Функциональная активность секретома мезенхимных стромальных/стволовых клеток человека при культивировании на внеклеточном матриксе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ушаков Роман Евгеньевич

• Ушаков Роман Евгеньевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Ушаков Роман Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Цель и задачи исследования

Положения, выносимые на защиту

Научная новизна полученных результатов

Теоретическая и практическая значимость работы

Личный вклад автора

Апробация работы

Финансовая поддержка работы

Объём и структура диссертации

Список публикаций по теме диссертационной работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие о стволовой клетке. Мезенхимные стромальные/стволовые клетки (МСК)

1.2. Секретом МСК. Состав, терапевтические свойства, подходы к их улучшению

1.3. Понятие о внеклеточном матриксе: структура, функции, модели для in vitro исследований. Влияние внеклеточного матрикса на культивируемые МСК

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Культивирование клеток

2.2. Получение децеллюляризованного матрикса

2.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов децеллюляризованного матрикса

2.4. Выявление белков внеклеточного матрикса с помощью иммуноблоттинга

2.5. Анализ пролиферации МСК на внеклеточном матриксе

2.6. Анализ подвижности МСК на внеклеточном матриксе

2.7. Выделение РНК и количественная ПЦР с обратной транскрипцией

2.8. Приготовление кондиционной среды

2.9. Мультиплексный анализ цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в кондиционной среде

2.10. Коллагеновая зимография

2.11. Тест зарастания "раны" in vitro

2.12. Хемотактический тест in vitro

2.13. Тест на образование капилляроподобных структур in vitro

2.14. Секвенирование микроРНК и биоинформатический анализ

2.15. Модель ВаС12-индуцированного некроза скелетных мышц in vivo

2.16. Приготовление гистологических препаратов и морфометрический анализ

2.17. Анализ пролиферации миобластов C2C12

2.18. Анализ активации сигнальных путей и ингибиторный анализ

2.19. Иммуноферментный анализ IL-8 в кондиционной среде

2.20. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение и характеристика децеллюляризованного ВКМ

3.2. Секреторная активность МСК изменяется при культивировании на дВКМ

3.3. Анализ транскриптомных данных из открытых источников, поиск дифференциально экспрессируемых компонентов секретома МСК при культивировании на дВКМ

3.4. Изучение влияния дВКМ на экспрессию в МСК ростовых факторов, цитокинов и хемокинов

3.5. Анализ дифференциальной экспрессии микроРНК в эМСК, культивируемых на дВКМ

3.6. Функциональные in vitro тесты кондиционных сред МСК, культивируемых на пластике и дВКМ

3.7. Применение кондиционных сред МСК на животной модели некроза скелетной мышечной ткани

3.8. Анализ сигнальных путей, активируемых в МСК при культивировании на дВКМ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ - внеклеточный матрикс

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дВКМ - децеллюляризованный внеклеточный матрикс

МСК - мезенхимные стромальные/стволовые клетки человека

км-МСК - МСК костного мозга

жт-МСК - МСК жировой ткани

НФК - неонатальные фибробласты кожи

эМСК - МСК десквамированного эндометрия менструальной крови

КС-пластик - кондиционная среда МСК, культивируемых на пластике

КС-дВКМ - кондиционная среда МСК, культивируемых на дВКМ

фет-МСК - фетальные МСК костного мозга

вс-МСК - МСК вартонова студня пупочного канатика

дп-МСК - МСК пульпы зуба

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПААГ - полиакриламидный гель РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭДТА-Ка2 - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ФСБ - фосфатно-солевой буфер ДМСО - диметилсульфоксид

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

CHAPS - (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) (3-((3 -холамидопропил)диметиламмонио)-1 -пропансульфонат) hEGF - human epidermal growth factor (эпидермальный фактор роста человека) hVEGF - human vascular endothelial growth factor (фактор роста эндотелия сосудов человека)

hFGF - human fibroblast growth factor (фактор роста фибробластов человека)

R3 IGF - insulin-like growth factor with the substitution of Arg for Glu at position 3 (инсулиноподобный фактор роста с заменой остатка аргинина на остаток глутаминовой кислоты)

DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole (4',6-диамидино-2-фенилиндол) FAK - focal adhesion kinase (киназа фокальной адгезии)

ECL - enhanced chemiluminescence (сверхчувствительная хемилюминесценция)

PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride (фенилметилсульфонилфторид)

vWF - von Willebrand factor (фактор фон Виллебранда)

Rb - retinoblastoma protein (белок ретинобластомы)

PGF - placental growth factor (плацентарный фактор роста)

FGF - fibroblast growth factor (фактор роста фибробластов)

HGF - hepatocyte growth factor (фактор роста гепатоцитов)

CXCL - chemokine (C-X-C) motif ligand (хемокиновые лиганды с мотивом

C-X-C)

MMP - matrix metalloproteinase (матриксная металлопротеиназа) IL - interleukin (интерлейкин)

MCP - monocyte chemoattractant protein (хемоаттрактивный белок моноцитов) G-CSF - granulocyte colony stimulating factor (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор)

GM-CSF - granulocyte-macrophage colony stimulating factor

(гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор)

MAPK - mitogen activated protein kinase (протеинкиназа, активируемая

митогенами)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Человек имеет весьма ограниченную способность к регенерации, то есть к полноценному восстановлению повреждённых тканей и органов. Тем не менее, человеческий организм в принципе обладает потенциями к регенерации, о чём свидетельствуют известные феномены безрубцового восстановления кожи эмбриона человека или регенерации ампутированных кончиков пальцев у детей [Iümgworth, 1974; Larson et al., 2010]. Активно развивающаяся в последние десятилетия междисциплинарная область науки — регенеративная медицина — ставит своей целью поиск способов инициировать программы регенерации и стимулировать самообновление организма. Одним из таких способов является применение мезенхимных стромальных/стволовых клеток человека (МСК), терапевтические свойства которых были показаны во многих исследованиях на примере широкого ряда заболеваний [Margiana et al., 2022; Rodríguez-Fuentes et al., 2021].

Непосредственное применение МСК предваряется этапами их выделения из тканей донора и наработки терапевтической дозы клеток или секретируемых ими молекул (секретома) путём размножения клеток в культуре in vitro [Berebichez-Fridman et al., 2018]. Несмотря на определённые успехи в медицинском использовании МСК, стандартные условия культивирования МСК — в частности, поддержание клеток в виде двумерного монослоя на пластиковой культуральной посуде — являются не вполне физиологически релевантными и потому снижают их терапевтический потенциал [Pereira et al., 2022]. Современным трендом биологии МСК, призванным преодолеть эти ограничения и улучшить основанную на МСК терапию, является воссоздание в условиях in vitro нативного микроокружения МСК, которое имеет место в ткани [Pereira et al., 2022; Noronha et al., 2019]. Одним из важнейших компонентов такого микроокружения является внеклеточный матрикс (ВКМ). Это наиболее естественный субстрат для существования клеток, обеспечивающий, по

сравнению с рутинно используемым культуральным пластиком или полимерными скаффолдами, оптимальную жёсткость и микроархитектуру, а также множество сигналов, воспринимаемых клеткой посредством интегриновых рецепторов [Hynes, 2009].

Согласно современным представлениям, терапевтическое действие МСК преимущественно связано с секрецией ими репертуара паракринных факторов, которые поддерживают ниши стволовых клеток, модулируют иммунный ответ, подавляют фиброзирование, регулируют активацию сигнальных каскадов и экспрессию генов в эндогенных клетках, оказывая цитопротекторное действие [Fernández-Francos et al., 2021; Trigo et al., 2024]. Как показывает анализ литературных данных, для повышения терапевтической эффективности МСК активно разрабатываются подходы к усилению их секреторной активности: культивирование в условиях гипоксии и на различных синтетических носителях, воздействие физическими факторами (излучение в видимой области, ультразвук), обработка цитокинами и другими биомолекулами, трёхмерное культивирование [Yin et al., 2019]. В то же время, актуальный как с теоретической, так и практической точки зрения вопрос о влиянии ВКМ на секреторную активность МСК в литературе освещён довольно скудно: по данной теме опубликовано буквально несколько работ, в которых было показано увеличение концентрации некоторых компонентов в секретоме при культивировании МСК на отдельных очищенных белках ВКМ без выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе этого феномена. Таким образом, комплексное изучение функциональных изменений в секретоме МСК в условиях микроокружения, создаваемого ВКМ, и оценка в этой связи практического значения культивирования МСК на ВКМ представляется весьма актуальной задачей, находящейся в русле современных биомедицинских исследований.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - изучить влияние внеклеточного матрикса на секреторную функцию МСК, установить лежащие в основе этого влияния механизмы и выявить возможные функциональные изменения в секреторной активности этих клеток.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) оптимизировать протокол получения биологически активного децеллюляризованного ВКМ (дВКМ).

2) сравнить уровни экспрессии цитокинов, хемокинов и ростовых факторов на уровне мРНК и секретируемого белка в МСК, культивируемых на дВКМ и культуральном пластике.

3) провести сравнительный анализ дифференциальной экспрессии микроРНК в МСК, культивируемых на дВКМ и на культуральном пластике.

4) сравнить свойства кондиционных сред от МСК, культивируемых на дВКМ и культуральном пластике, в следующих in vitro тестах: заживление «раны» на моделях фибробластов и кератиноцитов, хемотаксис моноцитов и образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками.

5) оценить терапевтические свойства кондиционных сред от МСК, культивируемых на дВКМ и культуральном пластике, на животной модели некроза скелетной мышечной ткани.

6) установить, какие сигнальные пути активируются в МСК при культивировании на дВКМ, и с помощью ингибиторного анализа оценить участие этих сигнальных путей в модуляции секреторной функции МСК.

Положения, выносимые на защиту

1) Обогащение секретома рядом цитокинов, хемокинов, ростовых факторов и микроРНК при культивировании МСК на дВКМ, по сравнению с пластиком, указывает на инструктирующую роль внеклеточного матрикса в индукции паракринных факторов.

2) Стимулирующие эффекты, которые обогащённый секретом оказывает на моделях in vitro и in vivo, свидетельствуют об усилении терапевтического потенциала МСК, культивируемых на дВКМ.

3) Ингибирование киназы фокальной адгезии в МСК, культивируемых на дВКМ, дополнительно усиливает секрецию некоторых паракринных факторов. Комбинация этих двух подходов может служить способом модификации секреторной активности МСК.

Научная новизна полученных результатов

Впервые обнаружено, что культивирование МСК различного тканевого происхождения на дВКМ вызывает многократное (вплоть до нескольких порядков) увеличение экспрессии целого ряда терапевтически значимых паракринных факторов, включая белки и микроРНК. Впервые показано, что обработка МСК ингибитором FAK дополнительно усиливает дВКМ-индуцированный секреторный ответ клеток: комбинирование этих двух подходов может рассматриваться как новый способ прекондиционирования МСК с целью усиления паракринной функции клеток. На животной модели и ряде клеточных моделей продемонстрировано, что обогащение секретома МСК, наблюдаемое при культивировании клеток на дВКМ, усиливает его терапевтический потенциал.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение в культуру МСК такого фактора клеточного микроокружения, как ВКМ, существенно изменяет

поведение клеток. Пренебрежение создаваемым ВКМ "контекстом", которое имеет место при культивировании клеток на широко используемых субстратах, не соответствующих физиологическим условиям, может вносить искажения в существующие представления о биологии клетки вообще и МСК в частности. Напротив, понимание и учёт роли ВКМ в функционировании клеток будет способствовать выявлению ранее не известных феноменов.

