Взаимодействие цитохрома C и активных форм кислорода тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Переверзев, Михаил Олегович

• Переверзев, Михаил Олегович
• кандидат физико-математических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Переверзев, Михаил Олегович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Активные формы кислорода.

Действие АФК

Образование и превращения АФК. Участки образования АФК в митохондриях. Защита от активных форм кислорода. Ферменты.

Низкомолекулярные антиоксиданты. Эшелоны защиты от АФК.

Краткие выводы по разделу «активные формы кислорода».

Некоторые методы регистрации активных форм кислорода.

Регистрация супероксида. Регистрация Н202-Регистрация ОН" и10г

Измерение Н2О2 с помощью скополетина и пероксидазы хрена.

Цитохром

Структура цитохрома

Электрон-транспортная функция цитохрома Участие цитохромав апоптозе. Цитохроми активные формы кислорода.

Пероксидаза хрена.

Общая информация. Механизм катализируемых реакций. Характеристикаединений пероксидазы хрена. Взаимодействие пероксидазы хрена и цитохрома

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выделение митохондрий из сердца крыс.

Выделение субмитохондриальных частиц из митохондрий сердца быка.

Приготовление липосом.

Приготовление липосом со встроенной цитохромоксидазой. Измерение скорости восстановления цитохрома с супероксидом. Наблюдение реакции обратного транспорта электронов.

Измерение скорости образования Н2О2 митохондриями.

Измерение скорости образования О2 " субмитохондриальными частицами.

Измерение потенциала на мембране липосом.

Обработка результатов эксперимента.

Реактивы.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ.

Восстановление цитохрома с супероксидом в присутствии азолектиновых липосом.

Генерация потенциала на мембране протеолипосом с цитохромоксидазой при окислении цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.

Генерация Н2О2 митохондриями сердца крыс.

Генерация (V* субмитохондриальными частицами из митохондрий сердца быка.

Окисление цитохрома с перекисью водорода, катализируемое пероксидазой хрена.

Влияние цитохромов с на генерацию Н2О2 митохондриями.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Восстановление цитохрома с супероксидом в присутствии азолектиновых липосом.

Генерация потенциала на мембране протеолипосом с цитохромоксидазой при окислении цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.

Генерация Н2О2 митохондриями сердца крыс.

Генерация О2 * субмитохондриальными частицами из митохондрий сердца быка.

Влияние цитохромов с на генерацию Н2О2 митохондриями.

Окисление цитохрома с перекисью водорода, катализируемое пероксидазой хрена.

Влияние мутированных цитохромов с на генерацию Н2О2 митохондриями. выводы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие цитохрома C и активных форм кислорода»

Одним из наиболее эффективных путей запасания энергии аэробными организмами является путь, где в качестве конечного акцептора электронов служит кислород. Однако, кислород является источником токсичных молекул, называемых активными формами кислорода (АФК). К ним причисляют супероксид, перекись водорода, синглетный кислород и гидроксил-радикал. Основным источником активного кислорода в клетке принято считать клеточные органеллы- митохондрии [6]. АФК вызывают окислительные повреждения биомолекул, в том числе ДНК, что является причиной многих заболеваний [1,2,3]. Повышенное образование АФК в клетке запускает программу клеточной смерти (апоптоз) [4] и наоборот, индукция апоптоза ведёт к повышению образования АФК [5]. Считается, что действие АФК является причиной раковых заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, старения организма [2,26]. Все эти факты обуславливают актуальность и необходимость изучения механизмов генерации АФК и путей предотвращения и снижения токсичного действия АФК на клетки организма.

Цитохром с (цит с)- белок межмембранного пространства митохондрий, основной функцией которого является перенос электронов от убихинол-цитохром оксидоредуктазы (комплекс ПГ) на цитохромоксидазу (комплекс IV). Кроме того, цит с способен окислять супероксид с константой скорости реакции около 2-Ю6 M'V1. Долгое время реакция восстановления цит с супероксидом использовалась в качестве метода определения концентрации О2 [7]. В 1997 году Форман и Ацци предположили, что концентрация цит с в межмембранном пространстве так высока, что весь супероксид, образуемый митохондриальной дыхательной цепью и высвобождаемый в межмембранное пространство, должен быть окислен цитохромом с до О2 [8]. В работе В. Скулачева [17] цит с также рассмотрен в качестве эффективного перехватчика Ог"" в межмембранном пространстве митохондрий. Вообще, есть основания полагать, что цит с может является основным перехватчиком Ог " в межмембранном пространстве, если учесть, что супероксид дисмутаза (СОД) обнаруживается в межмембранном пространстве митохондрий лишь некоторых видов тканей и организмов [49,109]. По данным Дж. Формана и А. Ацци концентрация цит с в межмембранном пространстве колеблется в пределах 0.5-^5 мМ. Однако, несмотря на высокие концентрации цит с в межмембранном пространстве, генерируемый дыхательной цепью митохондрий супероксид успевает не только дисмутировать до Н2О2, но и проникнуть за пределы внешней митохондриальной мембраны, как показано, например, в работе Хана и соавторов [57]. В то же время, Ради и др. [82] было показано наличие прооксидантного действия цит с. Таким образом, в настоящее время нет чёткого понимания, какую именно роль играет цит с межмембранного пространства митохондрий в утилизации АФК, генерируемых митохондриями. Каким образом взаимодействует цит с, расположенный снаружи митохондрий (высвобожденный из межмембранного пространства в результате апоптоза) с АФК, генерируемыми митохондриями, также неизвестно.

Целью настоящей работы было определение роли цит с в системе антиоксидантной защиты митохондрий. Была поставлена задача исследовать характеристики взаимодействия цит с и АФК в межмембранном пространстве и снаружи митохондрий. Также было запланировано провести исследование новых мутированных типов цитохромов с (не вызывающих апоптоз) по способности воздействовать на генерируемые митохондриями АФК с целью установить связь между способностью цит с вызывать апоптоз и характеристиками его действия на АФК. Определение степени вовлечённости цит с в процессы утилизации АФК, генерируемых митохондриями, позволит лучше понять причины проявления токсичного действия АФК и пути предотвращения этого действия.

Для описания характеристик взаимодействия цит с и супероксида в мемжмембранном пространстве митохондрий мы выбрали модель азолектиновых липосом. Была поставлена задача ответить на два вопроса: способен ли цит с, связанный с липидной мембраной, окислять супероксид и происходит ли генерация потенциала на липидной мембране протеолипосом при окислении цитохромоксидазой этих протеолипосом цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.

В межмембранном пространстве митохондрий цит с может находиться в двух состояниях: связанном с внутренней мембраной и растворённом в воде межмембранного пространства. О2' является гидрофильным ионом, а гем цит с, сорбированного на мембране, обращен в сторону липидного бислоя [71], поэтому вероятно, что только растворённый в воде, но не связанный на мембране цит с, способен окислять супероксид. Нами было показано, что связанный на мембране цит с, в отличие от растворённого в воде, не способен окислять супероксид. Этот вывод является одним из результатов настоящей работы. Таким образом, становится ясно, что не только общая концентрация цит с в межмембранном пространстве, но и состояние цит с (связан на мембране или растворён в воде), должно определять его способность утилизировать генерируемый митохондриями супероксид.

Образуется ли в результате окисления митохондриальной цитохромоксидазой восстановленного супероксидом цитохрома с достаточный для поддержания синтеза АТФ трансмембранный потенциал или скорость электронного переноса в этом случае слишком мала, чтобы компенсировать утечку Н через внутреннюю митохондриальную мембрану? Такая утечка может быть вызвана самим Ог*" за счёт Ог*"/ НО2* антипорта [1], активации разобщающих белков [11] или повреждения мембранных липидов и белков [12]. К. Майлер в 1990 году экспериментально продемонстрировала синтез АТФ митохондриями сердца крыс, запускаемый добавкой ксантина и ксантиноксидазы [13]. Однако, некоторые факты из исследования Майлер не позволяли однозначно утверждать, что синтез АТФ осуществляется именно в результате переноса электронов от О2'" на цит с и последующего окисления цит с цитохромоксидазой с генерацией Поэтому для ответа на поставленный вопрос требовалось проведение дополнительных экспериментов. Проведённое нами в данной работе исследование с использованием простейшей модельной системы, а именно протеолипосом со встроенной цитохромоксидазой, показало, что система цит с и О2* может служить донором электронов для цитохромоксидазы и поддерживать генерацию ЛIV [14].

При исследованиях действия внемитохондриального цит с на генерируемые митохондриями АФК мы показали, что добавляемый к митохондриям цит с в субмикромолярных концентрациях ингибирует генерацию Н2О2, связанную реакцией обратного транспорта электронов [15]. Кроме того, нами было проведено изучение механизмов такой ингибирующей активности цит с на генерацию Н2О2 митохондриями сердца крысы.

В нашей работе исследование взаимосвязанности способностей цит с вызывать апоптоз и взаимодействовать с АФК проводилось на мутированных цит с, имеющих замены в аминокислотном составе. В ходе совместных исследований предполагалось определить среди синтезированных в группе Кирпичникова мутантов цит с, не активных при индукции апоптоза, те, которые обладают наиболее близкими к животному цитохрому с характеристиками по активации дыхания митопластов и ингибированию генерации Н2О2. С помощью замены гена цитохрома с на ген, кодирующий цитохром с, лишённый апоптотической активности, но сохранивший другие функции, можно сравнить вклады цит с-зависимых и независимых путей апоптоза.

В институте биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова группой Кирпичникова был синтезирован ряд мутантов цитохромов с из дрожжей и из сердца лошади, причём, мутанты цит с Др были лишены способности вызывать апоптоз. В лаборатории Скулачева были проведены исследования по определению активности этих цитохромов с в дыхательной цепи (на модели митопластов) и по подавлению генерации Н2О2 митохондриями сердца крысы [23]. Было показано, что мутации в аминокислотной последовательности цит с Л приводят к снижению активности этого белка по ингибированию генерации Н2О2 митохондриями, и напротив, мутации в составе цит с Др позволяют повысить его активность по ингибированию этой генерации [23].

Гпава I. Литературный обзор.

Активные Формы Кислорода. Действие АФК.

Активные формы кислорода и свободные радикалы вовлечены во многие патологические и физиологические процессы. К ним относятся клеточная сигнализация, пролиферация и дифференциация, повреждение структур ДНК, апоптоз, рак, повреждения от ишемии и реперфузии, воспаления, дегенеративные заболевания и старение [1,2,3]. Существуют корреляции между возникновением и развитием заболеваний и повышенными концентрациями О2' и Н2О2 в крови и других тканях [2]. По утверждению некоторых исследователей, интенсивность образования АФК растёт с возрастом организма и ассоциирована с нейрозаболеваниями (болезнь Альцгеймера, склерозы), ишемической болезнью сердца и диабетом [24]. В работах Приора [25] и Маеды и Акаике [3] указывается, что повышенную генерацию Ог" клетками вызывают промотеры канцерогенеза.

Стационарный уровень окислительных повреждений митохондриальной ДНК отрицательно коррелирует с максимально возможной для данного вида организмов продолжительностью жизни. Считается, что при старении под действием АФК происходит накопление мутаций митохондриальной ДНК, что ведёт к нарушению функционирования митохондрий и росту генерации ими АФК [26].

Повреждение клеток растений во время засухи и холода также частично вызвано действием АФК [27]. По данным Шена и соавторов под действием ОН* и Н2О2 существенно снижается активность SH- содержащих ферментов цикла Кальвина. В таких белках АФК способствуют образованию внутри- и межмолекулярных перекрёстных связываний, типа -S-S- связей, образуют разрывы белков и приводят к их инактивации [27].

Окисление радикалами кислорода кардиолипина- липида внутренней митохондриальной мембраны, на ранних стадиях апоптоза приводит к десорбции цитохрома с с поверхности этой мембраны. Номура и соавторы обнаружили, что цит с преимущественно связывается с кардиолипином, а не с гидропероксидом кардиолипина, образуемого под действием АФК [10].

АФК также являются активаторами поры, вызывающей переход митохондрии в состоянии пермеабилизации (111 111), открытие которой обуславливает высвобождение в цитозоль цитохрома с и запуск программы апоптоза [4].

Под действием кислородных радикалов мембраны приобретают неселективную проводимость для ионов [28].

Действие АФК на субмитохондриальные частицы выражается в сильном подавлении активности комплекса I. По данным Парадиеса и соавторов [29], этот эффект АФК объясняется окислением кардиолипина, который необходим для функционирования фермента.

