Влияние лимфоидспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Новосадова, Екатерина Вячеславовна

• Новосадова, Екатерина Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Новосадова, Екатерина Вячеславовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Характеристика и свойства эмбриональных стволовых (ЭС) клеток

1.1.1. Получение ЭС клеток

1.1.2. Клеточный цикл

1.1.3. Дифференцировка ЭС клеток в культуре

1.1.4. Направленная дифференцировка ЭС клеток в культуре

1.1.5. Генетические модификации ЭС клеток

1.1.6. Моделирование эмбрионального развития с использованием ЭС клеток

1.2. Семейство TRIM белков

1.2.1. Характеристика семейства TRIM белков

1.2.2. Три основные группы белков TRIM семейства

1.2.3. Ген pub — представитель семейства TRIM белков 54 1.2.4 .Строение и свойства белка Pub 55 1.2.5. Возможные функции белка Pub

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Культивирование клеток млекопитающих

2.1.1. Культивирование ЭС клеток

2.1.2. Приготовление фидерного слоя из первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши

2.1.3. Культивирование клеток Rat

2.1.4. Культивирование лини клеток феохромацитомы крысы PC

2.1.5. Культивирование клеток человека Jurkat

2.2. Плазмиды, использованные в работе

2.2.1. Плазмиды pcDNA3, plneo, pPB, pRNAi, использованные для трансфекции ЭС клеток

2.2.2. Плазмиды pEJ6.6, pBR322 использованные для трансфекции клеток Rat

2.2.3. Плазмиды k-pub-myc, pub-myc, использованные для трансфекции ЭС клеток

2.3. Трансфекции клеток млекопитающих

2.3.1. Трансфекция ЭС клеток методом электропорации и последующая селекция

2.3.2. Трансфекция ЭС клеток с помощью липофектамина

2.3.3. Трансфекция и селекция псевдонормальной крысиной линии клеток Rat

2.3.4. Трансфекция клеток PC

2.4. Анализ пролиферации трансфицированных ЭС клеток

2.5. Индукция дифференцировки ЭС клеток с образованием ЭТ

2.6. Выделение тотальной РНК и проведение обратной транскрипции

2.7. Полимеразная цепная реакция

2.8. Выделение белковых гомогенатов из клеток млекопитающих

2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.10. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после электрофоретического разделения

2.11. Иммуноблотинг

2.12. Анализ дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты

2.13. Иммуноцитохимический анализ

2.14. Индукция дифференцировки стабильнотрансфицированных клеток PC-12 под действием ФРН

2.15. Статистическая обработка результатов экспериментов

Глава 3. Результаты и их обсуждения

3.1. Экспрессия эндогенного гена pub в недифференцированных

ЭС клетках мыши линии R1 и ЭТ

3.2. Получение трансфицированных линий ЭС клеток с повышенной экспрессией гена человека hpub, гена мыши pub, а также с пониженной экспрессией гена мыши pub

3.2.1. Изучение пролиферативной активности трансфицированных линий.

3.3. Оценка онкогенного потенциала гена человека hpub

3.4. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на разные пути дифференцировки

ЭС клеток мыши

3.4.1. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на энтодермальную дифференцировку

3.4.2. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на мезодермальную дифференцировку

3.4.3. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на эктодермальную дифференцировку

3.5. Влияние гена человека hpub на нейрональную дифференцировку линии клеток феохромацитомы крысы PC

3.6. Возможный механизм влияния экспрессии генов pub и hpub на процессы дифференцировки ЭС клеток

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние лимфоидспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши»

Ранее в отделе вирусной и клеточной молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН с помощью метода вычитающей гибридизации были получены и охарактеризованы клоны кДНК повышенно транскрибирующиеся в ВИЧ-ассоциированных иммунобластных лимфомах [1]. Анализ этих кДНК позволил выявить среди них, наряду с уже охарактеризованными генами {set, calpain и т.д.) несколько кДНК с неизвестными функциями. Одним из таких лимфоидспецифичных генов, был ген нуклеотидная последовательность (кДНК) которого содержалась в базе данных генома человека под названием KIAA0129. Японскими учеными было проведено исследование мышиного гомолога гена человека KIAA0129, которому они дали название pub. Показано, что белковый продукт этого гена КТАА0129 человека {hpub) имеет высокую степень гомологии (82%) с мышиным белком Pub [2].

