectral interactions of a series of chlorinated hydrocarbons with citochrome P-450 of liver microsomes from variously treated rats. FEBS Lett., 1975, v.51, p.II—14.

142. Pei-Lu Chiu, Peter P.Fu, Shen K.Yang Stereoselectivity of rat liver microsomal enzymes in the metabolism of 7-fluoro-benz (й-) anthracene and mutagenicity of metabolites. Cancer Res., 1984, v.44, N 2, p.562-570.

143. Phillips D. Fifty years of benzo (D>) pyrene. Nature (Lond) , 1983, v.303, p.468-472.

144. Prehn R.T. A clonal selection theory of chemical carcinogenesis. J.Nat.Cancer Inst., 1964, v.32, p.I-I7.

145. Proogh. R. , Partisi V., Okita R., Masters В., Jakobsson S. -Characteristics of benz (й.) pyrene metabolism by kidney, liver and lung microsomal fractions, from rodents and humans. Cancer Res., 19.79, v.39, p.II99-I206.

146. Rasmussen R., Wang I. Dependence, of specific metabolism of benzo (D>) pyrene on the inducer of hydroxylase activity. Cancer Res., 1974, v.34, p.2290-2295.

147. Rarrook C., Reberfroid M., Mercier M. Specific modification of the preperties of the N-hydroxylase. Arch.Toxicol. Suppl., 1978, v.I, p.291-294.

148. Rarrouk C., Mercier M., Reberfroid M. Induction, activation and inhibition of hamster and rat liver microsomal aryl-amide and arylamine N-hydroxylase. Cancer Res., 1980, v.40, p.3340-3546.

149. Robertson J.A., Nordenskjold M., Jernstrom B. The identification of bases in DNA involved in covalent binding of the reactive metabolite from 9-hydroxybenzo (0/) pyrene. Carcinogenesis, 1984, v.5, N 6, p.821-826.

150. Seidegard J., De Pierre J. Microsomal epoxide hydrolase. Biochem.Biophys.Acta, 1983, v.695, p.251-270.

151. Selkirk J., Shen K., Yang K., Gelhoin H. Analysis of benzo-(SL) pyrene metabolism in human liver and limphocytes and kinetic analysis of benzo (&•) pyrene in rat liver microsomes. Carcinogenesis, 1976, v.I, p.153-169.

152. Selkirk. J., Croy R. , Gelboin H. Berizo (ZL) pyrene metabolites: Efficient and rapid separation by high-pressure liquid chromatography. Science, 1.974, v.184, p.,169-171.

153. Selkirk. J., Croy R., Gelboin H. Isolation and characterisation of benzo (a.) pyrene-4,5-epoxide as. a metabolite of benzo-(CL)pyrene. Arch.Biochem.Biophys. , 1975, v.168, p.,322-326.

154. Sharma R., Gurto U., Farber E. et al. Effects of hepato-carcinogens and hepatocarcinogenesis on the activity of rat liver microsomal epoxide hydrolase. Cancer Res.,1981,v.41, N 9,p.33II-33I9

155. Shen K.Yanv, William V.Dower Metabolic pathways of 7,12-dimethylbenz (B') anthracene in hepatic microsomes. Proc.Nat. Acad.Sci.USA, 1975, v.72, N 7, p.2601-2605.

156. Sims P. The metabolisme of benzo (0>) pyrene by rat liver ho-mogenates. Biochem.Pharmacol., 1967, v.16, p.613-618.

157. Sims P. The metabolism of benzo (tu) pyrene by rat liver ho-mogenates. Biochem.Pharmacol., 1968, v.16, p.613-618.

158. Sims P. Qualitative and quantitative studies on the metabolism of a series of aromatic hydrocarbons by rat liver preparations. Biochem.Pharmacol., 1970, v.19, p.795-812.

159. Sims P. —Metabolic activation of chemical carcinogens. Br. Med.Bull., 1980, v.36, p.XI-18.

160. Sims P., Grover P. Epoxides: in polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism and carcinogenesis. Adv.Cancer Res., 1974, v.20, p.165-274.

161. Sims P., Grover P.L., Swaisland A., Pal K., Hewer A. Metabolic Activation of Benzo ( 0.) pyrene Proceeds by a Diol-Epoxi-de. Nature, 1974, v.252, p.326-328.

162. Stagiechy P., Oesch F., Bruder et al. Distribution of enzymes involwed in metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: among rat liver endomembranes and plasma membranes. Eur. J.Cell Biol., 1980, v.21, p.79-92.

163. Stevenson J., Van Haam E. Carcinogenicity of benz ((L) anthracene and benzo(a)phenanthrene derivatives. Am.Int.Ass.J., 1965, v.26, p.475-478.

164. Stewart H., Lorenz E. Morbid anatomy histopathology and histopathogenesis of forestomach carcinoma in mice fed carcinogenic hydrocarbons on oil emulsion. J.Nat.Cancer Inst., 1949, v.10, p.147.