Супероксид, по гипотезе Лиу [1], может функционировать в качестве протонофора на внутренней мембране митохондрий. По мнению Лиу кислая среда снаружи внутренней мембраны способствует поглощению протона молекулой Ог' с образованием пергидроксил-радикала НОг" (рКа 4,8). Предположительно НОг* по градиенту своей концентрации попадает в матрикс, где незамедлительно диссоциирует в условиях щелочной среды около внутренней поверхности внутренней мембраны (рН 8,0). Таким образом, протон оказывается в матриксе. В итоге, проводимость мембраны для протонов повышается. Выделившийся супероксид утилизируется супероксиддисмутазой матрикса с образованием перекиси водорода. После этого Н2О2 либо попадает в межмембранное пространство, либо утилизируется глутатион пероксидазой матрикса. В состоянии 4 митохондрий (потенциал на внутренней мембране достигает значений 180-200мВ [1,30]) генерация супероксида значительно возрастает, при этом должна повышаться и проводимость мембраны, что и происходило в экспериментах Лиу [1].

Токсичность активного кислорода используется в иммунном ответе. АФК синтезируются нейтрофилами и макрофагами для борьбы с бактериями. Кроме непосредственного повреждающего действия на клетки бактерий, ОН* активирует синтез лейкотоксина из линолеата нейтрофилами [31].

В обзоре И. А. Гамалея и др. [2] приведены данные о том, что Н2О2 и другие радикалы (NO* и Ог') могут служить в качестве вторичных передатчиков сигнала, а также посредников межклеточных взаимодействий. В концентрациях 0,1-50мкм Н2О2 активирует К+- каналы, дозозависимо усиливает окислительный взрыв нейтрофилов и макрофагов, опосредует хемотаксис гладкомышечных клеток к тромбоцитарному фактору роста, ускоряет выход органических анионов из макрофагов, участвует в биосинтезе тиреоидных гормонов, а также опосредует многие другие процессы. Предположительными мишенями сигнального воздействия АФК являются рецепторы с SH- группами, окисление которых и приводит к формированию сигнала. Такая модель приобретает большую достоверность, если учесть, что по данным Шена [27] именно SH- содержащие белки наиболее чувствительны к Ог * и ОН*.

Описана способность АФК активировать транскрипцию генов, по- видимому, за счёт разрывов ДНК [2].

В 1970х годах Харманом были сформулированы основы «митохондриальной свободнорадикальной теории старения», в которой основной причиной старения считался окислительный стресс, а митохондрии предполагались в качестве основного источника АФК (цит. по [24]). В настоящее время теория не подтверждена и не опровергнута. Лиу [32] приводит данные, что митохондрии производят до 95 % всего образуемого в организме Ог\ а утечка электронов на образование супероксида составляет 1-4 % от общего потока электронов в дыхательной цепи митохондрий [32,33]. Однако, Хансфорд и др. [34] утверждают, что в норме Н2О2 генерируется на неизмеримо низком уровне, а устоявшееся мнение об утечке в процессе дыхания 1- 4% электронного потока на супероксид не соответствует действительности и в физиологических условиях эта утечка на порядок ниже. На основе проведённых экспериментов Хансфорд и соавторы утверждают, что корреляция между объёмом генерации перекиси водорода и возрастом крыс не обнаружена. Сомнение в том, что АФК могут играть центральную роль в старении организма высказывают также Гамалей и др. [2]. Они приводят данные, что для необратимого повреждения клетки требуются концентрации перекиси водорода около 1мМ, а при её значениях в районе 250мкМ повреждения обратимы. Концентрации менее 50мкМ вообще не вызывают функциональных нарушений. Такую нечувствительность клетки к Н2О2 авторы объясняют наличием широко разветвлённой системы борьбы с АФК. В работах [2] и [8] утверждается, что до сих пор не обнаружено убедительных доказательств влияния АФК в процессе жизнедеятельности организмов ни на ДНК, ни на РНК.

Причиной окислительного стресса, по мнению Бекмана, следует считать не действие АФК, а нарушение балланса между образованием АФК и утилизацией АФК и продуктов окисления (рис.1) [6]. повоеждение активация ? защита предотвращение

Рис.1. Взаимодействие между образованием АФК, утилизацией А ФК и репарацией окислительных повреждений (из работы Бекмана [6]).

Образование и превращения АФК.

Одними из основных АФК являются супероксид-радикал (Ог*), перекись водорода (НгОг), гидроксил-радикал (ОН*) и синглетный кислород (*Ог). Пути образования и превращения АФК показаны на рис. 1.

Первичной формой активного кислорода принято считать супероксид Ог". Он образуется во всех клетках клеточными органеллами- митохондриями (рис.2, реакция 1). Нейтрофилы образуют Ог' для борьбы с патогенными клетками и бактериями («окислительный взрыв нейтрофилов»).

Время жизни супероксида- около 10"6 секунд [35,20]. Ог" быстро превращается в НгОг и синглетный кислород (рис. 1, реакции 3 и 3') в реакции спонтанной дисмутации:

Of + Of + 2Н+ —>Н202 + ]02

0>

Ов —з^ Н202—4-*- НО*

Рис.2. Пути образования А ФК.

Рис.2. Пути образованияАФК.

Реакция дисмутации Ог * катализируется ферментом супероксид дисмутазой, в этом случае не образуется синглетного кислорода [36].

Перекись водорода является наиболее стабильной молекулой среди АФК и способна проникать на расстояния, превышающие размеры клеток [25]. Токсичность Н2О2 в первую очередь определяется способностью превращаться в гидроксил-радикал и синглетный кислород в реакциях Фентона {2} и Хабер-Вайсса {3} при наличии атомов двухвалентного железа (рис.1, реакции 4, 4') [35,36]:

Fe2+ + Н202 Fe + + ОН + OK {2}

О2''+ Н202 ОН +Otf + '02 {3}.

Донорами электронов в реакции Фентона, кроме атомов Fe , могут служить атомы Си+ и Мп+. В работе [37] показано, что атомы Fe2+ и Fe3+ зачастую ассоциированы с анионными носителями (ДНК, мембраны, некоторые белки), вследствие чего гидроксил-радикал появляется рядом с ними.

Н2О2 легко проникает сквозь мембраны, преодолевает относительно большие расстояния, способна достигать важнейших участков клетки, оказывая на них разрушительное воздействие посредством реакций {2} и {3} [2,35]. В литературе имеются данные о том, что перекись водорода перемещается внутри клетки не только в свободном виде, но и в виде комплексов с различными соединениями, включая амино-и дикарбоновые кислоты, пептиды, основания нуклеиновых кислот, нуклеотиды. Предположительно, в этих случаях создаются связи типа водородных, причём не происходит деформации в структуре молекул- партнёров. Комплексы возникают быстро и легко, значительно увеличивают расстояние переноса Н2О2, повышая порог её разложения в сотни раз за счёт недоступности перекиси водорода в составе комплекса для утилизирующих её молекул, таких как каталаза, глутатион-пероксидаза и др, [38].

Время жизни перекиси водорода косвенно может повышать её предшественник-супероксид-радикал в высоких концентрациях. Он инактивирует каталазу и глутатион-пероксидазу, которые являются тушителями перекиси водорода [37].

Гидроксил радикал ОН" способен окислить любую биомолекулу, в том числе ДНК и считается наиболее токсичной формой активного кислорода. Однако, именно крайне высокая активность не позволяет ему проникать далеко от места появления: ОН" практически моментально вступает во взаимодействие с молекулами ближайшего окружения и перестаёт существовать. ОН* появляется в результате реакции Фентона [36].

Синглетный кислород. Для образования !Ог, необходимо обратить спин одного из неспаренных электронов в молекуле Ог [33]. Необходимая энергия может быть поставлена, например, молекулой сенсибилизатора, предварительно возбужденной светом. По данным Красновского и Кагана [39] !Ог образуется в результате взаимодействия с излучением молекул ретиналя. Ретиналь оказался эффективным генератором 'Ог. В пределах сетчатки *Ог может атаковать по меньшей мере четыре компонента фоторецепторной мембраны: фосфолипиды, ретиналь, а-токоферол и каротиноиды. Ненасыщенные жирные кислоты мембран синглетный кислород окисляет в реакции {4}:

02 + RH -+ROOH {Л}.

Преимущественно 'Ог взаимодействует с фосфолипидами, а-токоферолом, а также каротиноидами сетчатки- лютеином и зеаксантином.

Участки образования АФК в митохондриях.

Известно, что наиболее мощная генерация АФК наблюдается в состоянии 4 митохондрий, то есть при наличии субстрата дыхания (для генерации АФК необходим именно сукцинат) и отсутствии субстратов фосфорилирования. В этих условиях трансмембранный потенциал достигает значений свыше 180мВ, чего никогда не наблюдается в состоянии 3, то есть при наличии ещё и АДФ и Pj [30,34]. Генерация перекиси водорода в таком состоянии легко может быть снята добавлением АДФ и Р;, либо разобщителей, что ведёт к снижению за счёт запуска фосфорилирования или увеличения протонной проводимости мембраны соответственно. Ротенон, ингибитор восстановления убихинона комплексом I, снижает генерацию перекиси в состоянии 4 на 80%. Ингибитор же окисления семихинона цитохромом bi комплекса III антимицин А напротив, значительно повышает скорость генерации Н2О2 [2,30]. Стоит отметить, что «антимициновая» генерация Н2О2 нечувствительна к разобщителям [41]. Семихиноновый радикал в присутствии антимицина А накапливается быстрее, облегчая "паразитное" восстановление кислорода. Предотвращение образования семихинонового радикала путём ингибирования окисления убихинона C0QH2 железо-серным кластером комплекса 1П миксотиазолом действительно приводит к торможению перекисной генерации, что было продемонстрировано в работе Коршунова и др. [30].

Дж. Сан-Пиерре и др. в своей работе утверждают, что супероксид, генерируемый при окислении субстратов комплекса I, выделяется в матрикс, тогда как супероксид, образуемый при ингибировании комплекса Ш антимицином А, направляется в межмембранное пространство [116]. Второе утверждение основано на данных рентгеноструктурного анализа: центр о комплекса Ш, вблизи которого предположительно происходит окисление семихинона кислородом с образованием супероксида, ориентирован в сторону межмембранного пространства. Утверждение Дж. Сан-Пиерре о направленности Ог \ генерируемого в связи с комплексом I менее обосновано, так как неизвестны ни центры образования Ог * комплексом I, ни точное расположение относительно мембраны вообще каких-либо частей этого комплекса (что и отмечают сами авторы работы [116]).

Ш. Лиу [1] объясняет эффект повышенного синтеза АФК в состоянии 4 следующим образом. В данном состоянии трансмембранный потенциал достигает значений около 200мВ. Это приводит к приостановке окисления цитохрома biow цитохромом bhigh, из-за чего становится долгоживущим радикал семихинона, будучи неспособным отдать свой неспаренный электрон на комплекс III. Поэтому и возрастает вероятность его окисления непосредственно молекулой кислорода. В работе утверждается, что в состоянии 4 до 80% супероксида производится в связи с комплексом Ш и CoQH", а лишь 20% приходится на долю флавопротеина комплекса I. Это, однако, плохо согласуется с экспериментальными данными [30], где показано 80% торможение такого синтеза ротеноном.

В состоянии 4 наблюдается восстановление НАД4" до НАДН за счёт окисления убихинона. Данный процесс называется также обратным транспортом электронов на НАД+ Ротенон ингибирует обратный транспорт электрона по уже описанному выше механизму запрещения взаимодействия убихинона и комплекса I. Возможно сделать вывод о связи между обратным транспортом электронов от сукцината на НАД1" и генерацией супероксида. Точная связь между производством Ог * и процессами, ассоциированными с НАДН-убихинон оксидо- редуктазой неизвестна [42,43].

Необходимо отметить, что никакие субстраты комплекса I не могут вызвать столь же высокой скорости синтеза АФК, какая наблюдается при добавлении сукцината

41,42,44]. Видимо, это также объясняется связью обратного транспорта электронов и генерации супероксида. Однако, Кушнарёвой и соавторами показано, что при окислении субстратов комплекса I обеднение митохондрий по цитохрому с приводит к существенному росту скорости генерации Н2О2 такими митохондриями (но скорость и в этом случае ниже скорости генерации при окислении сукцината) [5].

Возможно, в генерации супероксида могут принимать участие все белковые компоненты: ФМН, Fe-S кластеры и убихинон [43]. Ещё в 1971г. Турман показал, что флавопротеид в составе микросомальных фракций производит перекись водорода [цит. по 41].

Утечка электронов на одноэлекгронное восстановление в дыхательной цепи оценивается в 1-4% от общего потока электронов при дыхании в митохондриях [1,33,43]. Конкретный центр формирования Ог' не был определён. В литературе имеются данные о том, что связанный радикал НАД1" также может служить источником супероксида [43].

Ингибирующее влияние на генерацию Ог" в связи с комплексом Ш и при обратном транспорте электронов от сукцината на НАД+ через комплекс I оказывает десорбция цитохрома с с внутренней митохондриальной мембраны. Она приводит к невозможности окисления C0QH2 (Fe-S) Ш кластером, что сходно с влиянием миксотиазола [5,17]. При окислении субстратов комплекса I десорбция цит с вызывает обратный эффект [5].

