Функциональные свойства культивируемых клеток сердца крыс: зрелых кардиомиоцитов, стволовых клеток и клеток-предшественников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат биологических наук Голованова, Татьяна Александровна

• Голованова, Татьяна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Голованова, Татьяна Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная организация сердечной мышцы

1.1.1. Структура сердечной мышцы

1.1.2. Роль Са2+ в мышечном сокращении и Са2+ как внутриклеточный регулятор

1.1.3. Патогенные и адаптивные изменения в сердце при ишемии/реперфузии

1.2. История открытия, терминология и современные представления о стволовых клетках

1.3. Сравнительные аспекты регенерации миокарда

1.3.1. Регенеративная способность сердца Zebrafish

1.3.2. Регенеративная способность сердца амфибий

1.3.3. Регенеративная способность сердца млекопитающих

1.4. Стволовые клетки миокарда млекопитающих

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Выделение и культивирование клеток миокарда крыс

2.2. Определение [Са ]j в культивируемых клетках миокарда крыс

2.3. Иммуноцитохимическое выявление стволовых клеток и клеток-предшественников в культуре

2.4. Моделирование окислительного стресса in vitro и оценка активности антиоксидантных препаратов

2.5. Получение апоптозных тел в первичной культуре клеток миокарда крыс

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфофункциональные характеристики культивируемых кардиомиоцитов новорожденных крыс

3.2. Выявление и характеристика клеток неонатального миокарда, способных к пролиферации и дифференцировке

3.2.1. Колонии сокращающихся кардиомиоцитов в первичной культуре

3.2.2. Идентификация клеток, формирующих колонии сокращающихся кардиомиоцитов in vitro

3.3. Способность стволовых клеток и кардиопредшественников сердца взрослых крыс к пролиферации и дифференцировке in vitro

3.4. Оценка функциональной активности свежевыделенных клеток миокарда новорожденных крыс

3.5. Применение разработанных клеточных моделей миокарда новорожденных крыс

3.5.1. Неонатальные кардиомиоциты как тест-система для скрининга антиоксидантных препаратов

3.5.2. Изучение влияния продуктов апоптоза на клетки-предшественники кардиомиоцитов

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СОКРАЩЕНИЯ

[Ca2+]i Внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция

CICR Кальций зависимый выброс кальция из саркоплазматического

ретикулума 4-ХмК 4-хлор-м-крезол

SP Side population cells

АКР Активные кислородные радикалы

АцХ Ацетилхолин

ДГПР Дигидропиридиновые рецепторы

ИЗП Изопротеренол

Кф Кофеин

Кх Колхицин

МСАО (Д+Ф) Макромолекулярная система с антиоксидантными свойствами

на основе декстрана (Д) и феноксана (Ф) МИ Митотический индекс

ПК Предшественники кардиомиоцитов

РиР Рианодиновые рецепторы

СК Стволовые клетки

CP Саркоплазматический ретикулум

ЭМС Электромеханическое сопряжение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональные свойства культивируемых клеток сердца крыс: зрелых кардиомиоцитов, стволовых клеток и клеток-предшественников»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Утрата способности клеток сердечной мышцы млекопитающих к самообновлению, присущему костным рыбам и амфибиям, которые полностью восстанавливают объем и функцию сердца при удалении 20% миокарда [Poss, 2007], является непреодолимым препятствием для полноценной регенерации поврежденного сердца. Уже через несколько дней постнатального развития у млекопитающих наблюдается полное прекращение пролиферации и остановка клеточного цикла кардиомиоцитов [Claycomb, 1992]. Установлено, что в сердце происходит переключение гиперплазии на гипертрофию между третьим и четвертым днями после рождения животного [McGill, Brooks, 1995; Li et al., 1996]. Долгое время существовало мнение, что дальнейший рост сердечной мышцы идет за счет увеличения объема кардиомиоцитов (гипертрофии), а не их числа, и сердце рассматривалось как окончательно дифференцированный орган, не способный к самообновлению [MacLellan, Schneider, 2000; Di Felice et al., 2009].

Однако в последние годы появились данные о наличии в сердце млекопитающих регенерационного потенциала. Так, в поврежденном миокарде человека было обнаружено присутствие незрелых пролиферирующих клеток, показана репликация миоцитов, кариокинез, цитокинез и очаги спонтанных миокардиальных регенераций [Beltrami et al., 2001]. Установлено, что миокард однодневной мыши способен к полному восстановлению структуры и функции после 15% резекции левого желудочка, но эта способность утрачивается уже к концу первой недели жизни [Porrello et al., 2011]. Более того, в литературе описано существование нескольких типов сердечных стволовых клеток (CK) и клеток-предшественников кардиомиоцитов (ПК), способных к самообновлению и дифференцировке в кардиомиоциты: Sea-Г CK [Oh et al., 2003], c-kit+ CK [Beltrami et al., 2003], Isll+ резидентные ПК [Laugwitz et al., 2005] и SP клетки (Side population cells) [Pfister et al., 2005]. Выявлено также образование

клеточных кластеров в культуре, или «кардиосфер», из тканей взрослого сердца мыши и человека [Messina et al., 2004].

Дальнейший поиск и изучение свойств сердечных стволовых клеток является одной из самых актуальных проблем физиологии миокарда. Имеющиеся в настоящее время данные о морфофункциональных свойствах CK сердца, факторах, регулирующих их самообновление и направленную кардиодифференцировку, фрагментарны и недостаточны [Parmacek, Epstein, 2005; Anversa et al., 2006]. Более того, получение чистых популяций сердечных стволовых клеток, применяемое в работах многих авторов, приводит к изолированию CK из их естественного микроокружения и к потере необходимых сигналов и факторов, ответственных за самообновление и дифференцировку CK.

Проблема разработки клеточных технологий для регенерации сердца до сих пор остается нерешенной [Behfar et al., 2010; Malliaras, Marbän, 2011]. В связи с этим существует острая необходимость создания новых клеточных моделей миокарда, которые позволили бы детально изучить все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных CK и ПК в условиях, приближенных к их нативному микроокружению. Использование таких моделей будет способствовать развитию представлений о физиологии сердечных стволовых клеток и позволит расширить клинические подходы к лечению заболеваний сердца.

Решение проблемы регенерации сердечной ткани также связано с поиском путей снижения функциональных нарушений в условиях ишемии/реперфузии, когда значительно усиливается образование активных кислородных радикалов (АКР) [Литвицкий и др., 1994]. Одной из наиболее действенных мер является введение экзогенных соединений, которые ингибируют либо сами АКР, либо источники их генерации. В этой связи создание клеточных тест-систем, позволяющих проводить скрининг

антиоксидантных препаратов, способствовало бы наиболее быстрому подбору оптимальных кардиопротекторов.

Цель диссертационной работы - функциональная характеристика зрелых кардиомиоцитов, а также резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников кардиомиоцитов сердца новорожденных и взрослых крыс в первичной культуре.

Задачи:

1. Изучить морфофункциональные свойства клеток миокарда неонатальных крыс.

2. Выявить резидентные стволовые клетки и клетки-предшественники в культуре клеток миокарда новорожденных крыс и охарактеризовать их пролиферацию и дифференцировку.

3. Оценить степень зрелости популяции клеток, развивающихся в кардиомиоцитарном направлении, по формированию у них электромеханического сопряжения.

4. Установить способность стволовых клеток и клеток-предшественников кардиомиоцитов к пролиферации, кардиодифференцировке и спонтанному сокращению у взрослых крыс в условиях первичной культуры.

5. Изучить антиоксидантную активность макромолекулярной системы, синтезированной на основе декстрана и феноксана в условиях экспериментального окислительного стресса на модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В первичной культуре сердечных клеток новорожденных крыс имитируются поведение и закономерности функционирования клеток миокарда, имеющие место в интактном сердце в первые дни после рождения крысы.

2. В культуре клеток сердечной мышцы новорожденных крыс происходит пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-

предшественников с образованием клонов. Направленная кардиодифференцировка этих клеток в составе колоний приводит к формированию популяции зрелых кардиомиоцитов, способных к спонтанному сокращению.

3. В культуре клеток миокарда взрослых крыс имеет место пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников с формированием колоний, но полной кардиодифференцировки этих клеток не наблюдается.

4. Создана in vitro модель регенерационного кардиомиогенеза, позволяющая изучать процессы пролиферации и дифференцировки сердечных стволовых клеток и клеток-предшественников и in vitro модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов, которая может служить в качестве тест-системы для скрининга лекарственных препаратов.

Научная новизна работы. Впервые в культуре клеток миокарда новорожденных крыс линии Wistar детально изучены физиологические свойства кардиомиоцитов на протяжении восьми-десяти дней культивирования и выявлены закономерности их функционирования. Установлено, что в культуре имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии клеток миокарда, происходящие в интактном сердце млекопитающих в первые дни после рождения. Это позволяет рассматривать ее в качестве модели для изучения прекращения пролиферации кардиомиоцитов.

Впервые in vitro охарактеризован процесс формирования спонтанно сокращающихся колоний кардиомиоцитов, образованных из резидентных стволовых клеток c-kit+- и Sea -типов и клеток-предшественников Ы1+-типа, и представлено доказательство кардиомиогенной дифференцировки резидентных кардиопредшественников в первичной культуре клеток неонатального миокарда крыс. Данный процесс имитирует регенерационный кардиомиогенез

от резидентной клетки-предшественника до формирования колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

В условиях первичной культуры клеток миокарда взрослых крыс выявлена пролиферативная активность резидентных стволовых клеток (c-kit+, Sca+, Isll+), но установлена их сниженная способность к кардиомиогенезу.

Показана адекватность использования модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов крыс в качестве тест-системы для скрининга антиоксидантных препаратов. Впервые выявлено кардиопротекторное действие синтезированной макромолекулярной системы (МСАО) на основе декстрана и феноксана (Д+Ф).

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные существенно расширяют представления о физиологии зрелых кардиомиоцитов и резидентных стволовых клеток сердца млекопитающих. Научно-практическая значимость работы заключается, прежде всего, в том, что модель резидентных стволовых клеток и кардиопредшественников имитирует регенерационный кардиомиогенез, а модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов предоставляет широкие возможности для изучения физиологии зрелых кардиомиоцитов. В связи с этим предложенные клеточные модели могут быть использованы в исследованиях по проблеме регенерации сердечной мышцы, при скрининге лекарственных (кардиотропных) препаратов, а также при разработке новых методов клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийском Симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на Политехническом симпозиуме «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона» (Санкт-Петербург, 2006), на XX форуме физиологов России (Москва, 2007), II Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), конференции «Фундаментальные науки-медицине» (Москва, 2007), международной конференции «Focus on Microscopy 2007» (Валенсия, Испания, 2007), Russian-Norwegian symposium «Myocardial

protection: molecular, pathophysiological and clinical aspects» (Санкт-Петербург, 2008), VII Европейском биофизическом конгрессе (Генуя, Италия, 2009), XXI всероссийском съезде Физиологического общества (Калуга, 2010), Европейском кардиологическом конгрессе (Стокгольм, Швеция, 2010), Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010), а также на рабочих совещаниях и заседаниях международной организации «ScanBalt» (Рига, Латвия, 2009), Санкт-Петербургского физиологического общества (2009), проблемной комиссии ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова (Санкт-Петербург, 2010), III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), XIV Международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика Л.А.Орбели (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в сборнике работ, 20 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 174 источников, из них 141 иностранных.

Работа поддержана грантом «ФН-медицине» 2007 г., грантами РФФИ № 09-04-00954 и № 11-04-00993, грантами Правительства Санкт-Петербурга № 090114 (2009) и № 10233 (2010), а также премией конкурса «Авангард знаний» (Сколково, 2011).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная организация сердечной мышцы

В этом разделе диссертации дано краткое описание морфофункциональной организации сердечной мышцы. Особое внимание уделено электромеханическому сопряжению (ЭМС), а также вопросам внутриклеточной регуляции ионов кальция.

1.1.1. Структура сердечной мышцы

У высших позвоночных различают сердечные миоциты предсердий и желудочков, которые называют сократительными (рабочими) миоцитами, а также пейсмекерные и проводящие миоциты [Прошева, 1998].

Кардиомиоциты рабочего миокарда желудочков представляют собой вытянутые, плотно упакованные клетки, которые сгруппированы в мышечные волокна. Для них характерно продольное расположение большинства внутриклеточных компонентов, включая миофибриллы, митохондрии и ядра. Миофибриллы - пучки нитей сократительных белков - являются основными внутриклеточными органеллами. Несколько реже встречаются митохондрии, расположенные правильными рядами в межмиофибриллярном пространстве и образующие беспорядочные скопления в субсарколеммальном и околоядерном пространствах. В кардиомиоцитах желудочков хорошо развиты система Т-трубочек и саркоплазматический ретикулум (СР), часто содержатся два и более ядер [Форбс, Сперелакис, 1988]. Вместе с Т-каналами цистерны СР образуют преимущественно диады, а не триады. Они, вероятно, имеют характер не трубок, а глубоких поперечных складок. Объем Т-системы в желудочковых миоцитах составляет 27-36 % от объема цитоплазмы. По каналам Т-системы не только распространяется импульс, но и поступают в клетку метаболиты. Мембраны СР содержат в своем составе Са -активируемую транспортную

'У А-

АТФазу, обеспечивающую накопление ионов Са внутри цистерн СР. При релаксации миофиламентов ионы

Са2+ всасываются в СР, достигая по его И

каналам терминальных цистерн. Кардиомиоциты предсердий по своим характеристикам напоминают клетки рабочего миокарда желудочков, но они имеют существенно меньший диаметр. У взрослых млекопитающих рабочие миоциты предсердий, в отличие от миоцитов желудочков, содержат секреторные гранулы. Миофибриллярных элементов в них меньше на 40 %, и реже наблюдаются лестничные структуры во вставочных дисках. Характерно, что Т-система в них почти совсем не развита, а если и присутствует, то каналы идут вдоль, а не поперек продольной оси клетки [Шубникова и др., 2001].

К пейсмекерно-проводящей системе относятся синусно-предсердный узел, предсердно-желудочковый узел, предсердно-желудочковый пучок, ветви пучка и его концевые разветвления, образованные клетками Пуркинье. Синусно-предсердный (синусный) узел содержит «истинные», пейсмекерные клетки, которые генерируют потенциал действия. Они занимают центральную часть узла, имеют длину 20—30 мкм и ширину около 8 мкм. Эти клетки лежат группами, бедны миофибриллами и митохондриями, почти лишены предсердных гранул и имеют светлую цитоплазму. Пейсмекерным клеткам свойственна спонтанная медленная диастолическая деполяризация. Другой тип клеток синусного узла, находящихся на его периферии, называют латентными. Латентные клетки проводят импульс из узла к другим клеткам предсердия. Предсердно-желудочковый узел имеет клетки, очень похожие на миоциты синусного узла. Предсердно-желудочковый узел осуществляет две жизненно важные функции. Одна из них состоит в проведении возбуждения из предсердий в желудочки, вторая - заключается в его способности выступать в качестве водителя ритма сердца благодаря наличию вторичной пейсмекерной активности. Предсердно-желудочковый пучок представляет собой прямое продолжение предсердно-желудочкового узла. Ножки пучка разветвляются под эндокардом, а также в толще миокарда желудочков. Концевые разветвления называют волокнами Пуркинье [Ирисава и др., 1988].

В функциональном отношении миокардиальная ткань представляет собой единую систему, и электротонические влияния в ней распространяются далеко за пределы одной клетки. Например, длина клетки Пуркинье около 150 мкм, а константа длины колонки из клеток (т.е. волокна Пуркинье), объединяющей клетки функционально - около 2 мм. Это указывает на существование между кардиомиоцитами высокого коэффициента передачи [Шубникова и др., 2001].

1.1.2. Роль Са2+ в мышечном сокращении и Са2+ как внутриклеточный регулятор

Кальций является мультифункциональным регулятором разнообразных клеточных функций [Berridge et al., 1998; Bers, Guo, 2005]. Внутриклеточный кальций присутствует в мышечных клетках в основном в связанном состоянии, и только небольшая его часть находится в цитоплазме в свободном (ионизированном) состоянии. Между наружной и внутренней средой клетки существует высокий трансмембранный концентрационный градиент ионов кальция. В покое концентрация ионизированного кальция ([Са ]j) в цитоплазме

8 7 3

составляет порядка 5-10" - 5-10" М, а в наружной среде - 10" М. Во внутриклеточных компартментах, запасающих кальций, концентрация Са2+ также очень велика по сравнению с его концентрацией в цитоплазме (в ядре - 1 мМ, митохондриях - 0,6-10"3 М, цистернах CP - 0,3-10"3 - 0,4-10"3 М) [Bers, 2001].

В электровозбудимых тканях ток кальция в клетку возрастает в результате деполяризации мембраны и открытия потенциалзависимых Са2+ каналов [Orlov et al., 1995]. В сердечных миоцитах выделяют два главных типа кальциевых каналов: L и Т. Са2+ токи Т-типа активируются и инактивируются низким мембранным потенциалом (-60 мВ), характеризуются коротким временем открытого состояния (1-2 мс), низкой проводимостью и нечувствительностью к дигидропиридинам. В желудочковых миоцитах Са2+ каналов Т-типа обычно мало, или они совсем отсутствуют, в то время как во всех сердечных миоцитах присутствуют Са2+ токи L-типа [Bers, 2001]. В

отличие от каналов Т-типа, кальциевым каналам L-типа свойственны активация и инактивация при более положительном мембранном потенциале (-30 мВ). Они медленнее инактивируются и характеризуются большой проводимостью. Ca каналы L-типа могут находиться в активированном состоянии около 500 мс (продолжительность открытого состояния, например, потенциалзависимого натриевого канала примерно 1 мс) и, таким образом, играют большую роль в реализации мышечного сокращения [Веап, 1985; Bers, 2001]. В основном эти каналы идентифицируются строгой чувствительностью к 1,4-дигидропиридиновому классу соединений, который включает и антагонистов, таких как нифедипин и нимодипин, и агонистов, таких как Вау К 8644 [Nilius et al., 1985].

Внутриклеточным депо, запасающим значительное количество кальция в мышечной клетке, является СР. Ионы кальция в полости СР хранятся в состоянии слабой ассоциации с Ca -связывающим белком кальсеквестрином, который обладает низким сродством к Ca , но высокой емкостью. Одна молекула кальсеквестрина способна связывать 43 иона кальция [Крутецкая, Лебедев, 2001]. Мембрана СР содержит крупные интегральные белки, играющие роль особых высокопроводящих кальциевых каналов. При их открывании происходит быстрый выход кальция из СР в миоплазму по концентрационному градиенту. Ca -высвобождающие каналы СР получили название рианодиновых рецепторов (РиР) за наличие сайтов высокой аффинности к рианодину. У млекопитающих выделяют три изоформы РиР, которые кодируются отдельными генами. В сердечных мышцах присутствует, в основном, РиР2 [Nakai et al., 1990; Otsu et al., 1990]. Алкалоид рианодин является селективным и специфическим лигандом этих рецепторов. В сердечных миоцитах рианодин в концентрациях 0,01-30 мкМ запускает выход Ca из СР, а при концентрациях >100 мкМ блокирует его [Meissner, 1986].