165. Thakker D.R., Yagi H., Akagi H., Koreeda M. et al. Metabolism of benzo(Шpyrene VI Stereoselective metabolism of benzo (Q>)pyrene and benzo (ft.) pyrene 7,8-dihydrodiol to diol epoxides. Chem.Biol.Interact., 1977, v.16, p.281-300.

166. Thompson M., King H., Osborne M., Brookes P. Rat liver mic-rosome-mediated binding of benzo(a)pyrene metabolites to DNA. Int.J.Cancer, 1976, v. 17, p.,270-274.

167. Tomas. P., Lu A., West A. et al. Accessibility of cytochrome P-450 in microsomal membranes: inhibition by antibodies to cytochrome. P-450. Mol.Pharmacol., 1977, v.13, p.819-831.

168. Tomingas R., Voltmer G., Bednarik. R. Direct fluorometric analysis, of aromatic polycyclic hydrocarbons on thin layer chromatogrames. Sci.Tot.Environ., 1977, v.7, N 3, p.261-267.

169. Ts'o P., Caspary W. , Coehn В. et al. Basic mechanisms in polycyclic hydrocarbon carcinogenesis. In: Chemical carcinogenesis, 1974, N.Y., p„113-154.

170. Tumors of glandular stomach induced in rats by intromural injection of 20-methylcholanthrene. Hare W. , Stewart H., Bennett J., Lorenz L. Nat.Cancer Inst., 1952, v.12, N 5, p.I0I9-I057.

171. Ulrich V., Staudinger H. Hydroxilation and substrate binding of cyclohexane by liver microsome. FEBS symp., 1969, v.I6, p.261-265.

172. Ulrich V., Kreners P. Multiple forms of cytochrome P-450 in the microsomal monoxygenase system. Arch.Toxicol., 1977, v. 39 , p.41-50.

173. Vadi H., Moldens P., Capdevila J., Orrenihis S. The metabolism of Benzo (В*) pyrene in isolated rat liver cells. Cancer Res., 1975, v.35, N 8, p.2083-2091.

174. Van Cant fort J., De Graeve J., Gie.len J.E. Radioactive assay of aryl hydrocarbon hydroxylase. Improved method and biological importance. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1977, v. 79, p.505-512.

175. Watabe Т., Ishizuki Т., Jsole M. A 7-hydroxymethyl sulfate ester as an active metabolite of 7,12-dimethylbenz{Щanthracene. Science, 1982, v.215, p.403-404.

176. Watabe Т., Ishizura Т., Ozawa N. et al. Conjugation of 7-hydroxymethyl-12-methylbenz(a)anthracene with glutatione viaa sulphate ester in hepatic cytosol. Biochem.Pharmacol., 1982, v.31, p.2542-2544.

177. Wattenberg L.W., Leong J.L., Strand P.J. Benzpyrene hydroxylase activity in the gastro-intestinal tract. Cancer Res., 1962, v.22, p.II20-II25.

178. Wattenberg L.W., Leong J.L. Histochemical demonstration of reduced pyridine nucleotide dependent polycyclic hydrocarbon metabolizing system. J.Histochem.Cytochem., 1962, v.10, p.412-420.

179. Weisburger E. Metabolism and activation of chemical carcinogens. Moll.and Cell Biochem., 1980, v.37, p.95-104.

180. Wiebel F.J., Selkirk J., Gelboin H., Haugen D., Van der Hoeven T.A., Coon M. Position-specific oxygenation of benzo (D-) pyrene by different forms of purified cytochrome P-450 from rabbit liver. Proc.Natl.Acad.Sci., 1975, v.72, p.3917-3920.

181. Wiebel F., Waters H., Elliot S., Gelboin H. Effects of 7,8-benzoflavone on the duration of zoxozolamine paralysis and hexobarbital hyphosis in rats. Biochem.Pharmacol., 1976, v.25, p.1431-1432.

182. Wislocki P.G., Wood A.W., Chang R., Levin W. et al. High mutagenicity and toxicity of diol epoxide derived from benzo-(B,)pyrene. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1976, v.68, p.1006-1012.

183. Wood A.W., Chang R.L., Huang M.T. et al. Mutagenicity of benzo(e)pyrene and triphenylene tetrahydroepoxides and diol epoxides in bacterial and mammalian cells. Cancer Res., 1980, v.40, p.1985-1989.

184. Yagi H., Holder G.M., Dansette P. et al. Synthesis and spectral properties, of the isomeric hydroxybenzo (a.) pyrenes.

185. J.Org.Chem., 1976, v.41, p.977-985.

186. Yang S.K., Roller P., Gelboin H. Enzymatic mechanism of benzo (CU) pyrene conversion to phenols and diols and improved high-pressure liquid chromatographis; separation of benzo (IL) -parene derivatives. Biochem., 1977, v.16, p.3680-3687.

187. Yang S.K., Roller P.P., Fu P.P., Harvey R.G., Gelboin H.V. -Evidence for a 2,3-epoxide as an intermediate in the microsomal metabolism of benzo (&) pyrene to 3-hydroxybenzo (tl) pyrene. BBRC, 1977, v.77, N 4, p.II76-II82.