В принципе, супероксид в процессе окислительного фосфорилирования способны производить все аэробные клетки [25]. Митохондрии растений не являются исключением. Однако, по данным Э. Брайдота и др. [44] такая генерация объясняется несколько другими причинами, нежели в животных митохондриях. Отличие состояло в действии ингибиторов и разобщителей. Так ротенон совершенно не влиял на скорость синтеза перекиси водорода при окислении сукцината, которая, тем не менее, полностью ликвидировалась малонатом, ингибитором комплекса III Антимицин А снижал (вместо повышения в случае животных митохондрий) продукцию перекиси на 60-80% при окислении сукцината или глутамата и малата. Ни АДФ и Pi, ни разобщители не могли полностью ликвидировать генерацию Н2О2, обусловленную окислением глутамата и малата, тогда как сукцинатная- полностью снималась. Авторы предположили, что растительные митохондрии даже в состоянии 4 имеют величину протон- движущей силы ниже пороговой, необходимой для запуска процесса обратного переноса электрона от сукцината на НАД+ и интенсивной генерации АФК в связи с комплексом I. По их мнению при окислении сукцината синтез перекиси водорода митохондриями гороха происходил в основном на уровне убихинон- оксидазы [44]. Именно этим авторы объясняли отсутствие эффекта ротенона.

Защита от АФК.

В организме содержится ряд систем, позволяющих предотвращать воздействие АФК. В первую очередь, это молекулы, улавливающие и деактивирующие АФК. К ним относятся низкомолекулярные антиоксиданты и антиоксидантные ферменты, использующие молекулы АФК в качестве субстратов.

Ферменты.

В данном разделе перечилены некоторые из наиболее известных и изученных антиоксидантных ферментов.

Супероксид дисмутазы (СОД)- это белки молекулярной массой от 30 ООО до 40 ООО, катализирующие реакцию дисмутации супероксида до перекиси водорода [45,46]: 2 О' +2Н+ -»Н202 +02

Существуют двуядерные СОД, содержащие медь и цинк (CuZnCOfl) и одноядерные

СОД, с атомом железа, марганца или никеля в активном центре (РеСОД, МпСОД,

СОД). В составе Си2пС0Д активным металлом является медь, а цинк играет другую роль, возможно по стабилизации структуры белка. По чувствительности к цианиду

СОД делят на два класса: чувствительные (содержат медь и цинк) и нечувствительные содержат железо или марганец) [45]. БеСОД и МпСОД идентичны по аминокислотным последовательностям и структуре [47].

Фридович показал, что СОД присутствует у всех организмов, подверженных влиянию кислорода, а анаэробные организмы, не способные существовать в присутствии кислорода, её не содержат [45]. Клетки эукариотических организмов обладают двумя внутриклеточными типами СОД. До 90 % общей активности клеточной СОД приходится на СигпСОД [48], расположенную в цитозоле (где она составляет до 2 % от общего содержания белка [49]). Также Си2пСОД обнаруживается в ядре, лизосомах, пероксисомах, межмембранном пространстве митохондрий [49].

Марганцевая СОД содержится в митохондриальном матриксе. Считается, что именно митохондриальная фракция супероксид дисмутазы играет главную роль в защите от окислительного стресса, так как именно митохондрии представляются основным источником АФК [48].

В клетках бактерий и в матриксе митохондрий некоторых эукариотических организмов содержатся БеСОД и МпСОД. Бактерия E.coli обладает обоими типами фермента [45].

Принцип функционирования всех типов СОД одинаков и основан на попеременном восстановлении и реокислении металла в активном центре при последовательном взаимодействии с О2* .

Число оборотов СОД в стационаре для Mn-СОД человека (kcat) равна 104 с"1, а отношение к^/Км примерно равно 109 NT1 с"1 [114].

В результате ферментативной дисмутации Ог' при катализе СОД высвобождается кислород, но в малоактивном триплетном состоянии, тогда как неферментативная дисмутация приводит к появлению синглетного кислорода [36,114]. Таким образом, СОД предотвращает появление этого типа АФК.

Глутатион пероксидаза (ГП)- белок с молекулярной массой 76 ООО. В активном центре фермента содержится атом селена. В организме наибольшие количества I'll наблюдаются в печени и эритроцитах, средние- в сердце и лёгких, наименьшие- в мышцах. Внутри клетки ГП содержится в цитозоле, ядре, э н до плазматическом ретикулуме и матриксе митохондрий [50].

ГП специфична к донору водорода- глутатиону (GSH). В качестве конечного акцептора электронов в пероксидазной реакции, катализируемой ГП, могут служить молекулы от перекиси водорода до органических гидропероксидов. ГП катализирует реакцию:

R-OOH + 2GSH ЮН + GSSG + Н20. {6}

7 11

Константа скорости реакции равна 5-10' ЬГс1. В итоге реакции две окисленные молекулы глутатиона оказываются соединёнными в одну (GSSG) с помощью дисульфидного мостика.

Регенерацию запасов восстановленного глутатиона из его дисульфида осуществляет НАДФН зависимая GSSG редуктаза.

Катсшаза- железосодержащий белок массой около 240 ООО. Обнаружена почти во всех видах клеток всех аэробных организмов. Катал аза расположена в пероксисомах (в основном), цитозоле и митохондриальном матриксе (в небольшом количестве) [50]. Каталаза катализирует два типа реакций:

Н202 + Н202 2Н20 + 02 (каталазная) {7}

Н202 + АН2 —► 2Н20 + А (пероксидазная) {8}

Обе реакции проходят в два этапа:

1) Kam-Fe3+ + Н202 kl комплекс I {9}

2) комплекс I + Н202 —*■k2 mm-Fe3+ + 2Н20 + 02 {10} 2') комплекс I + АН2 —*■ks кат-Fe3^ + 2Н20 + А {11} константы скоростей перечисленных реакций: kl = 1,7*107М1с1; Л2 = 2,б*107 М'с1; кЗ = (0,2- 1)*10* М'с1.

Донорами Н+ в каталазной реакции могут служить, кроме перекиси водорода, алифатические спирты; активность каталазы значительно выше при окислении метанола и этанола, чем высших гомологов [33].

Низкомолекулярные антиоксиданты.

Мощными низкомолекулярными антиоксидантами являются а- токоферол (витамин Е) и Р-каротин [51,52], способствующие восстановлению липидных радикалов LOO* до LOOH, и предотвращающие образование радикалов типа L", которые замыкают циклический каскад окисления липидов. Кофермент QH2 также принимает участие в обрыве данного каскада. Каротиноиды (Р-каротин, зеаксантин, ликопин и лютеин) являются тушителями синглетного кислорода. Высокой антиоксидантной активностью обладают флавоноиды- растительные полифенольные соединения, присутствующие в пищевых продуктах растительного происхождения. Флавоноиды являются тушителями супероксида и липидных пероксидов [52].

Известны вещества, повышающие проводимость мембран, вызывая падение трансмембранного потенциала, что приводит к разобщению процессов дыхания и фосфорилирования. В статье С. Коршунова и др. [30] показано, что превышение порога потенциала в 180мВ (в состоянии 4 митохондрий), ведёт к запуску мощной генерации супероксидных радикалов. Скулачев в 1994 году [51] выдвинул гипотезу о существовании природных "мягких разобщителей", способных обратимо понижать уровень трансмембранного потенциала, предотвращая ситуацию превышения им порога генерации Н2О2. Кроме того, такие разобщители запускали бы механизм быстрого, несопряжённого с фосфорилированием дыхания, приводящего к снижению внутриклеточной концентрации кислорода с уменьшением вероятности его одноэлектронного восстановления от накопившихся в состоянии 4 активных переносчиков электрона [51]. В работе [42] показано, что жирные кислоты способны обратимо снижать трансмембранный потенциал по принципу разобщения. Предполагается, что данный механизм функционирует в условиях in vivo. Если принять верной гипотезу Лиу [1] о существовании "цикла активного кислорода", то сам супероксид является мягким разобщителем. Он должен был бы понижать скорость своей собственной генерации по типу обратной связи, снижая трансмембранный потенциал.

Эшелоны защиты от Активных Форм Кислорода.

Общую систему антиокислительной защиты можно описать следующей схемой:

1) Общая защита от повышенной концентрации Ог на клеточном уровне (наличие градиента рОг от капилляров к тканям, низкое рОг в клетках);

2) Поглощение Ог цитохромоксидазой дыхательной цепи митохондрий. С её помощью концентрация Ог поддерживается на безопасно низком уровне, когда процессы одноэлектронного восстановления кислорода лимитируются уровнем [Ог];

3) Мягкое разобщение дыхания и фосфорилирования на внутренней митохондриальной мембране, не допускающее превышения трансмембранным потенциалом порога активной генерации Ог * комплексами I и Ш;

4) Утилизация Ог * цитохромом с, регенерация Ог с возвращением электрона от Ог" в дыхательную цепь;

5) Перехват образуемого митохондриями супероксида антиоксидантными ферментами (СОД, каталаза, I'll) в матриксе и межмембранном пространстве;

6) 111111 позволяет митохондриям снизить внутриклеточную концентрацию кислорода при помощи быстрого разобщённого дыхания;

7) Тушение АФК а- токоферолом, аскорбиновой кислотой и другими низкомолекулярными антиоксидантами;

8) Глутатион пероксидаза использует в качестве субстрата липидные пероксиды, выбивая их из реакций каскадного окисления липидов;

9) АФК- вызванное открытие 111111 и запуск митоптоза, то есть очищение клетки от перепроизводящих АФК митохондрий;

10) Апоптоз- очистка ткани от опасных клеток.

Схема составлена на основе схем и данных, представленных в работах [17,15,33, 115].

Краткие выводы по разделу "активные формы кислорода".

Различные перечисленные эффекты, связанные с активными формами кислорода позволяют сделать вывод об их интенсивном участии в процессах жизнедеятельности клетки и организма в целом. При сбалансированном поддержании систем защиты АФК по-видимому не способны оказать значительное повреждающее воздействие. После ослабления защиты и контроля за синтезом кислородные радикалы создают токсическое давление на функции организма.

Некоторые методы регистрации АФК.

Существует значительное количество методов, позволяющих определять количество АФК в исследуемом растворе. В основе таких методов лежат окислительно-восстановительные реакции между АФК и молекулами- метками. При восстановлении или окислении такие молекулы меняют свои характеристики. Такими характеристиками обычно являются спектры флуоресценции, оптического поглощения или ЭПР. В случаях, когда заранее известно, что поглощаемый исследуемым образцом О2 расходуется только на генерацию АФК (например, в случае генерации Ог" при окислении ксантина ксантиноксидазой), оценить скорость генерации можно по поглощению кислорода, которое определяется с помощью кислородного электрода [53].

Регистрация О2".

Все используемые для определения супероксида методы проверяются на чувствительность к супероксид дисмутазе. Только чувствительная к СОД часть эффекта принимается за супероксид- обусловленную. Так как некоторые методы регистрации супероксида чувствительны также и к Н2О2, в среду измерения для предотвращения появления Н2О2 иногда добавляется каталаза [54,55].

Окисление эпинефрина до адренохрома.

В присутствии Ог"' эпинефрин (адреналин) окисляется до адренохрома. За процессом окисления наблюдают спектрофотометрически по увеличению поглощения при длине волны 480 нм. Для перевода скорости изменения оптической поглощения в скорость генерации

Ог"' используют коэффициент поглощения б48о= 4 мМ^см"1. (в некоторых работах встречается вариант работы при разности поглощений на длинах волн 485 и 575 нм с коэффициентом поглощения Де485-575= 2,96 мМ'см"1 [55]). Одна молекула супероксида окисляет одну молекулу эпинефрина. Адреналин используют в начальной концентрации 1 мМ [54]. Недостатком метода является аутоокисление эпинефрина до адренохрома, что может привести к значительным погрешностям в измерениях [7].

Люминесценция полиноидина.

Уникальным, но редко используемым методом регистрации супероксида является метод с использованием белка полиноидина.

Полиноидин выделяется из покровного слоя люминесцирующих анеллид. Это мембранный белок массой 500 кДа, имеющий высокую чувствительность к супероксиду, которая, однако, ниже, чем у супероксид дисмутазы (добавка СОД предотвращает взаимодействие полиноидина и Ог'). При взаимодействии с Ог* полиноидин проявляет люминесцентные свойства. Интенсивность люминесценции растёт пропорционально концентрации супероксида, что позволяет использовать этот белок для измерений, связанных с наблюдением за Ог'. Максимум излучаемого света приходится на 520 нм [56]. Авторы [56] успешно использовали описанный метод применительно к клеточным культурам макрофагов и нейтрофилов.

Метод с использованием полиноидина мало распространён. В первую очередь, из-за недоступности этого белка для широкого круга энтузиастов изучения генерации Ог*.