Следует подчеркнуть, что результаты исследования вносят вклад в теоретическое обоснование ранее описанного явления, которое заключается в более выраженном терапевтическом эффекте "клеточных пластов" МСК, организованных с помощью ВКМ, по сравнению с суспензией МСК или их секретомом [Makarevich et al., 2015; Dergilev et al., 2018; Hsu et al., 2019; Boldyreva et al., 2019; Alexandrushkina et al., 2020]. С практической точки зрения, результаты работы могут быть учтены как для усовершенствования протоколов культивирования МСК, так и для повышения эффективности клеточной терапии.

Личный вклад автора

Основные результаты работы были получены автором лично или при его непосредственном участии. Планирование и проведение экспериментов, обсуждение и интерпретация результатов, подготовка публикаций и докладов на конференциях проходили совместно с научным руководителем Е.Б. Буровой. Рукописи статей готовились совместно с соавторами, указанными в списке публикаций.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональная активность секретома мезенхимных стромальных/стволовых клеток человека при культивировании на внеклеточном матриксе»

Апробация работы

Результаты работы были представлены и обсуждены на VIII Молодёжной школе-конференции по молекулярной биологии и генетическим технологиям Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 11-14 октября 2022 г.), XXIX и XXX Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых

учёных "Ломоносов" (Москва, 11-22 апреля 2022 г. и 10-21 апреля 2023 г.), конференции Международного Общества Исследования Стволовых Клеток (International Society for Stem Cell Research 2023 Annual Meeting, Бостон, США, 13-18 июня 2023 г.), XXIV съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 11-15 сентября 2023 г.), 27-й Пущинской школе-конференции молодых учёных с международным участием "Биология - наука XXI века" (Пущино, 22-25 апреля 2024 г.), VI Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024 г.).

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена в рамках грантов РФФИ № 19-04-00598, РНФ № 24-24-00324, РНФ № 22-74-10126 и Внутреннего Гранта Института цитологии РАН (конкурс 2023 года).

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы, содержащего 115 ссылок на первоисточники. Работа изложена на 120 страницах, содержит 26 рисунков и 2 таблицы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 - статьи, 7 - тезисы.

Статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК:

1. Ushakov R.E., Burova E.B. Conditioned medium of human mesenchymal stromal/stem cells cultured on decellularized extracellular matrix promotes murine skeletal muscle repair after acute injury // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2024. - Т. 736. - № 150511. doi: 10.1016/j.bbrc.2024.150511.

2. Ushakov R, Ratushnyy A, Buravkova L, Tolkunova E, Burova E. The Decellularized Cell-Derived Extracellular Matrix Enhances the Paracrine Function of Human Mesenchymal Stromal/Stem Cells // International Journal of Molecular Sciences. - 2024. - Т. 25. - № 4. - С. 2419. doi: 10.3390/ijms25042419.

3. Ушаков Р.Е. Потенциал биомедицинского использования децеллюляризованных матриксов культивируемых клеток // Цитология. -2023. - Т. 65. - № 1. - С. 11-19. doi:10.31857/S004137712301011X. Перевод: Ushakov, R.E. The Potential of Decellularized Cell-Derived Matrices for Biomedical Applications // Cell and Tissue Biology. - 2023. - Т. 17. - С. 216-222. doi:10.1134/S1990519X23030148

Тезисы докладов:

1. Ушаков Р.Е., Ратушный А.Ю., Буравкова Л.Б., Бурова Е.Б. Децеллюляризованный внеклеточный матрикс усиливает паракринную функцию мезенхимных стромальных/стволовых клеток и улучшает их терапевтические свойства. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине [электронный ресурс]; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024 г. Санкт-Петербург: Эко-Вектор, 2024. 1157 c. DOI: https://doi.org/10.17816/morph.konf2024 ISBN 978-5-907886-06-3

2. Р. Е. Ушаков, А. Ю. Ратушный, Л. Б. Буравкова, Е. Б. Бурова. Культивирование на децеллюляризованном внеклеточном матриксе как способ прекондиционирования мезенхимных стромальных/стволовых клеток. Биология - наука XXI века : Сборник тезисов 27-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием, Пущино, 22-25 апреля 2024 года. - Пущино: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук", 2024. - С. 163. - EDN EQUTAI.

3. Р. Е. Ушаков, А. Ю. Ратушный, Л. Б. Буравкова, Е. Б. Бурова. Децеллюляризованный внеклеточный матрикс усиливает способность мезенхимных стромальных/стволовых клеток к заживлению ран. Сборник тезисов XXIV съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Санкт-Петербург, 11-15 сентября 2023 г. Под общ. Ред. Член-корр. РАН, д.б.н. М.Л. Фирсова. - СПб.: Изд-во ВВМ, 2023. - 612 с. ISBN 978-5-9651-1500-6

4. R. E. Ushakov, V.I. Zemelko, E.B. Burova. Conditioned medium of mesenchymal stromal/stem cells cultured on decellularized matrix improves scratch wound healing in vitro. ISSCR2023 Poster Abstract Guide.

5. Р. Е. Ушаков. Модуляция секретома мезенхимных стромальных клеток при культивировании на внеклеточном матриксе. Материалы Международного молодежного научного форума «Л0М0Н0С0В-2023» / Отв. ред. И.А. Алешковский, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, Е.И. Зимакова. [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс, 2023. ISBN 978-5-317-06952-0

6. Р. Е. Ушаков, Н.А. Пуговкина, Ю.С. Иванова, Н.Д. Аксёнов, Е.В. Ломерт, И.Е. Перевозников, Е.Б. Бурова. Биоактивные свойства децеллюляризованного матрикса мезенхимных стромальных клеток

эндометрия человека. Материалы VIII Молодёжной школы-конференции по молекулярной биологии и генетическим технологиям Института цитологии РАН (11-14 октября 2022 г., Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Цитология, 2022, том 64, № 7, с. 611-780. DOI: 10.31857/S004137712207001X 7. Р. Е. Ушаков, Е.В. Ломерт. Децеллюляризованный матрикс мезенхимных стромальных клеток эндометрия человека: оптимизация получения и характеристика. Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2022» / Отв. ред. И.А. Алешковский, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, Е.И. Зимакова. [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс, 2022. ISBN 978-5-317-06824-0

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Понятие о стволовой клетке. Мезенхимные стромальные/стволовые

клетки (МСК)

Многоклеточные организмы состоят из большого количества специализированных (дифференцированных) клеток (нервных, мышечных. эпителиальных и многих других), согласованно выполняющих различные функции (проведение нервного импульса, сокращение скелетной и сердечной мускулатуры, обеспечение барьера со внешней средой и т.д.) в интересах целого организма. Разные типы дифференцированных клеток отличаются друг от друга как особенностями внутреннего строения, так и морфологически; тем не менее, организм со всем многообразием клеточных типов является результатом развития одной зародышевой клетки. Кроме того, на всём протяжении жизни организма клеточные популяции оскудевают в результате травм, заболеваний, действия физико-химических факторов внешней среды, "планового" обновления клеток. Из этих предпосылок следует, что клетки должны обладать способностью самовоспроизводиться и превращаться (дифференцироваться) в различные типы специализированных клеток, чтобы обеспечивать развитие организма, а также чтобы восстанавливать утрачиваемые по тем или иным причинам клетки. Это свойство называют стволовостью, а клетки, обладающие стволовостью, называют стволовыми. Впервые этот термин в том смысле, в котором его употребляют в настоящее время, предложил профессор Императорской военно-медицинской академии Александр Александрович Максимов, который показал, что клетки крови во всём их многообразии развиваются из одного и того же типа клеток-предшественников: гемопоэтических стволовых клеток (нем. die Stammzelle) [Maximow, 1908].

Стволовые клетки обладают способностью к поддержанию своей популяции (самообновлению) путём т.н. асимметричного деления, в результате которого одна из дочерних клеток сохраняет стволовость, а другая

дифференцируется в том или ином направлении под действием различных сигналов.

Стволовые клетки по степени дифференцировочного потенциала (потентности), то есть по количеству клеточных типов, в которые они способны дифференцироваться, подразделяют на:

1) Тотипотентные - способные давать начало всем видам зародышевых и внезародышевых тканей. У человека тотипотентной является первая клетка организма - зигота, а также клетки зародыша до стадии 16 бластомеров включительно;

2) Плюрипотентные - способные дифференцироваться во все типы зародышевых клеток. Плюрипотентными являются клетки внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты; также плюрипотентность можно индуцировать в соматических клетках с помощью экспрессии определённых транскрипционных факторов (факторы Яманаки)

3) Мультипотентные - их дифференцировочный потенциал ограничивается типами клеток, происходящих из одного зародышевого листка; примером мультипотентных клеток являются гемопоэтические клетки костного мозга, дающие начало клеткам миелоидного и лимфоидного рядов -фактически, всем клеточным компонентам крови;

4) Унипотентные - они предрасположены (коммитированы) к дифференцировке в один тип клеток; к примеру, в базальном слое эпидермиса находятся стволовые клетки, способные дифференцироваться лишь в кератиноциты.

В 1954 г. английский учёный Конрад Уоддингтон предложил концепцию эпигенетического ландшафта, которая также была воспринята для описания судьбы дифференцирующейся стволовой клетки [Eguizabal et а1., 2013.]. Согласно этой концепции, стволовую клетку можно уподобить мраморному шарику, скатывающемуся с горы (рис. 1.1). Чем выше находится шарик, тем

больше потенциальных траекторий, по которым он может двигаться (т.е. тем выше потентность клетки). Траектории движения задаются рельефом местности. Чем ниже шарик спускается, тем меньше вариантов потенциальных развилок у него остаётся. В конечном счёте, шарик окажется в конкретном месте внизу горы в зависимости от всей последовательности смен траекторий, и перескочить в соседнюю ложбинку он не может. Иначе говоря, стволовая клетка последовательно проходит ряд промежуточных стадий, каждая из которых всё более и более ограничивает её потенциал дифференцировки, и, превратившись в терминально дифференцированную клетку конкретной ткани, она уже не может стать клеткой другой ткани. Эта жёстко детерминированная схема была пересмотрена с открытием явлений дедифференцировки (утрата клеткой специализированных свойств и возврат к более стволовому состоянию), трансдифференцировки (прямой переход специализированной клетки из одного типа в другой минуя стадию дедифференцировки) и репрограммирования (индукция плюрипотентности в дифференцированных клетках с помощью экспрессии факторов Яманаки). С учётом этих открытий, современные представления о стволовых клетках и их судьбе могут быть наглядно изображены в виде модифицированной "горы Уоддингтона" (рис. 1.1.).