В молекуле РиР обнаружены специальные центры для связывания Са2+ и АТФ. В клетках сердечной мышцы одиночный канал Ca -выброса более

чувствителен к Ca и менее чувствителен к АТФ, чем в скелетных миоцитах. Открывание кальциевого канала в составе молекулы РиР сердечного миоцита происходит при действии на рецепторы ионов кальция в концентрациях 0,3-10 мкМ и АТФ в концентрациях 1-5 мМ [Meissner, 1994], а блокирование

2_)_ 'УЛ-

высвобождения Ca из CP - при концентрациях Ca 5-10 мМ [Xu et al., 1998].

Для оценки содержания ионов кальция в CP в интактных сокращающихся кардиомиоцитах или сердечной мышце наиболее эффективным способом являются кратковременное применение кофеина или холодного раствора (~1°С). Кофеин является активатором РиР как в скелетных, так и в сердечных миоцитах, но в последних рианодиновые рецепторы значительно более чувствительны к кофеину. В сердечной мышце охлаждение и кофеин (в концентрациях 1-10 мМ) индуцирует высвобождение Ca из СР. Амплитуда сокращения или количество высвободившегося кальция могут быть использованы в качестве показателей, отражающих содержание Са2+ в CP, доступного для выброса в данный момент времени [Fabiato, 1985].

Кофеин изменяет активность миофиламентов, причем этот механизм не зависит от связывания Ca с тропонином С. Возможно, он может иметь прямое влияние на взаимодействие поперечных миозиновых мостиков с актином [Powers, Solaro, 1995]. В сердце кофеин стимулирует аномальное высвобождение Са2+ внутри клетки, что может провоцировать аритмии [Bers, 2001]. До недавнего времени считалось, что в сердечных миоцитах действие

кофеина обусловлено тем, что он способен увеличивать аффинность РиР к

2_|_ 2-}-цитозольному Ca настолько, что диастолической [Ca ]¡ (при расслаблении

клетки) становится достаточно для активирования канала [O'Neill, Eisner,

1990]. Однако появилось предположение, что про-аритмическое действие

кофеина может быть обусловлено другим путем - за счет снижения порога

активации РиР люменарным Са2+. Дело в том, что высвобождение Са2+ из CP

может регулироваться не только цитозольным кальцием, но также кальцием

изнутри CP (lumen). Есть основания предполагать, что модуляция активности

РиР происходит с помощью Са2+-чувствительных сайтов, расположенных на люменарной стороне комплекса РиР, и в клетке существует динамическая схема контроля циркуляции Са2+. Центральным элементом этой схемы является сенсор содержания ионов кальция в люмене СР, который осуществляет согласование активности РиР с уровнем загрузки СР, позволяя клетке саморегулировать величину и функциональное состояние пула Са2+ в СР [Ьикуапепко а1., 2001].

Долговременное поддержание чрезвычайно низкой внутриклеточной концентрации Са2+ контролируется совместной работой каналов, насосов и обменников. Примерно 80% кальция активно возвращается обратно в СР за счет работы Са -АТФазы, встроенной в его мембрану, остальные 20% вытесняются из клетки во внеклеточную жидкость или за счет Иа+/Са2+ обменника, или посредством Са -АТФазных насосов, расположенных в сарколемме. Кроме транспортных систем, [Са2+^ контролируется Са2+-хелаторами высокой аффинности, локализованными в цитоплазме (Са2+-связывающие белки) и на внутренней поверхности плазматической мембраны [СагаЯэИ ег а1., 1995].

Потенциалы действия мышцы инициируют механическое сокращение посредством процесса, называемого электромеханическим сопряжением (ЭМС), который представляет собой сложный каскад реакций от момента деполяризации мембраны до повышения уровня внутриклеточного кальция вблизи специфически организованных сократительных белков - актинов и миозинов. Генерация возбуждения и формирование потенциала действия обеспечиваются деполяризацией сарколеммы в ответ на приходящий от пейсмекера стимул. Потенциал действия распространяется по Т-трубочкам и вызывает вход кальция в клетку. При повышении [Са ]{ до определенного уровня Са2+ связывается с тропонином, устраняя тропомиозиновую репрессию актина. Одновременно Са увеличивает АТФазную активность миозина, образуются актомиозиновые мостики, и химическая энергия переходит в

механическое сокращение. Во время сокращения тонкие актиновые и толстые миозиновые нити скользят друг относительно друга, в результате чего сокращается каждый саркомер и, тем самым, мышца в целом [Bers, 2001]. Использование флуоресцентных и люминесцентных красителей (типа Фура-2, Квин-2), которые испускают световые волны или изменяют характер своего свечения при связывании с ионами Са2+ внутри клетки, позволило определить как именно изменяется концентрация кальция при возбуждении мышечной клетки [Grynkiewicz et al., 1985]. Оказалось, что для реализации сокращения уровень кальция в цитоплазме должен возрасти на 1-2 порядка, т. е. от 10" до 10"5- 10~6 М. Однако расчеты показывают, что количество кальция, входящего из внеклеточной среды во время одного потенциала действия, недостаточно для индукции сокращения сердечного миоцита. Во время возбуждения мышечной клетки [Ca2+]j значительно увеличивается за счет высвобождения Са2+ из СР, который является главным источником прироста кальция в цитозоле [Bers, 2001].

Центральным моментом ЭМС в мышечных клетках является функциональное взаимодействие и пространственное расположение между РиР и потенциалактивируемыми Са2+ каналами L-типа. Дигидропиридиновые

94-

рецепторы (ДГПР) - типичные Са каналы L-типа, сосредоточенные в мембранах Т-трубочек сердечных мышечных клеток. В настоящее время в клетках сердца полное описание процесса, который связывает сарколеммный вход Са через ДГПР с высвобождением Са из СР через РиР во время ЭМС, отсутствует. Хотя ДГПР и РиР2 расположены близко друг другу в сердечной мышце, нет доказательств их прямого физического взаимодействия [Protasi et al., 1996]. Однако имеется функциональная ассоциация ДГПР-РиР2, и сопряжение между возбуждением и сокращением осуществляется по механизму Са2+-индуцированного выброса Са2+ из СР (CICR). При каждом потенциале действия активация ДГПР приводит к входу наружного Са , который выполняет роль триггера и стимулирует РиР, запуская значительный

2~ь

выброс ионов Са из CP в миоплазму [Cannell et al., 1995; Sham et al., 1995; Wang et al., 2003]. Без поступления наружного кальция, то есть в бескальциевой среде, сокращение сердечной мышцы становится невозможным.

По данным многочисленных исследований CICR в эмбриональном периоде отсутствует, появляясь только через несколько дней после рождения [Husse, Wussling, 1996; Bers, 2001]. Даже в неонатальном периоде CICR менее доминантен, чем у взрослых. Активация сокращения на ранних неонатальных стадиях сохраняет зависимость от входа Са2+ через наружную мембрану. Поскольку основным фактором в осуществлении CICR является пространственное взаимодействие ДГПР и РиР [Perez et al., 2005], незначительный вклад РиР в эмбриональном и раннем неонатальном периоде объясняют недоразвитием Т-трубочек и СР. На миоцитах желудочков сердца кролика было показано, что плотность расположения и ко-локолизация ДГПР и РиР увеличивается в раннем онтогенезе от рождения до 20-дневного возраста [Sedarat et al., 2000; Seki et al., 2003].

Применение техники пульсирующей локальной флуоресценции позволило Эскобар с соавт. [Escobar et al., 2004] изучить изменение механизма ЭМС в ходе развития крыс в экспериментальных условиях, близких к условиям in vivo. Авторы показали, что специфический вклад высвобождения Са2+ из CP через РиР значительно изменяется на протяжении первых трех недель постнатальной жизни. При рождении этот вклад составляет не более 15%, в то время как в 3-х недельном возрасте доходит до 88% общего внутриклеточного выброса. Этот быстрый переход неизбежно означает значительную модификацию механизма ЭМС от сарколеммно-зависимого при рождении до CICR-зависимого в трехнедельном возрасте. Итак, Са2+-зависимый выброс Са2+ формируется только после рождения животного. В первые пять дней преобладает вход Са через ДГПР, в то время как в трехнедельном возрасте более важным является CICR из CP [Escobar et al., 2004; Perez et al., 2005]. Окончательное формирование Т-трубочной системы после 10-го дня

постнатальной жизни [Page, Buecker, 1981] и начало функционирования CP являются потребностью развития более совершенного и сложного механизма ЭМС, такого как CICR.

1.1.3. Патогенные и адаптивные изменения е сердце при ишемии/реперфузии

Ишемия миокарда - это состояние относительного дефицита поступления кислорода с кровью по отношению к глобальным или локальным потребностям сердца в кислороде. Первым следствием ишемии является нарушение процесса ЭМС, приводящее к снижению или полной потере сократительной активности. Далее в миокарде происходит развитие аномальной электрической активности, которая может привести к возникновению аритмий. Достаточно глубокая и продолжительная ишемия сопровождается постепенным повреждением структуры клеток вплоть до необратимой фазы гибели клеток (инфаркт миокарда) [Хитров, Пауков, 1991]. Инфаркт миокарда - участок некроза мышцы сердца. В центральной зоне инфаркта по мере развития некроза, в кардиомиоцитах выявляются расслабленные миофибриллы с нечеткими контурами актиновых и миозиновых миофиламентов. На периферии инфарктной зоны наблюдается гиперсокращение миофибрилл, отложение солей кальция в митохондриях, развитие миоцитолиза [Ферранс, 1990].

В течение короткого времени (1-20 с) после прекращения коронарного кровотока в сердце не происходит изменение функций. Но как только истощение запасов кислорода достигает критического уровня, наступает период, который сопровождается функциональными нарушениями, вплоть до остановки сердца, а также некоторыми изменениями ультраструктуры мышцы. Однако если реперфузию и реоксигенацию начать на этой фазе ишемии, то произойдет быстрое восстановление функций до предишемического уровня. На собаках показано, что этот период продолжается после прекращения коронарного кровотока около 5 мин. При более длительной ишемии значительно усиливаются изменения ультраструктуры миокарда. Реперфузия и

реоксигенация на этой стадии приводит к восстановлению предишемических функций лишь после определенного времени, которое экспоненциально возрастает по мере увеличения периода ишемии [Гебхард и др., 1990].

В условиях гипоксии сердца важное значение имеет процесс массового входа Са2+ в поврежденные клетки, что вызывает их гиперсокращение. Избыток Са2+ в миоплазме приводит к нарушению расслабления миокарда, уменьшению диастолического расслабления и, соответственно, к снижению сократительной активности сердца. Накопление ионов кальция в миоплазме имеет и другие

•л.

неблагоприятные последствия. В условиях гипоксии Са усиленно захватывается митохондриями, что сопровождается снижением эффективности биологического окисления, депрессией гликолитичесого пути. Повышение [Са ]; приводит к активации соответствующих протеинкиназ, в результате чего происходит усиленный распад липидов мембран и дестабилизация мембран лизосом. Таким образом, включаются другие (липидные и лизосомные) механизмы клеточного повреждения [Хитров, Пауков, 1991]. В связи с этим для лечения заболеваний сердца важным является создание условий, предотвращающих нарастание [Са2+^ в кардиомиоцитах.

Ключевое место среди дополнительных (реперфузионных) повреждений миокарда занимают свободнорадикальные процессы [Зенков, 2001; Мещникова, 1997]. Для живых клеток наибольшую опасность представляет цепное окисление полиненасыщенных жирных кислот. В этих реакциях образуется большое количество липидных гидроперекисей, которые обладают высокой реакционной способностью и оказывают мощное повреждающее действие на клетку. Реперфузия сопровождается резким повышением продукции О2", Н202, ОЕГ, липидных и семихиноновых радикалов. Наряду с этим происходит снижение активности антиоксидантных ферментов клетки (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы) [Биленко, 1989]. Это ограничивает способность клеток инактивировать активные кислородные радикалы (АКР). В качестве мишеней, подверженных воздействию АКР,

выступают липиды и аминокислоты, особенно ароматические и SH-содержащие [Richard et al., 1990]. АКР вызывают окисление миоглобина [Wasawa et al., 1992], нарушают связывание Са с тропонином [Kaneco et al., 1992] и взаимодействуют с другими сократительными белками кардиомиоцитов, приводят к накоплению внутриклеточного Са2+ [Долгих, 2005; Ескунов, 2005] и провоцируют длительное нарушение сократительной способности миокарда [Lowe et al., 1994].

Для ослабления патологических последствий ишемии и реперфузии одной из наиболее действенных мер является введение экзогенных соединений, ингибирующих либо сами АКР, либо источники их генерации. При этом, исходя из того, что основной «взрыв» образования АКР приходится на первые минуты реперфузии, наибольшим эффектом будет обладать антиоксидантная терапия, проведенная в ишемический или ранний реперфузионный период [Биленко, 1989].

В биологических системах антиоксидантами называются вещества, способные ингибировать процессы свободнорадикального окисления. По механизму действия антиоксиданты можно разделить на [Круглякова, 1992]:

• «мусорщики» (scavenger of free radicals), которые очищают организм от всех свободных радикалов, чаще всего, восстанавливая их до стабильных неактивных продуктов;

• «ловушки» (trap of free radicals) - антиоксиданты, которые имеют сродство к какому-то определенному свободнорадикальному продукту (ловушки синглетного кислорода, гидроксил-радикала и т.д.). Ловушки часто используют для уточнения механизма свободнорадикальной реакции;

• антиоксиданты, обрывающие цепи (chain breaking antioxidants) -вещества, молекулы которых более реакционноспособны, чем их радикалы (ароматические амины, фенолы, нафтолы и др.). Чаще всего это фенолы, которые легко отдают свои электроны, превращая радикал, с которым они прореагировали, в молекулярный продукт, а сами при этом превращаются в

слабый феноксил-радикал, который уже не способен участвовать в продолжении цепной реакции.

1.2. История открытия, терминология и современные представления о

стволовых клетках

Существование стволовых клеток (CK) в некоторых тканях сначала было предсказано теоретически. Вильсон в 1896 г. в своей книге «Клетка в развитии и наследственности» предположил существование CK, обеспечивающих поддержание сперматогенеза [Wilson, 1986]. Русский ученый A.A. Максимов в 1908 г. на съезде гематологического общества в Берлине выступил с новой теорией кроветворения для объяснения быстрого самообновления кровяных клеток. Несколько миллиардов клеток крови погибает и образуется каждые сутки, что не может происходить за счет простого клеточного деления и требует другого механизма. Сделанные им выводы свидетельствовали в пользу того, что все клетки крови развиваются из одного предшественника, имеющего вид лимфоцита. Максимов сформулировал это положение в статье, опубликованной на немецком языке в 1909 году — «Лимфоцит как общая стволовая клетка разнообразных элементов крови в эмбриональном развитии и постфетальной жизни млекопитающих». Для объяснения быстрого самообновления клеток крови он предложил термин «стволовая кроветворная клетка» [Maximow, 1909]. В 60-х годах прошлого века И.Л. Чертков и А.Я. Фриденштейн заложили основы науки о CK костного мозга, доказав, что костный мозг является основным источником CK [Чертков, Фриденштейн, 1966].

Впервые недифференцированные плюрипотентные линии CK из эмбриобласта бластоцисты мыши были получены Мартином Эвансом в 1981 году [Evans, Kaufman, 1981]. 1998 год ознаменовался тем, что Томсон и Беккер впервые выделили и получили первые линии человеческих эмбриональных стволовых клеток [Thomson et al., 1998]. А в 1999 году журнал "Science"

признал открытие эмбриональных стволовых клеток третьим по значимости событием в биологии XX века после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном человека».

Сейчас трансплантация СК успешно применяется в лечении многих заболеваний, число которых достигает нескольких десятков (злокачественные новообразования, различные формы лейкозов, заболевания сердечнососудистой и нервной систем, болезни печени, желудочно-кишечного тракта, легких и др.). В поисках способов лечения инфаркта миокарда и сердечной недостаточности, инсульта, болезни Паркинсона, Альцгеймера и многих других заболеваний проводятся многоцентровые исследования и разрабатываются подходы для их лечения с помощью СК [Смолянинов, 2009].

Стволовые клетки - это исключительный тип клеток, который обладает тремя главными свойствами. Во-первых, это неспециализированные клетки, способные самоподдерживаться в течение длительного времени. Под самоподдержанием (самообновлением) понимается способность одной или обеих дочерних клеток сохранять полный потенциал материнской клетки, от которой они произошли. Во-вторых, они могут дифференцироваться в любые клетки организма или отдельные типы клеток при определенных физиологических или экспериментальных условиях, то есть превращаться в специализированные клетки. В-третьих, общее число СК строго регулируется, благодаря существованию механизма обратной связи между отделами функционально зрелых и стволовых клеток [Попов, 2010].

СК находятся в организме в определенном ограниченном специализированном микроокружении, получившем название «ниша», которое интегрирует и осуществляет межклеточные сигналы для регуляции и поддержания гомеостаза содержащихся в ней СК. Для самоподдержания СК получают от своего микроокружения сигналы, которые позволяют клеткам либо оставаться в недифференцированном состоянии, либо вступать в дифференцировку. Сигналы включают в себя многие факторы, среди которых и

химические соединения, выделяемые другими клетками, а также физический контакт с соседними клетками или определенными молекулами в нише [Urbanek et al., 2006; Morrison, Spradling, 2008]. Скофилд был первым, кто в 1978 году выдвинул гипотезу, в которой СК рассматривались во взаимосвязи с другими клетками, определяющими поведение стволовых. Согласно этой гипотезе, в нише блокируется созревание стволовых клеток, и как результат происходит продолжительное поддержание стволовых характеристик. Однако, как любая ткань, ниша подвержена старению. Потенциал деления и функциональные возможности окружающих клеток являются лимитирующими факторами, определяющими судьбу СК внутри неё [Schofield, 1978].

Таким образом ниша выполняет важные функции:

• Обеспечивает самоподдержание СК, а также их длительное пребывание в состоянии покоя.

• Ограничивает пролиферацию СК.

• Создает условия для максимальной защиты СК от внешних воздействий.

Теоретически для поддержания популяции СК одна половина дочерних клеток при каждом делении должна сохранять свойства родительских СК, тогда как другая половина может терять эти свойства и покидать отдел СК. Этого можно достичь либо асимметрией микроокружения, либо асимметричностью деления. В первом случае предполагается, что при делении СК образуются две подобные дочерние клетки, которые могут попасть в разные микроокружения и пойти по разным путям развития. При этом одна половина дочерних клеток сохраняет свойство стволовости, другая же вступает на путь дифференцировки. Следует отметить, что эта гипотеза не рассматривает случай, когда обе дочерние клетки сохраняют свойства материнской клетки или, наоборот, теряют их. Вторая стратегия предполагает, что СК всегда делятся асимметрично. При асимметричном делении образуются две дочерние клетки с разными свойствами: одна из них остается стволовой, а другая - приступает к

дифференциации. При асимметричном делении число СК не может увеличиться, что не соответствует реальным условиям тканевого гомеостаза. В настоящее время получены доказательства, что СК способны к асимметричному делению и при этом в зависимости от условий способны выбирать между симметричным и асимметричным митозом. Использование разных типов деления позволяет поддерживать тканевый состав [СИ'Ьапек е1 а1., 2006; Попов, 2010].