Окисление гидроэтидина до этидина.

Гидроэтидин окисляется супероксидом до этидина, что сопровождается ростом флуоресценции. Метод используется для регистрации генерации Ог* клетками. Так как гидроэтидин не окисляется Н2О2, метод оказывается достаточно специфичным к супероксиду. Флуоресценция возбуждается на длине волны 470 нм и измеряется на длине волны 590 нм [57].

Окисление дигидрофлуоресцеин диацетата (ДГФА).

Применительно к культуре клеток используется метод с окислением ДГФА. Регистрация изменений флуоресценции ДГФА под действием супероксида проводится методами флуоресцентной микроскопии [58].

Ещё один метод оценки генерации Ог' клетками- использование нитросинего тетразола. В его присутствии клетки, генерирующие Ог" окрашиваются в синий цвет [58]. Присутствие специальной редуктазы нитросинего тетразола в митохондриях, микро сомах и ядрах клеток во многих случаях не позволяет использовать этот метод

7].

Метод регистрации Ог* с использованием цитохрома с.

Одним из наиболее популярных методов регистрации Оз" является метод с использованием цитохрома с.

Цитохром с окисляет супероксид до кислорода в реакции: цит с3+ + О2' цит с2+ + О2.

Константа реакции равна lH-3-106 МV [7]. Реакция восстановления цитохрома с супероксидом ингибируется СОД.

Цитохром с- белок дыхательной цепи митохондрий и активно взаимодействует с комплексами Ш и IV этой цепи. Это является серьёзным недостатком метода, так как при измерениях процесс восстановления цит с от Ог * может быть полностью маскирован его взаимодействием с дыхательной цепью. В некоторых случаях решением проблемы является использование ацетилированного цитохрома с (а. цит с), который в значительной мере (но не полностью) теряет активность по отношению к цитохромредуктазе и оксидазе [7].

А. цит с получается в результате обработки нативного цит с уксусным ангидридом в определённых условиях. В результате такой процедуры оказываются ацетилированными остатки лизина и тирозина. Вариированием условий обработки можно добиться ацетилирования цит с по разному числу лизинов и тирозинов. Так Вада и Окунуки [59] описывали процедуру получения цит с, у которого маскировано от одного лизинового остатка до 18 остатков лизина и 4 остатков тирозина. Последний цитохром с был назван ими «22-ацетил-цитором с». Авторы отмечали, что при ацетилировании по 60 % лизинов оптические характеристики белка меняются незначительно, структура белка также не изменяется. Однако, у 22-ацетил-цитохрома с поглощение в области а-полосы падает, а структура в районе гема существенно меняется [59]. По-видимому, именно этот факт обуславливает использование цит с, который ацетилирован только по 60 % остатков лизина, а не по всем.

Цит с, у которого 60 % лизиновых остатков ацетилировано (а.цит с), сохраняет способность окислять супероксид, хотя и с несколько меньшей скоростью [7]. По данным Ацци [7] а.цит с в 30 раз медленнее нативного цит с восстанавливается сукцинат- цитохромредукгазой и в 20 раз медленнее окисляется цитохромоксидазой митохондрий. То есть а.цит с всё же сохраняет электрон-транспортную активность в дыхательной цепи, которая составляет 3-5 % от активности нативного цит с. Так как на генерацию супероксида дыхательной цепью митохондрий идёт не более 1-4 % от общего числа электронов, переносимых на кислород [33], то и этой активности а.цит с может хватить для внесения существенных искажений при измерении скорости генерации супероксида (см. главу «Результаты»),

Использование метода ЭПР.

При использовании ЭПР для регистрации генерации супероксида сохраняется основная идеология всех методов регистрации АФК: окислительно- восстановительная реакция с участием АФК.

Так например, метка ДМПО (5,5'- диметил-1 -пирролин-А^-оксид) окисляется супероксидом, что приводит к появлению спектра ЭПР [57].

Методы регистрации Н2О2.

Методы с использованием пероксидазы хрена.

Для измерения генерации Н2О2 наибольшее распространение получили методы с использованием пероксидазы хрена, катализирующей окисление различных доноров электронов перекисью водорода.

Так в работе [60] в качестве донора использовалась 7г-гидрофенилацетиловая кислота (гг-ГФАК). Окисленная форма гг-ГФАК проявляет флуоресцентные свойства.

По росту флуоресценции можно наблюдать за генерацией Н2О2. Флуоресценция возбуждается при длине волны 317 нм и измеряется при длине волны 414 нм. Метод используют применительно к исследованиям на митохондриях.

Часто используемым в последнее время донорами для пероксидазы хрена в пероксидазной реакции являются Амплекс красный (Amplex red, длина волны возбуждения- 560 нм, длина волны регистрации флуоресценции- 590 нм) и гомовалиновая кислота (длина волны возбуждения- 560 нм, длина волны регистрации флуоресценции- 590 нм). При их окислении также наблюдается рост флуоресценции. Оба метода применяется при исследованиях на митохондриях [61,62]. Амплекс красный используется в концентрациях около 2-5 мкМ [61], а гомовалиновая кислота в концентрации около 100 мкМ [62].

При окислении тетраметилбензидина наблюдается падение разности между оптическими поглощениями на длинах волн 465 и 575 нм [62].

Метод с использованием скополетина будет описан подробно в последующем разделе.

В перечисленных методах концентрация ПХ колеблется в пределах от 1 ед/мл [61] до 10 ед/мл [62].

Цитохром с пероксидаза.

В 70х годах некоторыми авторами использовался метод определения Н2О2 по образованию комплекса цитохром с пероксидазы с перекисью водорода. При взаимодействии цитохром с пероксидазы с перекисью водорода образуется фермент-субстратный комплекс с максимумом поглощения при длине волны 419 нм (свободный фермент имеет максимум поглощения при длине волны 407 нм). Комплекс устойчив в отсутствии субстрата- цитохрома с. Формирование комплекса наблюдают по изменению разности оптических поглощений на длинах волн 423 и 404 нм. Константа диссоциации комплекса- 10 нМ. Минимальная доступная для измерения скорость генерации Н2О2- 100 нМ/мин. Метод применялся при исследованиях на микросомах, цитозоле, митохондриях и клетках из различных организмов. Метод высокоспецифичен к Н2О2, но также крайне чувствителен к наличию цит с. В его присутствии комплекс фермента с Н2О2 быстро распадается. В принципе, можно наблюдать и за окислением цитохрома с, если в исследуемом образце нет цитохромредуктазы или оксидазы [33].

Комплекс каталазы и Н2Ог.

С цитохром с пероксидазным методом сходен метод по определению стационарной концентрации соединения I каталазы- промежуточного комплекса каталазы и перекиси водорода [33]. Концентрация соединения I определяется спекрофотометрически. Метод высокоспецифичен и высокочувствителен к Н2О2 и позволяет фиксировать быстрые изменения генерации Н2О2. Каталазный метод использовали при исследованиях на бактериях и в интактных системах целых органов (лёгкие, печень).

Методы регистрации ОН* и 102.

Сложность регистрации 'СЬ и ОН* заключается в высокой реакционной способности этих соединений. Синглетное состояние кислорода в воде распадается до триплетного с временем полураспада 2 мкс [33]. Ловушками синглетного кислорода являются каротиноиды [63] и производные фурана [33]. При распаде синглетного состояния до триплетного проявляется фотоэмиссия на длинах волн 634, 703, 1070 и 1269 нм.

Появление гидроксил-радикала в среде можно наблюдать по его реакции с дезоксирибозой. Дезоксирибоза- гидрофильная молекула. При взаимодействии с ОН* она образует продукт, который при нагревании с тиобарбитуровой кислотой образует соединение, обладающее пиком поглощения при длине волны 532 нм. Константа реакции второго порядка взаимодействия дезоксирибозы и ОН* равна 3*109 NTV1. Распад дезоксирибозы ингибируется маннитолом, фенилаланином, салицилатом, аргинином и Hepes, которые реагируют с ОН* с более высокими скоростями [64].

Гидроксил-радикалы можно регистрировать, наблюдая за окислением метки DMPO, сопровождающееся появлением сигнала ЭПР.

Метод измерения Н2О2 с использованием скополетина и пероксидазы хрена.

Скополетин (6-метокси-7-гидрокси-1,2-бензопирон)- молекула из семейства кумаринов (рис.3).

Рис.3. Скополетин.

Впервые метод измерения скорости генерации Н2О2 с помощью пероксидазы хрена и скополетина был описан в 1955 году в статье Андреа [65]. В 1961 году он был повторно описан Першке и Бродом [66]. В обеих работах было показано, что окисление скополетина перекисью водорода происходит со стехиометрией 1:1. Чувствительность метода была оценена Першке и Бродом в Ю"10 моль Н2О2. В экспериментах Першке и Брода скополетин не окислялся отдельно ни Н2О2, ни пероксидазой хрена. Авторами работ [65] и [66] был сделан вывод о целесообразности использования скополетина в качестве удобного флуоресцентного субстрата для ПХ при исследованиях процессов с выделением Н2О2. Однако, уже в этих первых статьях отмечался главный недостаток метода, связанный с неспецифичностью ПХ к разным субстратам. Окисление скополетина пероксидазой хрена конкурентно ингибируется некоторыми восстановителями. Ими могут быть аскорбиновая кислота, глутатион и ионы магния [65]. Для предотвращения их влияния предлагалось перед началом измерений проводить обработку исследуемого раствора перекисью водорода в присутствии ПХ. По мнению Андреа [65], это позволило бы истощить резервы конкурентных скополетину восстановителей и повысить точность измерений.

В дальнейшем скополетин-пероксидазный метод часто использовался при измерениях генерации Н2О2 различными системами (в том числе митохондриями), став наиболее применяемым методом.

Исследование кинетических характеристик реакции окисления скополетина перекисью водорода, катализируемой пероксидазой хрена было проведено Боверисом и соавторами [67]. Для реакций

ПХ + Н202 Ki ПХ- Н202 (соединение II) {12}

Соединение II + SH2 ->К4ПХ+ 2Н20 + S {13} где SH2 и S- восстановленная и окисленная формы скополетина) ими была определена константа К4. Она оказалась равна (0,7-^3) 105 M'V1 [67].

Н2О2 может быть окислена в результате различных реакций. Для более эффективного связывания Н2О2 именно пероксидазой хрена Боверис и соавторы [67] предположили, что для повышения эффективности необходимо иметь большое количество свободного фермента. То есть должно выполняться соотношение: к4 е [АН2] » d[H202] / dt, где е- концентрация свободного фермента.

Сравнение методов с использованием скополетина и пероксидазы хрена и с использованием цитохром с пероксидазы, проведённое Боверисом и соавторами, показало, что в разных условиях эффективность первого составляет 3- 53 % от эффективности второго. Это означает, при использовании скополетин-пероксидазного метода значительно недооценивается количество генерируемой исследуемой системой Н2Ог. Это связывалось авторами с неспецифичностью фермента пероксидазы хрена к субстрату окисления. Применение метода с использованием скополетина и пероксидазы хрена оправдывалось авторами по причине его простоты по сравнению с иными методами.

Цитохром с.

Структура цитохрома с.

Предположительно, цитохром с появился около 1,4-1,8млрд лет назад на заре зарождения жизни. Цит с выполняет функцию переноса электронов в дыхательных цепях многих организмов- от бактерий до млекопитающих и птиц. При этом различия по аминокилотному составу между белками из разных организмов достигают 40-45 % (например, между цитохромом животных и дрожжей) [20].

Масса белка составляет примерно 12400, в состав входит около 100 аминокислотных остатков (цитохром с сердца лошади- 104, дрожжей- 113). Окислительно- восстановительный потенциал по водородной шкале составляет +0,25-Ю,27 В (в этих пределах потенциалы цитохрома с сердца лошади и дрожжей совпадают).

Цит с представляет собой глобулу с гемом, содержащим атом железа. Железо может находиться в состояниях Fe2+ или Fe3+. Аминокислоты около гема, а также остатки, образующие "карман" вокруг гема, являются высококонсервативными и сохраняются у цитохромов с большинства организмов. Неполярные гидрофобные группы упакованы внутрь белка, снаружи расположены кислые или основные группы, что обуславливает общую гидрофильность белка [20]. Во всех типах цитохромов с всех организмов гем стабилизируется остатками цистеинов 13 и 14 и гисгидина 18 (в нумерации цитохрома с лошади) [70].

В состав цитохрома с входят 19 лизиновых остатков. Они образуют два заряженных кластера, между которыми находится отрицательно заряженный кластер. Восемь лизинов образуют положительно заряженное кольцо вокруг гемового канала с гидрофобными группами внутри (тирозин и фенилаланин). Кольцо лизинов обеспечивает электростатическое взаимодействие со связывающим белком [68].