Pub (hPub) относится к семейству TRIM (tripartite motif) белков [2], для которых характерно наличие так называемого TRIM (или RBBC) мотива, состоящего из трёх цинк-связывающих доменов: RING (R), B-box 1 (В1) и B-box 2 (В2), сопровождаемых coiled-coil (СС) регионом [3]. На данный момент известно 37 представителей данного семейства белков [3]. Некоторые из них вовлечены в такие биологические процессы, как регуляция транскрипции, организация цитоскелета, контроль клеточной пролиферации и дифференцировки [4].

Функции гена hpub не изучены. Однако известно, что его мышиный гомолог pub играет важную роль в процессах клеточной дифференцировки и оказывает существенное влияние на транскрипционную активность фактора PU.1 [2]. PU.1 относится к ETS семейству транскрипционных факторов, играет центральную роль в дифференцировке и пролиферации макрофагов и В-клеток в ходе гемапоэза, контролирует функциональную активность нейтрофилов [5]. Показано, что продукт гена pub ингибирует транскрипционную активность PU. 1 в гемоцитах и вследствие этого играет важную роль в дифференцировке и пролиферации миелоидных и лимфоидных клеток [2]. Влияние генов hpub и pub на более ранние стадии развития организма до настоящего времени исследовано не было.

В данной работе для изучения влияния генов hpub и pub на начальные этапы эмбрионального развития использовали модель эмбриональных стволовых клеток.

Эмбриональные стволовые клетки (ЭС клетки) представляют собой уникальную модель для изучения процессов, лежащих в основе онтогенеза. Как и в ходе развития зародыша in vivo, ЭС клетки в культуре способны давать начало всем трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме, а, соответственно, и всем развивающимся из них типам клеток. Исследования дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении в ответ на воздействие специфических индукторов (факторов роста, цитокинов) или на непосредственную генетическую модификацию позволяют приблизиться к пониманию функции исследуемых веществ и генов в данном процессе.

Есть данные о том, что гены некоторых членов TRIM семейства белков в случае рекомбинации с некоторыми другими генами приобретают свойства онкогена [4]. Основываясь на том, что повышенная экспрессия гена hpub наблюдалась в ВИЧ-ассоциированных иммунобластных лимфомах, необходимо было проверить, является ли увеличение экспрессии этого гена одной из причин злокачественного перерождения клеток и возникновения опухолей?

Нами проведены эксперименты с целью изучения влияния повышенной и пониженной экспрессии гена hpub (pub) на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши in vitro по трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме. На культуре ЭС клеток мы показали, что ген hpub человека действует аналогично гену pub мыши, что в дальнейшем позволило сравнивать нам действие повышенной экспрессии гена человека hpub и пониженной экспрессии гена pub мыши. Произведена оценка онкогенного потенциала лимфоидспецифичного гена hpub первичных фибробластов эмбрионов крысы.

Цель исследования

Целью работы было изучение влияния лимфомоспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro и оценка онкогенного потенциала данного гена.

Задачи исследования:

1. Изучить профиль экспрессии эндогенного гена pub на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши (при образовании эмбриоидных тел);

2. Получить стабильно трансфицированные поликлональные линии ЭС клеток мыши с повышенной экспрессией гена pub человека (hpub) и подавленной экспрессией эндогенного гена pub мыши;

3. Изучить влияния подавления экспрессии гена pub и' повышенной экспрессии гена hpub на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши в разных направлениях (эктодермальном, энтодермальном, мезодермальном);

4. Оценить онкогенный потенциал гена hpub человека на культуре псевдонормальных клеток крысы линии Rat-2.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Новосадова, Екатерина Вячеславовна

выводы

1. Экспрессия эндогенного гена pub увеличивается на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши.

2. Изменения в экспрессии генов hpub человека и pub мыши не оказывают влияния на пролиферативную активность эмбриональных стволовых клеток мыши.

3. Повышенная экспрессия гена hpub человека стимулирует, а пониженная экспрессия гена pub мыши ингибирует образование эмбриоидных тел in vitro.

4. На клеточной линии Rat-2 показано, что ген hpub человека не обладает выраженным онкогенным потенциалом, повышение его экспрессии не приводит к формированию фокусов морфологической трансформации.

5. Не обнаружено влияния генов hpub и pub на уровень экспрессии генов-маркеров энтодермальной дифференцировки (yimentin, somatostatin, GATA-4, GATA-6) в эмбриональных стволовых клеток мыши.