Традиционно стволовые клетки классифицируют на три основных типа: эмбриональные, зародышевые и взрослые стволовые клетки. Эмбриональные СК - это клетки, выделенные из эмбриона человека или животных. Эмбриональные СК выделяют из внутренней клеточной массы бластоцисты (стадия 3-5-дневного эмбриона). Они обладают неограниченной способностью к самообновлению и являются плюрипогентными, то есть способны формировать в процессе эмбриогенеза клетки любой тканевой специфичности, включая зародышевые и соматические. Зародышевые СК являются унипотентиыми. У млекопитающих они образуют клетки спермагогония, которые превращаются в зрелые сперматозоиды. По своим свойствам

Эмбриональные стволовые клетки

Взрослые стволовые клетки

Плюрипотентные СК

Мультипотентные СК

Рис. 1. Эмбриональные и взрослые СК [Cell therapy markets, 2007].

зародышевые СК являются промежуточными между эмбриональными и взрослыми СК. В противоположность эмбриональным, взрослые СК обнаружены в дифференцированных тканях. Они имеют ограниченную способность к самообновлению и являются источником образования функционально зрелых клеток любой тканевой специфичности. Взрослые СК могут быть мультипотентными или унипотентными (рис. 1). Мультипотентные СК способны генерировать дочерние клетки, которые могут дифференцироваться во множество клеточных линий, составляющих ту или иную ткань или орган. Например, гематопоэтические СК дают начало всем клеточным линиям крови. Другие СК дифференцируются только в одном направлении и являются унипотентными [Passier, Mummery, 2003; Cell therapy markets, 2007].

В настоящее время существует некоторая неопределенность в классификации СК. В работе Урбанэк с соавт. [Urbanek et al., 2006] было проведено следующее разграничение СК на прогениторы и клетки-предшественники. По определению, сердечные СК экспрессируют антигены стволовых клеток, такие как c-kit, MDR1, Sca-1, islet, при этом они не экспрессируют транскрипционные факторы или мембранные и цитоплазматические белки (дифференцированных) сердечных клеток. Прогениторы относятся к типу клеток, в которых эпитоп стволовости коэкспрессируется с транскрипционными факторами, специфичными для миоцитов, эндотелиальных или гладкомышечных клеток. Клетки-предшественники на шаг дальше по степени дифференцированности. Их цитоплазма содержит белки, специфичные для миоцитов, эндотелиальных или гладкомышечных клеток.

До недавнего времени считалось общепринятым, что функция СК взрослого организма ограничена клеточными линиями того органа, из которого эти СК получены, и что они могут участвовать в репарации только этого органа. Но появились данные о том, что взрослые СК могут

трансдифференцироваться в другие по отношению к тканям своего органа клеточные типы, то есть обладают свойством пластичности. Было показано, например, что CK костного мозга дифференцируются не только в клетки крови, но и в клетки других органов, таких как печень, нервные, сердечные клетки. Однако свойство пластичности стволовых клеток пока остается под вопросом [Raff, 2003; Passier, Mummery, 2003; Wagers, Weissman, 2004; Reinecke et al., 2008].

Открытие стволовых клеток изменило наши представления об организации тканей и о протекающих в них восстановительных процессах. Но чтобы познать тонкие механизмы поведения CK и найти возможность использования этих знаний в клинической практике, предстоит ответить на многие вопросы, например:

1. Почему эмбриональные CK размножаются на протяжении года и дольше в лабораторных условиях, не дифференцируясь при этом, а большинство взрослых CK этого не может?

2. Какие факторы регулируют размножение CK, их самообновление и дифференцировку?

3. Если CK обладают высоким потенциалом к регенерации, то почему повреждение тканей у человека, как правило, заканчивается образованием соединительнотканного рубца?

4. Почему CK, обладающие безграничной способностью к размножению, не образуют раковые опухоли?

Несмотря на то, что CK обладают высокой способностью к самообновлению, тем не менее, есть множество свидетельств снижения их функционирования. Немаловажным фактором в этих процессах является старение. Существует представление, что взрослые CK определяют продолжительность жизни всей ткани, и поэтому играют ключевую роль в процессе старения организма. Старение у млекопитающих определяется снижением способности адекватно поддерживать тканевой гомеостаз или

восстанавливать ткань после повреждения. По этой причине патологические и патофизиологические состояния, характеризующиеся снижением тканевого гомеостаза и ухудшением регенеративной способности, могут быть рассмотрены как следствие снижения числа СК и/или их функций [Rando, 2006; Beltrami et al., 2011]. А механизмы, с помощью которых сохраняется регенеративный потенциал СК, и то, в какой степени они нарушаются с возрастом, являются определяющими факторами тканевого старения [Charville, Rando, 2011].

Сейчас появляются данные о том, что ниши играют значительную роль в развитии стволовых клеток. Изучение влияния старения на структуру и функцию внеклеточного матрикса и на ниши мезенхимальных СК дало основание предполагать, что сами СК не изменяют своих характеристик с возрастом, но при этом испытывают сильное влияние изменяющихся с возрастом стволовых ниш [Fehrer et al., 2006]. Есть также данные о существовании прямой зависимости СК от их ниш. Так, исследование эпидермальных СК показало, что они сохраняют свою способность к пролиферации и дифференцировке в процессе жизни организма, но при этом с возрастом под действием окружения наблюдается подавление свойств СК [Giangreco et al., 2008]. Результаты изучения сателлитных клеток позволяют предположить, что микроокружение СК у молодых животных стимулирует регенерацию, в то время как у взрослых особей либо не способствует тканевой регенерации, либо ее подавляет [Gopinath, Rando, 2008].

1.3. Сравнительные аспекты регенерации миокарда

Стволовые и прогениторные клетки содержатся практически во всех органах млекопитающих и играют важную роль в поддержании их деятельности и самообновлении. Некоторые типы СК способны восстанавливать ткань даже после значительных повреждений. Примером может служить регенерация клеток крови и печени. К сожалению, СК не всех

органов обладают таким высоким регенеративным потенциалом. Так, низким потенциалом к самообновлению и регенерации характеризуется сердце млекопитающих. До недавнего времени и вовсе считалось, что сердце это окончательно дифференцированный орган, клетки которого не способны к делению [MacLellan, Schneider, 2000]. Однако в настоящее время это представление опровергнуто новыми данными о наличии в миокарде CK, участвующих в процессах самообновления и регенерации сердечной мышцы [Beltrami et al., 2003; Oh et al., 2003; Messina et al., 2004; Laugwitz et al., 2005; Pfister et al., 2005; Reinecke et al., 2008]. Сейчас сердце рассматривают уже не

Зона

мышца

Рис. 2. Способность сердечной мышцы к регенерации у млекопитающих, тритонов и 2еЬгсфз1? [Роэз, 2007]. Наилучшей способностью восстанавливать поврежденный миокард после отсечения верхушки сердца обладают 2еЬга)ЪЬ, у которых наблюдается отсутствие или незначительное рубцевание в области повреждения. У тритонов восстановление сердечной мышцы происходит с частичным рубцеванием, в то время как у млекопитающих фиброз инфарктного сердца приводит к значительному снижению сократительной функции миокарда.

как статичный орган, а как орган, имеющий определенный регенерационный потенциал.

Лечение заболеваний сердца и поиск способов восстановления функций поврежденного миокарда имеет важное социальное значение. Известно, что некоторые низшие позвоночные, такие как костные рыбы и хвостатые амфибии, обладают высокой способностью восстанавливать сердце после повреждения (рис. 2). В этой связи в решении проблем регенерации миокарда млекопитающих будет полезным обратиться к рассмотрению некоторых аспектов регенерации сердечной мышцы у других видов и типов животных.

1.3.1. Регенеративная способность сердца Zebrafish

Рыбки семейства Cyprinidae (Полосатый данио, Zebrafish) способны регенерировать сердце при значительных повреждениях. Это подтверждено в экспериментах, в которых хирургическим методом удалялось до 20% желудочка [Poss et al., 2002; Poss et al., 2003; Raya et al., 2003]. Отсечение затрагивало внутреннюю полость желудочка, высвобождая большое количество крови. При этом зона повреждения быстро закрывалось сгустком крови, и орган продолжал сократительную активность, необходимую для поддержания циркуляции крови. Далее, в течение нескольких дней сгусток крови, который затягивал верхушку желудочка, созревал в фибрин - смешанную среду, содержащую серные факторы и вырожденные эритроциты. Следует отметить, что в инфарктном желудочке у млекопитающих фибрин выполняет функцию привлечения фибробластов и воспалительных клеток и является предшественником формирования рубца. Удивительно, но в этих экспериментах показано, что во время репарации сердца у Zebrafish фибрин не замещался рубцовой тканью. Через 1-2 месяца после повреждения, в сердце Zebrafish оставалось очень мало коллагена или его не наблюдалось совсем. Вместо этого образовывались новые кардиомиоциты, которые замещали фибрин и формировали новую мышечную стенку. Можно предположить, что фибрин играет ключевую роль в процессе регенерации, вероятно, действуя, как

основа для запуска необходимых процессов или даже как центр паракринной сигнализации. Пик пролиферативной активности кардиомиоцитов приходился на 14-й день после ампутации верхушки желудочка, а стенка желудочка обычно восстанавливалась к 30-му дню [Poss, 2007].

Установлено, что сначала регенеративные пролиферативные процессы запускаются в дистальной или апикальной области повреждения. Использование BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) показало, что сердечная мышца восстанавливается за счет процесса образования новых кардиомиоцитов, при котором происходит постепенное смещение пролиферативной границы. Это дает основание предполагать, что у Zebrafish процесс регенерации сердца может быть сходен с процессом восстановления плавника, при котором зона пролиферации располагается в специфической области бластемы, а регенерация происходит по периферии [Nechiporuk, Keating, 2002; Poss, 2002].

Кардиомиоциты Zebrafish активно вступают в митоз, но пока остается не ясным то, как запускается пролиферация кардиомиоцитов и поддерживается в апикальной зоне регенерации. Первый возможный механизм того, как это происходит может заключаться в том, что для входа в клеточный цикл и дальнейшего деления могут быть индуцированы дифференцированные сокращающиеся кардиомиоциты. Второй - регенерация может проходить за счет недифференцированных прогениторных клеток, которые формируют новые, пролиферирующие кардиомиоциты. Третьим вариантом может быть процесс дедифференцировки, при котором в мышце будет подавляться экспрессия сократительных генов, таких как cardiac myosin light chain 2 и ventricular myosin heavy chain, и происходить переход дифференцированных клеток в недифференцированное или слабо дифференцированное состояние [Poss, 2007].

Данные, полученные на трансгенных костных рыбах, показали, что образование новых клеток сердечной мышцы происходит за счет пролиферации дифференцированных кардиомиоцитов. То есть подавляющее большинство,

если не все, новообразованные кардиомиоциты возникают из уже существующих кардиомиоцитов, которые возобновляют клеточный цикл и претерпевают репликацию ДНК. Вскоре после ампутации верхушки желудочка кардиомиоциты, находящиеся близко к границе повреждения, начинают претерпевать ограниченную дедифференцировку, которая характеризуется разборкой их саркомерных структур, экспрессией регуляторов клеточного цикла и отсоединением клеток друг от друга. Оценка экспрессии polo-like kinase 1, регулятора клеточного цикла, показала его повышенную экспрессию в регенерирующем сердце Zebrafish. При этом подавление polo-like kinasel резко ингибировало процесс регенерации. Таким образом, polo-like kinasel является важным регулятором клеточного цикла пролиферирующих кардиомиоцитов при восстановлении сердечной ткани. Авторы этого исследования полагают, что СК и/или ПК вовлечены в процесс регенерации миокарда незначительно [Jopling et al., 2010].

С другой стороны существуют работы, авторы которых утверждают, что недифференцированные прогениторные клетки сходные с теми, которые образуют эмбриональное сердце, ответственны за генерацию новых кардиомиоцитов во время регенерации [Lepilina et al., 2006]. Источник таких прогениторов пока не известен, и в то же время нет точных доказательств того, что в процессе регенерации сердца играет большую роль дедифференцировка.

На регенерацию сердца оказывают влияние и факторы немиокардиальной природы. Немиокардиальная составляющая сердца Zebrafish представлена эпикардом, тонким наружным эпителиальным слоем, покрывающем сердце, и эндокардом, слоем эндотелиальных клеток, выстилающих внутреннюю поверхность сосудов. В ответ на повреждение в течение 1-2 дней наблюдается значительная пролиферация эпикардиальных клеток и экспрессия таких маркеров, как tbxl8 и raldh2. После ампутации верхушки желудочка, рядом с границей среза формируется бластема, содержащая резидентные прогениторных клеток, которые экспрессируют прекардиальные маркеры. В

течение 7-14 дней после ампутации эпикардиальная ткань, окружающая обе камеры сердца, быстро разрастается, создавая новый эпителиальный покров миокарда. Далее эпикардиальные клетки начинают претерпевать эпителиально-мезенхимальное преобразование [Wynn, 2008], и субпопуляция клеток эпикарда встраивается в регенерирующую ткань миокарда. Клетки входят в область повреждения и формируют эндотелиальные и гладкомышечные клетки новых сосудов. Таким образом, эпикард активно участвует в процессе восстановления миокардиальной ткани. Взаимодействие миокарда и эпикарда связано с FGF (fibroblast growth factors) сигнализацией, и блокирование FGF рецепторов блокирует сердечную регенерацию [Lepilina et al., 2006]. Тот же сигнальный путь управляет сердечными прогениторными клетками при регулировании размеров сердца, атрио-вентрикулярных пропорций, числа желудочковых кардиомиоцитов на поздних стадиях развития [Marques et al., 2008]

В настоящее время важно понять, как эпикард, в том числе и окружающий предсердие, активируется при резекции верхушки желудочка, каким образом клетки эпикарда нацеливаются на область повреждения и какова степень участия эпикарда в регенерации инфаркта.

1.3.2. Регенеративная способность сердца амфибий

Амфибии рода Urodela, такие как тритон и аксолотль способны регенерировать конечности, хвост, спинной мозг, сетчатку, хрусталик, челюсть, часть кишечника, ткань мозга [Tsonis, 1996]. Показано также, что амфибии переносят массивное механическое повреждение желудочка сердца, вплоть до удаления одной четверти камеры [Rumyantsev, 1977]. В поврежденном миокарде наблюдается пролиферация клеток и присутствие митотических фигур в ядрах кардиомиоцитов. С помощью иммуноцитохимии показано появление концентрированной области клеточного деления в миокарде желудочка и предсердном эпикарде в ответ на повреждение сердца (отсечение верхушки желудочка). При этом включение BrdU, используемого для

определения пролиферирующих клеток, наблюдалось в ядрах миоцитов, находящихся рядом с зоной резекции желудочка [Flink, 2002].

Пока не ясно, какие факторы стимулируют клеточное деление, однако, показано, что тритоны имеют гетерогенную популяцию кардиомиоцитов, часть из которых, вероятно, более предрасположена к делению [Bettencourt-Dias et al., 2003]. Несмотря на данные о цитокинезе сердечных клеток in vitro и о вступлении клеток в клеточный цикл и митоз in vivo, все же при регенерации сердца у тритона преобладает процесс рубцевания. То есть, хотя и кажется, что кардиомиоциты имеют потенциал к регенерации, но при повреждении миокарда лишь незначительная часть сердечной мышцы замещается новообразованными кардиомиоцитами. В качестве объяснения этого можно предположить, что в сердце тритона существует некий барьер, препятствующий реорганизации пролиферирующих кардиомиоцитов. Возможно также и то, что в сердце происходит регенерации, но при этом формирование соединительнотканного рубца идет быстрее и, таким образом, перекрывает процесс образования миокардиальной ткани [Poss, 2007].

Интересна работа Бадер и Оберприллер [Bader, Oberpriller, 1979], в которой исследователи отсекали 1/16 - 1/8 часть желудочка тритона, измельчали последнюю и возвращали обратно в сердце. Они показали, что кардиомиоциты измельченного миокарда приживлялись, пролиферировали и были способны формировать сокращающуюся массу. К тридцатому дню пересаженная ткань представляла собой интегрированную структуру, состоящую главным образом из сердечной мышцы. При этом миоциты находились на разных стадиях миофибриллогенеза и содержали большое количество филаментов с длиной 10-нм. К семидесятому дню миоциты имели уже хорошо организованные миофибриллы и внеклеточные контакты, сходные с контактами кардиомиоцитов неповрежденной части миокарда [Bader, Oberpriller, 1979].

Последовательность событий, которые происходят после ампутации верхушки желудочка, была впервые описана в работе Оберприллер с соавт. [ОЬегрпНег е1 а1., 1974]. После ампутации сгусток крови быстро затягивает повреждение, через неделю он растворяется, и к 10-му дню в крайней зоне сгустка накапливаются лимфоциты. В это время в области, прилегающей к повреждению, происходят первые митотические события. Через две недели после ампутации в кровяном сгустке наблюдается активность макрофагов, и тонкий слой эпикардиальных клеток затягивает внутреннюю поверхность сгустка, а некроз в прилегающей трабекуле исчезает. На третьей неделе в области раны появляются волокна соединительной ткани, и в трабекуле увеличивается митоз. Одновременно в трабекулярных структурах вблизи раны появляются первые миофибриллы. После четвертой недели, зона повреждения уже в основном состоит из соединительной ткани. Последняя распространяется в рану, содержащую только рассредоточенные миоциты. Миофибриллы этих миоцитов меньше миофибрилл миоцитов здоровых животных. Таким образом, сделан вывод, что у тритона полного восстановления сердца не происходит, а образуется полуфункциональная ткань, содержащая смесь сократительной и соединительной ткани [ОЬегрпНег й а1., 1974].

В другой серии экспериментов, также посвященной изучению регенеративной способности сердца тритона, авторы использовали такой способ повреждения миокарда, который позволяет поддерживать внешнюю морфологию желудочка. Большая часть внутренней массы желудочка была дезорганизована путем механического разрушения вентрикулярного миокарда. Они показали, что сердце тритона способно эффективно регенерировать в течение 10-12 недель после повреждения. При этом наблюдалась полная функциональная реорганизация трабекулярной структуры миокарда без существенных остатков соединительной или рубцовой ткани. Авторы пришли к выводу, что сердце тритона в состоянии полностью восстанавливаться в

условиях, напоминающих потерю сократительных клеток при инфаркте или воспалении [Borchardt, Braun, 2007].

Лаубе и соавт. [Laube et al., 2006] показали, что способность кардиомиоцитов тритона регенерировать повреждения сердца коррелирует с их способностью трансдифференцироваться в разные типы клеток. В этих экспериментах механическое повреждение сердца приводило к значительному снижению саркомерных белков в миокарде, показывая, что во время регенерации происходит частичная дедифференцировка взрослых кардиомиоцитов. Интересно, что кардиомиоциты, имплантированные в регенерирующую конечность (в область, близкую к бластеме, которая сформировалась через пять дней после ампутации конечности), теряли их сердечный фенотип и приобретали фенотип клеток скелетной мышцы или хондроцитов. При этом кардиомиоциты, культивированные in vitro или имплантированные в неповрежденные конечности, сохраняли свой оригинальный фенотип. Поэтому был сделан вывод, что репрограммирование кардиомиоцитов зависит от контакта с бластемой конечности. Авторы предполагают, что сигналы из бластемы конечности вызывают дедифференцировку кардиомиоцитов, пролиферацию и ре-дифференцировку в специализированные клетки, а также то, что способность кардиомиоцитов трансдифференцироваться в разные типы клеток отражает клеточную программу, которая позволяет сердцу регенерировать [Laube et al., 2006].