Коппенол и Марголиаш [20] и Ридер [68] единодушны во мнении о совпадении доменов в составе цитохрома с, осуществляющих взаимодействие с цитохромредуктазой и цитохромоксидазой. Авторы [20] определяют домен связывания с редуктазой как состоящий из лизиновых остатков 13, 72, 86, 27, 87, а с оксидазой- из лизинов 13, 72, 86, 27. В статье [68] состав этого домена представлен состоящим из несколько большего числа лизинов.

По мнению Коппенола и Марголиаша перенос электрона осуществляется через выставленный наружу порфириновый гем. Так как домены взаимодействия с редуктазой и оксидазой совпадают, то цитохром с должен либо перемещаться в пространстве, либо, оставаясь на одном месте, поворачиваться от одного партнёра по взаимодействию к другому [20]

Лаппалайнен и соавторы показали, что за связывание с цит с в составе цитохромоксидазы отвечают аминокислотные остатки: глутамин 148, глутамат 154, аспартат 206, аспартат 221, глутамат 246, то есть отрицательно заряженные остатки. Мутации по ним в опытах Лаппалайнена и соавторов приводили к 35-85% снижению скорости окисления цитохрома с, а замены по трём последним из перечисленных остатков вели к 95% её спаду [69]. Интересно, что исследователям удалось повысить эффективность окисления цитохрома с СиА доменом цитохромоксидазы, устранив мутацией положительный заряд лизина 219 на этом домене. Это подтверждает электростатическую природу взаимодействия оксидазы с цитохромом с [69].

По данным Горбенко [71], у нативного свободного белка гем расположен в центре структуры на расстоянии 1,5нм от поверхности заряженного участка. В экспериментах с липидными бислоями Горбенко было показано, что при связывании цит с развёрнут заряженным участком гемовой щели в сторону бислоя. Проникновение внутрь бислоя при этом достигало 0,8- 4,3нм (считая от нижней заряженной поверхности цитохрома с до внешней стороны бислоя). Горбенко считает, что в результате взаимодействия и встраивания в липид белок претерпевает конформационное изменение типа расплавления. Структурные изменения в цит с при связывании с фосфолипидными мембранами такие же, как и при связывании с цитохромоксидазой митохондрий [71,72]. Связывание цит с на липосомах обусловлено электростатическими и, возможно, водородными связями [71]. Сорбция цит с на митохондриальных мембранах по данным Матлиба (цит. по Лемешко [73]) также в основном обусловлена электростатическим взаимодействием. В модели Лемешко [73] центры связывания цит с на внутренней мембране митохондрий образованы из отрицательно заряженных фосфолипидов. Лемешко считает, что каждый центр состоит из четырёх отрицательных зарядов, два из которых принадлежат кардиолипину, а два других- фосфолипидам с одним отрицательным зарядом (например, фосфатидилсерин).

Электронтранспортная функция цитохрома с.

Белок расположен на или около внешней поверхности мембраны (внутренняя мембрана митохондрий или плазматическая мембрана бактерий), на которой расположены компоненты дыхательной цепи.

Цит с митохондрий является переносчиком электронов от убихинон-цитохром с оксидо- редуктазы (комплекс Ш) на цитохромоксидазу (комплекс IV) дыхательной цепи. Десорбция цит с с поверхности мембраны приводит к остановке дыхания, то есть переноса электронов. На поверхности внутренней митохондриальной мембраны цит с в основном ассоциирован с кардиолипином (КЛ), специфичным для митохондрий липидом. КЛ расположен только во внутренней мембране митохондрий [10].

По данным Формана и Ацци, концентрация цит с в межмебранном пространстве митохондрий составляет от 0,5 до 5мМ [8]. Кортезе и соавторы установили, что в физиологических условиях большая часть резерва цит с (до 90 %) растворена в межмембранном пространстве, а концентрация растворённого цит с составляет 0,7 мМ [74]. Бернарди и Аццоне утверждают, что соотношение ассоциированного с внутренней мембраной и растворённого в межмембранном пространстве цит с непостоянно и может меняться под действием различных факторов [9].

Бернарди и Аццоне представили экспериментальные доказательства в пользу того, что цит с может функционировать в качестве переносчика электронов между внешней и внутренней митохондриальными мембранами при окислении внемитохондриального НАДН [9]. Авторы утверждают, что даже экзогенный цит с способен переносить электроны от экзогенного НАДН на цитохромоксидазу. Такие данные согласуются с гипотезой Марцулли и соавторов [75], что внемитохондриальный цит с может быть окислен цитохромоксидазой интактных митохондрий с неповреждённой внешней мембраной, однако, данные Лемешко противоречат такому предположению [73].

Участие цитохрома с в апоптозе.

В 1996 году было сообщено об идентичности белка дыхательной цепи и белка, запускающего программу клеточной смерти- апоптоз. Идентичными по составу аминокислот и структуре оказались цит с и Apaf- 2 (апоптотический фактор, активирующий протеазы) [16]. Как показано в работе [72], цит с вызывает апоптоз вне зависимости от того, как он попал в цитозоль: высвободился из митохондрий или был впрыснут искусственно. При появлении цит с в цитозоле реализуется следующая цепь событий: цит с активирует Apaf-1, происходит активация каспазы-9, а она, в свою очередь, приводит к активации каспазы-3 [77]. Таким образом, запускается каскад реакций, которые приводят к смерти клетки через апоптоз. При запуске апоптоза существует эффект положительной обратной связи: цит с активирует каспазы, которые, в свою очередь, приводят к выходу новой порции цитохрома [78]. Выброс цитохрома с из митохондрий ингибируется белком Вс1-2 [76,77,78], причём, этот белок способен замедлять прохождение апоптоза даже тогда, когда цит с уже оказался в цитозоле [78].

Процесс апоптоза идентифицируется исследователями по конденсации хроматина и цитозоля, фрагментированию ДНК, разрушению цитоплазматической мембраны. Образующиеся апоптотические тельца фагоцитируются соседними клетками [16].

Для запуска апоптоза цитохрому с необходимо покинуть пределы митохондрии и попасть в цитозоль. Существует несколько гипотез, объясняющих, каким образом происходит это событие.

Первая связывает этот эффект с наличием 111111, состоящей из нескольких белков внешней и внутренней митохондриальной мембраны [17,77]. При её открытии исчезает осмотическая разница между матриксом и цитозолем, рассеивается трансмембранный потенциал. Начинается набухание матрикса, происходит разрыв внешней мембраны. В результате этого цит с попадает в цитозоль [17,77]. Состав и функции 111111 ещё недостаточно хорошо изучены. Однако известно, что она собирается из транслоказы аденин-нуклеотидов (внутренняя митохондриальная мембрана), циклофилина-Д и потенциал-зависимого анионного канала (на внешней мембране). Активация ППП происходит либо за счёт повышения внутримитохондриальной концентрации Са2+ (более ЮмкМ) при одновременном истощении по АДФ и Pi, либо при повышенной генерации Н2О2 и Ог * митохондриями [4,17].

Вторая гипотеза исходит из предположения о наличии специальной поры во внешней мембране митохондрий, которая могла бы выпустить цит с наружу. На роль образователя такой поры претендует проапоптотический белок Вах из семейства Вс1-2. Он способен образовывать каналы достаточно большой проницаемости. Экспрессия его в дрожжах приводит к клеточной смерти, за счёт индукции высвобождения цитохрома с [77]. Однако, как отмечает Кромптон [4], мутированный Вах, не имеющий порообразующего домена, ещё более эффективен в отношении высвобождения цит с.

Согласно третьей гипотезе существует механизм высвобождения цит с, объясняемый набуханием митохондрий и разрывом внешней мембраны, но без диссипации трансмембранного потенциала, связанной с 111111. Поддержка фосфорилирования, несмотря на разрыв внешней мембраны, происходит за счёт того, что часть цит с всё же осталась связанной на внутренней митохондриальной мембране [18,77].

Описанные предположения о механизмах высвобождения цит с не опровергают друг друга, а описывают разные пути, активируемые разными сигналами. Выход цит с может быть опосредован воздействием нескольких факторов, одним из которых является усиление образования АФК [10]. Как уже было отмечено выше, АФК активируют 111111, что приводит к выходу цит с. Десорбция цит с с поверхности внутренней митохондриальной мембраны, по данным Номуры и соавторов [10], вызывается окислением кардиолипина до гидропероксида под действием АФК. Номура и соавторы установили, что цит с не способен связываться с гидропероксидом KJI, а связанный с KJI цит с десорбируется при окислении KJI до гидропероксида. Окисление KJI кислородными радикалами до гидропероксида происходило в экспериментах Номуры и соавторов раньше выхода цит с из митохондрий. В работе [10] показано, что окисление KJI приводит также к открытию 111111, что способствует выходу цит с в цитозоль и запуску апоптоза.

Шонхофф и соавторы [79] установили, что перед выходом цит с из митохондрий в цитозоль происходит нитрозилирование этого белка по атому железа. Ингибирование нитрозилирования цит с в экспериментах Шонхоффа и соавторов приводило к снижению процента апоптоза. Предполагается, что нитрозилирование происходит, когда цит с ещё связан с внутренней митохондриальной мембраной.

Интересные данные имеются в литературе о специфических видах цитохромов с-цитохромах с, содержащих цинк или медь вместо железа. Авторы [18] сообщают, что эти цитохромы совершенно лишены окислительно- восстановительной активности. Но и при этом они вызывали апоптоз при инъецировании в клетки, правда, с 50ти процентной эффективностью.

Цитохром с и активные формы кислорода.

Цит с с атомом трёхвалентного железа в составе гема способен окислять супероксид с константой реакции к = 2,4- 10б M'V1 (при рН 7,0). Перекись водорода, напротив, сама окисляет цит с. Реакции между цит с, Н2О2 и Ог* описываются уравнениями {14} и {15} [17]: цит с3+ + 02 * —► цит с2+ + 02 {14}

2 цит с2+ + Н202 + 2Н* —» 2 цит с3+ + 2Н20 {15}

Реакция {14} используется для измерения скоростей генерации Ог* (см. раздел «Некоторые методы регистрации АФК»), Цит с обладает характерными линиями поглощения в видимом спектре: по появлению линии 550нм в спектре белка (см. рис. 4) можно судить о его восстановлении. т -140 х и т 120

S а 100

1 80 60 о 40 х я

I 20 п

2 о

Д -восст

А " - OKI 1СЛ н 1 i \ f * / / \ 1 I

250 300 350 400 450 500 длина волны, нм

550

600

Рис. 4. Спектры восстановленного и окисленного цитохрома с из сердца лошади по данным Марголиаша [80].

В присутствии Н2О2 цит с (и вообще все цитохромы с-типа) катализируют окисление субстратов в пероксидазной реакции. Перекись водорода связывается с атомом железа и расщепляется, в результате чего образуется промежуточное соединение, способное катализировать пероксидазную реакцию [81]. Однако, для образования комплекса цит с и Н2О2 необходимо, чтобы железо в составе тема находилось в 5-координированном состоянии (стабилизировалось пятью связями). Для этого белок должен быть частично денатурирован и обладать развёрнутой структурой. В нативном же состоянии железо является 6-координированным и цит с не катализирует пероксидазную реакцию [81]. Тем не менее, результаты своих экспериментов, в которых цитохром с в присутствии Н2О2 вызывал перекисное окисление липидов, Ради и соавторы объясняли именно образованием соединения цит с и Н2О2. Ради и соавторы полагают, что это соединение является соединением феррильного типа

Fe=0 ), которое и окисляет органические молекулы [82].

Гипотеза о функционировании цит с в межмембранном пространстве митохондрий и цитозоле в качестве ловушки супероксида была предложена в 1997 году Скулачевым [17]. Для осуществления такой реакции цит с обязательно должен находиться в свободном состоянии. Наши опыты с липосомами показали, что связанный цит с не может окислять супероксид [15]. Восстановленный супероксидом цит с вновь может быть окислен цитохромоксидазой. Таким образом, электрон, отданный супероксиду, вернётся на путь его эффективной утилизации в дыхательной цепи.

Перенос электронов от супероксида на цитохромоксидазу митохондрий посредством цит с предположительно осуществлялся в экспериментах Майлер [13]. Майлер удалось продемонстрировать генерацию АТФ, используя супероксид, генерируемый при окислении ксантина ксантиноксидазой, в качестве субстрата. Атланте и др. [83] показали, что цитозольная фракция, содержащая цит с катализирует перенос электронов от супероксида на молекулярный кислород через дыхательную цепь митохондрий. Таким образом, авторы предположили, что цит с является частью клеточного и митохондриального защитного механизма против окислительно стресса.