6. Повышенная экспрессия гена hpub человека усиливает потенциал эмбриональных стволовых клеток мыши к дифференцировке в мезодермальном направлении: обнаружено увеличение количества сокращающихся кардиомиоцитов, усиление экспрессии генов скелетного и сердечного тропонина (tr sk, tr card), а также лимфоидспецифичных генов c-kit, IL-7. Пониженная экспрессия гена pub мыши приводит к уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов и снижению экспрессии этих генов по сравнению с контролем.

7. Повышенная экспрессия гена hpub человека оказывает ингибирующее действие на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши в эктодермальном направлении, приводя к уменьшению количества образующихся нейронов и к снижению экспрессии генов /?-/// tubulin, nestin, тогда как пониженная экспрессия гена pub мыши, напротив, способствует усилению экспрессии этих генов и стимулирует образование нейронов in vitro. Негативное влияние повышенной экспрессии гена hpub на нейрональную дифференцировку подтверждено также в экспериментах на клеточной линии феохромацитомы крысы РС-12.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Новосадова, Екатерина Вячеславовна, 2009 год

1. Ненашева В.В, Максимов В.В, Николавев А.И, Тарантул В.З. Сравнительный анализ уровней транскрипции генов в двух типах ВИЧ-ассоциированных лимфом. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2001. №4. С. 27-31.

2. Hirose S., Nishuzumi Н., Sakano Н. Pub, a novel PU.1 binding protein, regulates the transcriptional activity of PU.1. // Biochem. Biophs. Com. 2003. V. 311. P. 351-360.

3. Torok M., Etkin L. Two В or not two B? Overview of the rapidly expanding B-box family of proteins. // Differentiation. 2000. V. 67. P. 63-71.

4. Lloberas J., Solier C., Celada A. The key rol of PU.l/SP-1 cells, myeloid cells and macrophages. // Immunol. Today. 1999. V. 20. P. 184-189.

5. Doetschman Т., Eistetter H., Katz M., Schmidt W. and Kemler R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. II J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. V. 87. P. 27-^5.

6. Evans M. and Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. //Nature. 1981. V. 292 P. 154-156.

7. Wobus A., Holzhausen H., Jakel P. and Schoneich J. Characterization of a pluripotent stem cell line derived from a mouse embryo. II Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 212-219.

8. Geijsen N., Horoschak M., Kim K., Gribnau J., Eggan K. and Daley Q. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. //Nature. 2004. V. 427. P. 148-154.

9. Hiibner К., Fuhrmann G., Christenson K., Kehler J., Reinbold R., De La F., Wood J., Strauss F., Boiani M. and Scholer R. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. // Science. 2003. V. 300. P. 1251-1256.

10. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R. and Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11457-11462.

11. Blyszczuk P., Asbrand C., Rozzo A., Kania G., St-Onge L., Rupnik M. and Wobus A. Embryonic stem cells differentiate into insulin-producing cells without selection of nestin-expressing cells. // Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 1095-1104.

12. Dang S. and Zandstra P. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. // Methods Mol. Biol. 2004 V. 290. P. 353-364.

13. Doss M., Koehler C., Hescheler J., Sachinidis A. Embryonic stem cells: a promising tool for cell replacement therapy. // J. Cell. Mol. Med. 2004. V. 8. P. 465-473.

14. Soria В., Skoudy A., Martin F. From stem cells to betta cells: new strategies in cell therapy of diabetes mellitus. // Diabetologia. 2001. V. 44. P. 407-415.

15. Keller G. Embryonic stem cells differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. // Genes & Dev. 2005. V. 19. P. 1129-1155.

16. Evans M., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mous embryos. // Nature. 1981. V. 292. P. 154-158.

17. Martin G., Evans M. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 1441-1445.

18. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

19. Гривенников И.А., Мануйлова E.C. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития. В книге: Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Под ред. Академика Свердлова Е.Д. М.: Наука. 2003. Т. 1. С. 290.

20. Миталипов Ш.М., Миталипова М.М., Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro и in vivo. // Онтогенез. 1994. Т. 25. №6. С. 19-27.

21. Gearing D., Goygh N., King J. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukemia inhibitory factor (LIF). // EMBO J.1987. V. 6. P. 3995-4002.

22. Kishimoto Т., Taga Т., Akira S. Cytokine signaltransduction. // Cell. 1994. V. 76. P. 253-262.

23. Taupin J., Pitard V., Dechanel J. Leukemia inhibitory factor: part of a large ingathering family. // Int. Rev. Immunol. 1998. V. 16. P. 397-426.

24. Williams R., Hilton D., Pease S. Mieloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potentional of embryonic stem cells. // Nature.1988. V. 336. P. 684-687.

25. Smith A., Heath J., Donaldson D., Wong G., Moreau J., Stahl M., Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. //Nature. 1988. V. 336. P. 688-690.

26. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozumi M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic Ml cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P.10978-10982.

27. Baumann H., Wong G. Hepatocyte-stimulating factor III shares structural and functional identity with leukemia-inhibitory factor. // J. Immunol. 1989. V. 143. P. 1163-1167.

28. Hilton D. LIF: lots of interesting functions. // Trends Biochem. Sci. 1992. V. 17. P. 72-76.

29. Murphy M., Dutton R., Koblar S., Cheema S., Bartlett P. Cytokines which signal through the LIF receptor and their actions in the nervous system. // Prog. Neurobiol. 1997. V. 52. P. 355-378.

30. Mori M., Yamaguchi K., Abe K. Purification of a lipoprotein lipase-inhibiting protein produced by a melanoma cell line associated with cancer cachexia. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 160. P. 1085-1092.

31. Resnik J., Bixler L., Cheng L., Donovan P. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. //Nature. 1992. V. 359. P. 550-551.

32. Chodorowska G., Glowacka A., Tomczyk M. Leukemia inhibitory factor (LIF) and its biological activity. // Ann. Univ. Mariae Curie Scolodowska. 2004. V. 59. P. 189-193.

33. Ying Q., Stavridis M., Griffiths D., Li M., Smith A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. //Nat. Biot. 2003. V. 21. P. 183-186.

34. Pesce M., Anastassiadis K. and Scholer H. Oct-4: lessons of totipotency from embryonic stem cells. // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. P. 144—152.

35. Thomson J., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S., Waknitz M., Swiergiel J., Marshall V. and Jones J. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

36. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S. and Smith A. Functional expression cloning of nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. // Cell. 2003. V. 113. P. 643-655.о

37. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M. and Yamanaka S. The homeoprotein nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. // Cell. 2003. V. 113. P. 631-642.

38. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

39. Niwa H., Myyazaki J., Smith A. Quantitative expression of OCT-3/4 definies differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. // Nat. Genet. 2000. V. 24. P. 328-330.

40. Nishikawa S., Hirashima M., Matsuyoshi N., and Kodama H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK+VE-cadherin cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. // Development. 1998. V. 125. P. 1747-1757.

41. Yoshida H., Hayashi S., Kunisada Т., Ogawa M., Nishikawa S., Okamura H., Sudo Т., and Shultz L. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. // Nature. 1990. V. 345. P. 442-444.

42. Nakano Т., Kodama H. and Honjo Т. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. // Science. 1994. Y. 265. P. 10981101.

43. Guan K., Rohwedel J., Wobus A. Embryonic stem cell differentiation models: cardiogenesis, myogenesis, neurogenesis, epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro. // Cytotech. 1999. V. 30. P. 211-226.

44. Dieterlen-Lievre F. On the origin of haemopoietic stem cells in the avian embryo: An experimental approach. // J. Embryol. Exp. Morphol. 1975. V. 33. P. 607-619.

45. Godin I., Dieterlen-Lievre F. and Cumano A. Emergence of multipotent hemopoietic cells in the yolk sac and paraaortic splanchnopleura in mouse embryos, beginning at 8.5 days postcoitus. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Y. 92. P. 773-777.

46. Medvinsky A. and Dzierzak E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. // Cell. 1996. V. 86. P. 897-906.

47. Palis J., Roberston S., Kennedy M., Wall C. and Keller G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. // Development. 1999. V. 126. P. 5073-5084.

48. Russel E. Heriditary anemias of the mouse: A review for geneticists. // Adv. Genet. 1979. V. 20. P. 357-459.

49. Keller G., Kennedy M., Papayannopoulou Т., Wiles M. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. // Mol. Cell. Biol. 1993. V.13. P. 473-486.

50. Haar J. and Ackerman G. A phase and electron microscopic study of vasculogenesis and erythropoiesis in the yolk sac of the mouse. // Anat. Rec. 1971. V 170. P. 199-224.

51. Murray P. The development of in vitro of the blood of the early chick embryo. //Proc. Roy. Soc. London. 1932. V. 11. P. 497-521.

