Влияние звездчатых клеток печени на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Шафигуллина, Айгуль Касыймовна

• Шафигуллина, Айгуль Касыймовна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Шафигуллина, Айгуль Касыймовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Микроокружение стволовых клеток

2.1.1 Общие понятия о микроокружении стволовых клеток

2.1.2 Микроокружение стволовых клеток печени

2.2 Компоненты микроокружения стволовых клеток печени

2.2.1 Растворимые факторы роста

2.2.2 Межклеточные контакты и внеклеточный матрикс

2.3 Внепечёночные стволовые клетки и регенерация печени

2.3.1 Гемопоэтические стволовые клетки в регенерации печени

2.3.2 Мезенхимные стволовые клетки в регенерации печени

2.3.2.1 Свойства мезенхимных стволовых клеток

2.3.2.2 Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в гепатоциты

2.3.2.2.1 Способность мезенхимных стволовых клеток дифференцироваться в гепатоциты после трансплантации

2.3.2.2.2 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток in vitro

2.3.2.2.2.1 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток под действием факторов роста

2.3.2.2.2.2 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток под комплексным влиянием растворимых факторов и межклеточных контактов

2.3.3 Механизмы дифференцировки стволовых клеток в гепатоциты

2.4 Звёздчатые клетки печени, их фенотип и свойства

2.4.1 Звёздчатые клетки печени как фактор микроокружения

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Выделение звёздчатых клеток печени

3.1.1 Выделение звёздчатых клеток печени методом коллагеназно-проназной перфузии с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза

3.1.2 Выделение звёздчатых клеток печени методом Сеглена

3.2 Выделение мезенхимных стволовых клеток из костного мозга

крысы

3.3 Изучение влияния компонентов микроокружения на дифференцировку клеток in vitro

3.3.1 Культивирование звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток с рекомбинантными факторами роста HGF и FGF4 (модель 1)

3.3.2 Культивирование мезенхимных стволовых клеток в питательной среде звёздчатых клеток печени (модель 2)

3.3.3 Культивирование мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени на внутри луночных вставках (модель 3)

3.3.4 Совместное культивирование мезенхимных стволовых клеток и

звёздчатых клеток печени (модель 4)

3.3.4.1 Методика витального мечения клеток флуоресцентными мембранными метками РКН26 и РНК67 (Sigma)

3.4 Методика имму но цитохимического окрашивания культуры клеток

3.5 Молекулярно-биологические методы исследования экспрессии генов цитокератина 19 и VCAM в культуре звёздчатых клеток печени

3.5.1 Методика выделения тотальной РНК

3.5.2 Методика синтеза кДНК гена цитокератина 19 на матрице РНК

3.5.3 Электрофорез ДНК в 1,5% агарозном геле

3.5.4 Методика синтеза кДНК на матрице РНК

3.5.5 Методика постановки ПЦР в режиме реального времени

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Сравнительный анализ методов выделения звёздчатых клеток из печени крыс

4.2 Фенотип свежевыделенных звёздчатых клеток печени и его изменения при культивировании

4.3 Культивирование звёздчатых клеток печени с рекомбинантными факторами роста

4.4 Фенотип свежевыделенных мезенхимных стволовых клеток и его изменения при культивировании

4.5 Фенотип мезенхимных стволовых клеток при культивировании с рекомбинантными факторами роста

4.6 Фенотип мезенхимных стволовых клеток при культивировании в питательной среде звёздчатых клеток печени

4.7 Изменения фенотипа мезенхимных стволовых клеток при культивировании их со звёздчатыми клетками печени на внутрилуночковых вставках

4.8 Изучение фенотипа звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток при совместном культивировании

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6 ВЫВОДЫ

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8.БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

9. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние звездчатых клеток печени на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Сохранение стволовыми клетками своего фенотипа и свойств, а также координация их жизнедеятельности с потребностями всего организма достигается благодаря определённым окружающим условиям, объединённым и названным нишей стволовых клеток. Среди компонентов ниши особое внимание уделяют контактам стволовых клеток с популяцией непаренхиматозных клеток и наличию растворимых факторов [122]. Для ряда тканей млекопитающих стволовые клетки и их ниши уже описаны, например, для клеток-сателлитов, находящихся под базальной мембраной миофибрилл мышечной ткани [156], стволовых клеток сперматогенного эпителия яичка [185], а также стволовых клеток ценральной нервной системы, волосяного фолликула и эпителия кишки [90, 173]. Стволовая же клетка печени до сих пор не найдена и ведутся поиски не только самой стволовой клетки печени, но и ниши, в которой происходит её диффренцировка в гепатоциты. Среди растворимых факторов, которые влияют на дифференцировку предшественников гепатоцитов, наиболее изученными являются фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста фибробластов-4 (FGF4). Известно, что основным источником данных факторов роста в печени является одна из популяций непаренхиматозных клеток печени -звёздчатые клетки печени (ЗКП), которые находятся в перисинусоидальном пространстве в непосредственном контакте с гепатоцитами и вырабатывают факторы роста, необходимые для пролиферации и дифференцировки последних [87]. По мнению некоторых авторов, сами ЗКП в пределах печёночной дольки и ацинуса располагаются в нише стволовых клеток [141].

Согласно данным литературы, а также данным, полученным нашим коллективом, ЗКП играют ключевую роль в процессе фетального печёночного гемопоэза и дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов в ходе пренатального развития печени [1, 5, 51, 53]. Более того, именно эти клетки являются важнейшим участником восстановления массы клеток паренхимы в ходе регенерации печени как за счёт вырабатываемых ими макромолекул межклеточного матрикса и его ремоделирования [79], так и за счёт продукции вышеупомянутых факторов роста [87].

Если ЗКП необходимы для процессов фетального кроветворения в печени, а также дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов, то способны ли они создавать микроокружение для потомков стволовых клеток и, в частности, внепечёночных стволовых клеток? Ответ на этот вопрос можно получить, работая уже с известным клеточным типом - мезенхимными стволовыми клетками (МСК) костного мозга. Выбор популяции МСК обусловлен их доступностью с точки зрения методов выделения, хорошей выживаемостью и неприхотливостью в условиях in vitro, возможностью трансплантации аутологичных клеток, а значит, снятием множества законодательных, этических и религиозных вопросов по их применению в клинике. Впервые МСК были описаны Фриденштейном ещё в 70-х годах XX века [194]. С тех пор ведутся активные исследованиям свойств МСК, пластичности и возможности их применения в клинической практике. На сегодняшний день известно, что МСК способны продуцировать ряд факторов роста, цитокинов и сигнальных молекул, которые подавляют иммунный ответ, снижают апоптоз гепатоцитов, приводят к регрессу фиброза печени, стимулируют пролиферацию и функциональную активность гепатоцитов [119]. Определённые успехи достигнуты в экспериментах по дифференцировке МСК в гепатоцитоподобные клетки в условиях in vitro. Наиболее интересным среди исследований, посвящённых получению функционально активных гепатоцитов из МСК, является работа Снайкерс [215], в которой к культуре МСК костного мозга были добавлены рекомбинантные факторы роста HGF и FGF4 в той

последовательности, в которой эти факторы воздействуют на прогениторные клетки печени в ходе её развития во внутриутробном периоде [157]. Работ же, в которых проводилось бы изучение влияния естественных факторов роста или межклеточных контактов с непаренхиматозными клетками печени на гепатоцитарную дифференцировку МСК, на сегодняшний день нет. Более того, необходимо выяснить, что же важнее для дифференцировки прогениторных клеток в гепатоциты: растворимые факторы роста, непосредственные межклеточные контакты либо их комплексное воздействие.

Исходя из этого, целью нашей работы стало изучение влияния ЗКП как фактора микроокружения на изменения фенотипа культуры МСК костного мозга и их потомков в условиях in vitro у крысы.

Задачи:

1. Сравнить методы выделения звёздчатых клеток из печени крысы: метод выделения по Сеглену и метод коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза.

2. Изучить влияние рекомбинантных факторов роста FGF4 и HGF на фенотип мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени крысы in vitro.

3. Изучить влияние факторов роста, синтезируемых звёздчатыми клетками печени, на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы при различных вариантах культивирования:

а) в среде, переработанной звёздчатыми клетками печени;

б) при совместном культивировании мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени, разделённых полупроницаемой мембраной;

4. Изучить фенотип звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток при совместном культивировании.

5. Установить возможность слияния мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени при совместном культивировании.

Научная новизна. В диссертации впервые было проведено сравнение двух методов выделения ЗКП из печени крысы. Согласно полученным результатам, метод коллагеназно-проназной перфузии с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза является наиболее эффективным по сравнению с методом Сеглена по количеству выделенных ЗКП, их жизнеспособности и чистоте культуры [7].

В ходе работы были впервые выполнены различные варианты культивирования МСК и ЗКП [3]. На основании полученных данных установлено, что ЗКП способны создавать микроокружение для дифференцировки МСК в клетки с фенотипом гепатоцитов в условиях in vitro. Кроме того, было продемонстрировано, что важной составляющей микроокружения является секреция ЗКП факторов роста, индуцирующих появление в фенотипе культуры МСК экспрессии а-фетопротеина (а-ФП) и цитокератинов 18 и 19 (ЦК18 и ЦК19). Необходимо отметить, что изменения фенотипа МСК при культивировании их в кондиционированной среде ЗКП и при культивировании МСК и ЗКП, разделённых полупроницаемой мембраной, были аналогичны изменениям фенотипа МСК при культивировании их с рекомбинантными факторами роста HGF и FGF4. Подобные изменения фенотипа МСК были отмечены и при совместном культивировании МСК с ЗКП, однако, в отличие от предыдущих групп, экспрессия ЦК 18, ЦК 19 и а-ФП была более выраженной, что, вероятно, обусловлено одновременным действием непосредственных межклеточных контактов МСК с ЗКП и продуцируемых ЗКП факторов роста. Для разграничения двух клеточных популяций при совместном культивировании ЗКП и МСК нами было впервые проведено их предварительное витальное мечение флуоресцентными метками [3]. Благодаря этому было установлено, что появление в фенотипе МСК несвойственных им эпителиальных маркёров обусловлено не слиянием клеток, а действием сложного комплекса паракринных и контактных межклеточных взаимодействий.

В работе впервые показано появление в фенотипе МСК экспрессии цитокератинов и а-ФП на более ранних сроках при культивировании МСК с рекомбинантными факторами роста, однако более выраженная и устойчивая экспрессия ЦК 18, ЦК 19 и а-ФП наблюдалась при совместном культивировании ЗКП с МСК [3]. Таким образом, комплексное воздействие межклеточных контактов между ЗКП и МСК и продуцируемых ЗКП факторов роста обеспечивают изменение фенотипа МСК с мезенхимного на эпителиальный. На основании полученных результатов можно заключить, что ЗКП способны создавать микроокружение, благодаря которому происходит дифференцировка потомков стволовых клеток в гепатоциты.

Теоретическая и практическая ценность работы. Проведённое исследование имеет несомненный теоретический интерес, поскольку раскрывает ряд механизмов межклеточных взаимодействий, лежащих в основе дифференцировки потомков МСК костного мозга в гепатоциты. Полученные результаты способствуют выявлению новых данных о роли факторов роста, секретируемых ЗКП, а также о значении межклеточных контактов в создании микроокружения для прогениторных клеток, в том числе для стволовых клеток мезенхимного происхождения. В ходе исследования было показано, что появление в фенотипе МСК несвойственных им эпителиальных маркёров в виде ЦК 18, ЦК 19 и а-ФП может происходить под влиянием факторов роста НвР и РвР4, рекомбинантных или синтезируемых ЗКП. Однако для более устойчивой дифференцировки МСК в клетки с фенотипом гепатобластов необходимо создать условия, приближенные к естественным, поэтому оптимальным вариантом является совместное культивирование МСК и ЗКП, при котором происходит воздействие на МСК как межклеточных контактов с ЗКП, так и синтезируемых ими растворимых факторов.