Несмотря на свойство в концентрациях от 0,5 мкМ функционировать в качестве антиоксиданта, при концентрациях свыше 10~5 М цит с катализирует реакции Хабер-Вайсса и Фентона с образованием гидроксил- радикала, причём более эффективно, нежели Fe3+ и Fe2+. Таким образом, этот белок является в некоторых случаях и прооксидантом. Описанное качество цит с проявляется в экспериментах с нейтрофилами. В работе Хаякавы и соавторов добавление цит с к клеткам в растворе Н2О2 приводило к синтезу ОН*- радикала, который запускал производство лейкотоксина [31].

Пероксидаза хрена.

Общая информация.

Пероксидазы- это гемсодержащие ферменты молекулярной массы около 40 ООО, использующие перекись водорода для окисления субстратов. Пероксидазы выделяют из растений, грибов или бактерий, реже- из животных тканей [84]. Наряду с пероксидазой хрена существуют цитохром с-, глутатион-, аскорбат-, лакто- , тироид-, миело-, а также иные пероксидазы [33]. Все они обладают сходным строением, функциями и механизмами катализируемых реакций [85].

Одновременно с утилизацией Н2О2 пероксидазы окисляют ароматические амины и фенолы [86]. Некоторые авторы считают, что пероксидазы могут быть вовлечены в процессы синтеза и деградации клеточной стенки, стрессовый ответ, сигнализацию во время окислительного стресса и утилизацию ксенобиотиков [84].

Пероксидаза хрена способна окислять широкий спектр молекул, среди которых как одно- (цитохром с, ферроцианид и др.), так и двухэлектронные (скополетин, аскорбат, гваякол, различные фенолы и др.) субстраты. Среди окисляемых ПХ молекул есть молекулы, обладающие флуоресцентными свойствами. Это фенольные производные кумарина (скополетин, эскулетин) [67], люминол, Amplex Red [61,62], n-гидрофенилацетиловая кислота (jt-ГФАК) [60], гомовалиновая кислота и тетраметилбензидин [62]. При окислении эти молекулы либо теряют (скополетин), либо приобретают способность флуоресцировать (гомовалиновая кислота, Амплеко красный). Использование ПХ в сочетании с такими флуоресцентными метками даёт удобный и часто используемый метод для исследования процессов с участием перекиси водорода в биологических системах типа клеток и клеточных органелл, способных генерировать активные формы кислорода [60,61,62,65,67,87,88,89,90]. Недостатком всех методов с использованием пероксидазы хрена является её неспецифичность к субстрату, что может привести к занижению измеряемых количеств перекиси водорода за счёт окислении ею различных клеточных субстратов, таких как глутатион и аскорбат [65,67,87].

Механизм катализируемых реакций.

Схемы реакций, катализируемых пероксидазой хрена совпадают для всех типов пероксидаз и с небольшими изменениями справедливы для катал аз и некоторых оксидаз (например, цитохромоксидазы) [64,91].

Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. Реакция окисления субстрата проходит в два этапа, каждый из которых состоит из одноэлектронного окисления донора ферментом. Схема окисления двухэлектронного донора выглядит следующим образом:

ПХ + Н202 ~*к1 ПХ- Н202 (соединение I) {16}

ИХ- Н202 (соединение I) + АН2 АН + ПХ- Н202 (соединение II) {17}

ПХ-Н2О2 (соединениеII) + АН ->к4 А + 2Н20 + ПХ [64,67,86,87,92,93] {18}

Для превращения одной молекулы перекиси водорода в две молекулы воды требуется одна молекула двуэлектронного донора, что подтверждается экспериментально [65].

Константы скоростей реакций {16}, {17} и {18} при окислении различных доноров представлены в таблице 1.

Донор «1, М V1 К2, М"1С1 Кз, M"V1 К-з, с1 К4, M"V1 скополетин 0.85-107 [93], 0.81-106 [93,97].

1.2-107 [94],

0.9106 [95]

Гваякол То же 2.5-105 [94] ферроцианид То же 8105 [96] 7.9104 [94], 2104

96]

Цитохром с 8-106 1105 [95] МО7 [953] 10 [95] 5 104 [64], 1-Ю4 [95]

Аскорбат З103 [64]

Таблица 1. Константы скоростей реакций при окислении различных субстратов пероксидазой хрена (пояснения в тексте).

В статье Бовериса [67] приводится константа скорости реакции при окислении скополетина по механизму ПХ- Н2О2 (соединение II) + АН2 —* А + 2Н2О + ПХ. Она равна (0.7-3.2)-105 М-1 с"1 при условиях применимости кинетики Михаэлиса-Ментен.

Пероксидаза хрена способна окислять и одноэлектронные доноры. Схема реакций данного типа выглядит сходным с вариантом двухэлектронного донора образом [86,

Описанные реакции восстановления перекиси водорода до воды с окислением субстрата представляют собой так называемый пероксидазный цикл реакций. В литературе описывается также оксидазный цикл, который заключается в восстановлении кислорода до радикала НОО* за счёт окислении субстрата [92,98]. При этом образуется промежуточное соединение III пероксидазы хрена.

Чен и Шопфер [98] описывают также гидроксилитический цикла, в процессе работы которого образуется радикал ОН". Чен и Шопфер провели исследования зависимости скорости генерации гидроксил-радикала пероксидазой хрена от различных субстратов окисления. Они выяснили, что при наличии аскорбата гидроксил-радикал практически не появляется, тогда как в присутствии 600 мкМ НАДН или НАДФН скорость генерации ОН* составляла около 1200 нМ/мин.

Характеристика соединений пероксидазы хрена.

В ходе каталитического цикла пероксидаза хрена последовательно переходит в различные состояния, представляющие собой соединения фермента с субстратами. Эти соединения можно идентифицировать по характерным спектрам поглощения. В таблице 2 указаны некоторые параметры этих спектров.

92]:

ПХ + Н2О2 ПХ- Н202 (соединение I) + Н20

ПХ- Н202 (соединение I) + АН —> А+' + ПХ- Н202 (соединение II)

ПХ- Н202 (соединение II) + АН А+' + Н20 + ПХ

19} (20) {21}

Соединение Длина Коэффициент Длина волны Коэффициент волны поглощения в максимума поглощения поглощения в максимума Соре в длинноволновой длинноволновой поглощения области, области (500-600 нм), области (500-600 в Соре мМ"1см~1. нм. нм), области, нм. мМ"1см"1.

Ферри- 403 [99] 107 [99], 102 500 11 [99] пероксидаза [86,100]

Соединение 1 400 [101], 410 [87] 54 [86], 72 [99]

Соединение II 418 [87,101]

Соединение III 418 [101]

Ферро- 437 [101] пероксидаза

Оксипероксидаза 417 417 543

Таблица 2. Длины волн максимумов поглощения соединений пероксидазы хрена и коэффициенты поглощения на этих длинах волн.

Изменения спектральных характеристик пероксидазы хрена авторами работы [87] использовалось для определения скорости генерации перекиси водорода.

В каталитическом центре ПХ расположена простетическая группа протопорфирина-IX с атомом трёхвалентного железа Fe(III) в центре [84]. Соединение I образуется переносом одного атома кислорода с молекулы перекиси водорода на атом железа Fe (Ш) в геме фермента, после чего высвобождается первая молекула воды [84, 86,92]. Соединение I пероксидазы хрена является железо- кислородным порфириновым радикалом феррильного типа (Fe(IV)=0) [84,86,91,92]. Этот комплекс превращается в следующее соединение П при одноэлектронном окислении молекулы субстрата [102].

По разным данным окислительно-восстановительные потенциалы пар «соединение I/ соединение П» и «соединение II/ исходный фермент» равны примерно 1-н 1,3 В (по водородной шкале) [96,102]. В статье Хе [99] определены величины одноэлектронных восстановительных потенциалов для соединения I и соединения II при рН 7.0. Они соответственно равны 0.879 и 0.903 В.

По данным Чена и сотрудников [103] пероксидаза хрена необратимо ингибируется в присутствии цианида калия.

Взаимодействие пероксидазы хрена и цитохрома с.

Реакция окисления цит с перекисью водорода, катализируемая ПХ, была описана в 60х годах в работах Николса [95], Йонетани [104], Сантимона [105] и других исследователей. Цит с использовали в качестве одного из возможных субстратов для ПХ при изучении каталитического цикла данного фермента.

В статье Николса [95] приведены значения констант скоростей реакций образования и распада комплексов I и П (при рН 5-7 и температуре 25°С):

Схема 1. Каталитический цикл ПХ (по Николсу [95]). С1, С2- соединения lull пероксидазы хрена.

Ki = 8-106 MTV1, К7 = 4 с"1, к'4 = 4 с"1 (скорость спонтанного распада соединения П) [95]. Константа К4 определена в работе Йонетани [104]. Она равна (рН 6,0) 5-Ю4 IVT1^1.

Детально механизм окисления цит с пероксидазой хрена был рассмотрен в статье Сантимона [105]. Он показал, что окисление цит с включает стадию образования трёхмолекулярного комплекса фермента и двух его субстратов. Факт независимости скорости окисления цит с от концентрации Н2О2 Сантимон объяснял тем, что взаимодействие ПХ и Н2О2 происходит много быстрее, чем взаимодействие комплексов ПХ с цит с. Исследования Сантимона были проведены при рН 5,6 в ацетатном буфере. На схеме 2 приведён каталитический цикл окисления цит с Н2О2 и ПХ, предложенный Сантимоном. пх

Н202 цит с окисл Л

С2-Цс-.

С1 ч цит с восст. цит с окисл. Л

С2 цит с восст.

Схема 2. Механизм окисления цит с перекисью водорода, катализируемого ПХ (по Сантимону [105]).

На схеме: реакция 1- взаимодействие ПХ и Н2О2 с образованием Соединения I (С1), реакция 2- окисление цит с с образованием Соединения II (С2), реакция 3-взаимодействие Соединения П и цит с с образованием промежуточного комплекса между С2 и цит с (С2-Цс), которое самопроизвольно распадается до исходного фермента в исходном состоянии и окисленной формы цит с. Значения констант скоростей этих реакций представлены в Таблице 1.

В опытах Сантимона скорость реакции окисления цит с пероксидазой хрена не зависела от концентрации Н2О2; при истощении Н2О2 реакция резко прекращалась [105].

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Переверзев, Михаил Олегович

1. Только растворённая в водной фазе фракция цитохрома с способна окислять Ог"*. В наших условиях связанный с мембраной азолектиновых липосом цитохром с не окислял ни супероксид, ни аскорбат.2. При наличии в среде 2мМ Mg^^ цитохром с не связан с мембраной азолектиновых липосом и может быть восстановлен супероксидом. Восстановленный супероксидом цитохром с окисляется цитохромоксидазой липосом, несмотря на возможное повреждающее действие супероксида и продуктов его восстановления (Н2О2, ОН*). Возможное протонофорное действие супероксида не препятствует образованию потенциала на мембране липосом при окислении восстановленного цитохрома с цитохромоксидазой липосом.^. 3. Проведена количественная оценка доли потока электронов на образование супероксида в реакции обратного транспорта электронов к общему потоку электронов в дыхательной цепи СМЧ. В наших условиях на образование супероксида расходовалось 0.13 % от общего потока электронов в дыхательной цепи СМЧ.