Но то, является ли дедифференцировка кардиомиоцитов необходимым условием пролиферации in vivo, еще предстоит определить. Таким образом, у взрослых саламандр и тритонов, как и у Zebrafish процесс регенерации после ампутации верхушки сердца вовлекает формирование бластемы. У саламандры клетки бластемы образуются за счет дедифференцировки резидентных кардиомиоцитов. У тритона, как описано выше, делящиеся кардиомиоциты частично дезорганизуют свои саркомерные структуры и возвращаются в более раннее, в плане дифференцировки, состояние, после чего становятся

способными обновляться и дифференцироваться в другие клеточные типы под действием определенных индуктивных сигналов [Laube et al, 2006].

1.3.3. Регенеративная способность сердца млекопитающих

В отличие от Zebrafish и тритонов, сердце млекопитающих характеризуется гораздо более сниженной способностью к регенерации [Rumyantsev, 1977; Borchardt, Braun, 2007]. Пока мало изучены реальные процессы, происходящие в миокарде млекопитающих, но точно можно сказать, что кардиомиоциты этих животных обладают некой внутренней сопротивляемостью к делению.

В процессе развития сердце человека увеличивается в объеме в 16 раз по сравнению с сердцем новорожденного, при этом объем кардиомиоцитов возрастает в 15 раз. Рост миокарда идет как за счет полиплоидизации ядер, так и за счет гипертрофии кардиомиоцитов, т.е. умножения числа внутриклеточных структур и увеличения массы гиалоплазмы. Полиплоидизация и гипертрофия обеспечивают не только рост миокарда в процессе развития, но и, в какой-то мере, осуществляют компенсационный рост органа в ответ на повышенную нагрузку сердца, когда может происходить небольшой всплеск митотической активности, правда часто без цитотомии [Шубникова и др., 2001]. Для сердца характерна способность к регенерации путем регенераторной гипертрофии, при которой масса органа восстанавливается, а форма остается нарушенной [Di Felice et al., 2009]. Так, после перенесенного инфаркта миокарда, несмотря на восстановление массы органа, место повреждения замещается соединительной тканью, а сам орган гипертрофируется.

Известно, что во время эмбрионального развития клетки сердца активно пролиферируют. Их пролиферация достигает максимума в период формирования сердечных камер, но вскоре после рождения животного останавливается [MacLellan, Schneider, 2000]. В работе Ли с соавт. [Li et al., 1996] в экспериментах на крысах разного возраста (1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 12-дневных) было показано, что переключение гиперплазии на гипертрофию

кардиомиоцитов происходит между третьим и четвертым днями постнатального развития сердца. Далее деление кардиомиоцитов прекращается, и дальнейший рост органа происходит за счет увеличения размеров кардиомиоцитов, а не их числа, то есть путем гипертрофии. На крысах показано увеличение объема сердечных миоцитов в 2,5-раза с 3-го по 12-й день постнатального развития животного [Li et al., 1996]. При этом в миокарде наблюдается образование значительной доли двуядерных и многоядерных клеток. Механизм, который приводит к переключению процесса пролиферации на гипертрофию пока остается не ясным. Таким образом, сердце взрослого млекопитающего состоит из окончательно дифференцированных кардиомиоцитов, которые не способны делиться и поэтому не могут участвовать в процессах регенерации повреждений.

Факт прекращения деления кардиомиоцитов вскоре после рождения млекопитающего говорит о том, что большинство, если не все миоциты, выходят из клеточного цикла и оказываются остановленными в определенных его точках [Claycomb, 1992; McGill, Brooks, 1995; Walsh et al., 2010]. На свежевыделенных кардиомиоцитах фетальных, неонатальных и взрослых крыс показано, что в процессе развития сердца значительно снижается количество S-фазных миоцитов. При этом увеличивается доля G0- и/или Gr фазных клеток, а также клеток, находящихся в G2/M фазах. Исходя из этого, можно предположить, что в кардиомиоцитах существует механизм двойной блокады клеточного цикла. В период развития сердца увеличивается экспрессия ингибиторов циклин-зависимых киназ, p21CIP1 и p27KIP1. Авторы считают, что р21 и р2/ играют важную роль в процессе выхода кардиомиоцитов из клеточного цикла и в поддержании клеток в G0/Gi и G2/M фазах [Poolman et al., 1998].

В связи с поиском способов лечения сердечных заболеваний активно исследуются пути регуляции клеточного цикла. Показано, что клеточный цикл сердечных миоцитов можно перепрограммировать и запускать пролиферацию

[ВюкпеП ег а1., 2007]. Например, данные, полученные на трансгенных мышах, показали, что повышенная экспрессия циклина Б2 способствовала активации клеточного цикла кардиомиоцитов, и, таким образом, улучшала характеристики инфарктного миокарда [НаэБтк е1 а1., 2008].

Отсутствие пролиферации кардиомиоцитов взрослого сердца млекопитающих приводит к тому, что зона повреждения мышцы замещается клетками соединительной ткани с образованием рубца. В ответ на массовое повреждение сердечных миоцитов и некроз быстро запускается процесс репарации. Во время фазы воспаления моноциты и лимфоциты мигрируют в зону некроза для удаления погибших кардиомиоцитов. Далее наступает пролиферативная фаза: происходит формирование грануляционной ткани, которая характеризуется делением фибробластов, наличием макрофагов, миофибробластов, новых кровеносных сосудов и белков внеклеточного матрикса. Во время фазы созревания происходит образование богатого коллагеном рубца, который значительно снижает сократительную активность миокарда, препятствуя нормальной деятельности сердца [Ма1Бш е1 а1., 2010]. Хотя точные молекулярные механизмы заживления сердечной ткани пока не раскрыты, эти следующие друг за другом процессы точно координируются взаимодействием клеток с окружающим их белками и ростовыми факторами внеклеточного матрикса [Dobaczewski е1 а1., 2010].

Есть предположение, что фиброз в сердце млекопитающих обусловлен эволюционно. Для высших позвоночных характерно высокое кровяное давление, поэтому кровотечение при повреждении сердца может серьезно угрожать жизни животного. Выживание организма в таких условиях зависит от времени заживления раны. Вероятно, селективный отбор благоприятствовал более быстрому фиброзному ответу, поскольку клетки соединительной ткани способны дать максимально быстрый отклик на повреждение, активно вступая в пролиферацию. Низшие позвоночные имеют систему кровообращения с низким давлением и не полностью оксигенизированную кровь. У

млекопитающих эмбрион также развивается в условиях с низким кислородным давлением. Постнатальное же сердце млекопитающих, напротив, нуждается в высоко-кислородном метаболизме. Поскольку активация клеток-предшественников требует низкого уровня кислорода в микроокружении [Simon, Keith, 2008], то сердце взрослого млекопитающего, возможно, по своей сути не способно активировать собственные резидентные кардиогенные прогениторы [Ausoni, Sartore, 2009].

Существует также предположение, что высокий регенеративный потенциал саламандры и Zebrafish может быть обусловлен их менее сложным приобретенным иммунитетом [Godwin, Brockes, 2006], а также незрелой иммуновоспалительной реакцией и ограниченным количеством фибробластов [Blewett et al., 1997].

Деление сердечных клеток сопровождается структурными изменениями, главным образом приводящими к последовательной разборке и сборке миофибрилл [Ahuja et al., 2004]. Понимание этого механизма может помочь в выяснении причин прекращения деления кардиомиоцитов постнатального сердца, которое происходит сразу после созревания их сократительного аппарата. Ответ на этот вопрос важен для разработки способов регуляции клеточного деления. Вполне возможно, что процесс дедифференцировки может способствовать возобновлению клеточного цикла, как, например, в естественно делящихся кардиомиоцитах тритона [Bettencourt-Dias et al., 2003]. Действительно, дедифференцированные кардиомиоциты присутствуют у больных, страдающих такими заболеваниями, как хронический гибернирующий (спящий) миокард или хроническая фибрилляция предсердия, а также у пациентов, перенесших инфаркт [Heusch, Schulz, 2000]. Было обнаружено, что взрослые кардиомиоциты, ко-культивируемые с сердечными фибробластами, претерпевают дедифференцировку и вступают в клеточный цикл [Zaglia et al., 2009]. Таким образом, выяснение механизмов, управляющих

РОССИЙСКАЯ 1 ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

делением клетки и ответственных за его остановку в определенных фазах клеточного цикла, является важной задачей и требует глубокого понимания.

1.4. Стволовые клетки миокарда млекопитающих

Сердечные заболевания являются одной из лидирующих причин инвалидности и смертности среди людей [Sohn et al., 2007; Di Felice et al., 2009]. На повестке дня стоят вопросы лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, возникновение которых в значительной мере связано с нарушением структуры и функции мышечных тканей и, в первую очередь, сердечной мышцы. Потеря пролиферативной способности кардиомиоцитов взрослого сердца [MacLellan, Schneider, 2000] представляет основную опасность при ишемии и инфаркте миокарда, поскольку приводит к фиброзу сердечной мышцы и, как следствие, инвалидности людей.

До недавнего времени сердце млекопитающих считалось окончательно дифференцированным органом, неспособным к регенерации. Согласно этой концепции постулировалось, что количество кардиомиоцитов полностью формируется к моменту рождения (точнее к третьим-четвертым суткам после рождения), а сами кардиомиоциты представляют собой дифференцированные клетки, которые остаются неизменными на протяжении всей жизни. В сердечной ткани происходит постоянное старение и гибель миоцитов, но новые кардиомиоциты не образуются. Увеличение размеров миокарда от момента рождения млекопитающего до взрослого состояния, а также поддержание нормальной деятельности органа происходит за счет гипертрофии кардиомиоцитов, а не их пролиферации [Leri et al., 2005]. Учитывая, что возраст человека может достигать 80-100 лет, то, согласно этой концепции, продолжительность жизни дифференцированной клетки должна быть сравнимой с этими сроками.

В последнее десятилетие появились данные, позволяющие усомниться в правильности традиционного взгляда. Необходимо отметить, что еще П.П.

Румянцевым было описано присутствие в сердце млекопитающих незначительной популяции делящихся клеток [Румянцев, 1982]. В здоровом сердце человека 14 миоцитов из миллиона находятся в состоянии митоза, завершающегося цитотомией [Шубникова и др., 2001]. В 1998 году была опубликована работа, в которой показано, что у человека на поздних стадиях сердечной недостаточности присутствуют пролиферирующие миоциты [Kajstura et al., 1998]. Наличие делящихся сердечных миоцитов было обнаружено и в постинфарктном миокарде человека. При этом показано, что взрослое сердце содержит СК, активация которых происходит преимущественно при ишемических состояниях как ответ на повреждение мышцы, а сами незрелые клетки способны к делению и дифференцировке в кардиомиоциты, гладкомышечные и эндотелиальные клетки [Beltrami et al., 2001]. Обнаружено существование циклирующих желудочковых миоцитов при нормальных и патологических состояниях в сердце некоторых видов взрослых млекопитающих, а также человека [Kajstura et al., 1998; Beltrami et al., 2001; Quaini et al., 2002]. Описано интенсивное формирование миоцитов из сердечных СК в условиях гипертрофии миокарда у человека [Urbanek et al., 2003]. Извесно, что у грызунов число миоцитов в миокарде увеличивается в несколько раз с момента рождения и до взрослого состояния. При этом BrdU, МСМ5, Ki67 или тимидин экспрессирующие миоциты присутствуют на протяжении всей жизни грызунов, что показывает последовательное образование паренхимальных клеток [Anversa et al., 2006]. У крупных млекопитающих сердечная недостаточность характеризуется повышенной теломеразной активностью, стимуляцией циклинов и циклин-зависимых киназ, усиленным карио- и цитокинезом [Leri et. al., 2001]. Эти и другие результаты указывают на то, что сердце является динамическим органом и содержит потенциал к регенерации.

Более того, в 2011 появилась работа, в которой представлены данные, свидетельствующие в пользу того, что сердце млекопитающих способно к

регенерации, правда только в ранний период после рождения животного. Авторами этой работы было показано, что миокард однодневной мыши восстанавливался после отсечения 15% верхушки левого желудочка, а регенерация сердечной мышцы сопровождалась наличием пролиферации с минимальными гипертрофией и фиброзом. Таким образом, наблюдаемый регенеративный ответ отличался от процесса репарации. При этом выявлено, что большинство кардиомиоцитов в регенерированной ткани произошло из предсуществующих кардиальных клеток. Однако, в отличие от миокарда мыши однодневного возраста, сердце 7-дневной мыши было неспособно к регенерации после резекции верхушки желудочка, и в зоне повреждения наблюдался значительный фиброз [Porrello et al., 2011].

Вместе с тем, имеющиеся данные вызывают вопросы относительно двух очевидно противоречащих друг другу фактов: необратимый выход кардиомиоцитов взрослого миокарда из клеточного цикла и, в тоже время, присутствие в сердце миоцитов, претерпевающих митоз и цитокинез. Возникли вопросы о происхождении делящихся клеток, об увеличении их числа в ответ на острые хронические перегрузки и многие другие.

В настоящее время активно проводятся исследования на клеточном уровне. Спектр изучаемых клеток достаточно широк, и охватывает кардиомиоциты в первичной культуре, стволовые клетки, а также перевиваемые клеточные линии, стимулированные к кардиомиогенезу. Целью такого рода работ является изучение особенностей миогенеза для последующего использования полученных знаний в практической медицине.

Оценка объема клеток, находящихся в состоянии митотического деления, выявила, что эти клетки намного мельче (~ в 4-10 раз) взрослых полностью дифференцированных кардиомиоцитов. Это говорит о том, что в сердце действует иной, отличный от традиционного представления, механизм формирования кардиомиоцитов [Beltrami et al., 2001; Urbanek et al., 2005]. Реплицирующиеся кардиомиоциты похожи на увеличенные мелкие клетки,

возникшие в результате активации прогениторных клеток (клеток-предшественников) [Апуегеа ег а1., 2006]. Было показано, что после пересадки сердца женщины-донора реципиенту-мужчине, в пересаженном сердце и коронарных сосудах присутствует определенное число миоцитов, содержащих У хромосому [СНшш й а1., 2002]. То есть клетки реципиента мигрировали и приживались в донорской ткани, формируя эндотелий и гладкомышечные клетки сосудов.

Все эти результаты привели к констатации наличия стволовых клеток во взрослом миокарде млекопитающих. Важное место в рассмотрении проблемы самообновления и регенерации сердца занимает вопрос о происхождении популяции СК. На данный момент в литературе рассматривают две гипотезы, объясняющие длительное поддержание миокардом нормальной сократительной функции, каждая из которых имеет экспериментальные подтверждения. Согласно первой гипотезе, регенеративные процессы происходят в миокарде за счет резидентных клеток, которые могут вступать в митотический цикл уже во взрослом организме при повреждении. Согласно второй гипотезе, регенерация осуществляется за счет хоуминга (оседания и развития) циркулирующих прогениторных клеток из костного мозга в различных тканях, что было показано при пересадке женского донорского сердца мужчине. Их миграция происходит с участием специфических медиаторов из костного мозга в процессе воспаления. Такие клетки впоследствии приживаются в миокарде и могут способствовать его регенерации, дифференцируясь в кардиомиоциты, эндотелий, гладкомышечные клетки или сливаясь с существующими кардиомиоцитами. Таким образом, клетки, способные дифференцироваться в кардиомиоциты во взрослом сердце могут брать свое начало, предположительно, из [Рубина и др., 2007]:

• циркулирующих в крови клеток-предшественников, коммитированных (ориентированных) в соответствующем кардиомиоцитарном

направлении (Коммитирование - запуск программы, направленной на дифференцировку клетки);

• реплицирующихся предсуществующих кардиомиоцитов (предшественников кардиомиоцитов (ПК)), оставшихся в миокарде после эмбриогенеза, или стволовых клеток сердца);

• сочетанием двух вышеуказанных механизмов, а также слиянием клеток-предшественников с миоцитами сердца.

Итак, согласно новой концепции, сердце представляется самообновляющимся органом и регулируется компартментом стволовых клеток. На сегодняшний день известны несколько активных групп исследователей, работающих в области изучения СК сердца как in vivo, так и in vitro. Данные этих исследований подтверждают, что взрослое сердце содержит СК и клетки-предшественники, способные к дифференцировке в зрелые кардиомиоциты [Oh et al., 2003; Beltrami et al., 2003; Laugwitz et al., 2005; Pfister et al., 2005; Messina et al., 2004].

Так, американские ученые сообщили о существовании отчетливой резидентной популяции СК во взрослом миокарде крыс. Эти клетки негативны к стволовым маркерам клеток крови (CD34, CD45, CD20, CD45RO и CD8 (Lin)) и позитивны к c-kit (c-kitPOS) - рецептору фактора стволовых клеток. Эти клетки примерно в десять раз мельче зрелых кардиомиоцитов и встречаются во взрослом миокарде в количестве 1 на 104 миоцитов. Выявленные Lin"c-kitP0S-клетки способны самообновляться, клоногенны (способны давать колонии из одиночной клетки) и мультипотентны: при действии дексаметазона клоны дифференцируются в миоциты, гладкомышечные и эндотелиальные клетки (табл. 1) [Beltrami et al., 2003].

Популяция c-kit+ сердечных клеток была идентифицирована и у человека in vitro. Показано, что c-kit+ СК обладают фундаментальными свойствами стволовых клеток - самообновлением, клоногенностью и мультипотентностью,

и дифференцируются преимущественно в кардиомиоциты и, в меньшей степени, в гладкомышечные и эндотелиальные клетки [Bearzi et al., 2007].

Обнаружено присутствие сердечных клеток-предшественников во взрослом сердце мыши. Эти клетки характеризуются экспрессией антигена 1 стволовых клеток (Sca-1+) и способны к самообновлению. 8са-1+-клетки экспрессируют ранние маркеры сердечных клеток (GATA4, Mef2 nTef2), но не Nkx2-5 или гены, ответственные за кодирование кардиальных саркомерных белков. Незначительная субпопуляция этого типа клеток (<5%) способна к дифференцировке в кардиомиоциты при действии 5-азацитидина или ДМСО, демонстрируя биохимические доказательства дифференциации: экспрессию саркомерного а-актина, сердечного тропонина 1 (cTNl) Nkx2-5, а- и р-миозина тяжелых цепей и рецептора типа 1А для морфогенетических белков костного мозга (табл. 2) [Oh et al., 2003].

Мессина с соавт. [Messina et al., 2004] сообщили о выделении предшественников кардиомиоцитов из взрослого сердца мышей и человека и также показали их клоногенность, малый размер, способность к образованию клеточных кластеров (кардиосфер) в культуре. Клетки экспрессируют маркеры стволовых и эндотелиальных прогениторных клеток и, предположительно, обладают свойствами взрослых сердечных СК, способны к длительному самоподдержанию и дифференцировке in vitro в кардиомиоциты и клетки сосудов. Авторы выявили, что регенерирующий миокард также содержит эти клетки - малые кардиомиоциты [Messina et al., 2004]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что обновление в миокарде может происходить именно за счет кардиопредшественников, правда активность этого процесса находится на очень низком уровне (табл. 1).