Помимо теоретического интереса, проведённые исследования имеют и практическую ценность, так как в ходе выполнения работы было проведено сравнение двух методов выделения ЗКП. Согласно полученным результатам,

метод Сеглена по ассоциированному выделению ЗКП и гепатоцитов является менее затратным в финансовом плане, более простым в исполнении, однако более высокие показатели жизнеспособности ЗКП (90%) и чистоты культуры (99,5%) были получены при выделении клеток методом коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза. Также практический интерес может представлять предварительное витальное мечение клеток флуоресцентными метками перед посевом на культуральную чашку, что позволяет отслеживать рост и организацию клеток при совместном культивировании ЗКП и МСК. Мечение клеток позволило установить, что изменения фенотипа МСК при совместном культивировании МСК с ЗКП происходят не путём слияния клеток двух популяций, а путём их трансдифференцировки в гепатоцитарном направлении.

Результаты исследования позволяют по-новому взглянуть на функции ЗКП и рассматривать их как важный компонент микроокружения, необходимый для гепатоцитарной дифференцировки потомков стволовых клеток in vitro, что подтверждает их роль в данном процессе, установленную ранее при изучении онтогенеза и регенерации печени.

Полученные сведения могут быть использованы для дальнейшего изучения взаимодействия различных клеточных типов в процессе регенерации печени, а также могут быть рекомендованы для лабораторной практики и использованы в учебном процессе.

По материалам диссертации опубликовано 30 работ (1 монография, 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов научных исследований, 25 тезисов Всероссийских и Международных конференций). Общий объём публикаций -11,31 условно печатных листа, в т.ч. авторский вклад - 8,48 условно печатных листа.

Основное положение, выносимое на защиту

Звёздчатые клетки печени способны создавать микроокружение, которое обеспечивает изменение фенотипа мезенхимных стволовых клеток с мезенхимного на эпителиальный, в частности, потомки мезенхимных стволовых клеток начинают экспрессировать цитокератины 18 и 19 и а-фетопротеин.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного количества образцов для исследования, а также применением современных молекулярно-биологических методов, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием статистического метода. Достоверность различий между результатами оценивали по I-критерию Стьюдента.

Внедрение результатов исследования

В ходе проведения данного исследования были модифицированы методы иммуноцитохимического выявления антигенов и эти модификации внедрены в практическую работу кафедры нормальной анатомии и кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, а также в работу Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО Казанского государственного медицинского университета Минздрава России, Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Материалы диссертации включены в лекционные курсы для студентов кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры нормальной анатомии.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки», г. Уфа (2010), IV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», г. Казань (2010), IV Всероссийском симпозиуме с

международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», г. Санкт-Петербург (2010), 2-м Международном конгрессе студентов-медиков, г. Кошице, Словакия (2010), IV Международном конгрессе по гастроэнтерологии, г. Фрайбург, Германия (2010), III Международном симпозиуме «Актуальные вопросы клеточных технологий», г. Москва (2010), VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, г. Москва (2011), XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», г. Казань (2011), Международной научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 135-летию М.Д. Стражеска, г.Одесса, Украина (2011), 4-й Международной конференции молодых учёных «Молекулярная биология: достижения и перспективы», г. Киев, Украина (2011), 22-й Европейской конференции, г. Берлин, Германия (2011), II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий», г. Екатеринбург (2011), XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», г. Казань (2012), научно-практической конференции с международным участием, посвящённой 155-летию со дня рождения В.В. Подвысоцкого, г. Одесса, Украина (2012), 47-й Ежегодной встрече Европейской Ассоциации по Изучению Печени, г. Барселона, Испания (2012), 20-й Международной гепатологической неделе, г. Амстердам, Нидерланды (2012), XVIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», г. Казань (2013).

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 258 источников: 8

отечественных и 250 иностранных. Диссертация содержит 39 рисунков и 7 таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (госконтракт № 14.740.11.0457) и РФФИ (грант 09-04-97013-р_поволжье_а).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Микроокружение стволовых клеток

2.1.1 Общие понятия о микроокружении стволовых клеток

Стволовые клетки - уникальные клеточные популяции, обладающие тремя свойствами: способностью к самоподдержанию в течение длительного времени, отсутствием в фенотипе клеток тканеспецифичных маркёров, а также возможностью дифференцировки в различные типы специализированных клеток [12]. Процессы самоподдержания и дифференцировки стволовых клеток находятся под влиянием собственных генов стволовых клеток, а также под влиянием «внешних» сигналов от окружающих клеток, осуществляемых посредством межклеточных контактов, секретируемых ими факторов роста и других биологически активных веществ, а также компонентами межклеточного матрикса. Данный комплекс взаимодействий был объединён и назван микроокружением, или нишей стволовых клеток [122].

Впервые концепция ниши стволовых клеток была предложена в 1978 году Шофилдом для гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [214]. На сегодняшний день подобные ниши описаны для стволовых клеток ряда других тканей млекопитающих: клеток-сателлитов, находящихся под базальной мембраной миофибрилл мышечной ткани [156], стволовых клеток сперматогенного эпителия яичка [185], а также стволовых клеток ценральной нервной системы, волосяного фолликула и эпителия кишки [90, 173].

Стволовые клетки, находящиеся в нише, отличает способность к самоподдержанию популяции путём медленного симметричного и

ассимметричного деления без последующей дифференцировки. Данное свойство обеспечивается благодаря внутриклеточным сигнальным путям, таким как hedgehog, (З-catenin, однако главными считаются трансформирующий фактор роста-Р (Transforming Growth Factor beta, TGF-|3) и Notch-зависимый Wnt-сигнальные пути [17, 137, 213, 224, 252]. Белок Wnt активирует процесс транскрипции через [3-catenin [188], в то время как Notch-белок определяет асимметричный тип деления клетки [18, 138,144, 146, 152, 254].

Установлено, что немалую роль в поддержании ниши ГСК костного мозга отводится симпатической иннервации [218]. Норадренергические сигналы симпатической нервной системы играют критическую роль в мобилизации ГСК из костного мозга, индуцируемой гранулоцит колоние-стимулирующим фактором (Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF) [218].

Помимо окружающих клеток, белков базальной мембраны и внутриклеточных сигнальных путей большое значение в нише стволовых клеток имеют белки межклеточного матрикса, которые могут влиять на концентрацию и активность факторов роста, а значит опосредованно воздействовать на пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток [99, 172, 188, 193, 200].

Таким образом, стволовые клетки в нише находятся под комплексным влиянием белков базальной мембраны, факторов роста и межклеточных контактов с тканеспецифичными дифференцированными клетками. Данный комплекс взаимодействий позволяет стволовым клеткам сохранять свои свойства на протяжении длительного периода времени, а в случае повреждения ткани или органа ниша становится благоприятной средой для дифференцировки стволовых клеток в необходимую популяцию клеток.

2.1.2 Микроокружение стволовых клеток печени

Известно, что печень обладает высоким регенеративным потенциалом, а значит, в печени должен быть резерв клеток-предшественников. Однако, данное предположение не нашло достаточных подтверждений в различных исследованиях [227]. Помимо самих стволовых клеток в печени должна быть их

ниша, в которой клетки могли бы длительное время находиться и, в случае необходимости, пролиферировать и дифференцироваться с восполнением повреждённой популяции клеток печени, в первую очередь, гепатоцитов. В качестве подобной ниши в печени некоторые авторы рассматривают канальцы Геринга и концевые жёлчные протоки [226], однако в последнее время всё больше исследователей предполагают, что нишей стволовых клеток печени может быть перисинусоидальное пространство [227], которое ограничено белками базальной мембраны и гепатоцитами [212]. Поскольку в данном пространстве располагаются ЗКП, которые благодаря секреции множества различных факторов роста активно участвуют в процессе регенерации печени [87], то сами ЗКП некоторыми учёными рассматриваются в качестве возможных потенциальных стволовых/прогениторных клеток печени [1, 5, 51, 53, 141].

Предпложение о том, что перисинусоидальное пространство печени может быть нишей стволовых клеток печени было впервые высказано в 2009 году [212]. Доводом в пользу этой гипотезы стало наличие в перисинусодиальном пространстве компонентов, необходимых для формирования ниши стволовых клеток. Так, перисинусоидальное пространство располагается за подобием базальной мембраны, с которой связаны эндотелиальные клетки [90]. Белки базальной мембраны, ламинин и коллаген IV типа, необходимы для поддержания покоящегося состояния стволовых клеток и сдерживания тканеспецифичной дифференцировки [252]. В свою очередь, эндотелиальные клетки синусоидов печени вырабатывают растворимый фактор стромальных клеток (Stromal Cell-Derived Factor-1, SDF-1)[212]. Функция фактора SDF-1 за пределами печени заключается в стимуляции миграции ГСК к своей нише в костном мозге на этапе онтогенеза и последующего нахождения в ней [151], а в случае необходимости -миграции в периферическую кровь [231]. Возможно, что функцией фактора SDF-1 в печени также является привлечение в орган и удержание в нём стволовых клеток в ходе её регенерации. Здесь также нужно обратить внимание на то, что на мембране ЗКП, расположенных в перисинусоидальном пространстве печени, есть

рецептор Cystein-X-Cystein Receptor 4 (CXR4) для специфичного связывания с фактором SDF-1, а добавление этого фактора в культуру ЗКП стимулирует их миграцию в условиях in vitro [212]. Таким образом, можно предположить, что секреция эндотелиальными клетками синусоидов печени фактора SDF-1 необходима для удержания ЗКП в перисинусодиальном пространстве.

Как было сказано выше, миграция ГСК из костного мозга в ткани во многом зависит также от фактора G-CSF, уровень секреции которого находится под влиянием норадренергических сигналов симпатической нервной системы [218]. Установлено, что рядом с перисинусоидальным пространством и ЗКП находятся нервные окончания симпатической нервной системы [181, 206, 247], а в ответ на симпатическую стимуляцию ЗКП путём секреции простагландинов F2a и D активируют гликогенолиз в паренхиматозных клетках [19]. Таким образом, данное перисинусодиальное пространство, также как и ниша для ГСК, находится под влиянием симпатической нервной системы.

В формировании перисинусоидального пространства и поддержании «покоящегося», недифференцированного состояния стволовых клеток также участвуют и гепатоциты. В качестве доказательства можно привести результаты эксперимента по культивированию ЗКП с гепатоцитами, разделёнными полупроницаемой мембраной. В ходе этого эксперимента было показано, что в фенотипе ЗКП сохранялась экпрессия маркёров стволовых клеток CD133, Oct4 и не происходило трансдифференцировки ЗКП в миофибробласты, тогда как в монокультуре ЗКП уже к концу первой недели культивирования ЗКП приобретают фенотип миофибробластов и теряют экспрессию CD133 и Oct4. Установлено, что подобное влияние гепатоцитов на ЗКП обусловлено секрецией ими факторов Wnt и Jagl, свзывающихся с рецепторами Мус, Notch 1 на ЗКП [212]. Как было сказано ранее, в нише стволовых клеток Wnt/b-catenin и Notch сигнальные пути обеспечивают медленное и асимметричное деление стволовых клеток [17, 137].

Таким образом, перисинусоидальное пространство действительно обладает чертами ниши стволовых клеток, необходимыми для поддержания их свойств и фенотипа. Поскольку действие всех факторов данного пространства оказывает большое влияние на фенотип и свойства располагающихся в нём ЗКП, то логично предположить, что ЗКП могут быть стволовыми клетками печени.

Исследования свойств ЗКП показали, что сами ЗКП также могут влиять на фенотип и свойства окружающих их клеток, создавая для них своего рода микроокружение. Это микроокружение устанавливается благодаря растворимым факторам роста ЗКП, а также продуцируемых ЗКП компонентам межклеточного матрикса и непосредственным межклеточным контактам [87]. Рассмотрим каждый из компонентов микроокружения, создаваемого ЗКП, более подробно.

2.2 Компоненты микроокружения стволовых клеток печени

2.2.1 Растворимые факторы роста

Среди факторов роста, секретируемых ЗКП, наиболее важным является фактор роста гепатоцитов - Hepatocyte Growth Factor, HGF. Необходимо заметить, что ЗКП - единственный источник данного фактора роста в печени [110, 154, 232, 234]. Действие HGF направлено на гепатоциты [71, 117, 197] и приводит к активации синтеза ДНК при их повреждении. Также данный фактор роста необходим для нормального развития эпителиальных клеток печени, а именно, для их выживания, пролиферации и миграции (другое его название -рассеивающий фактор, scatter factor [71, 29, 164]), а также эпителиально-мезенхимной транс дифференцировки [155]. Известно, что при остром повреждении печени синтез HGF запускается одним из первых, уже через 3-6 часов после частичной гепатэктомии, и длится порядка 24-х часов. За этот период времени происходит 20-ти кратное увеличение концентрации HGF в плазме крови [75, 110], что стимулирует миграцию прогениторных клеток в печень [1 15]. Установлено, что дефект данного фактора роста и/или его рецептора C-met у мышей приводит к недоразвитию (гипоплазии) печени, ингибированию пролиферации гепатобластов и, как следствие, разрушению её паренхимы, а

также повышению уровня апоптоза и снижению клеточной адгезии [69]. Помимо действия in vivo HGF также является сильным митогеном для гепатоцитов in vitro [171]. Кроме того, HGF является одним из главных факторов роста, добавляемых к стволовым клеткам для индуцирования гепатоцитарной дифференцировки, при этом его действие направлено на культуру клеток, образовавших монослой и прекративших активную пролиферацию [55, 100, 109, 190]. Предполагают, что предтрансплантационная дифференцировка МСК в гепатоциты при культивировании с HGF способствует регенерации печени после воздействия четырёххлористого углерода (ССЦ), что проявляется уменьшением уровня трансаминаз в крови и повышением количества сывороточного альбумина [16, 239]. Более того, те же исследователи предполагают, что трансплантация преддифференцированных МСК снижает риск развития фиброза печени, который теоретически мог быть спровоцирован введением фракции стромальных клеток [16, 239].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шафигуллина, Айгуль Касыймовна, 2013 год

6. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ

ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гумерова A.A. Экспрессия маркеров различных типов клеток печени на ранних этапах пренатального развития человека / A.A. Гумерова, М.А.Титова, А.П. Киясов//Цитология.-2007.-Т. 2. - Р. 133-141.

2. Изменение активности воспаления и выраженности фиброза у больных алкогольным циррозом печени после трансплантации аутогенных гемопоэтических стволовых клеток / Г.Р. Бурганова [и др.] // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2012. - Т.7, №3. - С.34-36.

3. Звёздчатые клетки печени стимулируют дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крысы в гепатоциты in vitro / A.A. Гумерова [и др.] // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2012. - Т.6, №4.-С.72-81.

4. Киясов А.П. Мезенхимально-эпителиальная трансформация клеток Ито in vitro / А.П. Киясов, A.A. Гумерова, М.А. Титова // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. - № 3. - С. 150-154.

5. Киясов А.П. Экспрессия цитокератинов в пре- и постнатальном онтогенезе / А.П. Киясов, A.A. Гумерова, М.М. Билалов // Онтогенез. - 1997. - Т. 28, № 5. -С. 389-393.

6. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клони-рование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук // М.: Мир, 1984. — 480 с.

7. Сравнение различных методов выделения, мечения и трансплантации звёздчатых клеток печени крысы / А.К. Шафигуллина [и др.] // Клеточная

Трансплантология и Тканевая Инженерия. Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета. - 2013. - Т.8, №3. - С. 147-151.

8. Трансплантированные звёздчатые клетки печени участвуют в регенерации органа после частичной гепатэктомии без риска развития фиброза печени / А.К. Шафигуллина [и др.] // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2012. - Т.7, №3. - С. 169-172.

9. Activation of rat liver perisinusoidal lipocytes by transforming growth factors derived from myofibroblastlike cells. A potential mechanism of self perpetuation in liver fibrogenesis / M.G. Bachem [et al.] // J. Clin. Invest. - 1992. - V. 89. - P. 1927.

10. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes/ A. Banas [et al.] // Hepatology. - 2007. - V. 46, № 1. - P. 219-228.

11. Administration of fibroblast growth factor 2 in combination with bone marrow transplantation synergistically improves carbon-tetrachloride-induced liver fibrosis in mice / T. Ishikawa [et al.] // Cell Tissue Res. - 2007. - V. 327, № 3. - P. 463470.

12. Alison M.R. An introduction to stem cells / M.R. Alison, R. Poulsom, N.A. Wright // J.Path. - 2002. - V. 197. - P. 419-423.

13. Allogeneic blood stem cell transplantation for refractory leukemia and lymphoma: potential advantage of blood over marrow allografts / M. Korbling [et al.] // Blood. - 1995.-V. 85. - P.l659-1665.

14. A matrix metalloproteinase-9 activation cascade by hepatic stellate cells in transdifferentiation in the three-dimensional extracellular matrix / Y.P. Han [et al.] // J Biol Chem.-2007,-V. 282, № 17.-P. 12928-12939.

15. Anderson W.M. Carbocyanine dyes with long alkyl side-chains: broad spectrum inhibitors of mitochondrial electron transport chain activity / W.M. Anderson, D. Trgovcich-Zacok // Biochem Pharmacol. - 1995. -V. 49, № 9. - P. 1303-1311.

16. Application of mesenchymal stem cells to liver regenerative medicine / K. Yagi [et al.] // YakugakuZasshi.-2008.-V. 128, № l.-P. 3-9.

17. A role for WNT signaling in self-reneval of haemotopoietic stem cell / T. Reya [et al.] // Nature. - 2003. - V. 423. - P. 409-414.

18. Artavanis-Tsakonas S. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development / S. Artavanis-Tsakonas, M.D. Rand, R.J. Lake // Science. - 1999. -V. 284, № 5415.-P. 770-776.

19. Athary A. Prostaglandin F2a and D2 release from primary Ito cell cultures after stimulation with noradrenaline and ATP but not adenosine / A. Athary, K. Hanecke, K. Jungermann // Hepatology. - 1994. - V. 20. - P. 142-148.

20. Autologous CD34+ and CD133+ stem cells transplantation in patients with end stage liver disease / H. Salama [et al.] // World J Gastroenterol. - 2010. - V. 16, № 42.-P. 5297-5305.

21. Autologous hematopoietic stem cell transplantation in 48 patients with end-stage chronic liver diseases / H. Salama [et al.] // Cell Transplantation. - 2010. - V. 19. -P. 1475-1486.

22. Autologous infusion of expanded mobilized adult bone marrow-derived CD34+ cells into patients with alcoholic liver cirrhosis / M. Pai [et al.] // Am J Gastroenterol.-2008.-V. 103, №8.-P. 1952-1958.

23. Autologous transplantation of bone marrow-derived mononuclear and CD 133+ cells in patients with decompensated cirrhosis / S. Nikeghbalian [et al.] // Archives of Iranian Medicine.-2011,-V. 14, № 1.-P. 12-17.

24. Basic fibroblast growth factor treatment for non-steroidal anti-inflammatory drug associated gastric ulceration / M.A. Hull [et al.] // Gut. - 1995. - V. 37, № 5. -P. 610-612.

25. Basic fibroblast growth factor-induced activation of latent transforming growth factor beta in endothelial cells: regulation of plasminogen activator activity / R. Flaumenhaft [et al.] // J Cell Biol. - 1992. - V. 118. № 4. - P. 901-909.

26. Bcl-2 maintains B cell memory / G. Nunez [et al.] // Nature. - 1991. - V. 353, № 6339.-P. 71-73.

27. Ber-Ep4: New monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia / U. Latza [et al.] //J Clin Pathol. - 1990. - V. 43.-P. 213-219.

28. Bernardo M.E. Mesenchymal stromal cells Bernardo / M.E. Bernardo, F. Locatelli, W.E. Fibbe//Ann N Y Acad Sci. - 2009. - V. 1176.-P. 101-117.

29. Birchmeier C. Developmental roles of HGF/SF and its receptor, the c-Met tyrosine kinase / C. Birchmeier, E. Gherardi // Trends Cell Biol. - 1998. - V. 8. - P. 404410.

30. Blood stem cell transplantation: factors influencing cellular immunological reconstitution / J.G. Sharp [et al.] // J. Hematother. Stem Cell Res. - 2000. - V. 9. -P. 971-981.

31. Blood stem cells compared with bone marrow as a source of hematopoietic cells for allogeneic transplantation / R.E. Champlin [et al.] // IBMTR Histocompatibility and Stem Cell Sources Working Committee and the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Blood. - 2000. - V. 95. - P. 3702-3709.

32. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm / V. Gouon-Evans [et al.] // Nat. Biotechnol. - 2006. - V. 24. -P. 1402-1411.

33. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells / B.E. Petersen [et al.] // Science. - 1999,-V. 284.-P. 1168-1170.

34. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion / N. Terada [et al.] // Nature. - 2002. - V. 416, № 6880. - P. 542-545.

35. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium / D. Orlic [et al.] // Nature. -2001.-V. 410. - P. 701-705.

36. Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury / A.B. Carvalho [et al.] // Stem Cells. -2008. - V. 26, № 5. _p. 1307-1314.

37. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications / P. Bianco [etal.] // Stem Cells. - 2001.-V. 19,№. 3.-P. 180-192.

38. Bone marrow-derived cells express matrix metalloproteinases and contribute to regression of liver fibrosis in mice / R. Higashiyama [et al.] // Hepatology. - 2007. -V. 45, № l.-P. 213-222.

39. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rats / D.C. Zhao [et al.] // World J Gastroenterol. - 2005. - V. 11, № 22. -P. 3431-3440.

40. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century / A.l. Caplan, S.P. Bruder // Trends Mol Med. - 2001. - V. 7, № 6. - P. 259-264.

41. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells / C. Kordes [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 2007. - V. 352, № 2. - P. 410-417.

42. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes / X. Wang [et al.] // Nature. - 2003. - V. 422. - P. 897-901.

43. Cell sources of liver development and regeneration. In search of hepatic stem cells / A. Gumerova, A. Kiassov, S. Abdulkhakov, I. Gazizov, A. Shafigullina, D. Andreeva, A. Trondin, M. Kaligin, M. Titova, T. Yilmaz // LAP Lambert Academic Publishing. - 2012. - 128.

44. Chamberlain G. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing / G. Chamberlain, J. Fox, A.B, Middleton // J. Stem cells. - 2007. -V. 25. - P. 27392749.

45. Characterization and isolation of ductular cells coexpressing neural cell adhesion molecule and Bcl-2 from primary cholangiopathies and ductal plate malformations / L. Fabris [etal.]//Am. J. Pathol. - 2000. - V. 156.-P. 1599-1612.

46. Characterization of cells in the developing human liver / S. Nava [et al.] // Differentiation. - 2005. - V. 73. - P. 249-260.

47. Commitment of bone marrow cells to hepatic stellate cells in mouse / S. Baba [et al.] // J Hepatol. - 2004. - V. 40, № 2. - P. 255-260.

48. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue / S. Kern [et al.] // Stem Cells. - 2006. - V. 24, № 5. - P. 1294-1301.

49. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow / D.A. De Ugarte [et al.] // Cells Tissues Organs. - 2003. - V. 174. - P. 101-109.

50. Condic M.L. The basic about stem cells / M.L. Condic // First Thigs. - 2002. -V.l 19. - P.30-34.

51.Confocal microscopy immunofluorescence localization of desmin and other intermediate filament proteins in fetal rat livers / J.Vassy [et al.] // Hepatology. -1993.-V. 17, №2.-P. 293-300.

52. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation / N.D. Theise [et al.] // Hepatology. - 2000. -V. 31. - P. 235-240.

53. Desmin expressing nonhematopoietic liver cells during rat liver development: an immunohistochemical and morphometric study / A.P. Kiassov [et al.] // Differentiation.-1995.-V. 59, №4.-P. 253-258.

54. Desmin-containing stellate cells in rat liver; distribution in normal animals and response to experimental acute liver injury / A.D. Burt [et al.] // J Pathol. - 1986. -V. 150, № l.-P. 29-35.

55. Development of a non-transformed human liver cell line with differentiated-hepatocyte and urea-synthetic functions: applicable for bioartificial liver / J.H. Yoon [et al.] // Int J Artif Organs. - 1999. - V. 22, № 11. - P. 769-777.

56. Development of hepatic sinusoidal structute with special reference to the Ito cells / H. Enzan [et al.] // Microsc. Res. Tech. - 1997. - V. 39, № 4. - P. 336-349.

57. Dezawa M. Insights into autotransplantation: the unexpected discovery of specific induction systems in bone marrow stromal cells / M. Dezawa // Cell Mol Life Sci. -2006. - V. 63, № 23. - P. 2764-2772.

58. Differential expression of matrix-metalloproteinase-1 and -2 genes in normal and fibrotic human liver / S. Milani [et al.] // Am J Pathol. - 1994. - V. 144, № 3. -P. 528-537.

59. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo / M.J. Seo [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 2005. - V. 328, № 1. -P. 258-264.

60. Differentiation of liver epithelial (stem-like) cells into hepatocytes induced by coculture with hepatic stellate cells / H. Nagai [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. - V. 293, № 5. - P. 1420-1425.

61. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts / N. Bosselut [et al.] // Proteomics. - 2010. - V. 10, № 5.-P. 1017-1028.

62. Dual action of retinoic acid on human embryonic/fetal hematopoiesis: blockade of primitive progenitor proliferation and shift from multipotent/erythroid/monocytic to granulocytic differentiation program / A. Tocci [et al.] // Blood. - 1996. - V. 88, № 8.-P. 2878-2888.

63. Duncan S.A. Mechanisms controlling early development of the liver / S.A. Duncan // Mech. Dev. - 2003. - V. 120. - P. 19-33.

64. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation / E. Gussoni [et al.] // Nature. - 1999. - V. 401. - P. 390-394.

65. Eckardt K.U. Erythropoietin production in liver and kidneys / K.U. Eckardt // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. - 1996. -V. 5, № 1. - P. 28-34.

66. Effect of vitamin A deficiency on the integrity of hepatocytes after partial hepatectomy / R.P. Evarts [et al.] // Am. J. Pathol. - 1995. - V. 147, № 3. - P. 699706.

67. Effects of hepatectomized rat serum on the transdifferentiation of adult rat bone marrow cells into hepatocyte-like cells / B.J. Zhou [et al.] // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. - 2004. - V. 12, № 12. - P. 730-733.

68. Epimorphin expression and stellate cell status in mouse liver injury / R. Yoshino [et al.] // Hepatol. Res. - 2006. - V. 34. - P. 238-249.

69. Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud / F. Bladt [et al.] // Nature. - 1995. - V. 376. - P. 768-771.

70. Evidence for mesenchymal-epithelial transition associated with mouse hepatic stem cell differentiation / B. Li [et al.] // 2PLoS ONE. - 2011. - V. 6, № 2. - P. el 7092.

71. Evidence for the identity of human scatter factor and human hepatocyte growth factor / K.M. Weidner [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - V. 88. -P. 7001-7005.

72. Expression and regulation of cell adhesion molecules by hepatic stellate cells (HSC) of rat liver: involvement of HSC in recruitment of inflammatory cells during hepatic tissue repair / T. Knittel [et al.] // Am J Pathol. - 1999. - V. 154, № 1. - P. 153-167.

73. Expression of acidic fibroblast growth factor in regenerating liver and during hepatic differentiation / E.R. Marsden [et al.] // Lab. Invest. - 1992. - V. 67, № 4. -P. 427-433.

74. Expression of hepatocyte growth factor gene in endothelial and Kupffer's cells of damaged rat livers as revealed by in situ hybridization / S. Noji [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1990. - V. 173. - P. 42-47.

75. Expression of hepatocyte growth factor mRNA in regenerating rat liver after partial hepatectomy / R. Zarnegar [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 1991. - V. 177, № l.-P. 559-565.

76. Expression of hepatocyte-like phenotypes in bone marrow stromal cells after HGF induction / P.P. Wang [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 2004. - V. 320, № 3. - P. 712-716.

77. Expression of homologously recombined erythropoietin SV 40T antigen fusion gene in mouse liver: evidence for erythropoetin production by Ito cells / P.H. Maxwell [et al.] // Blood. - 1994. - V. 84. - P. 1823-1830.

78. Expression of NCAM in activated portal fibroblasts during regeneration of the rat liver after partial hepatectomy / K. Nakatani [et al.] // Arch Histol Cytol. - 2006. -V. 69, № l.-P. 61-72.

79. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat / T.H. Kim [et al.] // Hepatology. - 1997. - V. 26, № 4. - P. 896-904.

80. Fausto N. Liver Regeneration and Repair: Hepatocytes, Progenitor Cells, and Stem Cells / N. Fausto // Hepatology. - 2004. - V. 39, № 6 - P. 147-1487.

81. Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor beta 1 interactions in human liver myofibroblasts / J. Rosenbaum [et al.] // Gastroenterology. -1995. - V. 109, №6.-P. 1986-1996.

82. Fibroblast growth factor 2 facilitates the differentiation of transplanted bone marrow cells into hepatocytes / T. Ishikawa [et al.] // Cell Tissue Res. - 2006. - V. 323, № 2.-P. 221-231.

83. Fibroblast growth factor-4 and hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes / X.Q. Kang [et al.] // World J Gastroenterol. - 2005. - V. 11, № 47. - P. 7461-7465.

84. Fibrogenic potential of human multipotent mesenchymal stromal cells in injured liver / R.M. Baertschiger [et al.] // PLoS One. - 2009. - V. 4, № 8. - P. e6657.

85. Fibronectin regulates morphology, cell organization and gene expression of rat fetal hepatocytes in primary culture / A. Sanchez [et al.] // J. Hepatol. - 2000. - V. 32. -P. 242-250.

86. Foxfl J_ mice exhibit defective stellate cell activation and abnormal liver regeneration following CC14 injury / V.V. Kalinichenko [et al.] // Hepatology. -2003. - V.37. -P. 107-117.

87. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver / S.L. Friedman // Physiol. Rev. - 2008. - V. 88. - P. 125-172.

88. Friedman S.L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. // Liver Cirrhosis and its Development: J.L.Boyer et al. (Eds.) - Dordrecht -Boston - London: Kluwer Academic Publishers. - 2001. - P. 30-39.

89. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice / T.R. Brazelton // Science. - 2000. - V. 290. - P. 1775-1779.

90. Fuchs E. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche / E. Fuchs, T. Tumbar, G. Guasch // Cell. - 2004. - V. 116. - P. 769-778.

91.Fujio K. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat / K. Fujio // Lab. Invest. - 1994. -V. 70. - P. 511-516.

92. Functional integration of hepatocytes derived from human mesenchymal stem cells into mouse livers /1. Aurich [et al.] // Gut. - 2007. - V. 56, № 3. - P. 405-415.

93. Functional network analysis of the transcriptomes of mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid, amniotic membrane, cord blood, and bone marrow / M.S. Tsai [et al.] // Stem Cells. - 2007. - V. 25, № 10. - P. 2511-2523.

94. Generation of tissue-specific cells from MSC does not require fusion or donor-to-host mitochondrial/membrane transfer / E.J. Colletti [et al.] // Stem Cell Res. -2009.-V. 2, №2.-P. 125-138.

95. Granulocyte-colony stimulating factor administration ameliorates liver regeneration in animal model of fulminant hepatic failure and encephalopathy / S.E. Theocharis // Dig. Dis. Sci. -2003. - V. 48.-P. 1797-1803.

96. Grompe M. Adult liver stem cells / M. Grompe // Essentials of stem cell biology. -2009.-V. 34.-P. 285-298.

97. Grompe M. The role of bone marrow stem cells in liver regeneration / M. Grompe // Semin Liver Dis. - 2003. - V. 23. - P. 363-372.

98. Haider H. Bone marrow stem cell transplantation for cardiac repair / H. Haider, M. Ashraf// Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2005. - V. 288. - P. H2557-H2567.

99. Hall P.A. Stem cells: the generation and maintenance of cellular diversity / P.A. Hall, F.M. Watt // Development. - 1989. - V. 106, № 4. _p. 619-633.

100. Hamamoto R. Growth and differentiation of cultured fetal hepatocytes isolated various developmental stages / R. Hamamoto, M. Kamihira, S. lijima // Biosci Biotechnol Biochem. - 1999. - V. 63, № 2. - P. 395-401.

101. Hautekeete M.L. The hepatic stellate (Ito) cell: its role in human liver disease / M.L. Hautekeete, A. Geerts // Virchows Arch. - 1997. - V. 430. - P. 195-207.

102. Hematopoietic mobilization in mice increases the presence of bone marrow-derived hepatocytes via in vivo cell fusion / O. Quintana-Bustamante [et al.] // Hepatology. - 2006. - V. 43, № l.-P. 108-116.

103. Hematopoietic stem cells are uniquely selective in their migratory response to chemokines / D.E. Wright [et al.] // J. Exp. Med. - 2002. - V. 195. - P. 1145-1154.

104. Hepatic potential of bone marrow stromal cells: development of in vitro co-culture and intra-portal transplantation models / J.M. Luk [et al.] // J Immunol Methods.-2005,-V. 305, № l.-P. 39-47.

105. Hepatic stellate cells modulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells / X. Deng [et al.] // J Cell Physiol. - 2008. - V. 217,№ l.-P. 138-144.

106. Hepatic stellate cells reversibly express alpha-smooth muscle actin during acute hepatic ischemia / L. Rubbia-Brandt [et al.] // Transplant. Proc. - 1997. - V. 29. - P. 2390-2395.

107. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from human adipose tissue in vitro promotes hepatic integration in vivo / H. Aurich [et al.] // Gut. - 2009. - V. 58, №4.-P. 570-581.

108. Hepatocyte growth factor and fibroblast growth factor-4-induced differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells in vitro / J.M. Xie [et al.] // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. - 2006. - V. 26. № 10. - P. 1439-1442.

109. Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro / S.H. Oh [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 2000. - V. 279, № 2. - P. 500-504.

110. Hepatocyte growth factor/hepatopoietin A is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblast-like cells derived from fat-storing cells / P. Schirmacher [et al.]//Hepatology. - 1992. - V. 15.-P. 5-11.

111. Hepatocytes derived from bone marrow stem cells demonstrate polyploidisation / S.J.Forbes [et al.] //J Hepatol. - 2001.-V. 34, № l.-P. 20-21.

112. Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells / M.R. Alison [et al.] // Nature. -2000. - V. 406, № 6793. - P. 257.

113. Hepatocytic differentiation of mesenchymal stem cells in cocultures with fetal liver cells / C. Lange [et al.] // World J Gastroenterol. - 2006. - V. 12, № 15. -P. 2394-2397.

114. Hepatocytic gene expression in cultured rat mesenchymal stem cells / C. Lange [et al.] // Transplant Proc. - 2005. - V. 37, № 1. - P. 276-279.

115. HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver / O. Kollet [et al.] // J Clin Invest. - 2003. - V. 112, № 2. -P. 160-169.

116. Human bone marrow multipotent adult progenitor cells differentiate into hepatocyte-like cells with hepatocyte growth factor plus fibroblast growth factor-4 in vitro / L.J. Tang [et al.] // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. - 2005. - V. 13, № 9.-P. 652-655.

117. Human hepatocyte growth factor in plasma from patients with fulminant hepatic failure / E. Gohda [et al.]//Exp. Cell Res. - 1986. - V. 166.-P. 139-150.

118. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion / Y. Sato [et al.] // Blood. - 2005. - V. 106, №2.-P. 756-763.

119. Human progenitor cells with high aldehyde dehydrogenase activity efficiently engraft into damaged liver in a novel model / P. Zhou [et al.] // Hepatology. - 2009. -V. 49, №6.-P. 1992-2000.

120. Identification of adult hepatic progenitor cells capable of repopulating injured rat liver / M.I. Yovchev [et al.] // Hepatology. - 2008. - V. 47. - P. 636-647.

121. Identification of common pathways mediating differentiation of bone marrow-and adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells into three mesenchymal lineages / T.M. Liu [et al.] // Stem Cells. - 2007. - V. 25, № 3. - P. 750-760.

122. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size / J. Zhang [et al.] // Nature. - 2003. - V. 425. - P. 836-841.

123. IFATS collection: in vivo therapeutic potential of human adipose tissue mesenchymal stem cells after transplantation into mice with liver injury / A. Banas [et al.] // Stem Cells. - 2008. - V. 26, № 10. - P. 2705-2712.

124. Immunocytochemical detection of desmin in fat-storing cells (Ito cells) / Y. Yokoi [et al.] // Hepatology. - 1984. - V. 4. - P. 709-714.

125. Impaired wound healing in embryonic and adult mice lacking vimentin / B.J. Eckes [et al.] // J Cell Sei. - 2000. - V. 113, Pt 13. - P. 2455-2462.

126. Implications of the immunoregulatory functions of mesenchymal stem cells in the treatment of human liver diseases / H. Lin [et al.] // Cell Mol Immunol. - 2011. - V. 8, № 1. - P. 19-22.

127. Improved conditions to induce hepatocytes from rat bone marrow cells in culture / M. Miyazaki [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 2002. - V. 298, № 1. -P. 24-30.

128. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuroblastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: a novel system for modeling cancer cell micro-environment / A.A. Rizvanov [et al.] // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2010. - V. 76, № 2. - P.253-259.

129. In vitro differentiation of fat-storing cells parallels marked increase of collagen increase and secretion / A. Geerts [et al.] // J. Hepatol. - 1989. - V. 9. - P. 59-68.

130. In vitro differentiation of mouse bone marrow stromal stem cells into hepatocytes induced by conditioned culture medium of hepatocytes / Y. Chen [et al.] // J Cell Biochem. - 2007. - V. 102, № l.-P. 52-63.

131. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells / K.D. Lee [et al.] // Hepatology. - 2004. - V. 40, № 6. - P. 1275-1284.

132. Intercellular Communication in Normal and Regenerating Rat Liver: A Quantitative Analysis / J. David [et al.] // The Journal of Cell Biology. - 1981. -

V. 91.-P. 505-523.

133. Intermediate filaments in skeletal and cardiac muscle tissue in embryonic and adult chicken / K.T. Tokuyasu [et al.] // Ann. NY Acad. Sci. - 1985. - V. 455. - P. 200-212.

134. Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population / C.M. Baum [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. - 1992. - V. 89. - P. 2804-2808.

135. Isolation of mesenchymal stem cells from human placenta: comparison with human bone marrow mesenchymal stem cells / Z. Miao [et al.] // Cell Biol Int. -

2006.-V. 30, №9.-P. 681-687.

136. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood / O.K. Lee [et al.]//Blood. - 2004. - V. 103, №5.-P. 1669-1675.

137. Jagged 1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal / Y. Nyfeler [et al.] // EMBO J. - 2005. - V. 24. - P. 3504-3515.

138. Jan Y.N. Asymmetric cell division / Y.N. Jan, L.Y. Jan // Nature. - 1998. -V. 392, № 6678. - P. 775-778.

139. Kmiec Z. Cooperation of liver cells in health and disease / Z. Kmiec // Adv Anat Embryol Cell Biol. -2001. - V. 161, № 3-13.-P. 151.

140. Knook D.L. Fat-storing cells of the rat liver / D.L. Knook, A.M. Seffelaar, A.M. de Leeuw // Exp. Cell Res. - 1982. - V. 132. - P. 468-471.

141. Kordes C. Hepatic and pancreatic stellate cells in focus / C. Kordes, I. Sawitza, D. Haussinger//Biol Chem. - 2009. - V. 390, № 10.-P. 1003-1012.

142. Kubota H. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis / H. Kubota, H.L. Yao, L.M. Reid // Stem Cells. -

2007. - V. 25, № 9. - P. 2339-2349.

143. Kupffer cell depletion by gadolinium chloride enhances liver regeneration after partial hepatectomy in rats / R.M. Rai [et al.] // Am J Physiol. - 1996. - V. 270, № 6.-P. G909-G918.

144. Lewis J. Notch signalling and the control of cell fate choices in vertebrates / J. Lewis // Semin Cell Dev Biol. - 1998. - V. 9, № 6. - P. 583-589.

145. Li H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-based liver gene delivery/ H. Li // Journal of Hepatology. - 2011. - V. 54. - P. 930-938.

146. Lin H. The self-renewing mechanism of stem cells in the germline / H. Lin // Curr Opin Cell Biol. - 1998,- V. 10, №6.-P. 687-693.

147. Liu Z.C. Transdifferentiation of bioencapsulated bone marrow cells into hepatocyte-like cells in the 90% hepatectomized rat model / Z.C. Liu, T.M. Chang // Liver Transpl. - 2006. - V. 12, № 4. - P. 566-572.

148. Liver expression of epidermal growth factor RNA. Rapid increases in immediate-early phase of liver regeneration / B. Mullhaupt [et al.] // J Biol Chem. - 1994. - V. 269, №31.-P. 19667-19670.

149. Liver from bone marrow in humans / N.D. Theise [et al.] // Hepatology. - 2000. -V. 32.-P. 11-16.

150. Liver-specific gene expression in mesenchymal stem cells is induced by liver cells / C. Lange [et al.] // World J Gastroenterol. - 2005. - V. 11, № 29. - P. 44974504.

151. Long-term hematopoietic stem cells require stromal cell-derived factor-1 for colonizing bone marrow during ontogeny / T. Ara [et al.] // Immunity. - 2003. - V. 19, №2.-P. 257-267.

152. Lu B. Asymmetric cell division: lessons from flies and worms / B. Lu, L.Y. Jan, Y.N. Jan // Curr Opin Genet Dev. - 1998. - V. 8, №4. - P. 392-399.

153. Magnetically labeled mesenchymal stem cells after autologous transplantation into acutely injured liver / X.L. Shi [et al.] // World J Gastroenterol. - 2010. - V. 16, № 29. - P. 3674-3679.

154. Maher J.J. Cell-specific expression of hepatocyte growth factor in liver. Upregulation in sinusoidal endothelial cells after carbon tetrachloride / J.J. Maher // J. Clin. Invest. - 1993. - V. 91, № 5. - P. 2244-2252.

155. Matsumoto K. Emerging multipotent aspects of hepatocyte growth factor / K. Matsumoto, T. Nakamura//J. Biochem. Tokyo. - 1996.-V. 119, № 4. - P. 591-600.

156. Mauro A. Satellite cell of skeletal muscle fibers / A. Mauro // J. Biophys Biochem Cytol. - 1961. - V. 9. - P. 493-495.

157. McLin V.A. Molecular control of liver development / V.A. McLin, A.M. Zorn // Clin Liver Dis.-2006.-V. 10, №1,-P. 1-25.

158. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure / B. Parekkadan [et al.] // PLoS One. - 2007. - V. 2, № 9. - P. 1-6.

159. Mesenchymal stem cells and the immune system—immunosuppression without drugs? / J. Kiss [et al.] // Orv Hetil. - 2008. - V. 149, № 8. - P. 339-346.

160. Mesenchymal stem cells are susceptible to human herpesviruses, but viral DNA cannot be detected in the healthy seropositive individual / M. Sundin [et al.] // Bone Marrow Transplant. - 2006. - V. 37, № 11. - P. 1051 -1059.

161. Mesoderm-specific expression of the divergent homeobox gene Hlx during murine embryogenesis / T.J. Lints [et al.] // Dev. Dyn. - 1996. - V. 205. - P. 457470.

162. Meyer D.H. Modulation of hepatic lipocyte proteoglycan synthesis and proliferation by Kupffer cellderived transforming growth factors type beta 1 and type alpha / D.H. Meyer, M.G. Bachem, A.M. Gressner // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1990.-V. 171.-P. 1122-1129.

163. Microencapsulated UCB cells repair hepatic injure by intraperitoneal transplantation / S. Li [et al.] // Cytotherapy. - 2009. - V. 11, № 8. - P. 1032-1040.

164. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply / Y. Nakanuma [et al.] // Microsc. Res. Tech. -1997.-V. 38.-P. 552-570.

165. Minguell J.J. Mesenchymal stem cells / J.J. Minguell, A. Erices, P. Conget // Exp Biol Med (Maywood). - 2001. - V. 226, № 6. - P. 507-520.

166. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement / M. Dominici [et al.] // Cytotherapy. - 2006. - V. 8. - P. 315-317.

167. Mitogenic effect of transforming growth factor-beta 1 on human Ito cells in culture: evidence for mediation by endogenous platelet-derived growth factor / K.M. Win [etal.] // Hepatology. - 1993. - V. 18, № l.-P. 137-145.

168. Mitogenic signals for platelet-derived growth factor isoforms in liver fat-storing cells / M. Pinzani [et al.] // Am J Physiol. - 1991. - V. 260, № 3, Pt 1. - P. C485-C491.

169. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival / D. Orlic [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. - 2001. - V. 98. - P. 1034410349.

170. Modulation of alpha smooth muscle actin and desmin expression in perisinusoidal cells of normal and diseased human livers / A. Schmitt-Graff [et al.] // Am. J. Pathol. - 1991.-V. 138.-P. 1233-1242.

171. Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor / T. Nakamura [et al.] // Nature. - 1989. - V. 342, № 6248. - P. 440-443.

172. Morrison S.J. Regulatory mechanisms in stem cell biology / S.J. Morrison, N.M. Shah, D.J. Anderson//Cell. - 1997,-V. 88, №3.-P. 287-298.

173. Morrison S.J. Stem cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life / S. J. Morrison, A. C. Spradling // Cell. - 2008. -V. 132. - P. 598-611.

174. MUC1 (EMA) is preferentially expressed by ALK positive anaplastic large cell lymphoma, in the normally glycosylated or only partly hypoglycosylated form / R.L. ten Berge [et al.] // J Clin Pathol. - 2001. -V. 54. -P. 933-939.

175. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells / M.F. Pittenger [et al.] // Science. - 1999. - V. 284, № 5411. - P. 143-147.

176. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell / D.S. Krause [et al.] // Cell. - 2001. - V. 105. - P. 369-377.

1 77. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells / R.E. Schwartz [et al.] // J. Clin. Invest. - 2002. - V. 109. - P. 1291-1302.

178. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors / G. Ferrari |et al.]//Hum Immunol. - 1998. - V. 59.-P. 137-148.

179. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease / D.W. Powell [et al.] // Am J Physiol. - 1999. - V. 277, № 1, Pt 1. - P. C1-C9.

180. Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells / D. Campard [et al.] // Gastroenterology. - 2008. - V. 134, №3,-p. 833-848.

181. Nerves and perisinusoidal cells in human liver / P. Bioulac-Sage [et al.] // J. Hepatol. - 1990.-V. 10. - P.105-112.

182. Neufeld D.S. Isolation of rat liver hepatocytes / D.S. Neufeld // Methods Mol Biol.- 1997,-V. 75.-P. 145-151.

183. Newsome P.N. Human Cord Blood-Derived Cells Can Differentiate Into Hepatocytes in the Mouse Liver With No Evidence of Cellular Fusion / P.N. Newsome // Gastroenterology. - 2003. - V. 124. - P. 1891-1900.

184. No contribution of multipotent mesenchymal stromal cells to liver regeneration in a rat model of prolonged hepatic injury / F.C. Popp [et al.] // Stem Cells. - 2007. -V. 25, №3,-P. 639-645.

185. Oakberg E.F. Spermatogonial stem-cell renewal in the mouse / E.F.Oakberg // Anat Rec. - 1971.-V. 169.-P. 515-531.

186. Ong S.Y. Hepatic differentiation potential of commercially available human mesenchymal stem cells / S.Y. Ong, H. Dai, K.W. Leong // Tissue Eng. - 2006. - V. 12, № 12.-P. 3477-3485.

187. Orlic D. Hematopoietic stem cells biology and transplantation / D. Orlic, T.A. Bock, L. Kanz // Annals of The New York Academy of Sciences (New York, NY). - 1999.-P.405.

188. Peifer M. Signal transduction. Neither straight nor narrow / M. Peifer // Nature. -1999. - V. 400, № 6741. - P. 213-215.

189. Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis / M. Mohamadnejad [et al.] // Arch Iran Med. - 2007. - V. 10, № 4. - P. 459-466.

190. Phenobarbital suppresses growth and accelerates restoration of differentiation markers of primary culture rat hepatocytes in the chemically defined hepatocyte growth medium containing hepatocyte growth factor and epidermal growth factor / M. Miyazaki [et al.] // Exp Cell Res. - 1998. - V. 241, № 2. - P. 445-457.

191. Pleiotrophin/heparin-binding growth-associated molecule as a mitogen of rat hepatocytes and its role in regeneration and development of liver / K. Asahina [et al.] // Am. J. Pathol. - 2002. - V. 160. - P. 2191-2205.

192. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow / Y. Jiang [et al.] // Nature. - 200. - V. 418, № 6893. - P. 41-49.

193. Potten C.S. Regulation and significance of apoptosis in the stem cells of the gastrointestinal epithelium / C.S. Potten, J.W. Wilson, C. Booth // Stem Cells. -1997.-V. 15, №2.-P. 82-93.

194. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method / A.J. Friedenstein [et al.] // Exp Hematol. - 1974. -V. 2. - P. 83-92.

195. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues /

D.J. Prockop // Science. - 1997. - V. 276, № 5309. - P. 71-74.

196. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis / S. Milani [et al.] // Gastroenterology. - 1990. - V. 98. - P. 175-184.

197. Purification and partial characterization of hepatocyte growth factor from plasma of a patient with fulminant hepatic failure / E. Gohda [et al.] // J. Clin. Invest. -1988.-V. 81.-P. 414-419.

198. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo /

E. Lagasse [et al.] // Nat Med. -. 2000. - V. 6. - P. 1229-34.

199. Quah B.J. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester /

B.J. Quah, H.S. Warren, C.R. Parish // Nat Protoc. - 2007. - V. 2, № 9. - P. 20492056.

200. Quesenberry P.J. Stem cell homing: rolling, crawling, and nesting / P.J. Quesenberry, P.S. Becker // Proc Natl Acad Sci USA. - 1998. - V. 95, № 26. -P. 15155-15157.

201. Ramadori G. The stellate cell (Ito-cell, fat-storing cell, lipocyte, perisinusoidal cell) of the liver. New insights into pathophysiology of an intriguing cell / G. Ramadori // Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol. - 1991. - V. 61, № 3. -P. 147-158.

202. Rat liver myofibroblasts and hepatic stellate cells: different cell populations of the fibroblast lineage with fibrogenic potential / T. Knittel [et al.] // Gastroenterology. -1999. - V. 117,№5.-P. 1205-1221.

203. Reciprocal modulation of matrix metalloproteinase-13 and type I collagen genes in rat hepatic stellate cells / B. Schaefer [et al.] // Am J Pathol. - 2003. - V. 162, № 6.-P. 1771-1780.

204. Redistribution of intermediate filament subunits during skeletal myogenesis and maturation in vitro / G.S. Bennet [et al.] // J. Cell Biol. - 1979. - V. 82. - P. 577584.

205. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR / M.A. Passino [et al.] // Science. - 2007. - V. 315. - P. 1853-1856.

206. Release of osmolytes from perfused rat liver on perivascular nerve stimulation: alpha-adrenergic control of osmolyte efflux from parenchymal and nonparenchymal liver cells / S. Vom Dahl [et al.] // Hepatology. - 1999. - V. 1. - P. 195-204.

207. Roles of HGF as a pleiotropic factor in organ regeneration. In Hepatocyte Growth Factor-Scatter Factor and the c-Met Receptor. I. D. / K. Matsumoto [et al.] // Birkhauser-Verlag, Basel. -1993. - P. 225-250.

208. Rosen E.M. Scatter factor and the C-met receptor: a paradigm for mesenchymal/epithelial interaction / E.M. Rosen, S.K. Nigam, I.D. Goldberg // The Journal of Cell Biology.-1994,-V. 127, №6, Part 2. - P. 1783-1787.

209. Rosenbaum J. Regulation of Ito cell proliferation by soluble factors / J. Rosenbaum, S. Blazejewski // J Hepatol. - 1995. - V. 22, № 2. - P. 65-70.

210. Safety and Efficacy of Autologous Bone Marrow Stem Cell Transplantation Through Hepatic Artery for the Treatment of Chronic Liver Failure: A Preliminary Study / A. A. Khan [et al.] // Transplantation Proceedings. - 2008 - V. 40, № 4. - P. 1140-1144.

211. Safety and efficacy profile of G-CSF therapy in patients with acute on chronic liver failure / C. Di Campli [et al.] // Dig. Liver Dis. - 2007. - V. 39. - P. 10711076.

212. Sawitza I. The niche of stellate cells within rat liver / I. Sawitza, C. Kordes, D. Hausinger//Hepatology. - 2009. - V. 50. - P. 1617-1624.

213. Scadden D.T. The stem-cell niche as an entity of action / D.T. Scadden // Nature. - 2006. - V. 441, № 7097. - P. 1075-1079.

214. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell / R. Schofield // Blood Cells. - 1978. - V. 4. - P. 7-25.

215. Sequential exposure to cytokines reflecting embryogenesis: the key for in vitro differentiation of adult bone marrow stem cells into functional hepatocyte-like cells / S. Snykers [et al.] // Toxicol Sci. - 2006. - V. 94, № 2 - P. 330-341.

216. Serum from partial hepatectomy rat and hepatocyte growth factor stimulate bone marrow cell expressing albumin and alpha fetoprotein / J. Ma [et al.] // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. - 2004. - V. 12, № 7. - P. 410-413.

217. Serum from radiofrequency-injured livers induces differentiation of bone marrow stem cells into hepatocyte-like cells / Y. Yang [et al.] // J Surg Res. - 2009. - V. 155, № l.-P. 18-24.

218. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from the bone marrow / Y. Katayama [et al.] // Cell. - 2006. - V. 124. -P. 407-421.

219. Spadema S. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transitions during cancer progression / S. Spaderna // Verh Dtsch Ges Pathol. - 2007. - V. 91. -P. 21-28.

220. Spangrude G.J. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells / G.J. Spangrude, S. Heimfeld, I.L.Weissman// Science. - 1988. -V. 241. - P. 58-62.

221. Spatial and temporal patterns of ERK signaling during mouse embryogenesis / L.B. Corson [et al.] // Development. - 2003. - V. 130, № 19. - P. 4527-4537.

222. Species variation in the mechanisms of mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression / G. Ren [et al.] // Stem Cells. - 2009. - V. 27, № 8. - P. 19541962.

223. Spheroid formation and differentiation into hepatocyte-like cells of rat mesenchymal stem cell induced by co-culture with liver cells / Z. Qihao [et al.] // DNA Cell Biol. - 2007. - V. 26, № 7. - P. 497-503.

224. Spradling A. Stem cells find their niche / A. Spradling, D. Drummond-Barbosa, T. Kai // Nature. - 2001. - V. 414, № 6859. - P. 98-104.

225. Stem Cell-Induced Liver Regeneration / W.T. Knoefel [et al.] // Zentralbl Chir. -2013.-V. 138, № 2. - P. 166-172.

226. Stewart S. Heterogeneity and Plasticity of Hepatocyte Lineage Cells/ S. Stewart // Hepatology. - 2001. - V. 33, № 3. - P. 738-750.

227. Stewart S. Is There a Liver Stem Cell? / S. Stewart // Cancer research. - 1990. -V. 50. - P. 381 1-3815.

228. Study on differentiation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells into human sweat gland cells in vitro and the relative signal pathway / J.M. Yang [et al.] // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. - 2011. - V. 27, № 4. - 265-268.

229. Suskind D.L. Searching for common stem cells of the hepatic and hematopoietic systems in the human fetal liver: CD34+ cytokeratin 7/8+ cells express markers for stellate cells / D.L. Suskind, M.O. Muench // J. Hepatol. - 2004. - V. 40, № 2. - P. 261-268.

230. Systemic infusion of FLK1(+) mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice / B. Fang [et al.] // Transplantation. -2004,-V. 78, № l.-P. 83-88.

231. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood / A. Aiuti [et al.] // J. Exp. Med. 1997. - V. 185, № l.-P. 111-120.

232. The gene of hepatocyte growth factor is expressed in fat-storing cell of rat liver and is downregulated during cell growth and by transforming growth factor-ß / G. Ramadori [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1992. - V. 183, № 2. - P. 739-742.

233. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view / J.A. Martinez-Agosto [et al.] // Genes & Dev. - 2007. - V. 21. - P. 3044-3060.

234. The initiation of liver development is dependent on Foxa transcription factors / C.S. Lee [et al.] // Nature. - 2005. - V. 435. - P. 944-947.

235. The Met proto-oncogene mesenchymal to epithelial cell conversion / I. Tsarfaty [et al.] // Science. - 1994. -V. 263. - P. 98-101.

236. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells / X. Wang [et al.] // Proc Natl Acad Sei USA. - 2003. - V. 100 (Suppl. 1). - P. 1 1881 -11888.

237. The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis / L.J. Dai [et al.] // Stem Cell Res. - 2009. - V. 2, № 1. - P. 16-25.

238. The therapeutic potential of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly in the treatment of rat liver fibrosis / P.C.Tsai [et al.] // Liver Transpl. - 2009. - V. 15, № 5. - P. 484-495.

239. Therapeutic effect of transplanting HGF-treated bone marrow mesenchymal cells into CC14-injured rats / S. Oyagi [et al.] // J. Hepatol. - 2006. - V. 44, № 4. - P. 742-748.

240. Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on experimental liver fibrosis / M.T. Abdel Aziz [et al.] // Clin Biochem. - 2007. - V. 40, № 12.-P. 893-899.

241. Thy 1-positive mesenchymal cells promote the maturation of CD49f-positive hepatic progenitor cells in the mouse fetal liver / T. Hoppo [et al.] // Hepatology. -2004.-V. 39.-P. 1362-1370.

242. Towards a Clinically Relevant Lentiviral Transduction Protocol for Primary Human CD34+ / M. Millington [et al.] // Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. -2009. - V. 4, № 7. - P. 646-656.

243. Transplantation of bone marrow as compared with peripheral-blood cells from HLA-identical relatives in patients with hematologic cancers / W.I. Bensinger [et al.]//N Engl J Med.-2001.-V. 344. - P. 175-181.

244. Tsutsumi M. Characterization of desmin-positive rat liver sinusoidal cells / M. Tsutsumi, A. Takada, S. Takase // Hepatology. - 1987. - V. 7, № 2. - P. 277284.

245. Tumorigenicity of the met protooncogene and the gene for hepatocyte growth factor / S. Rong [et al.] // M. Mol. Cell Biol. - 1992. - V. 12. -P. 5152-5158.

246. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow / E. Mezey [et al.] // Science. - 2000. - V. 290. - P. 1959-1962.

247. Ueno T. Intrinsic innervation of the human liver / T. Ueno // J. Clin. Electorn. Microsc. - 1988. - V. 21. - P. 481-491.

248. Vassilopoulos G. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion / G. Vassilopoulos, P.R. Wang, D.W. Russell // Nature. - 2003. - V. 24. - P. 901-904.