4. Экспериментально показано, что утечка электронов на образование О2"* в дыхательной цепи СМЧ составляет 0.3 % от потока электронов в реакции обратного транспорта от сукцината на НАД^ через комплекс I.5. Цитохром с с заменой атома Fe в составе гема на Zn способен на 50 % подавлять генерацию Н2О2 митохондриями, окисляющими сукцинат в состоянии 4.6. Ингибирование генерации Н2О2 митохондриями при добавлении цитохрома с происходит за счёт взаимодействия цитохрома с и участка внешней поверхности внешней митохондриальной мембраны.7. Описан мутант щггохрома с дрожжей, который имеет высокую активность по 'ф ингибированию генерации Н2О2 митохондриями и по активации дыхания митопластов, но не способен к активации апоптоза.Список опубликованных по теме диссертации работ Перееерзева М.О. Статьи:

1. Korshunov, S.S., Krasnikov,B.F., PereverzevJVI.O.. Skulachev,V.P. (1999) FEBS Lett., 462: 192-198. "The antioxidant functions of cytochrome c".2. AbduUaev Z.Kh., Bodrova M.E., Chemiak B.V., Dolgikh D A , Kluck R.M., Pereverzev MjO., Arseniev A.S., Efremov R.G., Kirpichnikov M.P., Mokhova E.N., Newmeyer D.D., Roder H., Skulachev V.P. (2002) Biochem .J., 362: 749-754. "A cytochrome с mutant with high electron and antioxidant activities but devoid of apoptogenic effect".3. Markova O.V., Evstafieva A.G., Mansurova S.E., Moussine S.S., Palamarchuk L.A., * Pereverzev M.O.. Vartapetian AB.and Skulachev V.P. (2003) BBA, 1557: 109-117."Cytochrome с is transformed from anti- to pro-oxidant when interacting with truncated oncoprotein prothymosin a".4. Pereverzev M.O.. Vygodina TV., Konstantinov A.A., Skulachev V.P. (2003) Biochem.Soc. Transact, (in press). "Cytochrome c, an ideal antioxidant".Тезисы конференций:

1. Переверзев M.O.. Коршунов С. "Действие цитохрома с на скорость образования перекиси водорода митохондриями". VII Международная конференция "Ломоносов- 2000", секция "Физика", подсекция 'Ъиофизика" (Москва, 2000), ^' тезисы конференции, стр. 59-61.2. Переверзев М.О.. Коршунов С, Скулачёв В.П.. "Действие цитохрома с на скорость образования перекиси водорода митохондриями". Международная конференция "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (г.Пущино, 2000), тезисы конференции, стр. 117-119.3. Skulachev V.P., Korshunov S.S., Pereverzev М.О. "Cytochrome с outside mitochondria: a novel antioxidant function". 11 Международная биоэнергетическая конференция (Суссекс, Великобритания, 2000), ЕВЕС Reports (2000), 11 (F-1): 141.4. Pereverzev М.О., Vygodina TV., Konstantinov A.A, Skulachev V.P. (2003) Biochem.Soc. Transact, (in press).» 5. Pereverzev M.O. 'E^ffects of cobalt, zinc and porphyrin cytochromes с on hydrogen peroxide production by mitochondria". Международная программа- школа "Advanced Biophysics School on Lipid-Protein Interactions and the Organization of Membranes", (Сегед, Венгрия, 2001).6. Pereverzev M.O.. Kotlyar AB. 'Effects of cobalt, zinc and poфhyrin cytochromes с on hydrogen peroxide production by mitochondria". Международные курсы ФЕБО "Mitochondria in the Cell Life and Death" (Москва, 2001), тезисы конференции, стр.18.7. AbduUaev Z.Kh., Bodrova M.E., Chemyak B.V., Dolgikh D A , Efremov R.G., Jojua I.A., Pereverzev M.O.. Skulachev V.P. "Determination of the structural elements of cytochrome с responsible for its pro-apoptotic and antioxidant activities".Международные курсы ФЕБО "Mitochondria in the Cell Life and Death" (Москва, 2001), тезисы конференции, стр.1.8. Pereverzev М.О. "Cytochrome с mutants competent in antioxidant effects".Международные курсы ФЕБО 'Tree Radicals, Nitric Oxide,and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects" (Анталья, Турция, 2001), тезисы конференции, стр. 91.9. Пеоеверзев М.О. "Действие порфиринового, Zn- и Со-цитохромов с на генерацию перекиси водорода митохондриями". Всероссийское рабочее совещание "Митохондрии в патологии" (г.Пущино, 2001), тезисы конференции, стр.105-106.10. Абдуллаев. З.Х., Ефремов Р.Г., Переверзев М.О.. Бодрова М., Черняк Б.В., Долгих Д.А. "Определение структурных элементов цитохрома с, ответственных за его неканонические активности". Всероссийское рабочее совещание "Митохондрии в патологии" (Пущино, 2001), тезисы конференции, стр. 204- 205.11. Переверзев М.О. "Действие порфиринового, цинкового и кобальтового цитохромов с на генерацию перекиси водорода митохондриями". Междзшародная конференция "Ломоносов 2001", отдел "физика" (Москва, 2001), тезисы конференции, стр.25;

12. Мансурова Э., Маркова О.В., Мусин СВ., Паламарчук Л.А., Переверзев М.О..Евстафьева А.Г., Вартапетян АВ. «При взаимодействии протимозина а с цитохромом с образуются комплексы, способные к аутоокислению». Ш Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002), тезисы конференции, стр. 252-

13. Pereverzev М.О.. Gnvennikova V.G. "Superoxide radical generation by complex I during reverse electron transport reaction in respiratory chain". Конференция ФЕБО для молодых учёных (Стамбул, Турция, 2002), тезисы конференции, стр. 94.14. Pereverzev М.О.. Gnvennikova V.G. "Superoxide radical generation by complex I during reverse electron transport reaction in respiratory chain". 28 Съезд ФЕБО (Стамбул, Турция, 2002), EJB (2002), 269 (suppl.l), стр.47.15. Pereverzev M.O.. Vygodina TV. "Cytochrome с as an ideal antioxidant".Международные курсы ФЕБО 'Trontiers in neurodegenerative disorders and aging: fundamental aspects, clinical perspectives and new insights" (Анталья, Турция, 2003).16. Pereverzev M.O.. Vygodina TV., Konstantinov A.A. "Cytochrome c, an ideal antioxidant". Съезд Биохимического сообщества "Stress, signalling and control" (Эссекс, Великобритания, 2003).Благодарности.В первую очередь хочу выразить глубокую благодарность научным руководителям работы- академику Владимиру Петровичу Скулачеву и академику Всеволоду Александровичу Твердислову. Особено я признателен Владимиру Петровичу Скулачеву, который долгое время являлся моим непосредственным руководителем.Я очень благодарен к.б.н. Светлане Эдигеевне Мансуровой за обсуждение работы и полезные замечание, на которые я, к сожалению, не всегда вовремя обращал внимание.В работе с липосомальной системой огромную помощь оказала к.б.н. Татьяна Владимировна Выгодина, за что я крайне ей благодарен.Я очень признателен профессору кафедры биофизики Энно Кустовичу Рууге за неоценимую поддержку при написании работы и ценные замечания по содержанию диссертации.Я также очень благодарен Марине Бодровой и Ольге Марковой за помощь в проведении работ и полезные советы. Большое спасибо Ларисе Паламарчук и Рубену Симоняну, с которыми мы долго и дружно работали в одной лаборатории. Много раз выручали меня Вера Ивановна Дедухова и Михаил Высоких.Я благодарю Алексея Васильевича Манина за предоставление животных для работы.Большое спасибо профессору Андрею Дмитриевичу Виноградову, профессору Льву Сергеевичу Ягужинскому и к.б.н. Вере Георгиевне Гривенниковой за обсуждение результатов работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Переверзев, Михаил Олегович, 2003 год

1. Liu S. (1997) Bioscience Reports, 17 (3): 259-271. "Generation, Partitioning, Targeting and Functioning of Superoxide in Mitochondria".

2. Гамалей И.А., Клюбин ИВ. (1996) Цитология, 38 (12): 1233-1247. "Перекись водорода как сигнальная молекула".

3. Маеда X., Акаике Т. (1998) Биохимия, 63 (7): 1007-1019. "Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке".

4. Crompton М. (1999) Biochemica at Biophysica Acta, 1420: 1-13. "The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death".

5. Kushnareva Y., Murphy A.N., Andreyev A. (2002) Biochem. J., 368 (Pt.2): 545-553. "Complex I-mediated reactive oxygen species generation: modulation by cytochrome c".

6. Beckman K.B., Ames B.N. (1998) Ann. New York Acad. Sci., 854: 118-127. "Mitochondrial aging: open questions".

7. Azzi A., Montecucco C, Richter C. (1975) BBRC, 65 (2): 597-603. "The use of acetylated ferricytochrome с for the detection of superoxide radicals produced in biological membranes".

8. Forman H.J., Azzi A. (1997) FASEB J. 11: 374-375. "On the virtual existence of superoxide anions in mitochondria: thoughts regarding its role in pathophysiology".

9. Bernardi P., Azzone G.F. (1981) JBC, 256 (14): 7187-7192. "Cytochrome с as an electron shuttle between the outer and inner mitochondrial membranes".

10. Echtay K.S., Murphy M P., Smith R.A.J., Talbot D.A., Brand M. (2002) JBC, 277: 4712947135. " Superoxide activates mitochondrial uncoupling protein 2 from the matrix side. Studies using targeted antioxidants".

11. Goglia F., Skulachev V P. (2003) FASEB J. 17 (12): 1585- 1591. "A function for novel uncoupling proteins, antioxidant defence of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the outer membrane leaflet".

12. Mailer K. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun., 170 (1): 59-64. "Superoxide radical as electron donor for oxidative phosphorylation of ADP".

13. Pereverzev M.O., Vygodina T V., Konstantinov A.A., Skulachev VP. (2003) Biochem. Soc. Transact, (in press). "Cytochrome c, an ideal antioxidant".

14. Korshunov S.S., Krasnikov B.F., Pereverzev M.O., Skulachev V P. (1999) FEBS Lett., 462: 192-198. "The antioxidant functions of cytochrome c"

15. Liu X., Kim C.N., Yang J., Jemmerson R, Wang X. (1996) Cell, 86: 147-157. "Induction of apoptotic programm in cell free extract: requirement for ATP and cytochrome c".

16. Skulachev, V.P.(1998) FEBS Lett. 423: 275-280. "Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades".

17. Kluck R.M., Martin S.J., Hoffman B.M., Zhou J.S., Green D R., Newmayer D.D. (1997) EMBO J., 16 (15): 4639-4649. "Cytochrome с activation of CPP32-like proteolysis plays a critical role in a Xenopus cell-free apoptosis system".

18. Kluck R.M., Ellerby L.M., Ellerby H.M., Maiem S., Yaffe M P., Margoliash E., Bredesen D, Mauk AG., Sherman F., Newmeyer D.D. (2000) JBC, 275: 16127-16133. "Determinants of cytochrome с pro-apoptotic activity. The role of lysine 72 trimethylation".

19. Koppenol W.H., Margoliash E. (1982) JBC, 257 (8): 4426-37. "The assymetric distribution of charges on the surface of cytochrome c. Function implications".

20. Margoliash E., Schejter A. (1966) Adv. Prot. Chem., 21: 113- 286. "Cytochrome c"

21. Purring С , ZouH., Wang X., McLendon G. (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 74-35- 7436. "Stoichiometry, free energy, and kinetic aspects of cytochrome c: Apaf-1 binding in apoptosis".

22. Синицкая H.C., Хавинсон B.X. (2002) Успехи современной биологии, 122 (6): 557568. "Роль пептидов в свободнорадикальном окислении и старении организма".

23. Pryor W.A. (1986) Annual Review of Physiology, 48: 657-667. "Oxy-Radicals and Related Species: Their Formation, Lifetimes and Reactions".

24. Lopez-Torres M., Gredilla R, Sanz A., Barja G. (2002) Free Radical Biology & Medicine, 32 (9). 882-889. "Influence of aging and long-term caloric restriction on oxygen radical generation and oxidative DNA damage in rat liver mitochondria".

25. Shen В., Jensen R.G., Bohnert H.J. (1997) Plant Physiol., 115: 527-532. "Mannitol protects against Oxidation by Hydroxil Radicals".

26. Jamieson D., Chance В., Cadenas E., Boveris A. (1986) Annual Review of Physiology, 48: 693-702. "The Relation of Free Radical Production to Hyperoxia".

27. Paradies G, Petrosillo G., Pistolese M., Ruggiero F.M. (2002) Gene, 286 (1): 135-141. "Reactive oxygen species affect mitochondrial electron transport complex I activity through oxidative cardiolipin damage".

28. Korshunov S.S., Skulachev VP, Starkov A.A. (1997) FEBS Lett., 416: 15-18. "High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxigen species in mitochondria".

29. Hayakawa M., Ogava Т., Sigiyama S., Ozava T. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 161(3): 1077-1085. "Hydroxil Radical and Leucotoxin biosinthesis in neutrophyl plasma membrane".

30. Liu S. (1999) J. Bioenerg Biomembr., 31 (4): 367-376. "Cooperation of a "reactive oxygen cycle" with the Q cycle and the proton cycle in the respiratory chain supeoxide generating and cycling mechanisms in mitochondria".

31. Chance В., Sies H., Boveris A. (1979) Physiological reviews, 59 (3): 527-605. "Hydroperoxide metabolism in mammalian organs".

32. Hansford R.J., Hogue В A, Mildaziene V. (1997) J. Bioenerg. Biomembr., 29 (1). "Dependence of H202 Formation by Rat Heart Mitochondria on Substrate Availability and Donor Age".

33. Сборник "Биофизика", ред. Ю.АВладимирова. (1975) Москва. "Молекулярная патология мембранных структур", 5: 119-165. 'Толь супероксидных анион-радикалов и синглетного кислорода в патологии мембран".

34. Kellogg E.W., Fridovich I. (1975) JBC, 250 (22): 8812-8817. "Superoxide, hydrogen peroxide, and singlet oxygen in lipid peroxidation by a xanthine oxidase system".

35. Fridovich I. (1986) Archives of Biochemistry and Biophysics, 247 (1): 1-11. "Biological Effect of the Superoxide Radical".

36. Schubert J., Wilmer J.W. (1991) Free Radical Biology & Medicine, 11: 545-555. "Does Hydrogen peroxide exist "Free" in biologycal systems?".

37. Krasnovsky A. A., Kagan V.E. (1979) FEBS Lett., 108 (1): 152-154. " Photosensitization and quenching of singlet oxygen by pigments and lipids of photoreceptor cells of the retina".