В 1970-х годах группа советских учёных под руководством профессора Александра Яковлевича Фриденштейна выделила из костного мозга и селезёнки весьма немногочисленную популяцию фибробластоподобных клеток, способных прикрепляться ко дну культурального сосуда, пролиферировать с образованием колоний и синтезировать внеклеточный матрикс; эти клетки первоначально были названы колониеобразующими единицами фибробластов [Friedenstein et al., 1970]. Опыты по трансплантации этих клеток животным показали их способность к дифференцировке в клетки костной и хрящевой тканей, а также стромы костного мозга, за что они получили наименование остеогенных стволовых клеток или стромальных стволовых клеток костного мозга [Friedenstein et al., 1974, 1987].

I Унипотентные CK

Дифференцированные клетки

ПОТЕНТНОСТЬ

п

Мул ьтипотентные CK

МСК, CK взрослого организма

Плюрипотентные Ch

эск, ипск

Тотипотентные CK

Зигота

Ш ДЕДИФФЕРЕНЦИРОВКА

Рисунок 1.1. Модифицированная "Гора Уоддингтона", разъяснение приведено в тексте. СК - стволовые клетки, ЭСК - эмбриональные стволовые клетки, ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, МСК - мезенхимные стромальные/стволовые клетки. Адаптировано из [Eguizabal et al., 2013].

В 1990-х гг. группа американских исследователей под руководством Арнольда Каплана подтвердила открытие А.Я. Фриденштейна, показав наличие в костном мозге популяции мультипотентных клеток, не относящихся к гемопоэтическим стволовым клеткам и способным к мультилинейной дифференцировке в клетки костной, хрящевой и жировой ткани [Pittenger et al., 1999]; они также продемонстрировали, что инъекции этих клеток в составе коллагенового геля способствовали восстановлению повреждённого сухожилия у кроликов [Young et al., 1998]. Каплан назвал эти клетки мезенхимными стволовыми клетками (МСК; mesenchymal stem cells, MSCs), сделав акцент на том, что МСК дифференцируются в те клеточные типы, которые являются производными мезенхимы, эмбриональной соединительной ткани [Caplan, 1991; Atala, 2022]. Впоследствии оказалось, что клетки с аналогичными свойствами могут быть выделены из многих источников, в том числе из жировой ткани, пульпы зуба, эндометрия, периферической крови, плаценты, амниотической жидкости,

вартонова студня пупочного канатика и др. [Berebichez-Fridman, Montera-Olvera, 2018]. МСК вызвали колоссальный интерес в исследовательской среде из-за сравнительной простоты выделения и культивирования, низкой иммуногенности при трансплантации и высокого терапевтического потенциала, который сразу был распознан группой Каплана. В качестве характерной иллюстрации, заметим, что в 1993 году, буквально через два года после того, как был предложен термин МСК, Капланом и его коллегами была учреждена биотехнологическая компания Osiris Therapeutics, которая занялась разработкой подходов к клеточной терапии на основе МСК.

В 2006 году, когда стал наблюдаться лавинообразный рост числа публикаций, посвящённых МСК, и возникла необходимость в стандартизации исследований, Международное общество клеточной и генной терапии (International Society for Cell and Gene Therapy, ISCT) предложило минимальные критерии, согласно которым МСК - это клетки, адгезирующие к культуральному пластику, способные к дифференцировке in vitro в остеобласты, хондроциты и адипоциты, экспрессирующие поверхностные маркеры CD73, CD90, CD105, и не экспрессирующие маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток CD34, CD45, CD14, CD11b, CD79alpha, CD19, HLA-DR [Dominici et al., 2006].

Несмотря на то, что МСК на протяжении нескольких десятилетий остаются объектом активных исследований, и на многих моделях заболеваний была показана их терапевтическая эффективность, до сих пор ведётся дискуссия об их идентичности. Оказалось, что клетки соединительной ткани -стромальные фибробласты - также удовлетворяют минимальным критериям МСК [Denu et al., 2016]. Поскольку при выделении МСК представляют собой гетерогенную популяцию фибробластов, миофибробластов и других клеток, в которой именно стволовые клетки, то есть способные к самоподдержанию и дифференцировке, составляют лишь очень небольшую часть, в 2019 году общество ISCT рекомендовало именовать нефракционированные популяции

МСК не стволовыми, а стромальными клетками [Viswanathan et al., 2019]. Согласно официальной позиции ISCT, стволовость должна быть строго доказана с помощью получения колоний из клоногенных клеток и тестов на их дифференцировку in vitro и in vivo, тогда как нефракционированные популяции, которые на практике и используются в многочисленных доклинических и клинических испытаниях, необходимо характеризовать с точки зрения их терапевтических свойств с помощью ряда функциональных тестов in vitro и in vivo - на секрецию трофических факторов, иммуномодуляцию, стимуляцию ангиогенеза (роста капиллярной сети) и т.д. Сам Арнольд Каплан, с чьей подачи термин "мезенхимные стволовые клетки" получил широкое распространение, впоследствии отказался от его использования и предложил сохранить общепринятый акроним МСК, но вложить в него функциональный смысл, назвав их medicinal signaling cells, поскольку они или продукты их секреции при введении в организм оказывают терапевтическое действие [Caplan, 2019].

1.2. Секретом МСК. Состав, терапевтические свойства, подходы к их

улучшению

Об интересе к МСК в связи с их терапевтическим потенциалом красноречиво свидетельствует число клинических испытаний с их использованием - порядка 1700 только зарегистрированных (активных и завершённых) на соответствующем ресурсе Национального центра биотехнологической информации (NCBI) Департамента здравоохранения США1. Среди патологий, в отношении которых изучали терапевтические свойства МСК в этих испытаниях - заболевания опорно-двигательного аппарата (остеоартрит, мышечные дистрофии, дефекты костных тканей), сердечно-сосудистой системы (инфаркт миокарда, сердечная недостаточность, гипертония, хроническая ишемическая кардиомиопатия), нервной системы (болезни Альцгеймера и Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, травмы спинного и головного мозга), дыхательной системы (острый респираторный дистресс-синдром, хроническая обструктивная болезнь лёгких, идиопатический лёгочный фиброз), аутоиммунные заболевания (сахарный диабет I типа, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, реакции отторжения трансплантата), патологии желудочно-кишечной системы (болезнь Крона, цирроз печени), заболевания кожи (атопический дерматит, буллёзный эпидермолиз, диабетические язвы) [Kouchakian et al., 2021; Maldonado et al., 2023].

Плейотропные эффекты МСК в отношении такого количества органов и тканей во многом связаны с секретомом МСК, т.е. репертуаром секретируемых молекул. Секретом МСК состоит из растворимой и нерастворимой (везикулярной) фракций и содержит несколько сотен компонентов [Kehl et al., 2019; González-González et al., 2020]. В составе растворимой фракции находятся белковые молекулы - ростовые факторы, цитокины, хемокины, протеазы, шапероны, гликопротеины внеклеточного матрикса, а также липиды.

1 на портале clinicaltrials.gov по запросу mesenchymal cells по состоянию на ноябрь 2024 г.

Везикулярная фракция состоит из мембранных пузырьков-везикул различного размера (от 50 нм до нескольких микрон) и происхождения (экзосомы, микровезикулы, апоптотические тельца), внутри которых находятся белки, липиды и нуклеиновые кислоты (геномная и митохондриальная ДНК, матричная РНК, регуляторные РНК - микроРНК и длинные некодирующие РНК) и даже целые органеллы - например, митохондрии [Thomas et al., 2022]. Благодаря разнообразию биологически активных компонентов, секретом МСК:

1) оказывает иммуномодулирующее действие (например, простагландин Е2 (PGE2), индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO), трансформирующий фактор роста pi (TGF-P1), интерлейкин-6 (IL-6), оксид азота (NO) подавляют воспалительные реакции за счёт ингибирования пролиферации и дифференцировки клеток иммунной системы; противовоспалительные цитокины, такие как IL-10, способствуют поляризации макрофагов в противовоспалительный фенотип M2, участвующий в процессах разрешения воспаления и восстановления повреждённых тканей);

2) при участии таких молекул как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), факторы роста фибробластов (FGF), гемоксигеназа (HO-1) подавляет процесс апоптоза, т.е. программированной гибели, в клетках, которые подвергаются ему в неблагоприятных условиях повреждённых тканей;

3) способствует неоваскуляризации, т.е. росту сосудистой сети в повреждённых тканях, посредством таких белков, как VEGF, FGF-2, HGF, TGF-в, фактора роста тромбоцитов (PDGF), ангиопоэтина-1 (Ang-1), хемоаттрактивного белка моноцитов (MCP-1);

4) с помощью многочисленных ростовых факторов стимулирует пролиферацию резидентных стволовых и прогениторных клеток, способствуя восстановлению клеточных популяций повреждённых тканей;

5) посредством матриксных металлопротеиназ (MMP), фоллистатина, катепсина S, белков семейства Dickkopf (DKK) препятствует формированию

фиброзного рубца, который у человека и многих млекопитающих замещает собой специализированные клетки в процессе восстановления повреждённой ткани в ущерб её нормальному функционированию [González-González et al., 2020; Sandoná et al., 2021; Brizio et al., 2024].

Заметим, что в ранних работах по исследованию терапевтических свойств МСК в модельные организмы или человеку вводились (системно или местно) непосредственно клетки, и предполагалось, что позитивные эффекты были связаны с тем, что МСК замещали собой клетки повреждённых тканей. Впоследствии выяснилось, что инъекции продуктов секреции МСК обладают таким же действием, что и введение суспензии клеток. В результате, акцент в исследованиях природы терапевтических свойств МСК сместился на изучение состава и функциональных свойств секретома. Переход к парадигме бесклеточной терапии на основе продуктов секреции МСК позволяет преодолеть ограничения, связанные с трансплантацией клеток, такие как риски злокачественной трансформации МСК, иммунологические реакции, вероятность тромбоза при введении, снижение терапевтической эффективности МСК вследствие их гибели. Использование секретома МСК вместо суспензии клеток обладает также логистическими преимуществами, поскольку терапевтическая доза клеток должна быть использована сразу же по приготовлении, тогда как секретом можно заморозить и хранить до использования; кондиционные среды, содержащие продукты секреции МСК, также проще транспортировать, нежели культивируемые клетки.

Известно, что секретом МСК не является постоянным набором биомолекул: его качественный и количественный составы зависят от многих факторов - например, от тканевого происхождения МСК, возраста и здоровья донора клеток, партии или лота сыворотки для культивирования, длительности нахождения клеток в культуре (пассажа), от условий культивирования, таких как концентрация кислорода в атмосфере инкубатора, пространственная организация клеточной культуры (двух- или трёхмерная) и т.д. [Ferreira et al.,

2018]. Итак, состав секретома культивируемых МСК можно модифицировать с помощью тех или иных манипуляций in vitro. Такие подходы, позволяющие повысить терапевтический потенциал МСК, называют

прекондиционированием. Среди способов прекондиционирования МСК можно выделить:

1) Обработку клеток цитокинами, гормонами и ростовыми факторами. Известно, что на провоспалительное микроокружение МСК реагируют повышенной секрецией противовоспалительных компонентов секретома. Так, например, культивирование МСК в присутствии IL-1ß, фактора некроза опухоли (TNF-a), интерферона-гамма (LFN-у) и бактериального липополисахарида (LPS) стимулирует продукцию противовоспалительных молекул IL-6, PGE2 и IDO [Liu et al., 2005; Nemeth et al., 2009; Chen et al., 2010]. Прекондиционирование с помощью различных ростовых факторов и гормонов также улучшает терапевтические свойства МСК: например, обработка МСК коктейлем ростовых факторов (FGF-2, IGF-1, BMP-2) или мелатонином усилили терапевтическое действие МСК на животных моделях инфаркта миокарда и церебральной ишемии соответственно [Hahn et al., 2008; Tang et al., 2014];

2) Культивирование в гипоксической атмосфере. Согласно стандартным протоколам, клетки культивируются в атмосферном воздухе, т.е. с содержанием кислорода порядка 21%. Эти условия не воспроизводят физиологическое микроокружение МСК, поскольку в тканях концентрация кислорода варьирует от 1% (хрящевая ткань) до 12% (периферическая кровь) [Das et al., 2009]. Культивирование МСК в условиях пониженного содержания кислорода в атмосфере инкубатора приводит к активации транскрипционного фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1), который, в свою очередь, запускает экспрессию ряда генов, обеспечивающих адаптацию МСК к гипоксическим условиям. В

результате, прекондиционированные гипоксией МСК активнее пролиферируют in vitro, а при трансплантации в повреждённые ткани более устойчивы к апоптозу, менее склонны к стресс-индуцированному клеточному старению и потере дифференцировочного потенциала [Hawkins et al., 2013]. Такие клетки демонстрировали улучшение терапевтических свойств во многих экспериментах in vivo: например, на животных моделях диабетических ран или ишемии коры головного мозга, и это связывают со значительным возрастанием экспрессии ряда компонентов секретома, ассоциированных с неоваскуляризацией, антиапоптотическим и нейропротекторным действием (VEGF, Ang-1, SDF-1, GDNF, BDNF, IGF-1, FGF-2 и др.) [Jun et al., 2014; Kim et al., 2015];

3) Методы тканевой инженерии. Стандартные протоколы поддержания МСК in vitro подразумевают их культивирование в виде одного слоя клеток (монослоя) на плоских поверхностях культуральных сосудов (двухмерное или 2D-культивирование). Методы трёхмерного культивирования позволяют более точно воспроизвести условия существования клеток в тканях; по сравнению с двухмерной культурой, в системах 3D-культивирования существенно изменяется паттерн экспрессии генов, в т. ч. кодирующих компоненты секретома МСК. К таковым системам можно отнести культивирование МСК в сфероидах (клеточных агрегатах, формирующихся при посеве клеток на неадгезивные поверхности, либо под действием силы тяжести в суспензионных каплях или при центрифугировании), а также культивирование МСК на различных скаффолдах - трёхмерных каркасах, изготовленных из полимерных молекул, в т.ч. биологического происхождения. Во многих работах было показано, что сфероиды МСК или МСК в составе скаффолдов значительно увеличивают секрецию целого ряда противовоспалительных и ангиогенных молекул и оказывают

более выраженное терапевтическое действие по сравнению с двумерными культурами МСК на различных животных моделях [Cesarz, Tamama, 2015; Cunningham et al., 2018]. Ещё одним перспективным направлением тканеинженерной модификации терапевтических свойств МСК является технология клеточных пластов. Клеточный пласт является результатом самоорганизации МСК при длительном культивировании и представляет собой конструкцию, состоящую из одного или нескольких слоёв клеток, объединённых межклеточными контактами и внеклеточным матриксом (ВКМ), депонированным клетками в процессе культивирования. Клеточный пласт, трансплантированный в повреждённую ткань, обеспечивает гораздо более высокую выживаемость МСК по сравнению с использованием суспензии МСК: получение суспензии подразумевает обработку адгезировавших к поверхности культуральной посуды клеток протеолитическими ферментами для их открепления от белков ВКМ, что приводит к аноикису - апоптотической гибели клеток в ответ на потерю адгезии, тогда как в составе клеточного пласта МСК продолжают получать необходимые для функционирования сигналы из ВКМ. Более того, в составе пласта МСК демонстрируют увеличенную продукцию секретируемых факторов и более значительный терапевтический эффект на ряде моделей заболеваний [Boldyreva et al., 2019; Bou-Ghannam et al., 2021; Guo et al., 2021]. Особенно примечательным свойством клеточных пластов является их способность качественно изменить исход восстановления повреждённой ткани: так, аппликация пласта МСК жировой ткани к модели пролежневой раны у крысы привела к полноценному восстановлению дермы с придатками кожи; этого оказалось невозможно добиться инъекциями суспензии или секретома МСК, поскольку они приводили к тому же приципиальному исходу, что и спонтанное заживление раны без всякого лечения - замещению дефекта фиброзным рубцом [Alexandrushkina et al., 2020]. Таким образом,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ушаков Роман Евгеньевич, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Матвеева Д.К., Андреева Е.Р. Регуляторная активность децеллюляризованного матрикса мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. // Цитология. -2020. - Т. 62. - № 10. - С. 699-715.

Al-Anazi K.A. Update on Mesenchymal Stem Cells // Journal of Stem Cell Therapy and Transplantation. - 2024. - № 8. - С. 001-003. doi:10.29328/journaljsctt1001035.

Alexandrushkina N., Nimiritsky P., Eremichev R., Popov V., Arbatskiy M., Danilova N., Malkov P., Akopyan Z., Tkachuk V., Makarevich P. Cell Sheets from Adipose Tissue MSC Induce Healing of Pressure Ulcer and Prevent Fibrosis via Trigger Effects on Granulation Tissue Growth and Vascularization // International Journal of Molecular Sciences. - 2020. - Т. 21. - С. 5567. doi:10.3390/IJMS21155567.

Assun5äo M., Dehghan-Baniani D., Yiu C.H.K., Später T., Beyer S., Blocki A. Cell-Derived Extracellular Matrix for Tissue Engineering and Regenerative Medicine // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. - 2020. - Т. 8. - С. 602009. doi:10.3389/fbioe.2020.602009.

Atala A. An Interview with Cell Therapy Pioneer, Arnold Caplan // Stem Cells Translational Medicine. - 2022. - Т. 11. - № 6. - С. 567-571. doi:10.1093/stcltm/szac026.

Berebichez-Fridman R., Montero-Olvera P.R. Sources and Clinical Applications of Mesenchymal Stem Cells: State-of-the-art review // Sultan Qaboos University Medical Journal. - 2018. - Т. 18. - № 3. - С. 264-277. doi:10.18295/squmj.2018.18.03.002.

Boldyreva M.A., Shevchenko E.K., Molokotina Y.D., Makarevich P.I., Beloglazova I.B., Zubkova E.S., Dergilev K.V., Tsokolaeva Z.I., Penkov D., Hsu M.N., Hu Y.C., Parfyonova Y.V. Transplantation of Adipose Stromal Cell Sheet Producing Hepatocyte Growth Factor Induces Pleiotropic Effect in Ischemic Skeletal Muscle // International Journal of Molecular Sciences. - 2019. - T. 20. - № 12. - C. 3088. doi:10.3390/ijms20123088.

Bou-Ghannam S., Kim K., Grainger D.W., Okano T. 3D cell sheet structure augments mesenchymal stem cell cytokine production // Scientific Reports. - 2021.

- T. 11. - № 1. - C.8170. doi:10.1038/s41598-021-87571-7.

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. - 1976. - T. 72. - C. 248-254. doi: 10.1006/abio.1976.9999.

Brizio M., Mancini M., Lora M., Joy S., Zhu S., Brilland B., Reinhardt D. P., Farge D., Langlais D., Colmegna, I. Cytokine priming enhances the antifibrotic effects of human adipose derived mesenchymal stromal cells conditioned medium // Stem Cell Research & Therapy. - 2024. - T. 15. - № 1. C 329. doi:10.1186/s13287-024-03916-9

Callaway C.S., Delitto A.E., Patel R., Nosacka R.L., D'Lugos A.C., Delitto D., Deyhle M.R., Trevino J.G., Judge S.M., Judge A.R. IL-8 Released from Human Pancreatic Cancer and Tumor-Associated Stromal Cells Signals through a CXCR2-ERK1/2 Axis to Induce Muscle Atrophy // Cancers (Basel). - 2019. - T. 11.

- № 12. - C. 1863. doi:10.3390/cancers11121863.

Caplan AI. Medicinal signalling cells: they work, so use them // Nature. - 2019. - T. 566. - № 7742. C. 39. doi: 10.1038/d41586-019-00490-6.

Caplan A.I. Mesenchymal stem cells // Journal of Orthopaedic Research. - 1991. -T. 9. - № 5. C. 641-650. doi :10.1002/j or.1100090504.

Cesarz Z., Tamama K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells // Stem Cells International. - 2016. - T. 2016. - № 9176357. doi:10.1155/2016/9176357.

Chen K., Wang D., Du W.T., Han Z.B., Ren H., Chi Y., Yang S.G., Zhu D., Bayard F., Han Z.C. Human umbilical cord mesenchymal stem cells hUC-MSCs exert immunosuppressive activities through a PGE2-dependent mechanism // Clinical Immunology. - 2010. - T. 135. - № 3. C. 448-458. doi:10.1016/j.clim.2010.01.015.

Choi J., Choi W., Joo Y., Chung H., Kim D., Oh S.J., Kim S.H. FGF2-primed 3D spheroids producing IL-8 promote therapeutic angiogenesis in murine hindlimb ischemia // NPJ Regenerative Medicine. - 2021. - T. 6(1). - № 48. doi:10.1038/s41536-021-00159-7.

Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochemistry. - 1987. - T. 162. - № 1. - C. 156-159. doi:10.1006/abio.1987.9999.

Clark A.Y., Martin K.E., García J.R., Johnson C.T., Theriault H.S., Han W.M., Zhou D.W., Botchwey E.A., García A.J. Integrin-specific hydrogels modulate transplanted human bone marrow-derived mesenchymal stem cell survival, engraftment, and reparative activities // Nature Communications. - 2020. - T. 11. -№ 1. - C. 114. doi:10.1038/s41467-019-14000-9.

Cunningham C.J., Redondo-Castro E., Allan S.M. The therapeutic potential of the mesenchymal stem cell secretome in ischaemic stroke // Journal of Cerebral Blood

Flow and Metabolism. - 2018. - T. 38. - № 8. - C. 1276-1292. doi:10.1177/0271678X18776802.

Das R., Jahr H., van Osch G.J., Farrell E. The role of hypoxia in bone marrow-derived mesenchymal stem cells: considerations for regenerative medicine approaches // Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2010. - T. 16. - № 2. - C. 159-168. doi:10.1089/ten.TEB.2009.0296.

Denu R.A., Nemcek S., Bloom D.D., Goodrich A.D., Kim J., Mosher D.F., Hematti P. Fibroblasts and Mesenchymal Stromal/Stem Cells Are Phenotypically Indistinguishable // Acta Haematologica. - 2016. - T. 136. - № 2. - C. 85-97. doi:10.1159/000445096.

Dergilev K., Tsokolaeva Z., Makarevich P., Beloglazova I., Zubkova E., Boldyreva M., Ratner E., Dyikanov D., Menshikov M., Ovchinnikov A., Ageev F., Parfyonova Y. C-Kit Cardiac Progenitor Cell Based Cell Sheet Improves Vascularization and Attenuates Cardiac Remodeling following Myocardial Infarction in Rats // Biomed Research International. - 2018. - T. 2018. - № 3536854. doi:10.1155/2018/3536854.

Desgeorges T., Liot S., Lyon S., Bouvière J., Kemmel A., Trignol A., Rousseau D., Chapuis B., Gondin J., Mounier R., Chazaud B., Juban G. Open-CSAM, a new tool for semi-automated analysis of myofiber cross-sectional area in regenerating adult skeletal muscle // Skeletal Muscle. - 2019. - T. 9. - № 1. - C. 2. doi:10.1186/s13395-018-0186-6.

Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop Dj., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular

Therapy position statement // Cytotherapy. - 2006. - T. 8. - № 4. - C. 315-317. doi:10.1080/14653240600855905.

Dziki J., Badylak S., Yabroudi M., Sicari B., Ambrosio F., Stearns K., Turner N., Wyse A., Boninger M.L., Brown E.H.P., Rubin J.P. An acellular biologic scaffold treatment for volumetric muscle loss: results of a 13-patient cohort study // NPJ Regenerative Medicine. - 2016. - T. 1. - № 16008. doi:10.103 8/npjregenmed.2016.8.

Eguizabal C., Montserrat N., Veiga A., Izpisua Belmonte J.C. Dedifferentiation, transdifferentiation, and reprogramming: future directions in regenerative medicine // Seminars in Reproductive Medicine. - 2013. - T. 31. - №. 1. - C. 82-94. doi:10.1055/s-0032-1331802.

Fan G., Wen L., Li M., Li C., Luo B., Wang F., Zhou L., Liu L. Isolation of mouse mesenchymal stem cells with normal ploidy from bone marrows by reducing oxidative stress in combination with extracellular matrix // BMC Cell Biology. -2011. - T. 12. - №. 30. doi:10.1186/1471-2121-12-30.

Fernández-Francos S., Eiro N., Costa L.A., Escudero-Cernuda S., Fernández-Sánchez M.L., Vizoso F.J. Mesenchymal Stem Cells as a Cornerstone in a Galaxy of Intercellular Signals: Basis for a New Era of Medicine // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. - T. 22. - № 7. - C. 3576. doi:10.3390/ijms22073576.

Ferreira J.R., Teixeira G.Q., Santos S.G., Barbosa M.A., Almeida-Porada G., Gon5alves R.M. Mesenchymal Stromal Cell Secretome: Influencing Therapeutic Potential by Cellular Pre-conditioning // Frontiers in Immunology. - 2018. - T. 9. -C. 2837. doi:10.3389/fimmu.2018.02837.

Forcina L., Cosentino M., Musaro A. Mechanisms Regulating Muscle Regeneration: Insights into the Interrelated and Time-Dependent Phases of Tissue Healing // Cells. - 2020. - T. 9. - №. 5. - C. 1297. doi:10.3390/cells9051297.

Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells // Cell and Tissue Kinetics. - 1970. - T. 3. - №. 4. - C. 393-403. doi:10.1111/j.1365-2184.1970.tb00347.x.

Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers // Cell and Tissue Kinetics. - 1987. - T. 20. - №. 3. - C. 263-272. doi:10.1111/j.1365-2184.1987.tb01309.x.

Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Latsinik N.V., Panasyuk A.F., Keiliss-Borok I.V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo // Transplantation. - 1974. - T. 17. - № 4. - C. 331-340. doi:10.1097/00007890-197404000-00001.

Fukuda et al. - 2012. - Muscle repair promoter. U.S. Patent No. US 2012/0114594 A1. - U.S. Patent and Trademark Office.

Garcia-Velasco J.A., Arici A. Interleukin-8 expression in endometrial stromal cells is regulated by integrin-dependent cell adhesion // Molecular Human Reproduction. - 1999. - T. 5. - № 12. - C. 1135-1140. doi:10.1093/molehr/5.12.1135. PMID: 10587368.

González-González A., García-Sánchez D., Dotta M., Rodríguez-Rey J.C., Pérez-Campo F.M. Mesenchymal stem cells secretome: The cornerstone of cell-free regenerative medicine // World Journal of Stem Cells. - 2020. - T. 12 - № 12. - C. 1529-1552. doi:10.4252/wjsc.v12.i12.1529.

Grekhnev DA, Kruchinina AA, Vigont VA, Kaznacheyeva EV. The Mystery of EVP4593: Perspectives of the Quinazoline-Derived Compound in the Treatment of Huntington's Disease and Other Human Pathologies // International Journal of Molecular Sciences. - 2022. - №. 23(24). - C. 15724.

Guo R., Wan F., Morimatsu M., Xu Q., Feng T., Yang H., Gong Y., Ma S., Chang Y., Zhang S., Jiang Y., Wang H., Chang D., Zhang H., Ling Y., Lan F. Cell sheet formation enhances the therapeutic effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells on myocardial infarction as a bioactive material // Bioactive Materials. -2021. - T. 6. - № 9. - C. 2999-3012. doi:10.1016/j.bioactmat.2021.01.036.

Hahn J.Y., Cho H.J., Kang H.J., Kim T.S., Kim M.H., Chung J.H., Bae J.W., Oh B.H., Park Y.B., Kim H.S. Pre-treatment of mesenchymal stem cells with a combination of growth factors enhances gap junction formation, cytoprotective effect on cardiomyocytes, and therapeutic efficacy for myocardial infarction // Journal of the American College of Cardiology. - 2008. - T. 51. - № 9. - C. 933-943. doi:10.1016/jjacc.2007.11.040.

Hara M., Yuasa S., Shimoji K., Onizuka T., Hayashiji N., Ohno Y., Arai T., Hattori F., Kaneda R., Kimura K., Makino S., Sano M., Fukuda K. G-CSF influences mouse skeletal muscle development and regeneration by stimulating myoblast proliferation // Journal of Experimental Medicine. - 2011. - T. 208. - № 4. - C. 715-727. doi:10.1084/jem.20101059. Epub 2011 Mar 21.

Hatakeyama M., Weinberg R.A. The role of RB in cell cycle control // Progress in Cell Cycle Research. - 1995. - № 1. - C. 9-19. doi:10.1007/978-1-4615-1809-9_2

Hawkins K.E., Sharp T.V., McKay T.R. The role of hypoxia in stem cell potency and differentiation // Regenerative Medicine. - 2013. - T. 8. - № 6. - C. 771-782. doi:10.2217/rme.13.71.

He X., Chen X., Li B., Ji J., Chen S. FAK inhibitors induce cell multinucleation and dramatically increase pro-tumoral cytokine expression in RAW 264.7 macrophages // FEBS Letters. - 2017. - T. 591. - № 23. - C. 3861-3871. doi:10.1002/1873-3468.12895.

Heidemann J., Ogawa H., Dwinell M.B., Rafiee P., Maaser C., Gockel H.R., Otterson M.F., Ota D.M., Lugering N., Domschke W., Binion D.G. Angiogenic effects of interleukin 8 (CXCL8) in human intestinal microvascular endothelial cells are mediated by CXCR2 // Journal of Biological Chemistry. - 2003. - T. 278. -№ 10. - C. 8508-8515. doi:10.1074/jbc.M208231200.

Heuslein J.L., McDonnell S.P., Song J., Annex B.H., Price R.J. MicroRNA-146a Regulates Perfusion Recovery in Response to Arterial Occlusion via Arteriogenesis // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. - 2018. - № 6. - C. 1. doi:10.3389/fbioe.2018.00001.

Hsu M.N., Liao H.T., Truong V.A., Huang K.L., Yu F.J., Chen H.H., Nguyen T.K.N., Makarevich P., Parfyonova Y., Hu Y.C. CRISPR-based Activation of Endogenous Neurotrophic Genes in Adipose Stem Cell Sheets to Stimulate

Peripheral Nerve Regeneration // Theranostics. - 2019. - T. 9. - № 21. - C. 6099-6111. doi:10.7150/thno.36790.

Huang Y., Crawford M., Higuita-Castro N., Nana-Sinkam P., Ghadiali S.N. miR-146a regulates mechanotransduction and pressure-induced inflammation in small airway epithelium // The FASEB Journal. - 2012. - T. 26. - № 8. - C. 3351-3364. doi:10.1096/fj. 11-199240.

Hughes C.E., Nibbs R.J.B. A guide to chemokines and their receptors // FEBS Journal. 2018. - T. 285. - № 16. - C. 2944-2971. doi:10.1111/febs.14466.

Hussey G.S., Dziki J.L., Badylak S.F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine // Nature Reviews Materials. - 2018. - № 3. - C. 159-173. doi:10.103 8/s41578-018-0023-x

Hynes R.O., Naba A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. -2012. - T. 4. - № 1. - C. a004903. - doi:10.1101/cshperspect.a004903.

Hynes R.O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils // Science. - 2009. - T. 326. - № 5957. - C. 1216-1219. doi:10.1126/science.1176009.

Illingworth C.M. Trapped fingers and amputated finger tips in children // Journal of Pediatric Surgery. - 1974. - № 6. - C. 853-858. doi:10.1016/s0022-3468(74)80220-4.

Inanc S., Keles D., Oktay G. An Improved Collagen Zymography Approach for Evaluating the Collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13 // Biotechniques. -2017. - № 63. - C. 174-180.

Iozzo R.V., Gubbiotti M.A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases // Matrix Biology. - 2018. - № 71-72. C. 1-9. doi:10.1016/j.matbio.2018.03.023.

Jun E.K., Zhang Q., Yoon B.S., Moon J.H., Lee G., Park G., Kang P.J., Lee J.H., Kim A., You S. Hypoxic conditioned medium from human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells accelerates skin wound healing through TGF-ß/SMAD2 and PI3K/Akt pathways // International Journal of Molecular Sciences. - 2014. - T. 15. - № 1. - C. 605-628. doi:10.3390/ijms15010605.

Jung H.W., Choi J.H., Jo T., Shin H., Suh J.M. Systemic and Local Phenotypes of Barium Chloride Induced Skeletal Muscle Injury in Mice // Annals of Geriatric Medicine and Research. - 2019. - № 2. - C. 83-89. doi:10.4235/agmr.19.0012.

Kaar J.L., Li Y., Blair H.C., Asche G., Koepsel R.R., Huard J., Russell A.J. Matrix metalloproteinase-1 treatment of muscle fibrosis // Acta Biomaterialia. - 2008. - T. 4. - № 5. - C. 1411-1420. doi:10.1016/j.actbio.2008.03.010

Kanda S., Kanetake H., Miyata Y. HGF-induced capillary morphogenesis of endothelial cells is regulated by Src // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2006. - T. 344. - № 2. - C. 617-622. doi: 10.1016/j .bbrc.2006.03.183.

Kehl D., Generali M., Mallone A., Heller M., Uldry A.C., Cheng P., Gantenbein B., Hoerstrup S.P., Weber B. Proteomic analysis of human mesenchymal stromal cell secretomes: a systematic comparison of the angiogenic potential // NPJ Regenerative Medicine. - 2019. - № 4. - C. 8. doi:10.1038/s41536-019-0070-y.

Khan S.U., Ghafoor S. Myokines: Discovery Challenges and Therapeutic Impediments // Journal of the Pakistan Medical Association. - 2019. - T. 69. - № 7. -C. 1014-1017.

Kim D.S., Lee M.W., Yoo K.H., Lee T.H., Kim H.J., Jang I.K., Chun Y.H., Kim H.J., Park S.J., Lee S.H., Son M.H., Jung H.L., Sung K.W., Koo H.H. Gene expression profiles of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are modified by cell culture density // PLoS One. - 2014. - T. 9. - № 1. - C. e83363. doi:10.1371/journal.pone.0083363.

Kim Y.S., Noh M.Y., Cho K.A., Kim H., Kwon M.S., Kim K.S., Kim J., Koh S.H., Kim S.H. Hypoxia/Reoxygenation-Preconditioned Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Rescue Ischemic Rat Cortical Neurons by Enhancing Trophic Factor Release // Molecular Neurobiology. - T. 52. - № 1. - C. 792-803. doi:10.1007/s12035-014-8912-5.

Koltsova A.M., Krylova T.A., Musorina A.S., Zenin V.V., Turilova V.I., Yakovleva T.K., Poljanskaya G.G. The Dynamics of Cell Properties during Long-Term Cultivation of Two Lines of Mesenchymal Stem Cells Derived from Wharton's Jelly of Human Umbilical Cord // Cell and Tissue Biology. - 2018. - № 12. - C. 7-19.

Koltsova A.M., Zenin V.V., Turilova V.I., Yakovleva T.K., Poljanskaya G.G. The Derivation and Characterization of Mesenchymal Stem Cell Line, Isolated from Human Pulp of a Deciduous Tooth // Tsitologiya. - 2018. - № 60. C. 955-968.

Korbecki J., Barczak K., Gutowska I., Chlubek D., Baranowska-Bosiacka I. CXCL1: Gene, Promoter, Regulation of Expression, mRNA Stability, Regulation of

Activity in the Intercellular Space // International Journal of Molecular Sciences. 2022. - T. 23. - № 2. - C. 792. doi:10.3390/ijms23020792.

Kouchakian M.R., Baghban N., Moniri S.F., Baghban M., Bakhshalizadeh S., Najafzadeh V., Safaei Z., Izanlou S., Khoradmehr A., Nabipour I., Shirazi R., Tamadon A. The Clinical Trials of Mesenchymal Stromal Cells Therapy // Stem Cells International. - 2021. - № 2021. - C. 1634782. doi:10.1155/2021/1634782.

Krylova T.A., Koltsova A.M., Zenin V.V., Musorina A.S., Yakovleva T.K., Poljanskaya G.G. Comparative Characteristics of New Lines of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells, Bone Marrow, and Foreskin // Cell and Tissue Biology. - 2012. - № 6. - C. 95-107.

Kuang W., Tan J., Duan Y., Duan J., Wang W., Jin F., Jin Z., Yuan X., Liu Y. Cyclic stretch induced miR-146a upregulation delays C2C12 myogenic differentiation through inhibition of Numb // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2009. - T. 378. - № 2. - C. 259-263. doi:10.1016/j.bbrc.2008.11.041.

Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - T. 227. - № 5259. - C. 680-685. doi:10.1038/227680a0.

Larson B.J., Longaker M.T., Lorenz H.P. Scarless fetal wound healing: a basic science review // Plastic and Reconstructive Surgery. - 2010. - № 4. - C. 1172-1180. doi:10.1097/PRS.0b013e3181eae781.

Lin H., Yang G., Tan J., Tuan R.S. Influence of decellularized matrix derived from human mesenchymal stem cells on their proliferation, migration and multi-lineage

differentiation potential // Biomaterials. - 2012. - T. 33. - № 18. - C. 4480-4489. doi:10.1016/j.biomaterials.2012.03.012.

Liu C.H., Hwang S.M. Cytokine interactions in mesenchymal stem cells from cord blood // Cytokine. - 2005. - T. 32. - № 6. - C. 270-279. doi:10.1016/j.cyto.2005.1L003.

Makarevich P.I., Boldyreva M.A., Gluhanyuk E.V., Efimenko A.Y., Dergilev K.V., Shevchenko E.K., Sharonov G.V., Gallinger J.O., Rodina P.A., Sarkisyan S.S., Hu Y.C., Parfyonova Y.V. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165 // Stem Cell Research & Therapy. - 2015. - № 6. - C. 204. doi:10.1186/s13287-015-0199-6.

Maldonado V.V., Patel N.H., Smith E.E., Barnes C.L., Gustafson M.P., Rao R.R., Samsonraj R.M. Clinical utility of mesenchymal stem/stromal cells in regenerative medicine and cellular therapy // Journal of Biological Engineering. - 2023. - T. 17. -№ 1. - C. 44. doi:10.1186/s13036-023-00361-9.

Margiana R., Markov A., Zekiy A.O., Hamza M.U., Al-Dabbagh K.A., Al-Zubaidi S.H., Hameed N.M., Ahmad I., Sivaraman R., Kzar H.H., Al-Gazally M.E., Mustafa Y.F., Siahmansouri H. Clinical application of mesenchymal stem cell in regenerative medicine: a narrative review // Stem Cell Research & Therapy. - 2022. - T. 13. - № 1. - C. 366. doi:10.1186/s13287-022-03054-0.

Maximow A.A. Über embryonale Entwicklung der Blut- und Bindegewebszellen bei den Säugetieren Text // Anatomischer Anzeiger. - 1908. - T. 32 (Suppl.). -C.65-72.

Morris A.H., Kyriakides T.R. Matricellular proteins and biomaterials // Matrix Biology. - 2014. - № 37. - C. 183-191. doi:10.1016/j.matbio.2014.03.002.

Morton A.B., Norton C.E., Jacobsen N.L., Fernando C.A., Cornelison D.D.W., Segal S.S. Barium chloride injures myofibers through calcium-induced proteolysis with fragmentation of motor nerves and microvessels // Skeletal Muscle. - 2019. -T. 9. - № 1. - C. 27. doi :10.1186/s 13395-019-0213-2.

Nemeth K., Leelahavanichkul A., Yuen P.S., Mayer B., Parmelee A., Doi K., Robey P.G., Leelahavanichkul K., Koller B.H., Brown J.M., Hu X., Jelinek I., Star R.A., Mezey E. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production // Nature Medicine. - 2009. - №. 1. - C. 42-49. doi:10.1038/nm.1905.

Noronha N.C., Mizukami A., Caliari-Oliveira C., Cominal J.G., Rocha J.L.M., Covas D.T., Swiech K., Malmegrim K.C.R. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies // Stem Cell Research & Therapy. - 2019. - T. 10. - № 1. - C. 131. doi:10.1186/s13287-019-1224-y.

Novoseletskaya E., Grigorieva O., Nimiritsky P., Basalova N., Eremichev R., Milovskaya I., Kulebyakin K., Kulebyakina M., Rodionov S., Omelyanenko N., Efimenko A. Mesenchymal Stromal Cell-Produced Components of Extracellular Matrix Potentiate Multipotent Stem Cell Response to Differentiation Stimuli // Frontiers in Cell and Developmental Biology. - 2020. - № 8. - C. 555378. doi:10.3389/fcell.2020.555378.

Pang X., He X., Qiu Z., Zhang H., Xie R., Liu Z., Gu Y., Zhao N., Xiang Q., Cui Y. Targeting integrin pathways: mechanisms and advances in therapy // Signal

Transduction and Targeted Therapy. - 2023. - T .8. - № 1. - C. 1. doi:10.1038/s41392-022-01259-6.

Pedersen B.K., Febbraio M.A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ // Nat Reviews Endocrinology. - 2012. - T. 8. - № 8. - C. 457-465. doi:10.103 8/nrendo.2012.49.

Pedersen B.K., Steensberg A., Fischer C., Keller C., Keller P., Plomgaard P., Febbraio M., Saltin B. Searching for the exercise factor: is IL-6 a candidate? // Journal of Muscle Research and Cell Motility. - T. 24. - № 2-3. - C. 113-119. doi:10.1023/a:1026070911202.

Peng K.Y., Liu Y.H., Li Y.W., Yen B.L., Yen M.L. Extracellular matrix protein laminin enhances mesenchymal stem cell (MSC) paracrine function through avß3/CD61 integrin to reduce cardiomyocyte apoptosis // Journal of Cellular and Molecular Medicine. - 2017. - T. 21. - № 8. - C. 1572-1583. doi:10.1111/jcmm.13087.

Pereira A.R., Trivanovic D., Stahlhut P., Rudert M., Groll J., Herrmann M. Preservation of the naive features of mesenchymal stromal cells in vitro: Comparison of cell- and bone-derived decellularized extracellular matrix // Journal of Tissue Engineering. - 2022. - № 13. - C. 20417314221074453. doi:10.1177/20417314221074453.

Pfaffl M.W. A New Mathematical Model for Relative Quantification in Real-Time RT-PCR // Nucleic Acids Research. - 2001. - № 29. - C. e45.

Piez K.A. History of extracellular matrix: a personal view. Matrix Biology. - 1997. - T. 16. - № 3. - C. 85-92. doi:10.1016/s0945-053x(97)90037-8.

Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. 1999. - T. 284. - № 5411. - C. 143-147. doi :10.1126/science.284.5411.143.

Qi C., Song X., Wang H., Yan Y., Liu B. The role of exercise-induced myokines in promoting angiogenesis // Frontiers in Physiology. - 2022. - № 13. - C. 981577. doi:10.3389/fphys.2022.981577.

Ragelle H., Naba A., Larson B.L., Zhou F., Prijic M., Whittaker C.A., Del Rosario A., Langer R., Hynes R.O., Anderson D.G. Comprehensive proteomic characterization of stem cell-derived extracellular matrices // Biomaterials. - 2017. -№. 128. - C. 147-159. doi:10.1016/j.biomaterials.2017.03.008.