Однако в работе других авторов было высказано мнение, что кардиосферы из сердца мыши не являются источником сердечных СК. Было показано, что предполагаемые СК сердца, обладающие кардиомиогенным потенциалом, мигрируют из биопсии ткани во время ex vivo культивирования, и

что эти СК самоорганизуются в спонтанно-сокращающиеся кардиосферы. Исследования на неонатальных крысах дали основания предположить, что спонтанно сокращающиеся кардиосферы состоят из смеси фрагментов миокардиальной ткани, при отфильтровывании которых также образовывались кардиосферы, но без кардиомиогенного потенциала. Сходные результаты были получены и на неонатальных и взрослых мышах, а также крысах. Более того, с помощью проточной цитометрии и иммунофлуоресценции было показано, что кардиосферы состоят, главным образом, из смеси клеток (GATA-4+/коллагенГ/а-актин гладких мышц+/ CD45"), нежели формируются за счет роста клоногенных клеток. Таким образом, был сделан вывод, что кардиосферы не подходят в качестве источника сердечных СК с кардиомиогенным потенциалом [Andersen et al., 2009]. В то же время в другой работе, наоборот, была показана адекватность метода образования кардиосфер из миокарда для получения сердечных прогениторных клеток [Davis et al., 2009].

Популяция SP клеток (Side population cells) характеризуется по способности клеток высвечивать краситель Хёкст, используемый для окраски ДНК. Было показано, что эти клетки существует во многих тканях и способны к тканеспецифичной дифференцировке. В работе Пфистер с соавт. [Pfister et al., 2005] представлены данные, полученные на мышах, которые подтверждают существование популяции SP клеток в сердце. SP клетки представляют собой отдельную популяцию сердечных прогениторных клеток, способных к самообновлению. Среди сердечных SP клеток наибольшим потенциалом к кардиодифференцировке обладают клетки, экспрессирующие стволовой клеточный антиген 1 (Sca-1) и не экспрессирующие эндотелиальный маркер CD31, т.е. CD31 / Sca-1 SP клетки. Доля этих клеток составляет 500-1000 на взрослое сердце. При ко-культивировании со взрослыми кардиомиоцитами CD31VSca-l+ SP клетки способны как к биохимической, так и к функциональной дифференцировке в зрелые кардиомиоциты, проявляя экспрессию специфичных для кардиомиоцитов транскрипционных факторов и

сократительных белков. При этом небольшая часть клеток (10%) была способна к спонтанному сокращению с частотой меньше 1 Гц. При электрической стимуляции у CD317Sca-l+ SP клеток формировались ритмические сокращения, синхронизированные с сокращениями соседних взрослых кардиомиоцитов. Более того, дифференцированные клетки этой популяции проявляли кратковременные выбросы внутриклеточного кальция, неотличимые от ко-культивируемых с ними взрослых кардиомиоцитов. В случае монокультуры у этих клеток не наблюдалось спонтанных сокращений, а также других доказательств их функциональной зрелости. Таким образом, для полноценной дифференцировки CD31"/Sca-1+ клеткам необходимо взаимодействие, но не слияние, со зрелыми кардиомиоцитами (табл. 1) [Pfister et al., 2005].

И, наконец, в 2005 г. исследователи из калифорнийского университета представили доказательства существования сердечных прогениторных клеток, специализированных СК, в сердце новорожденных крыс, мышей и человека. Было показано, что субпопуляция этих клеток экспрессирует ген islet-1 (isll+). В отличие от других предполагаемых резидентных сердечных клеток-предшественников, эти клетки не экспрессируют стволовой клеточный антиген 1 (Sca-Г), CD31 (CD31") или c-kit (c-kit"), но экспрессируют Nkx2-5 и GATA4. Выделение клеток из сердца мыши показало, что большая часть Isll+ ПК находится во фракции сердечных мезенхимальных клеток. При культивировании изолированных Isll+ ПК сердечная мезенхимальная подложка (подслой) способствует их самообновлению. А ко-культивирование Isll+ кардиобластов с неонатальными кардиомиоцитами ведет к появлению

экспрессии миоцитных маркеров (у 25% клеток) без клеточного слияния,

2+

появлению осцилляций Са , сходных и синхронных с осцилляциями прилегающих миоцитов, а также генерации потенциала действия (табл. 1) [Laugwitz et al., 2005].

Транскрипционный фактор Isll+ является маркером клеточной популяции, которая вносит значительный вклад в формирование

эмбрионального сердца [Genead et al., 2010], формируя большую часть клеток обоих предсердий, правого желудочка, пути оттока, а также специфических областей левого желудочка. Экспрессия гена Isll исчезает по мере дифференциации в сердечные миоциты. Субпопуляция Isl Г недифференцированных ПК остается в сердце и после рождения животного, но доля этих клеток значительно снижается и составляет всего 500-600 клеток на сердце 1-5-дневной крысы. Лоугвитц с соавт. [Laugwitz et al., 2005] назвали эти клетки кардиобластами. Таким образом, Islf кардиобласты взрослого сердца являются потомками эмбриональных прогениторных клеток.

На ранней стадии кардиогенеза происходит формирование из мезодермы сердечного полумесяца [Harvey, 2002]. Было показано, что кардиогенная мезодерма состоит из двух популяций клеток или областей: первая и вторая сердечные области [Kelly, Buckingham, 2002; Buckingham et al., 2005]. Из клеток первой области сердца сначала формируется сердечный полумесяц, а потом левый желудочек. Isl 1 - это маркер второй сердечной области, клетки которой образуют оба предсердия и правый желудочек. Исследования на трансгенных мышах подтверждают, что islet-1 - это маркер отдельной популяции недифференцированных сердечных прогениторов, из которых формируются пути оттока сердца, большая часть клеток правого желудочка и предсердий, а

Рис. 3. Вклад Isl Г прогениторов (синий) в предсердно-желудочковый миокард (красный), проводящую систему (белый) и сердечные ганглии (зеленый) [Laugwitz et al., 2008]. В проводящей системе сердца Isl Г клетки наблюдаются больше всего в области синусно-предсердного узла (СПУ). ТТЛ - перегородка предсердий, ПЖ - межжелудочковая перегородка, ПЖУ - предсердно-желудочковый узел, ЛЖ- левый желудочек, ЛП - левое предсердие, ПрЖ - правый желудочек, ПрП -правое предсердие.

также небольшая часть клеток левого желудочка [Cai et al., 2003]. Isll+ клетки вносят вклад и в эндотелиальные и гладкомышечные линии клеток, включая гладкие мышцы коронарных сосудов. В 2007 г. было показано, что в период эмбрионального развития сердца Isll представляет собой специфический маркер субпопуляции пейсмекерных клеток [Sun et al., 2007]. Таким образом, из ЫГ предшественников формируется две трети всех клеток эмбрионального миокарда, за исключением клеток левого желудочка (рис. 3) [Laugwitz et al., 2008].

Что касается локализации сердечных СК и ПК в сердце, то показано, что расположение и специфические функции тех или иных клеточных групп зависят от механической нагрузки, приходящейся на данный участок миокарда. В сердце максимальная нагрузка приходится на базальную и среднюю части стенки желудочка. При приближении к верхушке желудочка нагрузка снижается, но самой низкой она является в предсердиях. Ниши сердечных СК располагаются в участках с наименьшей механической нагрузкой. Однако для СК характерно образование кластеров и в срединной части стенки желудочка [Рубина и др., 2007]. По данным Урбанэк с соавт. [Urbanek et al., 2006], полученным на взрослых мышах, сердечные СК регулируют обновление миоцитов, которое является неоднородным в сердце. Оно происходит быстрее в предсердиях и верхушке сердца, медленнее в основании и срединной части желудочков. Размеры ниш, локализованных в предсердиях, примерно в два раза крупнее размеров ниш желудочков. При этом число ниш, приходящихся на 1

3

мм в предсердном и апикальном миокарде примерно в восемь раз больше, чем в средней части и в основании желудочка [Urbanek et al., 2006].

Итак, регистрация sca-l+ и c-kit+ СК или isl-l+ сердечных ПК, SP клеток и образование «кардиосфер» из тканей взрослого миокарда свидетельствует о том, что в зрелом миокарде постоянно присутствуют незрелые клетки, способные к самообновлению и обладающие кардиомиогенным потенциалом (табл. 1) [Laugwitz et al., 2008]. Данное обстоятельство дает возможность

использования в перспективе клеточных технологий в лечении болезней миокарда.

Подводя итог обзору литературы, посвященному морфофункциональной характеристике кардиомиоцитов, стволовых клеток и клеток-предшественников сердца следует отметить, что сведения о физиологических свойствах перечисленных клеток в сердце млекопитающих недостаточны. В литературе описано существование нескольких типов сердечных стволовых клеток у млекопитающих, но имеющиеся в настоящее время данные о факторах, регулирующих их самообновление и направленную кардиодифференцировку фрагментарны. Более того, получение чистых популяций стволовых клеток, применяемое в работах других авторов, приводит к изолированию стволовых клеток из их естественного микроокружения и к потере необходимых сигналов и факторов, ответственных за их самообновление и дифференцировку. Мы думаем, что изучение сердечных стволовых клеток в условиях приближенных к их нативному микроокружению позволит получить новые фактические данные и осветить этот вопрос с другой стороны. Многие данные свидетельствуют в пользу существования регенерационного потенциала в миокарде взрослых млекопитающих, поэтому, пожалуй, одним из самых интересных в этой проблеме является вопрос, почему сердце млекопитающих обладает сниженной способностью к регенерации по сравнению с сердцем представителей рыб и амфибий. Поскольку у млекопитающих первостепенным является как можно скорое заживление поврежденного миокарда, то в литературе высказывается мнение, что эволюция шла по пути формирования фиброзного ответа и рубцевания зоны повреждения в силу их более быстрого отклика. Выход кардиомиоцитов из клеточного цикла приводит к тому, что клетки миокарда становятся неспособными участвовать в восстановительных процессах и поэтому не могут дать вклад в формирование новой миокардиальной ткани. Однако современные исследования представляют доказательства

существования в сердце млекопитающих незрелых клеток, ответственных за самообновление и регенерацию органа. Но есть точка зрения, что пул стволовых клеток значительно снижен и при этом затруднены процессы пролиферации и дифференцировки СК. Тем не менее, на стволовые клетки возлагаются большие надежды. Однако, следует отметить, что до сих пор отсутствуют клеточные модели миокарда, которые позволили бы проследить все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных стволовых клеток и кардиопредшественников, что важно как для фундаментальной физиологии, так и для медицины. Кроме того, для решения проблем, связанных с ишемическими и реперфузионными повреждениями сердечной мышцы, существует острая необходимость в разработке клеточных тест-систем для скрининга лекарственных (антиоксидантных) препаратов, которые способствовали бы наиболее быстрому подбору оптимальных кардиопротекторов. Для того чтобы ответить на эти вопросы и восполнить пробел в существующих знаниях о физиологии сердечных стволовых клеток у млекопитающих и было предпринято настоящее исследование.

Таблица 1. Свойства и протоколы дифференциации разных типов сердечных СК.

Сердечные CK Маркеры CK + - Доля клеток Кардио-специфичные факторы транскрипции Протокол дифференциации Гены сердечных миоцитов в клетках после их дифференцировки Мультипотентность

c-kit [Beltrami et al., 2003] c-kit CD34; CD45; lineage ~1 на 104 миоцитов GATA4 GATA5 MEF2C NKX2.5 Среда MEM с 10% эмбриональной сыворотки коров и Ю-8 М дексаметазона (+) а-саркомерный актин (+) сердечный миозин (+) десмин, connexin 43 (+)эндотелиальные белки (-) исчерченнось/сокращение (-) саркомеры Да (кардиомиоциты, гладкомышечные, эндотелиальные клетки)

Sca-1 [Oh et al., 2003] Sca-1; CD31 c-kit (±); CD34; CD45; lineage Не определено GATA4 GATA5 MEF2C NKX2.5 5-азацитидин; окситоцин; 5-аза + TGF-p (трансформирующий ростовой фактор- 3) (+) Тропонин 1: 2,8% (+) а-саркомерный актин: 4,6% (+) сердечный миозин (+) Тяжелые цепи миозина (anß) (+) десмин, connexin 43 {-) исчерченнось/сокращение (-) саркомеры

SP клетки [Pfister et al., 2005] Abcg2; Sca-1 CD31; c-kit (low); D34(low); D45 (low) 500-1000 на взрослое сердце GATA4; MEF2C; NKX2.5 Ко-культивирование с сердечными клетками в кардиомиоцитспецифичной среде (+)Тропонин (+) a-сердечный актин (+) connexin 43 (+) спонтанные сокращения клеток (10%) (+) ЭМ сопряжение (+) Са2+ выбросы

lslet-1 [Laugwitz et al., 2005] lls-1 Sca-1; c-kit; CD31 500-600 на сердце 1-5 дневной крысы NKX2.5; GATA4 Ко-культивирование с неонатальными миоцитами (+) Сердечный тропонин T: 25% (+) a-сердечный актин (+) исчерченность/сокращение (+) Саркомеры: 22% (+) ЭМ сопряжение (+) Са2+ выбросы (+) потенциал действия Aa.lsl-l",Nkx2-5+, Flkl+nporeHHTopbi. (сердечные, гладкомышечные, эндотелиальные клетки) [Moretti et al., 2006]

Kapduo-сферы [Messina et al., 2004] c-kit; Sca-1; MDR CD34; lineage Ю4 -4*105 клеток/кусоче к ткани GATA4 Ко-культивирование с неонатальными кардиомиоцитами крыс; экстремально низкочастотные электромагнитные поля (+) Тропонин 1, а- тяжелые цепи миозина (+)эндотелиальные белки (von Willebrand) (+) спонтанные сокращения Да (сердечные миоциты, клетки сосудов)

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Выделение и культивирование клеток миокарда крыс

В работе использовали крыс линии Wistar разного возраста: новорожденных (1-3 дня), 20- и 40- дневных, усыпленных ингаляцией С02, согласно международным правилам работы с животными. При ферментативном разрушении сердечной мышцы использовали метод Лэма с соавт. [Lam et al., 2002] в нашей модификации [Белостоцкая и др., 2006]. Выделенные сердца промывали в растворе Рингера (мМ: 146 NaCl, 5 КС1, 2 СаС12, 1 MgCl2, 11 глюкозы, 10 HEPES, рН 7,4), измельчали и инкубировали в этом же растворе с добавлением коллагеназы IA типа (1 мг/мл, Sigma) и трипсина (0,12%, Биолот, Россия) в течение 20-30 мин при температуре 37 °С. Полученную суспензию отстаивали в течение 1-2 мин для осаждения неразрушенных кусочков ткани. Супернатант осаждали на центрифуге при 1500 об/мин в течение 10 мин. Клетки переносили в теплую питательную среду DMEM с 10% сыворотки эмбрионов коров (Биолот, Россия) с добавлением 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Биолот, Россия). Для очистки популяции клеток от примеси немышечных клеток полученную суспензию преинкубировали в стеклянных чашках Петри в течение 30-40 мин. Клетки выращивали в 40 мм чашках Петри (Медполимер, Россия) на двух полосках покровного стекла (12x24 мм), предварительно покрытых слоем поли-Д-лизина в концентрации 0,1 мг/мл (Эпидбиомед, Россия). Рассев производили в концентрации МО5 кл/мл. Культивирование осуществляли в среде DMEM того же состава. Инкубацию проводили в С02-инкубаторе при 5% С02, влажности 95% и температуре 37 °С. Питательную среду меняли дважды в неделю.

С целью получения культуры свежевыделенных кардиомиоцитов применяли свойство избирательной адгезии крупных зрелых кардиомиоцитов к поли-Д-лизину [Маленьких и др., 2006]. Для этого после ферментативного разрушения сердечной мышцы и центрифугирования осадок с клетками

54

миокарда ресуспеизировали в растворе Рингера и наносили на 5 мин на полоски покровных стекол (12x24 мм), предварительно покрытых поли-Д-лизином (0,1 мг/мл, Эпидбиомед, Россия) или 0,1% желатином (Биолот, Россия). Неприкрепившиеся мелкие кардиомиоциты и примесные немышечные клетки удаляли, а оставшиеся на стеклах кардиомиоциты инкубировали в растворе Рингера при комнатной температуре в течение 1 ч.

Для построения кривой роста клетки выращивали в 24-луночных планшетах (Costar, США) в 0,5 мл питательной среды. Каждый день в камере Фукса-Розенталя подсчитывали количество клеток в лунках, снимая их с поверхности смесью трипсин (0,25%, Биолот, Россия)/версен (0,03%, Биолот, Россия) в соотношении 1:3. Данные четырех экспериментов с тремя повторами в каждом усредняли.

Способность сердечных клеток к делению оценивали по митотическому индексу (МИ, отношение числа митотических ядер к интерфазным) и накоплению митотических клеток в присутствии колхицина (Кх, Serva). Колхицин разрушает веретено деления и блокирует делящиеся клетки в метафазе митоза. Кх в коцентрации 0,05 мкг/мл добавляли в очередные три лунки планшета с клетками на 24 часа. За это время все пролиферирующие клетки, вступившие в митоз, округлялись и отрывались от монослоя неделящихся клеток. Долю к-митозов определяли на микроизображениях (инвертированный микроскоп PIM-III (WPI, США)) путем подсчета числа плавающих клеток к прикрепленным. МИ и долю многоядерных клеток определяли на окрашенных гематоксилином препаратах путем подсчета 1000 клеток на каждый срок фиксации с использованием тринокулярного светового микроскопа Н 605Т (WPI, США). Клетки выращивали на покровных стеклах и ежедневно фиксировали смесью ледяной уксусной кислоты и спирта (1:3).

Кинетику изменений и морфологию клеток прослеживали путем прижизненного микрофотографирования растущей популяции в чашках Петри на инвертированном микроскопе PIM-III (WPI, США) с использованием

цифровой камеры Leica DFC300 FX (Германия) и аналоговой камеры Panasonic WV-CL920/G (Япония) или на фиксированных смесью ледяной уксусной кислоты и спирта (1:3) и окрашенных гематоксилином препаратах на тринокулярном микроскопе Н605Т (WPI, США). Морфометрические параметры клеток определяли на микроизображениях клеток, снятых с поверхности смесью трипсин/версен (1:3), с помощью программы ВидеоТестМорфология (ВидеоТест, Россия). Объем клеток вычисляли по формуле: V=3,14/6 d2-D, где d - малый диаметр (ширина), a D - большой диаметр клетки (длина).

Видеоролики сокращающихся колоний кардиомиоцитов получали с помощью цифровой камеры Leica DFC300 FX (Германия) и инвертированного микроскопа PIM-III (WPI, США) с объективом х40.

Статистическую обработку результатов (кривая роста, кривая нарастания объема клеток миокарда) производили в программах Microsoft Excel 7.0 и SPSS Statistics. Для оценки значимости полученных результатов применяли регрессионный анализ. Статистические решения принимались на 5%-ном уровне значимости. Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± стандартная ошибка.

2.2. Определение [Ca2+]j в культивируемых клетках миокарда крыс

Регистрацию [Ca ]; осуществляли с помощью компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, США), состоящей из инвертированного микроскопа Nikon TMS (хЗО) с монохромной цифровой видеокамерой RS-170 CCD (Cohu), компьютера и программного обеспечения. Возбуждение образца проводили при 340 и 380 нм, а эмиссию регистрировали при 510 нм. Фура, связанная с ионами Ca , имеет максимум флуоресценции при 340 нм, а свободная Фура - при 360380 нм (рис. 4). Программа InCytIm2™ рассчитывала концентрацию ионов кальция по методу Гринкевич с соавт. [Grynkiewicz et al., 1985] как

Длина волны, нм

Рис. 4. Спектры возбуждения Фура-2 (0,5 мкМ) в отсутствие свободного Са2+ и при концентрации Са2+ 1мМ [Grynkiewicz et al., 1985].

соотношение интенсивностей флуоресценции (F34o/F38o) с учетом калибровочной кривой. В опытах по измерению [Са2+], применяли раствор Рингера (мМ): 146 NaCl, 5 КС1, 2 СаС12, 1 MgCl2, 11 глюкозы, 10 HEPES, рН 7,4, а также бескальциевый раствор Рингера - тот же раствор, но без ионов кальция с добавлением хелатора Са2+ - ЭГТА в концентрации 1 мМ. В качестве раствора с высокой концентрацией К+ применяли раствор Рингера с содержанием 120 мМ КС1 и 26 мМ NaCl.

Использование Са -чувствительного флуоресцентного зонда Фура-2АМ позволяет измерять внутриклеточную концентрацию ионов Са2+ [Grynkiewicz et al., 1985]. Для измерения [Са2+]} стекла с клетками инкубировали в растворе Рингера с флуоресцентным красителем Фура-2АМ (Sigma) в концентрации 10 мкМ в течение 1 ч при 26 °С. Затем клетки ополаскивали в растворе Рингера и хранили в свежем буфере до измерения. Эксперименты проводили при комнатной температуре на покровных стеклах, размещенных непосредственно над объективом инвертированного микроскопа в установке по анализу ионов. Для предотвращения высыхания клеток на поверхность покровного стекла наносился раствор Рингера, образующий мениск. При проведении

эксперимента раствор Рингера удалялся с помощью перистальтического насоса, и на его место вводился раствор с соответствующим агентом в объеме 250 мкл, который затем отмывался с помощью свежего раствора Рингера.

Принцип построения кривой изменения [Са2 ], можно понять из рис. 5. Красная кривая отражает динамику изменения концентрации Фура-2АМ, связанной с Са2 . Голубая кривая показывает изменение концентрации свободной Фура-2АМ. Зеленая кривая построена программой InCytIm2lv1 и демонстрирует динамику изменения [Са2 ]j в ответ на воздействия (в данном случае на 4-хлор-м-крезол в концентрации 2 мМ). Видно, что возрастание концентрации Фура-2АМ, связанной с Са~~, отражает повышение [Са" ];, при этом концентрация свободной Фура-2АМ падает.

Время, с

Рис. 5. Кривые изменения концентрации [Са2>], (1, зеленая кривая), Фура-2АМ, связанной с Са" (2, красная кривая) и свободной Фура-2АМ (3, голубая кривая).

Уровень дифференцировки кардиомиоцитов в составе формирующихся в первичной культуре колоний и функциональное состояние зрелых кардиомиоцитов в опытах по моделированию окислительного стресса определяли по способности рецепторов наружной мембраны и саркоилазматического ретикулума (СР) отвечать повышением [Са2']; на

действие соответствующих агентов. Были использованы: АТФ (Sigma), агонист пуринэргических рецепторов в концентрации 180 мкМ; ацетилхолин (АцХ, Sigma) - лиганд АцХ рецепторов в концентрации 20 мкМ; кофеин (Кф, Sigma) и 4-хлор-м-крезол (4-ХмК, Sigma), активаторы рианодиновых рецепторов (РиР) CP, в концентрациях 5 мМ и 2 мМ, соответственно; изопротеренол (Изо, Sigma), агонист (З-адренорецепторов в концентрации 10 мкМ и раствор Рингера с повышенным содержанием К (120 мМ) в качестве деполяризующего агента.

2.3. Иммуноцитохимическое выявление стволовых клеток и клеток-

предшественников в культуре

Для выявления пролиферирующих резидентных ПК и СК клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали с помощью параформальдегида (2,5-4%), пермеабилизировали (10 мин; фосфатный буферный раствор, 0,25% Тритон Х-100), блокировали сайты неспецифического связывания антител (30 мин; 1% бычий сывороточный альбумин, приготовленный на основе фосфатного буферного раствора с 0,25% Тритон Х-100) и применяли два варианта иммуноцитохимического окрашивания.

При первом варианте ПК и СК метили с помощью первичных антител к антигенам СК и ПК: мышиные анти-c-kit моноклональные антитела (Invitrogen, 5 мкг/мл), мышиные анти-Sca-l поликлональные антитела (Abeam, 1:100) и кроличьи моноклональные анти-isll антитела (Abeam, 1:100). В качестве маркера зрелых миоцитов использовали кроличьи анти-ОАТА4 поликлональные антитела (Abeam, 1:500). Затем следовала инкубация клеток смесью вторичных антител: козьи антимышиные фикоэритрин-конъюгированные антитела (Invitrogen, 1:100), козьи антимышиные конъюгированные с F1TC антитела (Abeam, 1:100) и ослиные антикроличьи FlTC-конъюгированные антитела (Abeam, 1:100). Для подавления

аутофлуоресценции клетки окрашивали в течение 5 мин кристаллическим фиолетовым в концентрации 2 мг/мл.

При втором варианте иммуноокрашивания применяли Zenon-технологию, которая представляет собой быстрый (в течение 5 мин), универсальный и надежный способ получения конъюгата первичного антитела с флуоресцентной меткой (Zenon-kit). Для окраски использовали первичные мышиные моноклональные антитела к Isll (Abeam, 5 мкг/мл) и Sea (Abeam, 12,5 мкг/мл) антигенам, конъюгированные согласно Zenon-технологии либо с Alexa 405 (Tnvitrogen), либо с Alexa 594 (Invitrogen). Для выявления c-kif CK применяли коммерческие антитела, конъюгированные с F1TC (Abeam, 1:70). Актиновый цитоскелет зрелых кардиомиоцитов метили Родамин-Фаллоидином (Sigma, 10 мкг/мл).

Идентификацию клеток проводили па флуоресцентном микроскопе PFM (WP1, США), об.хЮО (масл.) и конфокальных микроскопах Leica TCS SP5 (Германия), об.х40 (масл.), Leica TCS SL (Германия), об.хбЗ (масл.), Leica SP5 (Германия), об.хбО (масл.).

2.4. Моделирование окислительного стресса in vitro и оценка активности

антиоксидантных препаратов

В основу создания модели окислительного стресса положены известные сведения о повышении внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция под влиянием свободнорадикальных процессов при действии пероксида водорода (Н202) [Hofgaard et al., 2006; Пухтеева и др., 2006]. Модель окислительного стресса, которая имитирует процесс образования свободных радикалов во время ишемии и последующей реперфузии, создавали с помощью Н202 в концентрациях 10'J-10"8 M.

В работе изучали защитное действие известного биоантиоксиданта гистохрома (2,5-10°- 2,5-10""'%; эхинохром-2,3,5,7,8-пентагидрокси-б-этил-1,4-нафтахинон, 2%, ТИБХ, Россия), являющегося "перехватчиком" свободных

радикалов [Закирова и др., 1997], синтетического антиоксиданта феноксана

I 8

(10" -10" М; 3,5-ди-трет.бутил-4-оксифенилпропионат калия) [Мищенко и др., 2002] и синтезированной макромолекулярной системы с антиоксидантными свойствами (МСАО) на основе декстрана и феноксана (10~4-10~8 М) [Арефьев и др., 2007] на [Са2 ]¡, в условиях окислительного стресса. Феноксан и МСАО (Д+Ф) также относятся к разряду "перехватчиков" свободных радикалов.

Феноксан из группы фенозанов, синтезированный в ИХФ РАН, является водорастворимым производным ионола и активно используется как корректор оксидантных патологий в живых биологических системах (рис. 6).

Макромолекулярные системы с антиоксидантными свойствами были разработаны для предупреждения повреждающего действия АКР на химическом факультете СПбГУ [Домнина и др., 2005]. Структура вновь синтезированной МСАО на основе гидроксилсодержащего гидрофильного полимера - декстрана (мол. масса 40000) с присоединенным фрагментом

ho^QWCH2CH2COOK

Феноксан МСАО (Д+Ф)

Рис. 6. Структуры синтетического антиоксиданта феноксана [Мищенко и др., 2002] и МСАО на основе гидроксилсодержащего гидрофильного полимера -декстрана (Д) с присоединенным фрагментом феноксана (Ф) [Арефьев и др., 2007].

антиоксиданта феноксана представлена на рис. 6.

При статистической обработке результатов усредняли данные каждого эксперимента среди находящихся в поле зрения микроскопа клеток, а также данные нескольких повторов и различных экспериментов с одинаковыми условиями проведения. Математический анализ данных проводился с использованием линейного регрессионного анализа. Концентрации кальция в клетках в отдельные моменты времени сравнивались между собой с использованием критерия Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни. Помимо этого, использовался смешанный дисперсионный анализ кривых изменения [Са2+]; со временем совместного воздействия МСАО (Д+Ф) в диапазоне концентраций

6 8 4

10" - 10"' М с пероксидом водорода (10" М). Анализировались специфические эффекты (парные сравнения между градациями одного фактора при фиксированных значениях второго). В экспериментах по тестированию феноксана также применялся линейный регрессионный анализ. Статистические решения принимались на 5%-ном уровне значимости. Полученные величины представлены как среднее ± стандартная ошибка (М ± ш).

2.5. Получение апоптозных тел в первичной культуре клеток миокарда

крыс

Модель сокращающихся кардиомиоцитов была использована в пилотных экспериментах для проверки гипотезы о возможном стимулирующем влиянии апоптозных тел на процессы формирования зрелых сокращающихся кардиомиоцитов из резидентных СК и ПК. Апоптозные тела в первичной культуре клеток миокарда новорожденных крыс были получены согласно методу Христов с соавт. [Hristov et al., 2004J в нашей модификации. На четвертый день культивирования производили смену среды. DMEM с % сыворотки эмбрионов коров (Биолот, Россия) заменяли на DMEM без сыворотки, что стимулировало образование апоптозных тел уже через 24 часа.

Среду с апоптозными телами очищали от мертвых клеток и их фрагментов путем центрифугирования (800 g, 10 мин). Супернатант повторно центрифугировали при 16 ООО g в течение 20 мин, что давало возможность получить концентрированную суспензию апоптозных тел. В диссертации использовали апоптозные тела, нормированные по белку в концентрации 0,1 мкг/мл. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта при длине волны 595 нм на спектрофотометре SmartSpec Plus (Bio-Rad, США).

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфофункциональные характеристики культивируемых кардиомиоцитов новорожденных крыс

Изучение пролиферации и дифференцировки кардиомиоцитов крыс в культуре позволило выявить ряд интересных результатов. На рис. 7 представлены микрофотографии клеток, выделенных из сердца новорожденных крыс, в различные сроки после посева и последующего культивирования. Видно, что со временем увеличивается как количество клеток, так и их размер.

Кривая роста, представленная на рис. 8, показывает кинетику изменения количества клеток в первые пять суток в первичной культуре.

Рис. 7. Микрофотографии клеток миокарда новорожденных крыс в первичной культуре в различные сроки in vitro: а) 1-е (следующий день после посева); б) 3-е; в) 6-е; г) 8-е сутки культивирования. Камера Leica DFC300 FX, тринокулярный микроскоп Н605Т (WPI, США), об.х40.

Видно, что за четыре дня культивирования количество клеток увеличивается более чем в 4 раза.

2 о

Ё 6 ч

* « ,

о 4» 4 м -

« н « о 2

о

1 2 3 4 5 Время культивирования, сут

Рис. 8. Нарастание количества клеток в первичной культуре кардиомиоцитов новорожденных крыс. Значимость нарастания р=0,023.

Данные по накоплению к-митозов (рис. 9, а) демонстрируют всплеск митотической активности со второго по четвертый дни культивирования. Доля клеток, остановленных в метафазе с помощью Кх, достигала 20-23% ежедневно. Затем количество митотических клеток снижалось и держалось на уровне 6-7% в последующие дни наблюдения (7-8-е сутки). Таким образом, было установлено, что суммарно около 70% клеток сердца вступало в деление на протяжении первых 2-5 суток развития in vitro, а МИ в этот период колебался в диапазоне от 1,6 до 0,4 % (табл. 2). При этом митотическое деление на стадиях профазы, метафазы и анафазы регистрировалось не только в первые пять дней развития клеток миокарда в

со 25

о -л 20 -

с

Н 15

1 10

X

Я 5

ч

о 0 -

а

^ л

о 4

5!

Заключение диссертации по теме «Физиология», Голованова, Татьяна Александровна

выводы

1. Показано, что в первичной культуре сердечных клеток новорожденных крыс имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии клеток миокарда, происходящие в интактном сердце млекопитающих в первые дни после рождения. Переход от гиперплазии к гипертрофии происходит на четвертые-пятые сутки in vitro. Количество делящихся клеток достигает 60-70%. Объем гипертрофированных кардиомиоцитов на шестые сутки in vitro составляет 3246±190 мкм3.

2. Выявлено образование незначительного количества колоний (1-2 клона на 100 тыс. клеток) в культуре клеток неонатального миокарда, которые увеличиваются в размерах и приобретают способность к сокращению. Установлено, что колонии образованы резидентными стволовыми клетками c-kit+- и 8са+-типов и предшественниками кардиомиоцитов Ы1+-типа, различающимися по морфологии и срокам кардиодифференцировки.

3. Показано, что в течение трех недель в клетках колоний формируется электромеханическое сопряжение с типичным для клеток миокарда Са2+-зависимым выходом Са2+ из саркоплазматического ретикулума. Представлено доказательство полной кардиомиогенной дифференцировки резидентных стволовых клеток сердца при ко-культивировании со зрелыми кардиомиоцитами.

4. Стволовые клетки и клетки-предшественники (c-kit+, Sca+, Isll+) кардиомиоцитов сердца 20- и 40- дневных крыс сохраняют способность к пролиферации и образуют колонии, не проявляющие сократительной активности in vitro.

5. Создана клеточная модель регенерационного кардиомиогенеза, позволяющая изучать все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных стволовых клеток.

6. На модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов выявлена значительная антиоксидантная активность макромолекулярной системы, синтезированной на основе декстрана и феноксана.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время актуальной проблемой является разработка клеточных моделей миокарда, позволяющих изучать процессы регенерации поврежденного сердца. Одной из причин низкого регенеративного потенциала миокарда является то, что кардиомиоциты постнатального сердца не способны к делению. Наши исследования, проведенные на первичной культуре клеток миокарда неонатальных крыс линии Wistar, показали, что в культуре имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии кардиомиоцитов, происходящие в интактном сердце в первые дни после рождения млекопитающих. Основная популяция клеток неонатального сердца in vitro представлена зрелыми кардиомиоцитами, способными к сокращению. Подобно ситуации в организме, в течение первых трех-пяти дней они претерпевают однократное деление, после чего окончательно теряют способность к пролиферации. На четвертые-пятые сутки в культуре наблюдается процесс перехода от гиперплазии к гипертрофии с формированием полиплоидных или многоядерных кардиомиоцитов. Таким образом, наблюдаемое сходство с ситуацией in vivo позволяет рассматривать первичную культуру клеток миокарда новорожденных крыс в качестве адекватной модели для решения проблемы прекращения пролиферации кардиомиоцитов в постнатальном периоде.

Неспособность клеток взрослого миокарда к делению приводит к формированию быстрого фиброзного ответа в зоне повреждения сердца у млекопитающих. В связи с этим ведется активный поиск сердечных стволовых клеток, способных стать источником образования новых кардиомиоцитов при регенерации мышцы. В нашей работе в первичной культуре клеток миокарда крыс на фоне гипертрофии основной популяции кардиомиоцитов, впервые было выявлено присутствие незначительного количества мелких клеток, способных к пролиферации. Пройдя несколько

118 циклов митотического деления, они формируют колонии (потомки одной клетки). Данные иммуноцитохимии показали, что популяция колониеобразующих клеток представлена клетками трех типов: резидентными стволовыми клетками c-kit+- и 8са+-типов и Isll+ кардиопредшественниками. Установлено, что резидентные стволовые клетки и кардиопредшественники, в первую очередь клетки Isll+- типа, формируют колонии, клетки которых при ко-культивировании со зрелыми кардиомиоцитами миокарда вступают на путь спонтанной кардиодифференцировки, приобретая способность к сокращениям с частотой, доходящей до 60 уд/мин. Кардиодифференцировка сопровождается формированием электромеханического сопряжения, типичного для клеток миокарда. На основании приведенных данных мы заключаем, что в ходе работы получена клеточная модель, которая представляет собой модель регенерационного кардиомиогенеза от незрелой клетки-предшественника до функционально активных кардиомиоцитов и позволяет изучать все этапы пролиферации и дифференцировки резидентных сердечных стволовых клеток.

Известно, что регенеративный потенциал сердца млекопитающих изменяется с возрастом. В связи с этим мы провели серию экспериментов на культуре клеток миокарда 20- и 40-дневных крыс. Показано, что миокард взрослых крыс также содержит резидентные стволовые клетки и кардиопредшественники выше обозначенных типов, которые сходным образом формируют клоны разного размера. Однако, несмотря на активную пролиферацию стволовых клеток, было установлено, что в культуре затруднен процесс их дифференцировки с формированием электромеханического сопряжения и появления сокращающихся колоний.

Патогенные и адаптивные изменения в сердце протекают и при ишемии и реперфузии миокарда, когда происходит массированное образование активных форм кислорода. Сейчас разрабатываются новые лекарственные препараты, способные защитить клетки миокарда от действия

119 окислительного стресса. На in vitro модели зрелых кардиомиоцитов неонатальных крыс нами была разработана клеточная тест-система для скрининга антиоксидантных лекарственных препаратов. В основу создания этой модели положены известные сведения о повышении [Ca2+]i под влиянием свободнорадикальных процессов при действии пероксида водорода (Н202) [Долгих, 2005; Ескунов, 2005]. Модель окислительного стресса позволила оценить антиоксидантное действие как известных антиоксидантов (гистохром и феноксан), так и вновь синтезированной макромолекулярной системы с антиоксидантными свойствами на основе декстрана и феноксана -МСАО (Д+Ф). Результаты показывают, что гистохром оказывает защитный эффект в первые 10-20 минут окислительного стресса (Н202, 3-10"4М). Для МСАО (Д+Ф) было установлено, что ее антиоксидантное действие на один-два порядка выше, чем у ее аналога феноксана: 10" М против 10'5-10"6 М, соответственно. Сравнение действия МСАО (Д+Ф) с другим антиоксидантом гистохромом выявило более длительное защитное действие гибридных макромолекул в условиях окислительного стресса. В нашей системе с помощью МСАО (Д+Ф) удавалось удерживать уровень кальция в течение 1 часа, что в три раза превышает продолжительность протекторного действия гистохрома.

Таким образом, в ходе выполнения работы созданы две клеточные модели: модель зрелых кардиомиоцитов и модель регенерационного кардиомиогенеза от резидентной клетки-предшественника до колоний сокращающихся кардиомиоцитов. Была показана адекватность применения модели зрелых кардиомиоцитов в исследованиях в качестве тест-системы для скрининга антиоксидантных препаратов, а модели регенерационного кардиомиогенеза - для изучения физиологии резидентных сердечных стволовых клеток и клеток-предшественников, а также возможности влияния на эти процессы различных физических факторов, естественных физиологических или биохимических модуляторов (апоптоз, продукты апоптоза).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Голованова, Татьяна Александровна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арефьев Д.В., Белостоцкая И.С., Вольева Н.С., Домнина Н.Л., Комиссарова Н.Л., Сергеева О.Ю., Хрусталева P.C. Гибридные макромолекулярные антиоксиданты на основе гидрофильных полимеров и пространственно-затрудненных фенолов // Известия Академии наук. Серия химическая. 2007. Т. 4. С. 751-760.

2. Белостоцкая Г.Б., Дарашина И.В., Голованова Т.А., Хрусталева P.C., Цырлин В.А. Оценка функционального состояния свежевыделенных кардиомиоцитов крыс в условиях окислительного стресса // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2008. Т. 26, № 2. С. 85-92.

3. Белостоцкая Г.Б., Захаров Е.А., Голованова Т.А. Пролиферация и дифференцировка кардиомиоцитов крысы в культуре // Цитология. 2006. Т. 48, № 9. С. 743-744.

4. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов: молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения. М: «Медицина», 1989. с. 368.

5. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М: Наука, 1981. с. 276.

6. Гебхард М.М., Бретшнейдер Х.Ю., Прюссе К.Ю. (Gebxard М.М., Bretschneider H.J., Preusse C.J.) Кардиоплегия // Физиология и патофизиология сердца: В 2 т. Т.2: Пер. с англ./ Под ред. Н. Сперелакиса: 2-е изд., исправленное. -М.: Медицина, 1990, 624 с. С. 292 -307.

7. Долгих В.Т. Патогенетическая значимость перегрузки кардиомиоцитов Са2+ в развитии постреанимационной недостаточности сердца // Кардиология. 2005. Т. 3, № 17. С. 7-13.

8. Домнина Н.С., Хрусталева P.C., Сергеева О.Ю., Комарова Е.А.,

Арефьев Д.В., Цырлин В.А. Водорастворимый полимерный

антиоксидант, плазмозаменитель с антиокислительной и

122

антирадикальной активностью (варианты) и способ поддержания уровня артериального давления и процессов антиоксидантной защиты в организме при острой кровопотере. Патент РФ № 2273483, 2005, приоритет от 06.05.2004.

9. Ескунов П.Н. Возможности коррекции постишемических реперфузионных изменений миокарда крыс с помощью финоптина // Бюлл. СО РАМН. 2005. Т.З, № 117. С. 87-90.

10. Закирова А.Н., Иванова М.В., Голубятников В.Б., Мищенко Н.П., Кольцова Е.А., Федореев С.А., Красновид Н.И., Лебедев A.B. Фармакокинетика и клиническая эффективность гистохрома у больных острым инфарктом миокарда // Эксперим. и клинич. фармакол. 1997. Т. 60. С. 21-24.

11. Зенков Н.К. Окислительный стресс. / ред. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Мещникова У.Б. //МАИК "Наука-Интерпериодика", 2001. с. 343.

12. Ирисава X., Нома А., Кокубун С., Курачи Ю. (Irisawa Н., Noma А., Kokubun S., Kurachi Y.) Электрогенез пейсмекерного потенциала в атриовентрикулярном узле // Физиология и патофизиология сердца:Пер. с англ./Под ред. Н. Сперелакиса: В 2 т. Т. 1.- М.: Медицина, 1988, 624 с. С. 150-165.

13. Круглякова К.Е. Общие представления о механизме действия антиоксидантов // Сб. научн. статей: Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. 1992. С. 27-32.

14. Крутецкая З.И., Лебедев О. Е. Механизмы Са2+ сигнализации в клетках //Цитология. 2001. Т. 43, № 1. С. 5-32.

15. Литвицкий П.Ф., Сандриков В.А., Демуров Е.А. Адаптивные и патогенные эффекты реперфузии и реоксигенации миокарда. М.: Медицина, 1994. с.320.

16. Маленьких Ю.В., Левина Г.Е., Николаенко Н.С., Пинаев Г.П. Выделение фракции клеток с наиболее выраженной способностью к

кардиомиоцитарной дифференцировке путем их избирательной адгезии к подложке // Цитология. 2006. Т. 48, № 9. С. 779.

17. Марков В.А., Максимов И.В., Репин А.Н., Варваренко В.И., Луста И.В., Буймов Г.А., Перчаткин В.А. Влияние нового водорастворимого биоантиоксиданта гистохрома на реперфузионное повреждение при тромболизисе у больных в острой стадии инфаркта миокарда .// Кардиология. 1999. № 12. С. 20-23.

18. Мещникова Е.Б., Зенков Н.К., Сафина А.Ф. Окислительный стресс при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда // Успехи соврем, биологии. 1997. Т. 117, № 3. С. 362-373.

19. Мищенко Д.В., Котельникова P.A., Богданов Г.Н. Метод триплетных зондов в исследовании микровязкости биологических мембран при механоакустических воздействиях // Материалы IX Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем'2002». Т. 2. 25-28.06.2002, Яльчик, Россия. Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2002. № 11. С. 25.

20. Попов A.B. Введение в клеточную биологию стволовых клеток: учебно-методическое пособие /Б.В. Попов. - СПб.: СпецЛит, 2010. 319 с.

21. Прошева В.И. Функциональная специфичность пейсмекерной системы сердца // Успехи физиол. наук. 1998. Т. 29, № 3. С. 31-34.

22. Пухтеева И.В., Прокопенко Н.В., Герасимович Н.В. Действие пероксида водорода на внутриклеточное содержание ионов кальция в тимоцитах крыс // Изв. Нац. АН Беларуси, Серия Биол. Наук. 2006. № 3. С. 81-85.

23. Рубина К.А., Мелихова B.C., Парфенова Е.В. Резидентные клетки-предшественники в сердце и регенерация миокарда // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. T. II, № 1. С. 29-35.

24. Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессе репродукции, дифференцировки и регенерации. Л.: Наука, 1982. с. 288.

25. Смолянинов А.Б. Клеточные и генные технологии в кардиологии. -СПб: СпецЛит, 2009. с. 175.

2+

26. Сперелакис Н. Медленные каналы и их роль в поступлении ионов Ca // Физиология и патофизиология сердца: Пер. с англ./Под ред. Н. Сперелакиса: В 2 т. Т. 1.- М.: Медицина, 1988, 624 с. С. 241-277.

27. Тюкавин А.И., Белостоцкая Г.Б., Галагудза М.М., Голованова Т.А., Захаров Е.А., Буркова Н.В., Ивкин Д.Ю. Влияние продуктов апоптоза на клетки-предшественники кардиомиоцитов и сократимость миокарда // Научные труды III Съезда физиологов СНГ / ред. Григорьева А.И. [и др.], М.: Медицина-Здоровье, 2011. С. 336.

28. Тюкавин А.И., Венков A.A., Кузнецов A.C., Петрищев H.H., Двалишвили М.Ю., Мчедлидзе Г.Ш., Бубнов В.А. Когерентное излучение как модулятор программированной гибели клеток // Медицинский академический журнал. 2005. Т. 5, № 3. С. 44-51.

29. Ферранс В.Дж. (Ferrans V.J.) Влияние токсических веществ на миокард // Физиология и патофизиология сердца: В 2 т. Т.2: Пер. с англ./ Под ред. Н. Сперелакиса: 2-е изд., исправленное. - М.: Медицина, 1990, 624 с. С. 338-365.

30. Форбс М.С., Сперелакис Н. (Forbes M.S., Sperelakis N.) Ультраструктура миокарда млекопитающих // Физиология и патофизиология сердца:Пер. с англ./Под ред. Н. Сперелакиса: В 2 т. Т. 1.- М.: Медицина, 1988, 624 с. С. 15-66.

31. Хитров Н.К., Пауков B.C. Адаптация сердца к гипоксии. - М: Медицина, 1991.-240 с.

32. Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Родоначальная кроветворная клетка и ее дифференцировка // Успехи современной биологии. 1966. Т. 52, №1(4). С.97-114.

33. Шубникова Е.А., Юрина H.A., Гусев Н.Б., Балезина О.П., Большакова Г.Б. Мышечные ткани. М.: «Медицина», 2001. с. 240.

34. Ahuja P., Perriard E., Perriard J.C., Ehler E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes // J. Cell Sci. 2004. Vol. 117. P. 3295 - 3306.

35. Andersen D.C., Andersen P., Schneider M., Jensen H.B., Sheikh S.P.

Murine "Cardiospheres" are not a source of stem cells with cardiomyogenic potential // Stem Cells. 2009. Vol. 27. P. 1571-1581.

36. Anversa P., Kajstura J., Leri A., Bolli R. Life and Death of Cardiac Stem Cells. A Paradigm Shift in Cardiac Biology // Circulation. 2006. Vol. 113. P. 1451-1463.

37. Anversa P., Leri A., Kajstura J. Cardiac regeneration // J. Am. Coll. Cardiol. 2006. Vol. 9, No 47. P. 1769-1776.

38. Asai Y., Tada M., Otsuji T.G., Nakatsuji N. Combination of functional cardiomyocytes derived from human stem cells and a highly-efficient microelectrode array system: an ideal hybrid model assay for drug development // Curr. Stem Cell Res. Ther. 2010. Vol. 5, No3. P. 227-232.

39. Ausoni S., Sartore S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration // J. Cell Biol. 2009. Vol. 184, No 3. P. 357-364.

40. Bader D., Oberpriller J. Autoradiographic and electron microscopic studies of minced cardiac muscle regeneration in the adult newt, notophthalmus viridescens // J. Exp. Zool. 1979. Vol. 208, No 2. P. 177-193.

41. Barzelay A., Ben-Shoshan J., Entin-Meer M., Maysel-Auslender S., Afek A., Barshack I., Keren G., George J. A potential role for islet-1 in postnatal angiogenesis and vasculogenesis // Thrombosis and Haemostasis. 2010. Vol. 103, No l.P. 188-197.

42. Bearzi C, Rota M, Hosoda T, Tillmanns J, Nascimbene A, De Angelis A, Yasuzawa-Amano S, Trofimova I, Siggins RW, Lecapitaine N, Cascapera S, Beltrami AP, D'Alessandro DA, Zias E, Quaini F, Urbanek K, Michler R, Bolli R, Kajstura J, Leri A, Anversa P. Human cardiac stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 2007. Vol. 104, No 35. P. 14068-14073.

126

43. Bean B.P. Two kinds of calcium channels in canine atrial cells. Differences in kinetics, selectivity, and pharmacology // J. Gen. Physiol. 1985. Vol. 86. P. 1-30.

44. Behfar A., Crespo-Diaz R., Nelson T., Terzic A., Gersh B. Stem Cells: Clinical Trials Results The End of the Beginning o the Beginning of the End? // Cardiovasc. Haematol. Disord. Drug Targets. 2010. Vol. 10, No 3. P. 186201.

45. Beltrami A.P., Urbanek K., Kajstura J., Yan S., Finato N., Bussani R., Nadal-Ginard B., Silvestri F., Leri A., Beltrami C., Anversa P. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction // N. Engl. J. Med. 2001. Vol. 344. P. 1750-1757.

46. Beltrami A.P., Barlucchi L., Torella D., Baker M., Limana F., Chimenti S., Kasahara H., Rota M., Musso E., Urbanek K., Leri A., Kajstura J., Nadal-Ginard B., Anversa P. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. 2003. Vol. 114. P. 763-776.

47. Beltrami A.P., Cesselli D., Beltrami C.A. At the stem of youth and health // Pharmacol. Ther. 2011. Vol. 129, No 1. P. 3 - 20.

48. Berridge M.J., Boatman M.D., LiP P. Calcium a life and death signal // Nature. 1998. Vol. 395. P. 645-648.

49. Bers D.M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. Dordrecht/Boston/London: Kluwer academic publishers, 2001. p. 427.

50. Bers D.M., Guo T. Calcium signaling in cardiac ventricular myocytes // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005. Vol. 1047. P. 86-98.

51. Bettencourt-Dias M., Mittnacht S., Brockes J. Heterogeneous proliferative potential in regenerative adult newt cardiomyocytes // J. Cell. Sci. 2003. Vol. 116(Ptl9). P. 4001-4009.

52. Bhatwadekar A.D., Glenn J.V., Curtis T.M., Grant M.B., Stitt A.W., Gardiner T.A. Retinal endothelial cell apoptosis stimulates recruitment of endothelial progenitor cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009. Vol. 50, No 10. P. 4967-4973.

53. Bicknell K., Coxon K., Brooks G. Can the eardiomyocyte cell cycle be reprogrammed? // J. Mol. Cell Cardiol. 2007. Vol. 42. P. 706-721.

54. Blewett C.J., Cilley R.E., Ehrlich H.P., Blackburn II J.H., Dillon P.W., Krummel T.M. Regenerative healing of incisional wounds in midgestational murine hearts in organ culture// J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1997. Vol. 113. P. 880-885.

55. Borchardt T., Braun T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems:What are the differences between newts and man? // Thromb. Haemost. 2007. Vol. 98. P. 311-318.

56. Brooks G., Poolman R.A., Li J.M. Arresting developments in the cardiac myocyte cell cycle: role of cyclin-dependent kinase inhibitors // Cardiovasc. Res. 1998. Vol. 39, No 2. P. 301-311.

57. Brooks G., Poolman R.A., McGill C.J., Li J.M. Expression and activities of cyclins and cyclin-dependent kinases in developing rat ventricular myocytes // J. Mol. Cell. Cardiol. 1997. Vol. 29, No 8. P. 2261-2271.

58. Buckingham M., Meilhac S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells // Nat. Rev. Genet. 2005. Vol. 6. P. 826835.

59. Cai Ch., Liang X., Shi Y., Chu P., Pfaff S., Ju Chen, Evans S. Isll Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart // Developmental Cell. 2003. Vol. 5. P. 877-889.

60. Cannell M. B., Cheng H., Lederer W. J. The control of Ca2+ release in heart muscle // Science. 1995. Vol. 268. P. 1045-1049.

61. Carafoli E., Chiesi M., Gazzotti P. Membrane carriers related to intracellular calcium regulation // Hypertension: Pathophysiology Diagnosis and Management / Laragh J.H., Brenner B.M. (eds): 2nd edition. 2 vol. Vol. l.-New York: Raven Press, 1995. 3311 p. P. 1245-1260.

62. Cell therapy markets. TriMark Publications, LLC, 2007. Vol. TMRCTHER07-0701. p. 270. (http://www.trimarkpublications.com).

128

63. Chamuleau S., Belle E., Doevendans P. Enhancing cardiac stem cell differentiation into cardiomyocytes // Cardiovasc. Res. 2009. Vol. 82. P. 385— 387.

64. Charville G.W., Rando T.A. Stem cell ageing and non-random chromosome segregation// Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2011. Vol. 1561, No 366. P. 85-93.

65. Claycomb W.C. Control of cardiac muscle celldivision // Trends Cardiovasc. Med. 1992. Vol. 2. P. 231-236.

66. Davis D.R., Zhang Y., Smith R.R., Cheng K., Terrovitis J., Malliaras K., Li T.S., White A., Makkar R., Marbán E. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue // PLoS One. 2009. Vol. 9(4-e7195).

67. Di Felice V., De Luca A., Colorito M.L., Montalbano A., Ardizzone N.M., Macaluso F., Gammazza A.M., Cappello F., Zummo G. Cardiac stem cell research: an elephant in the room? // Anat. Rec. (Hoboken). 2009. Vol. 292, No 3. P. 449-454.

68. Dobaczewski M., Gonzalez-Quesada C., Frangogiannis N.G. The

extracellular matrix as a modulator of the inflammatory and reparative response following myocardial infarction// J. Mol. Cell. Cardiol. 2010. Vol. 3, No 48. P. 504-511.

69. Escobar A.L., Ribeiro-Costa R., Villalba-Galea C., Zoghbi M.E., Pérez C.G., Mejía-Alvarez R. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2004. Vol. 286. P. H971-H978.

70. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. Vol. 292, No 5819. P. 154-156.

71. Fabiato A. Rapid ionic modifications during the aequorin-detected calcium transient in a skinned canine cardiac Purkinje cell // J. Gen. Physiol. 1985. Vol. 85, No 2. P. 189-246.

72. Fehrer C., Laschober G., LePerdinger G. Aging of murine mesenchymal stem cells // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. Vol. 1067. P. 235-242.

73. Flink I.L. Cell cycle reentry of ventricular and atrial cardiomyocytes and cells within the epicardium following amputation of the ventricular apex in the axolotl, Amblystoma mexicanum: confocal microscopic immunofluorescent image analysis of BrdU-labeled nuclei // Anat. Embryol. (Berl). 2002. Vol. 205, No 3. P. 235-244.

74. Forrester J.S., White A.J., Matsushita S., Chakravarty T., Makkar R.R. New paradigms of myocardial regeneration postinfarction: Tissue preservation, cell environment, and pluripotent cell sources // JACC Cardiovasc. Interv. 2009. Vol. 2, No 1. P. 1-8.

75. Genead R., Danielsson C., Andersson A., Corbascio M., Franco-Cereceda A., Sylvén C., Grinnemo K. Islet-1 cells are cardiac progenitors present during the entire lifespan: from the embryonic stage to adulthood // Stem Cells Dev. 2010. Vol. 19, No 10. P. 1601-1615.

76. George C.H., Higgs G.V., Lai F.A. Ryanodine receptor mutations associated with stress-induced ventricular tachycardia mediate increased calcium release in stimulated cardiomyocytes// Circ. Res. 2003. Vol. 93, No 6. P. 531-540.

77. Giangreco A., Qin M., Pintar J.E., Watt F.M. Epidermal stem cells are retained in vivo throughout skin aging // Aging Cell. 2008. Vol. 7, No 2. P. 250-259.

78. Godwin J.W., Brockes J.P. Regeneration, tissue injury and the immune response // J. Anat. 2006. Vol. 209. P. 423 - 432.

79. Gomez J.P., Potreau D., Branka J.E., Raymond G. Developmental changes in Ca currents from newborn rat cardiomyocytes in primary culture // Pflugers Arch. 1994. Vol. 428. P. 241-249.

80. Gopinath S.D., Rando T.A. Stem cell review series: aging of the skeletal muscle stem cell niche // Aging Cell. 2008. Vol. 7, No 4. P. 590-598.

81. Gorman R.C., Jackson B.M., Burdick J.A., Gorman J.H. Infarct restraint to limit adverse ventricular remodeling // J. Cardiovasc. Transl. Res. 2011.Vol. 4, No l.P. 73-81.

82. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 3440-3450.

83. Guinamard R., Chatelier A., Demion M., Potreau D., Patri S., Rahmati M., Bois P. Functional characterization of a Ca -activated non-selective cation channel in human atrial cardiomyocytes // J. Physiol. 2004. Vol. 558 (Ptl). P. 75-83.

84. Guinamard R., Rahmati M., Lenfant J., Bois P. Characterization of a

Ca -

activated nonselective cation channel during dedifferentiation of cultured rat ventricular cardiomyocytes // J. Membr. Biol. 2002. Vol. 188, No 2. P. 127135.