249. Wake K. Perisinusoidal stellate cells (fat-storing cells, interstitial cells, lipocytes), their related structure in and around the liver sinusoids, and vitamin A-storing cells in extrahepatic organs / K. Wake // Int Rev Cytol. - 1980. - V. 66. - P. 303-353.

250. Wan C. Allogenic peripheral blood derived mesenchymal stem cells (MSCs) enhance bone regeneration in rabbit ulna critical-sized bone defect model / C. Wan, Q. He, G. Li // J Orthop Res. - 2006. - V. 24, № 4. _ p. 610-618.

251. Watanabe Y. Liver-derived matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) recruits progenitor cells from bone marrow into the blood circulation / Y. Watanabe, T. Haruyama, T. Akaike // Biol Pharm Bull. - 2003. - V. 26, № 4. - P. 564-568.

252. Watt F.M. Out of Eden: stem cells and their niches / F.M. Watt, B.L. Hogan // Science. - 2000. - V. 287. - P. 1427-1430.

253. Wells J.M. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers / J.M. Wells, D.A. Melton // Development. - 2000. - V. 127, № 8. - P. 1563-1572.

254. Xie T. Decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary / T. Xie, A.C. Spradling // Cell. - 1998. - V. 94, №2. -P. 251-260.

255. Zaret K.S. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis / K.S. Zaret // Nat. Rev. Genet. - 2002. - V. 3. - P. 499-512.

256. Zhang G.Q. A study of rat mesenchymal stem cells (MSCs) differentiating into liver cells when co-cultured with rat hepatocytes / G.Q. Zhang, C.H. Fang, D.Z. Chi // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. - 2005. - V. 13, № 9. - P. 648-651.

257. Zhang G.Q.Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat mesenchymal stem cells into a hepatocyte lineage in vitro / G.Q. Zhang, C.H. Fang, D.Z. Chi // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. - 2005. - V. 43, № 11. - P. 716-720.

258. Zhao R. Embryonic development of the liver / R. Zhao, S.A. Duncan // Hepatology. - 2005. - V. 41. - P. 956-967.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

1. Рисунок 1. Схема выделения звёздчатых клеток из печени крыс. Стр.53.

2. Рисунок 2. Схема выделения мезенхимных стволовых клеток из костного мозга крыс. Стр.55.

3. Рисунок 3. Схема культивирования МСК в кондиционированной среде ЗКП. Стр.57.

4. Рисунок 4 Схема культивирования МСК и ЗКП на внутрилуночковых вставках. Стр.58.

5. Рисунок 5. ЗКП непосредственно после выделения из печени крысы. А -фазово-контрастная микроскопия, Б - аутофлуоресценция витамина А, х20. Стр.69.

6. Рисунок 6. Культура ЗКП, иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к десмину: А - 6-е сутки, Б - 22-е сутки, х40. Стр.70.

7. Рисунок 7. ЗКП на 4-й день культивирования. А - формирование колоний, х5, Б - экспрессия а-ГМА, 7-й день культивирования, х10. Стр.70.

8. Рисунок 8. Результаты ПЦР в режиме реального времени на ген VC AM. МСК рО - МСК костного мозга нулевого пассажа; ЗКП рО - ЗКП нулевого пассажа (свежевыделенные); ЗКП р4 - ЗКП четвёртого пассажа (р < 0,05). Стр.71.

9. Рисунок 9. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры ЗКП с антителами к PCNA, 6-й день. Ядра пролиферирующих клеток красного цвета, х10. Стр.72.

10. Рисунок 10. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры ЗКП с антителами к C-kit (А), Вс1-2 (Б), 6-й день культивирования, х10. Стр.73.

11. Рисунок 11. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры ЗКП с антителами к виментину, 22-й день, х20. Стр.74.

12. Рисунок 12. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры ЗКП с антителами к ЦК 18 (А) на 21-й день, х40 и к ЦК 19 (Б) на 28-й день культивирования, х20. Стр.75.

13. Рисунок 13. Электрофоретическое разделение образцов кДНК в 1,5% агарозном геле, проанализированных на гены ß-актина и ЦК 19. М - Маркер GeneRuler DNA ladder (Fermentas), 1 - кДНК МСК, выделенных из жировой

ткани, клетки 2-го пассажа, 2 - кДНК культуры ЗКП нулевого пассажа, 3 - кДНК культуры ЗКП 4-го пассажа. Стр.75.

14. Рисунок 14. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры ЗКП с антителами к: А - а-ФП, 28-й день культивирования, Б - HSA, 22-е сутки культивирования, х10. Стр.77.

15. Рисунок 15. ЗКП, культивированные с факторами роста. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к ЦК 18, 14-е сутки, х10. Стр.78.

16. Рисунок 16. ЗКП, культивированные с факторами роста. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к а-ГМА: А - 6-й день, Б -14-й день, х5. Стр.79.

17. Рисунок 17. ЗКП, культивированные с факторами роста. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к десмину: А - контрольная культура, 68-е сутки; Б - 14-е сутки, х40. Стр.79.

18. Рисунок 18. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к C-kit: А -контрольная культура ЗКП, 22-е сутки; Б - культивирование с факторами роста, 17-е сутки, х10. Стр.80.

19. Рисунок 19. ЗКП, культивированные с факторами роста. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к ЦК 18 (А) и а-ФП (Б), 17-е сутки, х40. Стр.80.

20. Рисунок 20. ЗКП, культивированные с факторами роста. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к HS А, 17-й день, х40. Стр.81.

21. Рисунок 21. Иммуноцитохимическое окрашивание монокультуры МСК с антителами к виментину: А - на 14-е сутки, х 10, Б - на 28-е сутки, х20. Стр.82

22. Рисунок 22. Иммуноцитохимическое окрашивание монокультуры МСК с антителами к десмину: А - на14-е сутки, х10, Б - на 28-е сутки, х20. Стр.82.

23. Рисунок 23. Иммуноцитохимическое окрашивание монокультуры МСК с антителами к а-ГМА: А - 3-й день культивирования, Б - 35-е сутки, х10. Стр.84.

24. Рисунок 24. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры МСК антителами к: А - C-kit, 28-й день, Б - Вс1-2, 13-й день, х10. Стр.84.

25. Рисунок 25. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры МСК антителами к: А - ЦК18, 7-е сутки, Б - ЦК18, 28-е сутки, х10. Стр.85.

26. Рисунок 26. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры МСК с антителами к ЕМА (А) и ESA (Б), 14-й день, х20. Стр.86.

27. Рисунок 27. Увеличение количества МСК после добавления гепатоцитарных факторов роста. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры МСК антителами к а-ГМА: А - после добавления FGF4, 6-й день, Б -формирование монослоя, после добавления HGF, 9-й день, х 10, В - на 14 сутки, хЮ. Стр.87.

28. Рисунок 28. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к десмину культуры МСК после добавления смеси HGF и FGF4, 9-е сутки, хЮ. Стр.88.

29. Рисунок 29. МСК, культивированные с факторами роста. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к: А - C-kit, 14-е сутки, Б -ЦК 19, 9-е сутки, х20. Стр.89.

30. Рисунок 30. МСК, культивированные с факторами роста. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к а-ФП, 9-е сутки, х20. Стр.89.

31. Рисунок 31. Иммуноцитохимическое окрашивание МСК, культивированных в среде ЗКП, 7-ой день: А - экспрессия десмина, х40, Б - экспрессия а-ГМА, х10. Стр. 92.

32. Рисунок 32. Иммуноцитохимическое окрашивание МСК, культивированных в среде ЗКП, с антителами к: А - C-kit, 7-ой день, х40, Б - C-met, 21-е сутки, х20. Стр. 92.

33. Рисунок 33. Иммуноцитохимическое окрашивание МСК, культивированных в среде ЗКП: А - антитела к ESA, 35-е сутки, х20, Б - смесь первичных антител к ЦК 18 и ЦК 19, 28-е сутки, х20. Стр.93.

34. Рисунок 34. МСК, культивированные в среде ЗКП. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к а-ФП (А) и HSA (Б), 28-е сутки, х40. Стр.93.

35. Рисунок 35. Иммунноцитохимическое окрашивание с антителами к десмину МСК при культивировании их с ЗКП на внутрилуночных вставках, 22-е сутки, х10. Стр.97.

36. Рисунок. 36. МСК при культивировании с ЗКП на внутрилуночных вставках. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к: А - ЦК 18, Б -ЦК 19, В - а-ФП, 22-е сутки, хЮ. Стр.97.

37. Рисунок 37. Иммуноцитохимическое окрашивание совместной культуры МСК и ЗКП с антителами к: А - десмин, десмин-позитивные клетки располагаются вокруг десмин-негативных клеточных островков, Б - C-kit, 28-е сут, х 10, В - Вс1-2, 21 -е сут, х20. Стр.99.

38. Рисунок 38. Иммуноцитохимическое окрашивание совместной культуры МСК и ЗКП антителами к ЦК 19 (А) и ESA (Б) на 21-й день культивирования, к а-ФП (В) на 28-й день культивирования, хЮ. Стр.100.

39. Рисунок 39. Совместное культивирование ЗКП и МСК: А - ЗКП, красного цвета, Б - МСК, зелёного цвета, В - совмещение рисунков А и Б, 10-е сут, хЮ. Стр.103.

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

04201451961

На правах рукописи

Шафигуллина Айгуль Касыймовна

Влияние звёздчатых клеток печени на фенотип мезенхимных стволовых клеток

крысы in vitro

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель -доктор медицинских наук доцент А. А. Гумерова

Казань-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................5

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................14

2.1 Микроокружение стволовых клеток..........................................................................................14

2.1.1 Общие понятия о микроокружении стволовых клеток....................................14

2.1.2 Микроокружение стволовых клеток печени..............................................................15

2.2 Компоненты микроокружения стволовых клеток печени..................................18

2.2.1 Растворимые факторы роста......................................................................................................18

2.2.2 Межклеточные контакты и внеклеточный матрикс..............................................21

2.3 Внепечёночные стволовые клетки и регенерация печени..................................24

2.3.1 Гемопоэтические стволовые клетки в регенерации печени..........................25

2.3.2 Мезенхимные стволовые клетки в регенерации печени....................................30

2.3.2.1 Свойства мезенхимных стволовых клеток..............................................................32

2.3.2.2 Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в гепатоциты... 35 2.3.2.2. Способность мезенхимных стволовых клеток

дифференцироваться в гепатоциты после трансплантации......................................35

2.3.2.2.2 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых

клеток in vitro................................................................................................................................................................................................36

2.3.2.2.2.1 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток под действием факторов роста..........................................................................................37

2.3.2.2.2.2 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток под комплексным влиянием растворимых факторов и межклеточных контактов..............................................................................................................................43

2.3.3 Механизмы дифференцировки стволовых клеток в гепатоциты............44

2.4 Звёздчатые клетки печени, их фенотип и свойства....................................................46

2.4.1 Звёздчатые клетки печени как фактор микроокружения..............................47

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................................51

3.1 Выделение звёздчатых клеток печени....................................................................................51

3.1.1 Выделение звёздчатых клеток печени методом коллагеназно-проназной перфузии с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза....................................................................................................................................52

3.1.2 Выделение звёздчатых клеток печени методом Сеглена..............................53

3.2 Выделение мезенхимных стволовых клеток из костного мозга

крысы....................................................................................... 55

3.3 Изучение влияния компонентов микроокружения на дифференцировку клеток in vitro............................................................................ 56

3.3.1 Культивирование звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток с рекомбинантными факторами роста HGF и FGF4 (модель 1).................................................................................. 56

3.3.2 Культивирование мезенхимных стволовых клеток в питательной среде звёздчатых клеток печени (модель 2)........................................ 57

3.3.3 Культивирование мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени на внутрилуночных вставках (модель 3)........................ 58

3.3.4 Совместное культивирование мезенхимных стволовых клеток и

звёздчатых клеток печени (модель 4)............................................... 59

3.3.4.1 Методика витального мечения клеток флуоресцентными мембранными метками РКН26 и РНК67 (Sigma)................................. 59