52. Sabin F. Studies on the origin of blood vessels and of red corpuscles as seen in the living blastoderm of the chick during the second day of incubation. // Contrib. Embryol. 1920. V. 9. P. 213-262.

53. Faloon P., Arentson E., Kazarov A., Deng C., Porcher C., Orkin S. and Choi K. Basic fibroblast growth factor positively regulates hematopoietic development. // Development. 2000. V. 127. P. 1931-1941.

54. Lacaud G., Gore L., Kennedy M., Kouskoff V., Kingsley P., Hogan C., Carlsson L., Speck N., Palis J. and Keller G. Runxl is essential for hematopoietic commitment at the hemangioblast stage of development in vitro. // Blood. 2002. V. 100. P. 458-466.

55. Sachinidis A., Fleischman В., Kolossov E., Wartenberg M., Sauer H., Hescheler J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cell. // Card. Research. 2003. V. 58. P. 278-291.

56. Scerjanc I., Petropoulos H., Ridgeway A., Wilton S. Myocyte enhancer factor 2C and Nkx2-5 up-regulate each other's expression and initiate cardiomyogenesis in P19 cells. // J. of Boil. Chem. 1998. V. 273. P. 3490434910.

57. Behfar A., Zingman L., Hodgson D., Rausier J., Kane G., Terzic A., Puceat M. Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. // FASEB J. 2002. V. 16. P. 1558-1566.

58. Wei H., Juhasz O., Li J., Tarasova Y., Boheler K. Embryonic stem cell and cardiomyocite differentiation: phenotypic and molecular analyses. // J. Cell. Nol. Med. 2005. V. 9. P. 804-817.

59. Le Douarin В., Nielsen A., Gamier J., Ichinose H., Jeanmougin F., Losson R. Apossible involvement of TIF la and TIFip in the epigenetic control of transcription by nuclear receptors. // EMBO. J. 1996. V. 15. P. 6701-6715.

60. Nakanisi M, Hamazaki T, Komazaki S, Okochi H, Asashima M. Pancreatik tissue formation from murine embryonic stem cells in vitro. // Differentiation. 2007. V. 75. P. 1-11.

61. Ventura C., Maioli M. Opioid peptide gen expression primers cardiogenesis in embryonal pluripotent stem cells // Circ. Res. 2002. V. 87. P. 189-194.

62. Dang S and Zandstra P. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. // Methods Mol. Biol. 2004. V. 290. P. 353-364.

63. Kramer J., Hegert C., Guan K., Wobus A., Muller P. and Rohwedel J. Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and BMP-4. // Mech. Dev. 2000. V. 92. P. 193-205.

64. Buttery L., Bourne S., Xynos J., Wood H., Hughes F., Hughes S., Episkopou V. and Polak J. Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. // Tissue. 2001. V. 7. P. 89-99.

65. Bain G., Kitchens D., Yao M., Huettner J. and Gottlieb D. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. // Dev. Biol. 1995. V. 168. P. 342-357.

66. Fraichard A., Chassande O., Bilbaut G., Dehay C., Savatier P. and Samarut J. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. //J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 3181-3188.

67. Guan К., Chang H., Rolletschek A., Wobus A. Embryonic stem cell-derived neurogenesis. Retinoic acide induction and lineage selection of neuronal cells. // Cell Tissue Res. 2001. V. 305. P. 171-176.

68. Ye W., Shimamura K., Rubenstein J., Hynes M. and Rosenthal A. FGF and Shh signals control dopaminergic and serotonergic cell fate in the anterior neural plate. // Cell. 1998. V. 93. P. 755-766.

69. Simon H., Bhatt L., Gherbassi D., Sgado P. and Alberi L. Midbrain dopaminergic neurons: Determination of their developmental fate by transcription factors. // Ann. NY Acad. Sci. 2003. V. 991. P. 36-47.

70. Bagutti C., Wobus A., Fassler R. and Watt F. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes: Comparison of wild-type and PI integrin-deficient cells. // Dev. Biol. 1996. V. 179. P. 184-196.

71. Coraux C., Hilmi C., Rouleau M., Spadafora A., Hinnrasky J., Ortonne J., Dani C. and Aberdam D. Reconstituted skin from murine embryonic stem cells. // Curr. Biol. 2003. V. 13. P. 849-853.

72. Rathjen P., Nichols J., Toth S., Edwards D., Heath J., Smith A. Developmentally Programmed induction of differentiation inhibiting activity and the control of stem cell populations. // Genes Dev. 1990. V. 4. P. 23082318.

73. Chinzei R., Tanaka Y., Shimizu-Saito К., Hara Y., Kakinuma S., Watanabe M., Teramoto K., Arii S., Takase K., Sato C., Terada N. and Teraoka

74. H. Embryoid-body cells derived from a mouse embryonic stem cell line show differentiation into functional hepatocytes. // Hepatology. 2002. V. 36. P. 22—29.

75. Choi D., Oh H., Chang U., Koo S., Jiang J., Hwang S., Lee J., Yeoh G., Shin H., Lee J. and Oh B. In vivo differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes. // Cell Transplant. 2002. V. 11. P. 359-368.

76. Yamada Т., Yoshikawa M., Kanda S., Kato Y., Nakajima Y., Ishizaka S. and Tsunoda Y. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green. // Stem Cells. 2002. V. 20. P. 146-154.

77. Yamamoto H., Quinn G., Asari A., Yamanokuchi H., Teratani Т., Terada M. and Ochiya T. Differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes: biological functions and therapeutic application. // Hepatology. 2003. V. 37. P. 983-993.

78. Soria В., Roche E., Berna G., Leon-Quinto Т., Reig J. and Martin F. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. // Diabetes. 2000. V. 49. P. 157-162.

79. Leon-Quinto Т., Jones J., Skoudy A., Burcin M. and Soria B. In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells. // Diabetologia. 2004. V. 47. P. 1442-1451.

80. Desbaillets I., Ziegler U., Groscurth P. and Gassman M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. // Experemental Physiology. 2000. V. 85. P. 645-651.

81. Xu. C., Liguori G., Adamson E., Persico M. Abrogation of the CRIPTO gene in mouse leads to failure of postgastrulation morphogenesis and lack of differentiation ofcardiomyocites. //Development. 1999. V. 126. P. 483-494.

82. Bahramian M. and Zarbl H. Transcriptional and posttranscriptional silencing of rodent alpha 1(1) collagen by a homologous transcriptionally self-silenced transgene. // Mol. Cell Biol. 1999. V. 19. P. 274-283.

83. Wobus A., Boheler K. Embryonic Stem Cells: propects for developmental biology and cell therapy. // Physiol. Rev. 2005. V. 85. P. 635-678.

84. Lake J., Rathjen J., Remiszewski J., Rathien P. Reversible programming of pluripotent cell differentiation. // J. Cell. Sci. 2000. V. 113. P. 555-566.

85. Rathjen J., Lake J., Bettess M., Washington J., Chapman G., Ratjen P. Formation of primitive ectoderm like cell population, EPL cell, from ES cell in response to biologically derived factors. // J. Cell Sci. 1990. V. 112. P. 601-612.

86. Kubo A., Shinozaki K., Shannon J., Kouskoff V., Kennedy M., Woo S., Fehling H., Keller G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. //Development. 2003. V. 131. P. 1651-1662.

87. Reddy B, Etkin L, Freemont P. A novel zinc finger coiled-coil domain in a family of nuclear proteins. // Trends. Biochem. Sci. 1992. V. 17. P. 344-345.

88. Borden K. RING fingers and B-boxes: zinc-binding protein-protein interaction domains. //Biochem. Cell. Biol. 1998. V. 76. P. 351-358.

89. Сингер M., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир. 1998. Т.2. С. 130-131.

90. Takanashi М., Cooper G. ret transforming gen encodes a fusion protein homologous to tyrosine kinases. // J. Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 1378-1385.

91. Tezel G., Nagasaka Т., Iwahashi N., Asai N., Iwashita Т., Sakata K., Takanashi M. Different nuclear/cytoplasmic distributions of RET finger protein in different cell types. // Pathol. Int. 1999. V. 49. P. 881-886.

92. Shimono Y., Murakami H., Hasegawa Y., Takahashi M. RET finger protein is a transcriptional repressor and interacts with enhanser of polycomb that has dual transcriptional functions. // J. Biol. Chem. 2000. V. 257. P. 3941139419.

93. El-Hodiri H., Shou W., Etkin L. Xnf7 functions in dorzal-ventral pattering of the Xenopus embiyo. // Dev. Biol. 1997. V. 190. P. 1-17.