85. Harding S.E., Ali N.N., Brito-Martins M., Gorelik J. The human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte as a pharmacological model // Pharmacol. Ther. 2007. Vol. 113, No 2. P. 341-353.

86. Harel-Adar T., Ben Mordechai T., Amsalem Y., Feinberg M.S., Leor J., Cohen S. Modulation of cardiac macrophages by phosphatidylserine-presenting liposomes improves infarct repair // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. Vol. 108, No 5. P. 1827-1832.

87. Harvey R. P. Patterning the vertebrate heart // Nat. Rev. Genet. 2002. Vol. 3. P. 544-556.

88. Hassink R., Pasumarthi K., Nakajima H., Rubart M., Soonpaa M., de la Rivi e re A., Doevendans P., Field L. Cardiomyocyte cell cycle activation improves cardiac function after myocardial infarction // Cardiovasc. Res. 2008. Vol. 78. P. 18-25.

89. Heusch G., Schulz R. The biology of myocardial hibernation // Trends Cardiovasc. Med. 2000. Vol. 10. P. 108 - 114.

90. Hofgaard J.P., Sigurdardottir K.S., Treiman M. Protection by 6-aminonicotinamide against oxidative stress in cardiac cells // Pharmacol. Res. 2006. Vol. 54, No 4. P. 303-310.

91. Hristov M., Erl W., Linder S., Weber P.C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro II Blood. 2004. Vol. 104, No 9. P. 27612766.

92. Husse B., Wussling M. Developmental changes of calcium transients and contractility during the cultivation of rat neonatal cardiomyocytes // Mol. Cell Biochem. 1996. Vol. 163-164. P. 13-21.

93. Jopling C., Sleep E., Raya M., Marti M., Raya A., Belmonte J.C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation //Nature. 2010. Vol. 464, No 7288. P. 606-609.

94. Kajstura J., Leri A., Finato N., Di Loretto C., Beltrami C., Anversa P. Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. Vol. 95. P. 8801-8805.

95. Kajstura J., Pertoldi B., Leri A., Beltrami C., Deptala A., Darzynkiewicz Z., Anversa P. Telomere shortening is an in vivo marker of myocyte replication and aging // Am. J. Pathol. 2000. Vol, No 3. 156. P. 813-819.

96. Kajstura J., Gurusamy N., Ogorek B., Goichberg P., Clavo-Rondon C., Hosoda T., D'Amario D., Bardelli S., Beltrami A.P., Cesselli D., Bussani R., del Monte F., Quaini F., Rota M., Beltrami C.A., Buchholz B.A., Leri A., Anversa P. Myocyte turnover in the aging human heart // Circ. Res. 2010. Vol. 11, No 107. P. 1374-1386.

97. Kaneco M., Suzuki H., Masuda H. Effect of oxygen free radicals on Ca2+ binding to cardiac troponin // Jap.Circ. J. 1992. Vol. 56(Suppl.5). P. 12881290.

98. Kelly R. G., Buckingham M. E. The anterior-heart forming field: voyage to the arterial pole of the heart // Trends Genet. 2002. Vol. 18. P. 210-216.

99. Kuzmenkin A., Liang H., Xu G., Pfannkuche K., Eichhorn H., Fatima A., Luo H., Saric T., Wernig M., Jaenisch R., Hescheler J. Functional characterization of cardiomyocytes derived from murine induced pluripotent stem cells in vitro IIFASEB J. 2009. Vol. 23, No 12. P. 4168-4180.

100. Lam M.L., Bartoli M., Claycomb W.C. The 21-day postnatal rat ventricular cardiac muscle cell in culture as an experimental model to study adult cardiomyocyte gene expression // Mol. Cell. Biochem. 2002. Vol. 229, No 12. P. 51-62.

101. Laube F., Heister M., Scholz C., Borchardt T., Braun T. Re-programming of newt cardiomyocytes is induced by tissue regeneration // J. Cell Sci. 2006. Vol. 119. P. 4719-4729.

102. Laugwitz K., Moretti A., Carón L., Nakano A., Chien K. Isletl cardiovascular progenitors: a single source for heart lineages? // Development. 2008. Vol. 135. P. 193 - 205.

103. Laugwitz K-L., Moretti A., Lam J., Gruber P., Chen Y., Woodard S., Lin L., Cai C., Lu M. Postnatal isll+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages //Nature. 2005. Vol. 433. P. 647-653.

104. Lepilina A., Coon A., Kikuchi K., Holdway J., Roberts R., Burns C., Poss K. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during Zebrafish heart regeneration // Cell. 2006. Vol. 127. P. 607 - 619.

105. Leri A., Barlucchi L., Liman a F., Deptala A., Darzynkiewicz Z., Hintze T.H., Kajstura J., Nadal-Ginard B.» Anversa P. Telomerase expression and activity are coupled with myocyte proliferation and preservation of telomeric length in the failing heart // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001. Vol. 98. P. 8626 -8631.

106. Leri A., Kajstura J., Anversa P. Cardiac Stem Cells and Mechanisms of Myocardial Regeneration // Physiol. Rev. 2005. Vol. 85. P. 1373-1416.

107. Li E., Wang X., Capasso J., Gerdes A. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development // J. Mol. Cell. Cardiol. 1996. Vol. 28, No 8. P. 1737-1746.

133

108. Linke A., Müller P., Nurzynska D., Casarsa C., Torella D., Nascimbene A., Castaldo C., Cascapera S., Böhm M., Quaini F., Urbanek K., Leri A., Hintze T.H., Kajstura J., Anversa P. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2005. Vol. 102, No 25. P. 8966-8971.

109. Liu J., Lieu D.K., Siu C.W., Fu J.D., Tse H.F., Li R.A. Facilitated

2+

maturation of Ca handling properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes by calsequestrin expression // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2009. Vol. 297, No 1. P. 152-159.

110. Lowe EL, Baeger I., Blastic I.E., Haseloff R.F. Oxygen radicals attenuate the contractility of skinned muscle fibers from the pig myocardium // Pharmazie. 1994. Vol. 49. P. 845-849.

111. Lukyanenko V., Viatchenko-Karpinski S., Smirnov A., Wiesner T.F.,

Györke S. Dynamic regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content and • 2+ •

release by luminal Ca -sensitive leak in rat ventricular myocytes // Biophys. J. 2001. Vol. 81. P. 785-798.

112. MacLellan W.R., Schneider M.D. Genetic dissection of cardiac growth control pathways //Annu. Rev. Physiol. 2000. Vol. 62. P. 289-319.

113. Malliaras K., Marbän E. Cardiac cell therapy: where we've been, where we are, and where we should be headed // Br. Med. Bull. 2011. Vol. 98, No 1. P. 161-185.

114. Marques S.R., Lee Y., Poss K.D., Yelon D. Reiterative roles for FGF signalling in the establishment of size and proportion of the Zebrafish II Dev. Biol. Vol. 2008. 321. P. 397- 406.

115. Matsui Y., Morimoto J., Uede T. Role of matricellular proteins in cardiac tissue remodeling after myocardial infarction // World J. Biol. Chem. 2010. Vol. 1, No 5. P. 69-80.

116. Maximow A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der Säugetiere // Folia Haematologica. 1909. Vol. 8. P. 125-134.

117. McGill C. J., Brooks G. Cell cycle control mechanisms and their role in cardiac growth // Cardiovasc. Res. 1995. Vol. 30. P. 557-569.

118. Meissner G. Ryanodine activation and inhibition of the Ca2+ release channel of sarcoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261, No 14. P. 63006306.

119. Meissner G. Ryanodine receptor/Ca release channels and their regulation by endogenous effectors // Annu. Rev. Physiol. 1994. Vol. 56. P. 485-508.

120. Messina E., De Angelis L., Frati G., Morrone S., Chimenti S., Fiordaliso F., Salio M., Battaglia M., Latronico M.V., Coletta M., Vivarelli E., Frati L., Cossu G., Giacomello A. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart // Circ. Res. 2004. Vol. 95, No 9. P. 911921.

121. Moretti A., Caron L., Nakano A., Lam J., Bernshausen A., Chen Y., Qyang Y., Bu L. Multipotent embryonic isll+ progenitor cells lead to cardiac, smooth muscle, and endothelial cell diversifi cation // Cell. 2006. Vol. 127. P. 1151 - 1165.

122. Morrison S.J, Spradling A.C. Stem cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life // Cell. 2008. Vol. 132. P. 598611.

123. Nakai J., Imagawa T., Hakamata Y., Shigekawa M., Takeshima H., Numa S. Primary structure and functional expression from cDNA of the cardiac ryanodine receptor/calcium release channel // FEBS Lett. 1990. Vol. 271. P. 169-177.

124. Nechiporuk A., Keating M.T. A proliferation gradient between proximal and msxb-expressing distal blastema directs Zebrafish fin regeneration // Development. 2002. Vol. 129, No 11. P. 2607-2617.

125. Nilius B., Hess P., Lansman J.B., Tsien R.W. A novel type of cardiac calcium channel in ventricular cells //Nature. 1985. Vol. 316. P. 443-446.

126. Oberpriller J.O., Oberpriller J.C. Response of the adult newt ventricle to injury//J. Exp. Zool. 1974. Vol. 187. P. 249-253.

127. Oh H., Bradfute S., Gallardo T., Nakamura T., Gaussinf V., Mishina Y., Pocius J., Michael L. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: Homing, differentiation, and fusion after infarction // PNAS. 2003. Vol. 100, No 21. P. 12313-12318.

128. O'Neill S. C., Eisner D. A. A mechanism for the effects of caffeine on Ca release during diastole and systole in isolated rat ventricular myocytes //J. Physiol. 1990. Vol. 430. P. 519-536.

129. Orlov S.N., Li J.-M., Tremblay J., Hamet P. Genes of intracellular calcium metabolism and blood pressure control in primary hypertension // Seminars in Nephrology. 1995. Vol. 15, No 6. P. 569-592.

130. Otsu K., Willard H., Khanna V., Zorzato F., Green N., MacLennan D. Molecular cloning of cDNA encoding the Ca release channel (ryanodine receptor) of rabbit cardiac muscle sarcoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 13472-13483.

131. Page E., Buecker J.L. Development of dyadic junctional complexes between sarcoplasmic reticulum and plasmalemma in rabbit left ventricular myocardial cells. Morphometric analysis // Circ. Res. 1981. Vol. 48. P. 519-522.

132.Parmacek M.S., Epstein J.A. Pursuing cardiac progenitors: regeneration redux // Cell. 2005. Vol. 3, No 120. P. 295-298.

133.Passier R., Mummery C. Origin and use of embryonic and adult stem cells in differentiation and tissue repair // Cardiovasc. Res. 2003. Vol. 58. P. 324335.

134. Perez C.G., Copello J.A., Li Y., Karko K.L., Gomez L., Ramos-Franco J., Fill M., Escobar A.L., Mejia-Alvarez R. Ryanodine receptor function in newborn rat heart // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2005. Vol. 288. P. H2527-H2540.

135. Pfister O., Mouquet F., Jain M., Summer R., Helmes M., Fine A., Colucci W.S., Liao R. Cd31- but not cd31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation // Circ. Res. 2005. Vol. 97, No 1. P. 52-61.

136. Poolman R.A., Gilchrist R., Brooks G. Cell cycle profiles and expressions of p21CIPl AND P27KIP1 during myocyte development // Int. J. Cardiol. 1998. Vol. 67, No 2. P. 133-142.

137. Porrello E.R., Mahmoud A.I., Simpson E., Hill J.A., Richardson J.A., Olson E.N., Sadek H.A. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart // Science. 2011. Vol. 331, No 6020. P. 1078-1080.

138. Poss K., Keating M., Nechiporuk A. Tales of regeneration in Zebrafish II Dev. Dyn. 2003. Vol. 226, No 2. P. 202-210.

139. Poss K., Wilson L., Keating M. Heart regeneration in Zebrafish II Science. 2002. Vol. 298, No 5601. P. 2188-2190.

140. Poss K. Getting to the heart of regeneration in Zebrafish II Semin. Cell Dev. Biol. 2007. Vol. 18. P. 36-45.

141. Powers F.M., Solaro R.J. Caffeine alters cardiac myofilament activity and regulation independently of Ca binding to troponin C // Am. J .Physiol. 1995. Vol. 268, No 6 (Pt 1). P. C1348-C1353.

142. Protasi F., Sun X., Franzini-Armstrong C. Formation and maturation of the calcium release aParatus in developing and adult avian myocardium // Dev. Biol. 1996. Vol. 173. P. 265-278.

143. Quaini F., Urbanek K., Beltrami A.P., Finato N., Beltrami C.A., Nadal-Ginard B., Kajstura J., Leri A., Anversa P. Chimerism of the transplanted heart//N. Engl. J. Med. 2002. Vol. 347, No 1. P. 5-15.

144. Raff M. Adult stem cell plasticity: fact or artifact? // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. Vol. 19. P. 1-22.

145. Rando T. A. Stem cells, ageing and the quest for immortality // Nature. 2006. Vol. 441, No 7097. P. 1080-1086.

146. Raya A., Koth C.M., Buscher D., Kawakami Y., Itoh T., Raya R.M., Sternik G., Tsai H.J., Rodríguez-Esteban C., Izpisúa-Belmonte J.C.

Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in Zebrafish II Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100(Suppl 1). P. 11889-11895.

147. Reinecke H., Minami E., Zhu W.Z., Laflamme M.A. Cardiogenic differentiation and transdifferentiation of progenitor cells // Circ. Res. 2008. Vol. 103, No 10. P. 1058-1071.

148. Richard V.J., Murry C.E., Jennings R.B., Reimer K.A. Oxigen derived free radicals and postischemic myocardial reperfusion: therapeutic implication//Fundam. Clin. Pharmacol. 1990. Vol. 4. P. 85-103.

149. Rumyantsev P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiac myogenesis and regeneration // Int. Rev. Cytol. 1977. Vol. 51. P. 187-273.

150. Satin J., Kehat I., Caspi O., Huber I., Arbel G., Itzhaki I., Magyar J., Schroder E.A., Perlman I., Gepstein L. Mechanism of spontaneous excitability in human embryonic stem cell derived cardiomyocytes // J. Physiol. 2004. Vol. 559(Pt2). P. 479-496.

151. Schild L., Bukowska A., Gardemann A., Polczyk P., Keilhoff G., Tager M., Dudley S.C., Klein H.U., Goette A., Lendeckel U. Rapid pacing of embryoid bodies impairs mitochondrial ATP synthesis by a calcium-dependent mechanism-a model of in vitro differentiated cardiomyocytes to study molecular effects of tachycardia // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1762, No 6. P. 608-615.

152. Sedarat F., Xu L., Moore E.D.W., Tibbits G.F. Colocalization of dihydropyridine and ryanodine receptors in neonatale rabbit heart using confocal microscopy // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000. Vol. 279. P. H202-H209.

153. Seki S., Nagashima M., Yamada Y., Tsutsuura M., Kobayashi T., Namiki

A., Tohse N. Fetal and postnatal development of Ca2+ transients and Ca2+ sparks in rat cardiomyocytes // Cardiovasc. Res. 2003. Vol. 58. P. 535-548.

154. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell // Blood, cell. 1978. Vol. 4, No 1-2. P. 7-25.

155. Sham J., Cleeman L., Morad M. Functional coupling of Ca2+ channels and ryanodine receptors in cardiac myocytes// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

1995. Vol. 92. P. 121-125.

156. Simon M., Keith B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. Vol. 9. P. 285-296.

157. Sohn R.L., Jain M., Liao R. Adult stem cells and heart regeneration // Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 2007. Vol. 5, No 3. P. 507-517.

158. Souza E.M., Henriques-Pons A., Bailly C., Lansiaux A., Araujo-Jorge T.C., Soeiro Mde N. In vitro measurement of enzymatic markers as a tool to detect mouse cardiomyocytes injury // Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 2004. Vol. 99, No 7. P. 697-701.

159. Sun Y., Liang X., Najafi N., Cass M., Lin L., Cai Ch., Chen Ju., Evans S. Islet 1 is Expressed in Distinct Cardiovascular Lineages, Including Pacemaker and Coronary Vascular Cells // Dev. Biol. 2007. Vol. 304, No 1. P. 286-296.

160. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. Vol. 282, No 5391. P. 1145-1147.

161. Tsonis P.A. Limb regeneration. Cambridge: Cambridge University Press,

1996. p. 232.

162. Urbanek K., Quaini F., Tasca G., Torella D., Castaldo C., Nadal-Ginard

B., Leri A., Kajstura J., Quaini E., Anversa P. Intense myocyte formation from cardiac stem cells in human cardiac hypertrophy // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100. P. 10440-10445.

163. Urbanek K., Torella D., Sheikh F., De Angelis A., Nurzynska D., Silvestri F., Beltrami C.A., Bussani R., Beltrami A.P., Quaini F., Bolli R., Leri A., Kajstura J., Anversa P. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. Vol. 102, No 24. P. 8692-8697.

164. Urbanek K., Rota M., Cascapera S., Bearzi C., Nascimbene A., De Angelis A., Hosoda T., Chimenti S., Baker M., Limana F., Nurzynska D., Torella D., Rotatori F., Rastaldo R., Musso E., Quaini F., Leri A., Kajstura J., Anversa P. Cardiac stem cells possess growth factor-receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and long-term survival // Circ. Res. 2005. Vol. 97, No 7. P. 663-673.

165. Urbanek K., Cesselli D., Rota M., Nascimbene A., Angelis A., Hosoda T., Bearzi C., Boni A., Bolli R., Kajstura J., Anversa P., Leri A. Stem cell niches in the adult mouse heart // PNAS. 2006. Vol. 103, No 24. P. 92269231.

166. Wagers A.J., Weissman I.L. Plasticity of adult stem cells // Cell. 2004. Vol. 116, No 5. P. 639-648.

167. Walsh S., Ponten A., Fleischmann B., Jovinge S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo - an analysis based on cardiomyocyte nuclei // Cardiovasc. Res. 2010. Vol. 86, No 3. P. 365-373.

168. Wang R., Zhang L., Bolstad J., Diao N., Brown C., Ruest L., Welch W., Williams A., Chen S. Residue Gln4863 within a predicted transmembrane sequence of the Ca release channel (ryanodine receptor) is critical for ryanodine interaction//!. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 51557-51565.

169. Wasawa T., Matsuoka A., Tajima G. Hydrogen peroxide plays a key role in the oxidation reaction of myoglobin by molecular oxygen: A computer simulation//Biophys. J. 1992. Vol. 63. P. 544-550.

170. White S.M., Constantin P.E., Claycomb W.C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac

140

muscle cell structure and function // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2004. Vol. 286, No 3. P. H823-829.

171. Wilson E.B. The cell in development and inheritance // New York: Macmillan, 1896. p. 330.

172. Wynn T.A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis // J. Pathol. 2008. Vol.214. P. 199-210.

173. Xu L., Tripathy A., Pasek D.A., Meissner G. Potential for pharmacology of ryanodine receptor/calcium release channels // Ann. NY. Acad. Sci. 1998. Vol. 853. P. 130-148.

174. Zaglia T., Dedja A., Candiotto C., Cozzi E., Schiaffino S., Ausoni A. Cardiac interstitial cells express GATA4 and control dedifferentiation and cell cycle re-entry of adult cardiomyocytes // J. Mol. Cell. Cardiol. 2009. Vol. 46, No 5. P. 653-662.