3.4 Методика имму но цитохимического окрашивания культуры клеток ... 60

3.5 Молекулярно-биологические методы исследования экспрессии генов цитокератина 19 и VCAM в культуре звёздчатых клеток печени............ 63

3.5.1 Методика выделения тотальной РНК........................................ 63

3.5.2 Методика синтеза кДНК гена цитокератина 19 на матрице РНК........................................................................................................... 64

3.5.3 Электрофорез ДНК в 1,5% агарозном геле.................................. 65

3.5.4 Методика синтеза кДНК на матрице РНК........................................... 66

3.5.5 Методика постановки ПЦР в режиме реального времени................. 66

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................. 68

4.1 Сравнительный анализ методов выделения звёздчатых клеток из печени крыс............................................................................... 68

4.2 Фенотип свежевыделенных звёздчатых клеток печени и его изменения при культивировании.................................................................... 69

4.3 Культивирование звёздчатых клеток печени с рекомбинантными факторами роста......................................................................... 77

4.4 Фенотип свежевыделенных мезенхимных стволовых клеток и его изменения при культивировании...................................................... 82

4.5 Фенотип мезенхимных стволовых клеток при культивировании с рекомбинантными факторами роста................................................ 86

4.6 Фенотип мезенхимных стволовых клеток при культивировании в питательной среде звёздчатых клеток печени...................................... 91

4.7 Изменения фенотипа мезенхимных стволовых клеток при культивировании их со звёздчатыми клетками печени на внутрилуночковых вставках.......................................................... 96

4.8 Изучение фенотипа звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток при совместном культивировании............................ 99

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................ 105

6 ВЫВОДЫ............................................................................... 111

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................... 113

8.БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................... 115

9. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА........................... 140

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Сохранение стволовыми клетками своего фенотипа и свойств, а также координация их жизнедеятельности с потребностями всего организма достигается благодаря определённым окружающим условиям, объединённым и названным нишей стволовых клеток. Среди компонентов ниши особое внимание уделяют контактам стволовых клеток с популяцией непаренхиматозных клеток и наличию растворимых факторов [122]. Для ряда тканей млекопитающих стволовые клетки и их ниши уже описаны, например, для клеток-сателлитов, находящихся под базальной мембраной миофибрилл мышечной ткани [156], стволовых клеток сперматогенного эпителия яичка [185], а также стволовых клеток ценральной нервной системы, волосяного фолликула и эпителия кишки [90, 173]. Стволовая же клетка печени до сих пор не найдена и ведутся поиски не только самой стволовой клетки печени, но и ниши, в которой происходит её диффренцировка в гепатоциты. Среди растворимых факторов, которые влияют на дифференцировку предшественников гепатоцитов, наиболее изученными являются фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста фибробластов-4 (FGF4). Известно, что основным источником данных факторов роста в печени является одна из популяций непаренхиматозных клеток печени -звёздчатые клетки печени (ЗКП), которые находятся в перисинусоидальном пространстве в непосредственном контакте с гепатоцитами и вырабатывают факторы роста, необходимые для пролиферации и дифференцировки последних [87]. По мнению некоторых авторов, сами ЗКП в пределах печёночной дольки и ацинуса располагаются в нише стволовых клеток [141].

Согласно данным литературы, а также данным, полученным нашим коллективом, ЗКП играют ключевую роль в процессе фетального печёночного гемопоэза и дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов в ходе пренатального развития печени [1, 5, 51, 53]. Более того, именно эти клетки являются важнейшим участником восстановления массы клеток паренхимы в ходе регенерации печени как за счёт вырабатываемых ими макромолекул межклеточного матрикса и его ремоделирования [79], так и за счёт продукции вышеупомянутых факторов роста [87].

Если ЗКП необходимы для процессов фетального кроветворения в печени, а также дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов, то способны ли они создавать микроокружение для потомков стволовых клеток и, в частности, внепечёночных стволовых клеток? Ответ на этот вопрос можно получить, работая уже с известным клеточным типом - мезенхимными стволовыми клетками (МСК) костного мозга. Выбор популяции МСК обусловлен их доступностью с точки зрения методов выделения, хорошей выживаемостью и неприхотливостью в условиях in vitro, возможностью трансплантации аутологичных клеток, а значит, снятием множества законодательных, этических и религиозных вопросов по их применению в клинике. Впервые МСК были описаны Фриденштейном ещё в 70-х годах XX века [194]. С тех пор ведутся активные исследованиям свойств МСК, пластичности и возможности их применения в клинической практике. На сегодняшний день известно, что МСК способны продуцировать ряд факторов роста, цитокинов и сигнальных молекул, которые подавляют иммунный ответ, снижают апоптоз гепатоцитов, приводят к регрессу фиброза печени, стимулируют пролиферацию и функциональную активность гепатоцитов [119]. Определённые успехи достигнуты в экспериментах по дифференцировке МСК в гепатоцитоподобные клетки в условиях in vitro. Наиболее интересным среди исследований, посвящённых получению функционально активных гепатоцитов из МСК, является работа Снайкерс [215], в которой к культуре МСК костного мозга были добавлены рекомбинантные факторы роста HGF и FGF4 в той

последовательности, в которой эти факторы воздействуют на прогениторные клетки печени в ходе её развития во внутриутробном периоде [157]. Работ же, в которых проводилось бы изучение влияния естественных факторов роста или межклеточных контактов с непаренхиматозными клетками печени на гепатоцитарную дифференцировку МСК, на сегодняшний день нет. Более того, необходимо выяснить, что же важнее для дифференцировки прогениторных клеток в гепатоциты: растворимые факторы роста, непосредственные межклеточные контакты либо их комплексное воздействие.

Исходя из этого, целью нашей работы стало изучение влияния ЗКП как фактора микроокружения на изменения фенотипа культуры МСК костного мозга и их потомков в условиях in vitro у крысы.

Задачи:

1. Сравнить методы выделения звёздчатых клеток из печени крысы: метод выделения по Сеглену и метод коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза.

2. Изучить влияние рекомбинантных факторов роста FGF4 и HGF на фенотип мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени крысы in vitro.

3. Изучить влияние факторов роста, синтезируемых звёздчатыми клетками печени, на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы при различных вариантах культивирования:

а) в среде, переработанной звёздчатыми клетками печени;

б) при совместном культивировании мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени, разделённых полупроницаемой мембраной;

4. Изучить фенотип звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток при совместном культивировании.

5. Установить возможность слияния мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени при совместном культивировании.

Научная новизна. В диссертации впервые было проведено сравнение двух методов выделения ЗКП из печени крысы. Согласно полученным результатам, метод коллагеназно-проназной перфузии с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза является наиболее эффективным по сравнению с методом Сеглена по количеству выделенных ЗКП, их жизнеспособности и чистоте культуры [7].

В ходе работы были впервые выполнены различные варианты культивирования МСК и ЗКП [3]. На основании полученных данных установлено, что ЗКП способны создавать микроокружение для дифференцировки МСК в клетки с фенотипом гепатоцитов в условиях in vitro. Кроме того, было продемонстрировано, что важной составляющей микроокружения является секреция ЗКП факторов роста, индуцирующих появление в фенотипе культуры МСК экспрессии а-фетопротеина (а-ФП) и цитокератинов 18 и 19 (ЦК18 и ЦК19). Необходимо отметить, что изменения фенотипа МСК при культивировании их в кондиционированной среде ЗКП и при культивировании МСК и ЗКП, разделённых полупроницаемой мембраной, были аналогичны изменениям фенотипа МСК при культивировании их с рекомбинантными факторами роста HGF и FGF4. Подобные изменения фенотипа МСК были отмечены и при совместном культивировании МСК с ЗКП, однако, в отличие от предыдущих групп, экспрессия ЦК 18, ЦК 19 и а-ФП была более выраженной, что, вероятно, обусловлено одновременным действием непосредственных межклеточных контактов МСК с ЗКП и продуцируемых ЗКП факторов роста. Для разграничения двух клеточных популяций при совместном культивировании ЗКП и МСК нами было впервые проведено их предварительное витальное мечение флуоресцентными метками [3]. Благодаря этому было установлено, что появление в фенотипе МСК несвойственных им эпителиальных маркёров обусловлено не слиянием клеток, а действием сложного комплекса паракринных и контактных межклеточных взаимодействий.

В работе впервые показано появление в фенотипе МСК экспрессии цитокератинов и а-ФП на более ранних сроках при культивировании МСК с рекомбинантными факторами роста, однако более выраженная и устойчивая экспрессия ЦК 18, ЦК 19 и а-ФП наблюдалась при совместном культивировании ЗКП с МСК [3]. Таким образом, комплексное воздействие межклеточных контактов между ЗКП и МСК и продуцируемых ЗКП факторов роста обеспечивают изменение фенотипа МСК с мезенхимного на эпителиальный. На основании полученных результатов можно заключить, что ЗКП способны создавать микроокружение, благодаря которому происходит дифференцировка потомков стволовых клеток в гепатоциты.

Теоретическая и практическая ценность работы. Проведённое исследование имеет несомненный теоретический интерес, поскольку раскрывает ряд механизмов межклеточных взаимодействий, лежащих в основе дифференцировки потомков МСК костного мозга в гепатоциты. Полученные результаты способствуют выявлению новых данных о роли факторов роста, секретируемых ЗКП, а также о значении межклеточных контактов в создании микроокружения для прогениторных клеток, в том числе для стволовых клеток мезенхимного происхождения. В ходе исследования было показано, что появление в фенотипе МСК несвойственных им эпителиальных маркёров в виде ЦК 18, ЦК 19 и а-ФП может происходить под влиянием факторов роста НвР и РвР4, рекомбинантных или синтезируемых ЗКП. Однако для более устойчивой дифференцировки МСК в клетки с фенотипом гепатобластов необходимо создать условия, приближенные к естественным, поэтому оптимальным вариантом является совместное культивирование МСК и ЗКП, при котором происходит воздействие на МСК как межклеточных контактов с ЗКП, так и синтезируемых ими растворимых факторов.

Помимо теоретического интереса, проведённые исследования имеют и практическую ценность, так как в ходе выполнения работы было проведено сравнение двух методов выделения ЗКП. Согласно полученным результатам,

метод Сеглена по ассоциированному выделению ЗКП и гепатоцитов является менее затратным в финансовом плане, более простым в исполнении, однако более высокие показатели жизнеспособности ЗКП (90%) и чистоты культуры (99,5%) были получены при выделении клеток методом коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза. Также практический интерес может представлять предварительное витальное мечение клеток флуоресцентными метками перед посевом на культуральную чашку, что позволяет отслеживать рост и организацию клеток при совместном культивировании ЗКП и МСК. Мечение клеток позволило установить, что изменения фенотипа МСК при совместном культивировании МСК с ЗКП происходят не путём слияния клеток двух популяций, а путём их трансдифференцировки в гепатоцитарном направлении.

Результаты исследования позволяют по-новому взглянуть на функции ЗКП и рассматривать их как важный компонент микроокружения, необходимый для гепатоцитарной дифференцировки потомков стволовых клеток in vitro, что подтверждает их роль в данном процессе, установленную ранее при изучении онтогенеза и регенерации печени.

Полученные сведения могут быть использованы для дальнейшего изучения взаимодействия различных клеточных типов в процессе регенерации печени, а также могут быть рекомендованы для лабораторной практики и использованы в учебном процессе.

По материалам диссертации опубликовано 30 работ (1 монография, 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов научных исследований, 25 тезисов Всероссийских и Международных конференций). Общий объём публикаций -11,31 условно печатных листа, в т.ч. авторский вклад - 8,48 условно печатных листа.

Основное положение, выносимое на защиту

Звёздчатые клетки печени способны создавать микроокружение, которое обеспечивает изменение фенотипа мезенхимных стволовых клеток с мезенхимного на эпителиальный, в частности, потомки мезенхимных стволовых клеток начинают экспрессировать цитокератины 18 и 19 и а-фетопротеин.