94. Shou W., Li X., Wu С., Cao. Т., Kuang G., Etkin L., Che S. Finely turned regulation of cytoplasmic retention of Xenopus nuclear factor 7 by phosphorylation of individual threonine residues. // J. Mol. Cell. Biol. 1996. V.16. P. 990-997.

95. Jensen J., Shieles C., Freemont P. PML protein isoforms and the RBCC/TRIM motif. // Oncogen. 2001. V. 20. P. 7223-7233.

96. Zhong S., Hu P., Ye Т., Stan R., Ellis N., Pandolfi P. A rol for PML and the nuclear body in genomic stability. // Oncogen. 1999. V. 18. P. 7941-7947.

97. Moosmann P., Georgiev O., Le Douarin В., Bourquin J., Schaffner W. Transcriptional repression by RING finger protein TIFip that interacts with the KRAB repressor domain of KOX1. // Nucleic Acide Res. 1996. V. 24. P. 48594867.

98. McKercher S., Torbett В., Anderson K., Henkel G., Vestal D., Baridault H., Klemzs M., Feeney A., Wu G., Paige C., Maki R. Targeted disruption of the PU.1 gene results in multiple hematopoetic abnormalities. // EMBO J. 1996. V.15.P. 5647-5658.

99. Kodandapani R., Pio F., Ni C., Picciali G., Klemsz M., McKercher S., Maki R., Eli K. A new pattern for helix-turn-helix recognition reveald by the PU.1 ETS-domain-DNA complex. //Nature. 1996. V. 380. P.456-460.

100. Zhang P., Behre G., Pan J., Iwama A., Radomska H., Auron F., Tenen D. Negative cross-talk between hematopoetic regulators: GATA protein repress PU.1. // Med. Science. 1999. V. 96. P. 8705-8710.

101. Hallier M., Lerga A., Barnache S., Tavitian A., Moreau-Gachelin F. The transcription factor Spi-l/PU.l interacts with the Potential Splicing Factor TLS. //J. Biol. Chem. 1998. V.273. P. 4838-4842.

102. Hallier M., Tavitian A., Moreau-Gachelin F. The transcriptional factor Spi-l/PU.l binds RNA and interferes with the RNA -binding protein p54nrb. // American Society for Biochem and Molecular Biol. 1996. V. 271. P. 1117711181.

103. Zhang P., Zhang X., Iwama A., Yu C., Smith K., Mueller В., Narravula S., Torbett В., Orkin S. and Tenen D. PU.1 inhibits GATA-1 function and erythroid differentiation by blocking GATA-1 DNA binding. // Blood. 2000. V. 96. P. 2641-2648.

104. Guerrasio A., Saglio G., Rosso C., Alfarano A., Camaschella C., Lo Coco F., Biondi A., Rambaldi A., Nicolis S., Ottolenghi S. Expression of GATA-1 mRNA in human myeloid leukemic cells. // Leukemia. 1994. V. 8. P. 10341038.

105. Schuetze S., Stenberg P., Kabat D. The Ets-related transcription factor PU.1 immortalizes erytroblasts. // Mol. Cell .Biol. 1993. V. 13. P. 5670-5678.

106. Rekhtman N., Radparvar F., Evans Т., Skoultchi A. Direct interaction of hematopoietic transcription factors PU.1 and GATA-1: functional antagonism in erythroid cells. // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 1398-1411.

107. Shimono Y., Murakami H., Hasegawa Y., Takahashi M. RET finger protein is a transcriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb that has dual transcriptional functions. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 3941139419.

108. Suzumori N., Burns K., Yan W., Matzuk M. RFPL4 interacts with oocyte proteins of the ubiquitin-proteasome degradation pathway. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 550-555.

109. Eisenbies C., Singh H., Storb U. Pip, a novel IRF family member, is a lymphoid-specific, PU. 1 -dependent transcriptional activator. // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1377-1387.

110. Pongubala J., Van Beveren C., Nagulapalli S., Klemsz M., McKercher S., Maki R. and Atchison M. Effect of PU. 1 phosphorylation on interaction with NF-EM5 and transcriptional activation. // Science. 1993. V. 259. P. 1622-1625.

111. Papaioannov V., Johnson R. Production of chimeras and genetically defined offspring targeted ES cells. // In book Gene targeting. A Practical Approach. Ed. By Joyner A. J. Oxford University Press. 1993. P. 107-109.

112. Robertson E. Embryo-derived stem cell lines. // In book Teratocarcinomas and embryonic stem cells. A Practical Approach. Ed. By Robertson E. J. Oxford. Washington DC: IRL Press. 1987. P. 71-112.

113. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. С. 58.

114. Sell S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy. // Crit. Rev. Oncol/ Hematol. 2004. V. 51. P. 1-28.

115. Nenasheva V., Nikolaev A., Martynenko A., Tarantul V. Differential gene expression in HIV/SIV-associated and spontaneous lymphomas. // Int. J. Med. Sci. 2005. V. 2. P.122-128.

116. Tarantul V., Nikolaev A., Martynenko A., Hannig H., Hunsmann G., Bodemer W. Differential gene expression in B-cell non-Hodgkin's lymphoma of SIV-infected monkey. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. V. 16. P. 173179.

117. Tarantul V., Nikolaev A., Hannig H., Nenasheva V., Hunsmann G., Bodemer W. Detection of Abundantly Transcribed Genes and Gene Translocation in Human Immunodeficiency Virus Associated non-Hodgkin's Lymphoma. //Neoplasia. 2001. V. 2. P. 132-142.

118. Бобрышева И.В., Барон Е.М., Варшавер Н.Б. Роль активированного клеточного онкогена с-Ha-ras-l в мутагенном эффекте плазмиды pEJ6.6. // Генетика. 1992. Т.28. №8. С. 5-11.

119. Holtzinger A., Evans Т. Gata4 regulates the formation of multiple organs. //Development. 2005. V. 132. P. 4005-^1014.

120. Peterkin Т., Gibson A., Patient R. GATA-6 maintains BMP-4 and Nkx2 expression during cardiomyocyte precursor maturation. // Embo J. 2003. V. 22. P. 4260-4273.

121. Reiter J., Alexander J., Rodaway A., Yelon D., Patient R., Holder N., Stainier D. Gata5 is required for the development of the heart and endoderm in zebrafish. // Genes Dev. 1999. V. 3. P. 2983-2995.

122. Holtzinger A., Evans T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. // Dev. Biol. 2007. V. 312. P. 613-622.

123. Peterkin Т., Gibson A., Patient R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. // Dev Biol. 2007. V. 311. P. 623-635.

124. Zhao R., Watt A., Battle M.5 Li J., Bondow B. and Stephen A. Loss of both GATA4 and GATA6 blocks cardiac myocyte differentiation and results in acardia in mice. // Duncan. Developmental Biology. 2008. V. 317. P. 614-619.

125. Nakanishi M., Hamazaki Т., Komazaki S., Okochi H., Asashima M. Pancreatic tissue formation from murine embryonic stem cells in vitro. // Differentiation. 2007. V. 75. P. 1-11.

126. Leavis P., Gergely L. Thin filament-linked regulation of vertebrate muscle contraction. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1984. V. 16. P. 235-305.

127. Dhoot G., Perry S. The localization of the different forms of troponin I in skeletal and cardiac muscle cells. // Exp. Cell. Res. 1978. V. 117. P. 357-370.

128. Perry S. Troponin I: inhibitor or facilitator. // Mol. Cell. Biochem. 1999. V. 190. P. 9-32.

129. Fuchs E., Weber К. Intermediate Filaments: Structure, Dynamics, Function and Disease. // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 345-382.

130. Jiang Y., Henderson D., Blackstad M., Angel C., Miller R. and Verfaillie C. Neuroectodermal differentiation from mouse multipotent adult progenitor cells. // PNAS. 2003. V. 18. P. 1-7.

131. Houston I. et all. Reduction in PU.1 activity results in a block to В cell development, abnormal myeloid proliferation, and neonatal lethality. // Exp. Hematol. 2007. V. 35. P. 1056-1068.

132. Potocnik A., Nielsen P. and Eichmann K. In vitro generation of lymphoid precursors from embryonic stem cells. // The EMBO Journal. 1994. V. 22. P. 5274-5283.

133. Chabot В., Stephenson D., Chapman V., Besmer P., Bernstein A. The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine kinase receptor maps to the mouse W locus. // Nature. 1988. V. 335. P. 88-89.

134. Geissler E., Ryan M., Housman D. The dominant-white spotting (W) locus of the mouse encodes the c-kit proto-oncogene. // Cell. 1988. V. 55. P. 185-92.

135. Gibson L., Piktel D. and Landreth K. Insulin-like growth factor-1 potentiates expansion of interleukin-7- dependent pro-B cells. // Blood. 1993. V. 82. P. 3005-3011.