Ramos-Rodriguez D.H., Fok S.W., Dorais C.J., Filler A.C., Caserta M., Leach J.K. Decellularized Extracellular Matrix Improves Mesenchymal Stromal Cell Spheroid Response to Chondrogenic Stimuli // Tissue Engineering Part A. - 2024. - Nov 18. doi:10.1089/ten.tea.2024.0267.

Rodríguez-Fuentes D.E., Fernández-Garza L.E., Samia-Meza J.A., Barrera-Barrera S.A., Caplan A.I., Barrera-Saldaña H.A. Mesenchymal Stem Cells Current Clinical Applications: A Systematic Review // Archives of Medical Research. - 2021. - T. 52. - № 1. - C. 93-101. doi:10.1016/j.arcmed.2020.08.006.

Sandoná M., Di Pietro L., Esposito F., Ventura A., Silini A.R., Parolini O., Saccone V. Mesenchymal Stromal Cells and Their Secretome: New Therapeutic

Perspectives for Skeletal Muscle Regeneration // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. - 2021. - № 9. - C. 652970. doi:10.3389/fbioe.2021.652970.

Seo H.R., Jeong H.E., Joo H.J., Choi S.C., Park C.Y., Kim J.H., Choi J.H., Cui L.H., Hong S.J., Chung S., Lim D.S. Intrinsic FGF2 and FGF5 promotes angiogenesis of human aortic endothelial cells in 3D microfluidic angiogenesis system // Scientific Reports. - 2016. - № 6. - C. 28832. doi:10.1038/srep28832.

Steensberg A., van Hall G., Osada T., Sacchetti M., Saltin B., Klarlund Pedersen B. Production of interleukin-6 in contracting human skeletal muscles can account for the exercise-induced increase in plasma interleukin-6 // The Journal of Physiology. - 2000. - №. 529(1). - C. 237-242. doi:10.1111/j.1469-7793.2000.00237.x.

Sun Y., Li W., Lu Z., Chen R., Ling J., Ran Q., Jilka R.L., Chen X.D. Rescuing replication and osteogenesis of aged mesenchymal stem cells by exposure to a young extracellular matrix // The FASEB Journal. - 2011. - T. 25. - № 5. - C. 1474-1485. doi:10.1096/fj. 10-161497.

Sutherland T.E., Dyer D.P., Allen J.E. The extracellular matrix and the immune system: A mutually dependent relationship // Science. - 2023. - T. 379. - № 6633. -C. eabp8964. doi:10.1126/science.abp8964.

Tak P.P., Firestein G.S. NF-kappaB: a key role in inflammatory diseases // Journal of Clinical Investigation. - 2001. - T. 107. - № 1. - C. 7-11. doi:10.1172/JCI11830.

Tang Y., Cai B., Yuan F., He X., Lin X., Wang J., Wang Y., Yang G.Y. Melatonin Pretreatment Improves the Survival and Function of Transplanted Mesenchymal Stem Cells after Focal Cerebral Ischemia // Cell Transplantation. - 2014. - T. 23. -№ 10. - C. 1279-1291. doi:10.3727/096368913x667510.

Telles G.D., Concei?äo M.S., Vechin F.C., Libardi C.A., Mori M.A.D.S., Derchain S., Ugrinowitsch C. Exercise-Induced Circulating microRNAs: Potential Key Factors in the Control of Breast Cancer // Frontiers in Physiology. - 2022. - № 13. -C. 800094. doi:10.3389/fphys.2022.800094.

Thomas M.A., Fahey M.J., Pugliese B.R., Irwin R.M., Antonyak M.A., Delco M.L. Human mesenchymal stromal cells release functional mitochondria in extracellular vesicles // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. - 2022. - № 10. C. 870193. doi:10.3389/fbioe.2022.870193

Trigo C.M., Rodrigues J.S., Camöes S.P., Sola S., Miranda J.P. Mesenchymal stem cell secretome for regenerative medicine: Where do we stand? // Journal of Advanced Research. - 2024. doi:10.1016/jjare.2024.05.004.

van der Rest M., Garrone R. Collagen family of proteins // The FASEB Journal. -1991. - T. 5. - № 13. - C. 2814-2823.

Viswanathan S., Shi Y., Galipeau J., Krampera M., Leblanc K., Martin I., Nolta J., Phinney D.G., Sensebe L. Mesenchymal stem versus stromal cells: International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT®) Mesenchymal Stromal Cell committee position statement on nomenclature // Cytotherapy. - 2019. - T. 21. - № 10. C. 1019-1024. doi:10.1016/jjcyt.2019.08.002.

Waldemer-Streyer R.J., Kim D., Chen J. Muscle cell-derived cytokines in skeletal muscle regeneration // FEBS Journal. - 2022. - T. 289. - № 21. - C. 6463-6483. doi:10.1111/febs.16372.

Wang Y., Yu J., Ou C., Zhao Y., Chen L., Cai W., Wang H., Huang S., Hu J., Sun G., Li L. miRNA-146a-5p Inhibits Hypoxia-Induced Myocardial Fibrosis Through

EndMT // Cardiovascular Toxicology. - 2024. - T. 24. - № 2. - C. 133-145. doi: 10.1007/s12012-023-09818-1.

Yamamoto Y., Gaynor R.B. IkappaB kinases: key regulators of the NF-kappaB pathway // Trends in Biochemical Sciences. - 2004. - T. 29. - № 2. - C. 72-79. doi:10.1016/j.tibs.2003.12.003.

Yamashita Y.M. Cell adhesion in regulation of asymmetric stem cell division // Current Opinion in Cell Biology. - 2010. - T. 22. - № 5. - C. 605-610. doi:10.1016/j.ceb.2010.07.009.

Yang J., Chen X., Yuan T., Yang X., Fan Y., Zhang X. Regulation of the secretion of immunoregulatory factors of mesenchymal stem cells (MSCs) by collagen-based scaffolds during chondrogenesis // Materials Science and Engineering C: Materials for Biological Applications. - 2017. - №. 70(Pt 2). - C. 983-991. doi:10.1016/j.msec.2016.04.096.

Yang M.C., O'Connor A.J., Kalionis B., Heath D.E. Improvement of Mesenchymal Stromal Cell Proliferation and Differentiation via Decellularized Extracellular Matrix on Substrates With a Range of Surface Chemistries // Frontiers in Medical Technology. - 2022. - № 4. - C. 834123. doi:10.3389/fmedt.2022.834123.

Yin J.Q., Zhu J., Ankrum J.A. Manufacturing of primed mesenchymal stromal cells for therapy // Nature Biomedical Engineering. - 2019. - T. 3. - № 2. - C. 90-104. doi:10.1038/s41551-018-0325-8.

Young R.G., Butler D.L., Weber W., Caplan A.I., Gordon S.L., Fink D.J. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair // Journal of Orthopaedic Research. - 1998. - T. 16. - № 4. - C. 406-413. doi:10.1002/jor.1100160403.

Zemelko V.I., Grinchuk T.M., Domnina A.P., Artzibasheva I.V., Zenin V.V., Kirsanov A.A., Bichevaia N.K., Korsak V.S., Nikolsky N.N. Multipotent Mesenchymal Stem Cells of Desquamated Endometrium: Isolation, Characterization, and Application as a Feeder Layer for Maintenance of Human Embryonic Stem Cells // Cell and Tissue Biology. - 2012. - № 6. - C. 1-11.

Zito F. Role of extracellular matrix in regulating embryonic epithelial-mesenchymal transition // Biomolecular Concepts. - 2012. - T. 3. - № 4. -C. 333-344. doi: 10.1515/bmc-2011-0065.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа никогда бы не увидела свет без вклада многих людей, которые приходили на помощь в трудную минуту. Автор сердечно благодарит всех, кто помогал и поддерживал словом и делом, ободрял и вдохновлял в ходе работы над диссертацией:

За веру, надежду и любовь - семью и друзей;

За вдумчивое и заботливое руководство, всестороннюю помощь, терпение и искреннее участие - научного руководителя Е.Б. Бурову;

За финансовую поддержку: чл.-корр. РАН А.Н. Томилина, О. Г. Люблинскую, А.П. Домнину, Е.Н. Толкунову, Н.А. Михайлову, О.В. Анацкую;

За поддержку реактивами и оборудованием: М.В. Харченко, Ю.А. Нащёкину, Е.Н. Толкунову, А.Б. Малашичеву;

За помощь в освоении исследовательских методов: А.П. Домнину, Д.С. Синяка, А.В. Соколову, П.О. Никонова, А.Д. Никотину, Д.А. Переплётчикову, М.А. Микеладзе, Е.Р. Михайлову, Л.Л. Алексеенко;

За помощь в эксплуатации оборудования: М.Ю. Сироткину, А.Г. Миттенберга, Е.В. Ломерт, Д.В. Кригер, А.Н. Шатрову, Н.Д. Аксёнова, Г.И. Штейна, М.Л. Воробьёва;

За предоставленные культуры клеток: А.П. Домнину, А.М. Кольцову и сотрудников Коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН, чл.-корр. РАН Е.А. Воротеляк и сотрудников уникальной научной установки "Коллекция клеточных культур для биотехнологических и биомедицинских исследований" Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН;

За помощь в проведении экспериментов: И.В. Кожухарову, Н.А. Пуговкину, Ю.С. Иванову;

За проведение анализа препаратов ВКМ с помощью сканирующей электронной микроскопии: А.В. Нащёкина;

За проведение мультиплексного анализа цитокинов/хемокинов/ростовых факторов кондиционной среды МСК: А.Ю. Ратушного и чл.-корр. РАН Л.Б. Буравкову;

За проведение анализа траекторий наночастиц: Л.М. Забегину и А.В. Малек;

За подготовку библиотек и секвенирование микроРНК: А.М. Мазура и сотрудников компании "Геноаналитика";

За анализ внеклеточных везикул с помощью просвечивающей электронной микроскопии: М.Г. Мартынову.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Рис. 1П. Дифференциальная экспрессия генов компонентов секретома в эМСК через 72 часа культивирования на децеллюляризованных внеклеточных матриксах, депонированных вс-МСК, эМСК и фет-МСК по отношению к клеткам, культивируемым на пластике. Данные получены с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. В качестве референсного гена использовался GAPDH. Данные представлены в виде тепловой карты: цветовой градиент соответствует значению двоичного логарифма кратного изменения уровня экспрессии FC (fold change); отрицательные значения Log2FC означают уменьшение экспрессии, положительные - увеличение. Значения Log2FC продублированы в ячейках в виде среднего значения трёх независимых повторов эксперимента.

дВКМ ВС-МСК дВКМ эМСК дВКМ Фет-МСК

4.15

2.33

2.24

5.3

2.19

2.67

4.66

2.11

1.29

3.75

1.91

1.45

7.32

7.21

6.17

Log FC

I

Рис. 2П. Тепловая карта, построенная для дифференциально экспрессируемых микроРНК в эМСК на дВКМ по сравнению с клетками на пластике. Эксперименты по секвенированию микроРНК проводили для трёх биологических повторов (культуры эМСК от трёх разных доноров). 7^соге соответствует выраженному в единицах стандартного отклонения отличию уровня экспрессии конкретного биологического повтора от среднего уровня экспрессии для экспериментальной группы. Положительные значения 7^соге соответствует дифференциально экспрессируемым микроРНК, увеличившим свою экспрессию в эМСК на дВКМ по сравнению с клетками на пластике, отрицательные значения 7^соге - уменьшившим свою экспрессию.

Рис. 3П. Иммунофлуоресцентная окраска поперечных срезов большеберцовой мышцы на 11-е сутки после индукции некроза хлоридом бария у мышей, получавших инъекции кондиционных сред эМСК, культивировавшихся на пластике и дВКМ, и среды ДМЕМ в качестве контроля. Слева -репрезентативное изображение препаратов, окрашенных антителами против коллагена I типа. Масштабная линейка соответствует 50 мкм. Данные представлены в виде "ящиков с усами" с указанием минимального, максимального и медианного значений, 25- и 75-го процентилей. (Тест Anova-Welch's для сравнения групп с неравной дисперсией и с post hoc тестом Тьюки для поправки на множественное сравнение, 6 мышей в каждой экспериментальной группе (n = 6), для каждого образца измерения проводились на трёх полях зрения).

Рис. 4П. Экспрессия генов IL-8, MMP-1, GRO-a в эМСК, культивировавшихся на пластике и дВКМ в присутствии ингибитора интегриновых рецепторов ау^Э, ау^5, а5^1 (циленгитид, 20 мкМ). Ингибиторы добавляли через 8 часов после посева клеток, РНК из клеток выделяли через 48 часов после посева. В качестве контроля клеткам добавляли ДМСО, в котором растворяли ингибиторы. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение для Э независимых экспериментов; * - p<0.05, ** - p<0.01; *** - p<0.001; (ANOVA с post hoc тестом Тьюки).

Рис. 5П. Экспрессия генов IL-8, MMP-1, GRO-a в эМСК, культивировавшихся на пластике и дВКМ в присутствии ингибиторов киназ Akt (LY294002, 20 мкМ) и p38 (SB203580, 5 мкМ). Ингибиторы добавляли через 8 часов после посева клеток, РНК из клеток выделяли через 48 часов после посева. В качестве контроля клеткам добавляли ДМСО, в котором растворяли ингибиторы. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение для 3 независимых экспериментов; * - p<0.05, ** - p<0.01; *** - p<0.001; (ANOVA с post hoc тестом Тьюки).

Табл. 1П. Результаты мультиплексного анализа ростовых факторов, цитокинов и хемокинов в кондиционной среде МСК различного происхождения, через 72 часа культивирования на пластике и дВКМ. Данные представлены как средние значения ± стандартные отклонения двух измерений.

Аналит пг/мл

эМСК фет-МСК вс-МСК дп-МСК

Пласт ик дВКМ Пласти к дВКМ Пласт ик дВКМ Пласти к дВКМ

sCD40L 13.53 ± 0 21.84 ± 2.45 5.17 ± 0 17.58 ± 1.18 25.355 ± 2.5 39.94 ± 2.6 10.49 ± 0 18.43 ± 2.37

EGF 5.97 ± 0 7.195 ± 0.41 5.95 ± 0.92 5.97 ± 0 5.72 ± 0.11 8.91 ± 1.01 5.81 ± 1.96 5.885 ± 0.34

Eotaxin 4.11 ± 0 3.56 ± 0 2.99 ± 0 4.37 ± 0.36 44.785 ± 1.57 9.31 ± 0 5.61 ± 0 4.63 ± 0

FGF-2 <13.8 2 157.425 ± 10.81 <13.82 131.49 ± 2.79 23.72 ± 0 672.86 ± 1.2 31.92 ± 5.06 32.71 ± 0

FLT-3L 2.34 ± 0 2.5 ± 0 <0.91 1.14 ± 0.03 <0.91 1.73 ± 0.02 <0.91 <0.91

Fractalki пе <19.3 8 < 19.38 <19.38 <19.38 <19.38 <19.38 <19.38 <19.38

G-CSF <3.39 374.21 ± 33.68 5.21 ± 0 843.07 ± 712.65 350.37 ± 23.83 2055.5 ± 543.76 35.58 ± 2.02 37.62 ± 21.99

GM-CSF 143.0 3 ± 0 917.01 ± 134.32 10.03 ± 9.82 4.915 ± 1.87 21.31 ± 2.88 236.49 ± 45.39 11.105 ± 9.11 9.525 ± 2.25

GRO-a 0.82 ± 0 179.2 ± 20.05 2.86 ± 1.46 2719.5 ± 392.44 2517 ± 214.96 9181.5 ± 651.24 8.04 ± 2.17 94.685 ± 3.95

HGF <9.26 406.13 ± 0 <9.26 131.98 ± 0 43.18 ± 0 76.64 ± 0 13.15 ± 0 18.15 ± 0

IFNa2 <4.86 <4.86 <4.86 <4.86 <4.86 <4.86 <4.86 <4.86

IFNy <1.21 <1.21 <1.21 <1.21 <1.21 1.51 ± 0 <1.21 <1.21

IL-1a 5.89 ± 0 13.295 ± 3.93 <3.83 5.23 ± 0 47.355 ± 0.27 110.53 ± 5.19 <3.83 <3.83

IL-1b <1.13 1.49 i О.12 <1.13 1.32 i О.12 3.88 i О.О7 15.45 i 1.64 <1.13 1.495 i О.12

IL-1RA <1.46 <1.46 <1.46 <1.46 <1.46 <1.46 6.39 i О <1.46

IL-2 <О.46 1.12 i О.25 <О.46 1.О6 i О О.73 i О.О8 1.415 i О.16 <О.46 О.59 i О.О5

IL-3 <О.79 О.95 i О О.9 i О <О.79 <О.79 <О.79 1.74 i О <О.79

IL-4 <О.58 <О.58 <О.58 <О.58 <О.58 О.74 i О.О7 1.О4 i О.24 2.565 i О.79

IL-5 <О.24 <О.24 <О.24 <О.24 <О.24 <О.24 <О.24 <О.24

IL-6 4О.52 i О 386.6 i 39.31 12.87 i 6.О2 2ОО.57 i 1О.67 4962 i 217.78 5913.5 i 64.34 683.64 i 179.97 1131.5 i 51.61

IL-7 1.39 i О 2.95 i О.74 1.67 i О.96 О.87 i О.16 < О.6О 1.19 i О.32 1.68 i О.82 О.96 i О.О3

IL-8 26.47 i О 8112 i 1О8.89 2О.О1 i 9.78 68ОО.5 i 5О9.82 352О i 28.28 6862 i 657.6О 117.41 i 26.65 3ОО8 i 166.87

IL-9 О.92 i О 1.84 i О О.8О5 i О.16 1.61 i О.32 2.ОО5 i О.О7 3.11 i О.28 1.495 i О.16 1.61 i О

IL-Ю <О.89 <О.89 <О.89 <О.89 <О.89 О.99 i О.12 <О.89 <О.89

IL-12(p4 О) 4.46 i О 8.25 i 1.16 4.46 i О 9.О8 i О 19.54 i 1.45 29.18 i О 6.65 i 1.О9 9.95 i 1.23

IL-12(p7 О) <2.24 <2.24 <2.24 <2.24 <2.24 <2.24 <2.24 <2.24

IL-13 <4.23 <4.23 <4.23 <4.23 <4.23 5.15 i О <4.23 6.53 i О.28

IL-15 5О.59 i О 43.88 i 1.99 <2.45 4.68 i О.43 4.575 i О.28 1О.О35 i О.6О 3.57 i О 2.97 i О.27

IL-17A <1.11 1.6 i О <1.11 1.32 i О.12 1.74 i О.19 4.О2 i О.29 1.41 i О 1.23 i О

IL-17/IL-25 <19.5 9 <19.59 <19.59 <19.59 <19.59 <19.59 <19.59 <19.59

IL-17F <16.9 5 <16.95 <16.95 <16.95 <16.95 <16.95 <16.95 <16.95

IL-18 <О.53 <О.53 <О.53 <О.53 <О.53 <О.53 <О.53 <О.53

IL-22 28.25 i О 32.725 i 1.23 35.39 i 9.23 33.55 i 4.О9 31.25 i О.84 55.О5 i 5.46 48.32 i 13.65 57.48 i 3.36

IL-27 <1О.6 5 17.65 i 4.19 11.98 i О 15.94 i 1.76 15.94 i 1.76 24.72 i 1.37 14.58 i 3.68 19.44 i 3.18

1Р-1О <2.36 <2.36 <2.36 <2.36 <2.36 <2.36 <2.36 <2.36

MCP-1 4547 i О 739О.5 i 212.83 32О.645 i 59.3О 5872 i 548.71 8974 i 87.68 12.274.5 i 596.О9 2336.5 i 581.94 2218.5 i 314.66

MCP-3 <6.94 37.47 i 1.4 <6.94 62.67 i 29.89 89.55 i 3.84 42О8.5 i 3365.12 13.11 i О.39 17.78 i 3.73

M-CSF 168.4 2 i О 163.5 i 1.73 13О.1О5 i 12.29 15О.24 i 4.8О 93.89 i О 1О4.55 i 2.65 275.18 i 23.17 214.97 i О

MDC <О.62 <О.62 <О.62 <О.62 <О.62 <О.62 <О.62 <О.62

MIG <5.47 <5.47 <5.47 <5.47 <5.47 <5.47 <5.47 <5.47

MIP-1a 1О.71 i О 14.76 i О.25 8.27 i О.98 11.125 i О.58 13.66 i О.79 27.16 i О.5О 11.31 i 1.44 11.12 i О.58

MIP-1b <О.42 <О.42 <О.42 <О.42 <О.42 О.76 i О.28 <О.42 <О.42

PDGF-A A 1О.4 i О <7.74 <7.74 <7.74 25.О7 i О.12 121.О3 i 5.58 <7.74 <7.74

PDGF-A B/BB 15.23 i О 24.78 i 1.89 12.46 i О 16.61 i 1.95 17.99 i О 26.1О i 3.76 24.О6 i 6.65 28.75 i 3.72

RANTE S <1.15 27.31 i О.28 <1.15 9.4 i О.16 <1.15 1.62 i О 1.51 i О 9.47 i О.38

TGFa <1.О4 1.45 i О <1.О4 1.33 i О 1.21 i О 2.715 i О.36 1.21 i О 1.21 i О

TNFa <4.О2 4.28 i 9О <4.О2 <4.О2 2О.92 i 1.34 28.4О5 i О.96 6.95 i 1.92 12.125 i О.98

TNFß 1.64 i О 1.47 i О <1.38 1.98 i О 6.835 i О.16 9.455 i О.92 4.535 i 1.19 11.81 i О.16

VEGF-A 82.38 i О <2.36 39.О8 i 11.32 68.985 i 1.54 <2.36 <2.36 262.215 i 52.37 1О4О i 11.31

Ссылка на результаты секвенирования микроРНК (необработанные прочтения):