38. Boveris A., Chance B. (1973) Biochem. J., 134: 707- 716. "The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxigen".

39. Loschen G, Flohe L, Chance B. (1971) FEBS Lett., 18 (2): 261-264. "Respiratory chain Linked H202 Production in pigeon heart mitochondria ".

40. Korshunov S.S., Korkina O.V., Ruuge E.K., Skulachev V P., Starkov A.A. (1998) FEBS Lett., 435: 215-218. "Fatty acids as natural ancouplers preventing generation of 02"* and H202 by mitochondria in the resting state".

41. Vinogradov A.D. (1998) BBA, 1364: 169-185. "Catalytic properties of the mitochondrial NADH- ubiquinone oxidoreductase (Complex I) and the pseudo-reversible active / inactive enzyme transition".

42. Braidot E., Petrussa E, Vianello A., Macri F. (1999) FEBS Lett. 451: 347-350. "Hydrogen Peroxide Generation by higher Plant mitochondria oxidizing complex I or complex П substrates".

43. Fridovich I. (1974) Advances in Enzymology, 41: 35-97. "Superoxide Dismutases".

44. Chen J R., Weng C.N., Ho T.Y., Cheng 1С., Lai S.S. "Identification of the copper- zinc superoxide dismutase activity in Mycoplasma hyopneumoniae". Vet. Microbiol. (2000), 73 (4): 301-310.

45. Sugio S., Hiraoka B Y., Yamakura F. (2000) Eur. J. Biochem., 267 (12): 3487-3495. "Crystal structure of cambialistic superoxide dismutase from porphyromonas gingivalis".

46. Sturtz L.A., Diekert K, Jensen L.T., Lill R, Culotta V С (2001) JBC, 276 (42): 3808438089. "A fraction of yeast Cu, Zn- superoxide dismutas and its metallochaperone, CCS, localise to the intermembrane space of mitochondria".

47. Okado-Matsumoto A, Fridovich I. (2001) JBC, 276 (42): 38388-38393. "Subcellular distribution of superoxide dismutases (SOD) in rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria".

48. Antunes F., Han D, Cadenas E. (2002) Free Rad. Biol. Med, 33 (9): 1260-1267. "Relative contributions of heart mitochondria glutathione peroxidase and catalase to H(2)0(2) detoxification in in vivo conditions".

49. Skulachev, VP. (1994) Biochemistry (Moscow), 59 (12): 1433-1434. "Lowering of Intracellular 02 Concentration as a Special Function of Respiratory Systems of Cell".

50. Панкин B.3., Тихазе A.K., Беленков Ю Н. (2001) Москва, НИИ кардиологии им.Мясникова, изд. второе. «Пособие для врачей: свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях».

51. Pastore D., Laus M.N., Fonzo N.D., Passarella S. (2002) FEBS Lett., 516 (1-3): 15-19. "Reactive oxygen species inhibit the succinate oxidation-supported generation of membrane potential in wheat mitochondria".

52. Herrero В., Baija G. (2000) J Bioenerg. & Biomembr., 32(6): 609-615. "Localization of the site of oxygen radical generation inside the complex I of heart and nonsynaptic brain mammalian mitochondria".

53. Han D., Antunes F., Canali R, Rettori D., Cadenas E. (2003) JBC, 278 (8): 5557-5563. "Voltage-dependent anion channels control the release of the superoxide anion from mitochondria to cytosol".

54. Turner СР., Toye A.M., Jones O.T.G. (1998) Free Radical Biol. Med. 24 (3): 401-407. "Keratinocyte superoxide generation".

55. Wada K., Okunuki K. (1968) J. Biochem., 64 (5): 667- 681. "Studies on chemically modified cytochrome с. I. The acetylated cytochrome c".

56. Liu Y., Fiskum G., Schubert D. (2002) J. Neurochem., 80 (5): 780-787. "Generation of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain".

57. Votyakova T V., Reynolds I.J. (2001) J. Neurochem., 79 (2): 266-277. "DeltaPsi(m)-Dependent and -independent production of reactive oxygen species by rat brain mitochondria".

58. Staniek K, Nohl H. (2000) BBA, 1460 (2-3): 268-275. "Are mitochondria a permanent source of reactive oxygen species?".

59. Гомбоева С Б., Шумаев К Б., Гесслер Н.Н., Панкин В.З. (2001) Доклады Академии наук, 377 (3): 402-405. "Механизм окисления бета-каротина и полиненасыщенных жирных кислот".

60. Puppo A., Halliwell В. (1988) Biochem. J., 249 (1): 185-190. " Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Is haemoglobin a biological Fenton reagent?".

61. Andreae W.A. (1955) Nature, 175 (4463): 859-860. "A sensitive method for the estimation of hydrogen peroxide in biological materials".

62. Perschke H., Broda E. (1961) Nature, 190: 257-258. "Determination of very small amounts of hydrogen peroxide".

63. Boveris A., Martino E., Stoppani A.O.M. (1977) Anal Biochem., 80 (1): 145-158. "Evaluation of the horseradish peroxidase-scopoletin method for the measurement of hydrogen peroxide formation in biological systems".

64. Rieder R, Bosshard H.R. (1980) JBC, 255 (10): 4732-9. "Comparison the binding sites on cytochrome с for cytochrome с oxidase, cytochrome bcl and cytochrome cl. Differential acetylation of lysyl residues in free and coplexed cytochrome c".

65. Lappalainen P., WatmoughN.J., Greenwood C., SarasteM. (1995) Biochemistry, 34 (17): 5824-30. "Electron transfer between cytochrome с and the isolated CuA domain: identification of substrate-binding residues in cytochrome с oxidase".

66. Ptitsyn O.B. (1998) JBC, 278 (3). 655-66. "Protein folding and protein evolution: common folding nucleus in different subfamilies of c-type cytochromes?".

67. Gorbenko G.P. (1999) BBA, 1420: 1-13. "Structure of cytochrome с complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer".

68. Lemeshko V.V. (2002) JBC, 277 (20): 17751-17757. "Cytochrome с sorption-desorption effects on the external NADH oxidation by mitochondria".

69. Cortese J.D., Voglino A.L., Hackenbrock C.R. (1998) Biochemistry, 37 (18): 6402- 6409. "Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c".

70. Marzulli D., La Piana G., Fransvea E., Lofrumento N.E. (1999) BBRC, 259 (2): 325-330. "Modulation of cytochrome c-mediated extramitochondrial NADH oxidation by contact site density".

71. Zhivotovsky В., Orrenius S., Brustugun ОТ, Doskeland S O. (1998) Nature, 391: 449450. "Injected cytochrome с induces apoptosis".

72. Reed J.C. (1997) Cell, 91: 559-562. "Cytochrome c: can't live with it- can't live without it".

73. Hengartner M.O. (1998) Nature, 391: 441-442. "Death cycle and Swiss army Knives".

74. Schonhoff СМ., Gaston В., Mannick J.B. (2003) JBC, 278 (20): 18265-18270. "Nitrosylation of cytochrome с during apoptosis".

75. Margoliash E., Frohwirt N., Wiener E. (1959) Biochem. J., 71: 570-572. "A study of the cytochrome с haemochromogen".

76. Diederix RE M., Ubbink M., Canters G.W. (2002) Biochemistry, 41: 13067-13077. "Peroxidase activity as a tool for studying the folding of c-type cytochromes".

77. Radi R, Sims S., Cassina A, Turrens J.F. (1993) Free Rad. Biol. Med., 15: 653-659. "Roles of catalase and cytochrome с in hydroperoxide-dependent lipid peroxidation and chemiluminescence in rat heart and kidney mitochondria".

78. Yonetani T. (1965) JBC, 240 (11): 4509-4514. "Studies on cytochrome с peroxidase".

79. Du P. and Loew G.H. (1995) Biophysical Journal, 68: 69-80. "Theoretical study of model compound I complexes of horseradish peroxidase and catalase".

80. Boveris A., Oshino N, Chance B. (1972) Biochem. J., 128, 617-630. "The cellular production of hydrogen peroxide".

81. Nozomu О , Jamieson D., Chance B. (1975) Biochem. J., 146: 53-65. "The properties of hydrogen peroxide production under hyperoxic and hypoxic conditions of perfused rat liver".

82. Boveris A., Chance B. (1973) Biochem. J., 134: 707-716. "The mitochondrial generation of hydrogen peroxide".

83. Staniek К., Nohl H. (1999) ВВА, 1413: 70-80. "Н202 detection from intact mitochondria as a measure for one-electron reduction of dioxygen requires a non-invasive assay system".

84. Kincaid J R., Zheng Y., Al-Mustafa J., Czarnecki K. (1996) JBC, 271 (46): 28805-28811. "Resonance Raman spectra of native and mesoheme-reconstituted horseradish peroxidase and their catalytic intermediates".

85. Berglund G.I., Carlsson G.H., Smith A T., Szoke H., Henriksen A., Hajdu J. (2002) Nature, 417: 463-468. "The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution".

86. Newmeyer S.L., deMontellano P RO. (1995) JBC, 270 (33): 19430-19438. "Horseradish peroxidase His-42-»Ala, His-42-»Val, and Phe-41-»Ala mutants".

87. Nicholls P. (1966) Hemes and hemoproteins, 307-318. "The role of endogenous donor".

88. Farhangrazi Z.S., Fossett M.E., Powers L.S., Ellis W.R. (1995) Biochemistry, 34: 28662871. "Variable-temperature spectroelectrochemical study of horseradish peroxidase".

89. Chen S., Schopfer P. (1999) Eur. J. Biochem., 260: 726-735. "Hydroxyl-radical production in physiological reactions".

90. He В., Sinclair R, Copeland B.R., Makino R., Powers L.S., Yamazaki I. (1996) Biochemistry, 35: 2413-2420. "The structure-function relationship and reduction potentials of high oxidation states of myoglobin and peroxidase".

91. Rodriguez-Lopez J.N., Smith A.T., Thorneley R.N.F. (1997) JBC, 272 (1): 389-395. "Effect of distal cavity mutations on the binding and activation of oxygen by ferrous horseradish peroxidase".

92. Makino R, Yamazaki I. (1972) J. Biochem., 72: 655-664. "Effects of 2,4- substituents of deuterohemin upon peroxidase functions".

93. Hayashi Y., Yamazaki I. (1979) JBC, 254 (18): 9101-9108. "The oxidation-reduction potentials of compound I/П and compound П/ferric couples of horseradish peroxidases A2 and C"

94. Chen Y.R., Deterding L.J., Tomer K.B., Mason R.P. (2000) Biochemistry, 39: 44154422. "Nature of the inhibition of horseradish peroxidase and mitochondrial cytochrome с oxidase by cyanyl radical".

95. Yonetani T. (1966) JBC, 241 (11): 2562-2571. "Studies on cytochrome с peroxidase".

96. Santimone M. (1975) Biochimie, 57: 91-96. "The mechanism of ferrocytochrome с oxidation by a horseradish isoperoxidase".

97. Выгодина T.B. (1987) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, биологический ф-т МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва.

98. Akerman К.Е.О., Wikstrom M.K.F. (1976) FEBS Lett., 68 (2): 191-197. "Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential".

99. Miki Т., Orii Y. (1985) JBC, 261 (9): 3915-3918. "Proton translocation by cytochrome oxidase vesicles catalyzing the peroxidatic oxidation of ferrocytochromec".

100. Crapo J.D., Oury Т., Rabouille С, Slot J.W., Chang L. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 10405-10409. "Copper,zinc superoxide dismutase is primarily a cytosolic protein in human cells trates".

101. Starkov A.A., Fiskum G. (2001) BBRC, 281 (3): 645-650. "Myxothiazol induces H(2)0(2) production from mitochondrial respiratory chain".

102. Lemeshko V.V. (2000) FEBS Lett., 472: 5-8. "Mg2+ induces intermembrane electron transport by cytochrome с desorption in mitochondria with the ruptured outer membrane".

103. Рогожин В В., Верхотуров В В. (1999) Биоорганическая химия, 25 (5): 377-382. "Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена".

104. Yu Т., Wang X., Purring-Koch С., Wei Y, McLendon G. L. (2001) J. Biol. Chem., 276: 13034-1038. "A mutational epitope for cytochrome с binding to the apoptosis protease activation factor-1".

105. Hearn A.S., Tu C., Nicks H.S., Silverman D.N. (1999) JBC, 274 (35): 24457-24460. "Characterization of the product-inhibited complex in catalysis by human manganeseФ superoxide dismutase".

106. Скулачев В.П. (2000) Первое Северинское чтение, Москва, МГУ. "Кислород и явления запрограммированной смерти".

107. St-Pierre J., Buckingham J.A., Roebuck S.J., Brand M.D. (2002) JBC, 277 (47): 44784-44790. "Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain".