Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Шугурова, Ирина Михайловна

• Шугурова, Ирина Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шугурова, Ирина Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫИ

1.1. Вирус иммунодефицита человека

1.2. Геном ВИЧ

1.3. Эффекты гена tat2Л

1.4. Эффекты гена nef

1.4.1. Генные мишени Nef в Т-клетках

1.5. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Культуры клеток

2.1.1. Псевдонормальная линия клеток фибробластов крысы Rat

2.1.2. Первичные фибробласты крысы

2.1.3. Глиальные клетки

2.1.4. Клетки феохромоцитомы крысы PC

2.1.5. Первичные эмбриональные фибробласты мыши

2.1.6. Эмбриональные стволовые клетки

2.2. Плазмиды, использованные в экспериментах4J

2.3. Перенос генов в клетки методом электропорации

2.4. Получение поликлональных tat- и nef-трансфицированных культур

2.5. Тестирование переноса генов

2.6. Изучение пролиферации клеток

2.7.Изучение дифференцировки клеток

2.8. Цитохимический тест для выявления активности щелочной фосфатазы

2.9. Иммуноцитохимический анализ

2.10. Статистическая обработка результатов экспериментов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Конструирование и анализ рекомбинантных плазмид с экс дрессирующимися генами ВИЧ

3.1.2. рМТtat

3.1.3. pTat-neo

3.1.4. pNef и pNef-fs

3.2. Эффекты гена tat ВИЧ

3.2.1. Морфология и пролиферативная активность fatf-трансфицированных псевдонормальных фибробластов крысы (линия Rat-2)

3.2.2. Онкогенный потенциал гена tat и кооперативный эффект

3.2.3. Морфология и пролиферативная активность клеток феохромоцитомы крысы (линия PC 12), трансфицированных геном tat

3.2.3. Нейрональная дифференцировка и пролиферативная активность tat-трансфицированных клеток феохромоцитомы крысы в присутствии фактора роста нервов (NGF)

3.3. Эффекты гена nefRWl

3.3.1. Морфология ие^трансфицированных первичных фибробластов эмбрионов крысы

3.3.2. Морфология и пролиферативная активность клеток феохромоцитомы крысы (линия PC 12), трансфицированных геном nef

3.4. Влияние генов tat и nef на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши

3.4.1. Оценка активности промотора CMV

3.4.2. Пролиферативная активность генетически модифицированных линий ЭС клеток

3.4.3. Дифференцировка трансфицированных ЭС клеток

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro»

Актуальность проблемы

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - этиологический агент синдрома приобретенного иммунодефицита, названного чумой ХХ-ого века. По данным ООН, на начало 2004 года в мире зарегистрировано 40 миллионов ВИЧ-инфицированных, из них 2,5 - дети в возрасте до 15 лет.

Только в 2000 г. СПИД стал причиной трех миллионов смертей, а общее количество погибших от заболевания достигло к этому моменту 21,8 миллиона. В России в 1997 году выявлено более 3500 ВИЧ-инфицированных, что в 1,5 раза больше, чем за предыдущие 10 лет. По состоянию на начало 2005 года число официально зарегистрированных инфицированных составило в нашей стране около 350 000 человек, однако по подсчетам их истинное количество значительно больше - 600-700 тысяч, т.е. носителями ВИЧ являются уже около 1 % населения России. По прогнозу, в 2005 г. число инфицированных может быть более 1 миллиона.

В первые 10 лет эпидемия ВИЧ-инфекции распространялась, в основном, среди молодых мужчин, однако теперь она представляет серьезную проблему и здоровью молодых женщин. В США СПИД уже занял 4-ое месте среди наиболее часто встречающихся причин смерти женщин в возрасте 15-45 лет, а в некоторых крупных городах вышел на 3-е место после рака и несчастных случаев. Серьезность этой проблемы для всего мирового сообщества не вызывает сомнений.

Главным клиническим показателем СПИДа является резкое уменьшение количества CD4+ Т-лимфоцитов. Белки оболочки ВИЧ связываются с молекулой CD4 и СХСЯ4-корецептором, что в результате эндоцитоза приводит к проникновению вируса внутрь клеток субпопуляции T4/h.

Иммунный дефицит, возникающий в результате инфицирования ВИЧ, сопровождается развитием ряда сопутствующих патологий: нейропатией, энтеропатией, нефропатией, миопатией, нарушением гематопоэза, опухолеобразованием. Частота такого рода патологий у ВИЧ-носителей возрастает в десятки и тысячи раз, по сравнению со средними показателями в популяции. Однако до сих пор детальные молекулярные механизмы возникновения этих и других патологий остаются неизвестными.

После обнаружения ВИЧ и вируса иммунодефицита обезьян (ВИО) были начаты исследования механизмов взаимодействия между этими вирусами и клетками. Особое внимание было уделено влиянию вирусов иммунодефицита и их отдельных генов на клеточный метаболизм и зависимость репликации вирусов от многих факторов клеток-хозяев {Свердлов, Тарантул, 1992).

В первых же экспериментах было показано, что в ряде патологических процессов, сопровождающих ВИЧ-инфекцию, могут участвовать продукты как структурных, так и регуляторных генов ВИЧ/ВИО. Глубокое и всестороннее изучение функций вирусных генов, которое можно назвать этапом функциональной анатомии генома вируса, позволит получить информацию для следующего этапа (синтеза) - исследования функций целого вирусного генома в координированном взаимодействии его отдельных генов между собой и с геномом клетки-хозяина. Большое внимание в этих исследованиях было обращено на изучение роли регуляторных генов ВИЧ/ВИО, которые участвуют не только в регуляции экспрессии и репликации вирусного генома, но также оказывают существенное влияние на метаболизм клеток. Это делает возможным поиск более эффективных медикаментозных способов борьбы с клиническими проявлениями ВИЧ-инфекции.

Объектами наших исследований являлись два регуляторных гена ВИЧ-tat и nef. Эти гены, по существовавшим к началу настоящей работы данным, имели разнонаправленное влияние на экспрессию и репликацию ВИЧ в клетках. Ген tat рассматривался как трансактиватор транскрипции ВИЧ, а ген nef как негативный фактор экспрессии вирусных генов и репликации вируса. При этом мало было известно относительно влияния этих генов на жизнедеятельность клетки. Однако уже первые исследования по влиянию продуктов регуляторных генов на клеточный метаболизм показали, что существует тесная взаимосвязь между этими процессами. Постепенно накапливались данные, указывающие на плейотропные эффекты генов tat и nef на клетки, и их участие в развитии некоторых патологий, сопутствующих СПИДу.

Продукт гена tat представляет собой секретируемый фактор, который является трансактиватором транскрипции как вирусных, так и отдельных клеточных генов, влияет на рост и пролиферацию клеток, их миграцию, апоптоз и ангиогенез. Наряду с этим ген tat иногда оказывает и ингибирующее воздействие на экспрессию клеточных генов. Показана нейротоксичность белка Tat, которая проясняет молекулярные механизмы некоторых нейропатологий, сопровождающих СПИД. Важным было обнаружение у гена tat онкогенного потенциала, который, по-видимому, ассоциирован с развитием лимфом и саркомы Капоши у ВИЧ-инфицированных пациентов. В дальнейшем было определено, что многие из эффектов гена tat на клетки осуществляются в результате взаимодействия белка Tat с определенным набором клеточных белков.

Ген nef участвует в многочисленных процессах, происходящих в клетках, в частности в негативной и в позитивной регуляции экспрессии клеточных генов, а также в репликации вируса. Кроме того был обнаружен эффект гена nef на эндоцитоз и ряд других процессов. На астроцитах человека был выявлен модулирующий эффект гена nef на уровень TNF-a, что проявлялось в задержке апоптоза (Robichaud\ Poulin, 2000). В настоящее время ясно, что продукт гена nef также как и гена tat, взаимодействует в клетках с большим числом белков, участвующих в передаче клеточных сигналов и транспорте белковых продуктов {Benichou et al., 1994; Collette et al., 1996).

Таким образом, имеющиеся данные указывают на полифункциональность генов nef и tat ВИЧ-1 на клетки. Однако в полной мере молекулярные механизмы влияния продуктов этих генов на процессы метаболизма в клетках и их роль в развитии различных патологий у ВИЧ-инфицированных пациентов остается неизвестной. Остается также много вопросов, связанных с видо-специфическими эффектами продуктов этих двух регуляторных вирусных генов.

Нами проведены эксперименты по изучению влияния регуляторных генов ВИЧ на непермиссивные к вирусу нормальные, псевдонормальные и злокачественные клетки грызунов. Это позволило изучить общие эффекты воздействия на клетки, присущие отдельным продуктам вирусных генов, что в дальнейшем может быть использовано в разработке эффективных подходов к терапии ВИЧ-инфицированных больных, созданию принципиально новых высокоспецифичных медицинских препаратов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния регуляторных генов вируса иммунодефицита человека nef и tat на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов для выяснения их роли в развитии различных патологий у человека. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 .Изучение влияния продуктов регуляторных генов nef и tat ВИЧ на пролиферативную активность и морфологию различных клеточных культур крысы: псевдонормальная линия клеток (Rat-2) и линия опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12).

2.Оценка онкогенного потенциала регуляторных генов nef и tat ВИЧ на культуре первичных фибробластов эмбрионов крысы, исследование кооперативного эффекта между генами nef и tat, а также онкогенами Ha-ras и с-тус.

3.Изучение влияния регуляторных генов nef и tat ВИЧ на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате проведенной работы впервые получены данные о кооперации между геном tat и известными онкогенами c-Ha-ras и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

Впервые получены данные о том, что регуляторный ген nef ВИЧ-1 инициирует образование многоядерных синцитиальных клеток при трансфекции опухолевой линии феохромоцитомы крысы.

Проведенные эксперименты по изучению влияния регуляторных генов ВИЧ на модели непермиссивных к вирусу нормальных, псевдонормальных и злокачественных клеток грызунов позволили изучить общие эффекты воздействия на клетки, присущие отдельным вирусным генам, что в дальнейшем может быть использовано в разработке эффективных походов к терапии ВИЧ-инфицированных больных, созданию принципиально новых высокоспецифичных медицинских препаратов.

Изучение направленной тканеспецифической дифференцировки эмбриональных стволовых клеток может быть в перспективе использовано в клеточной терапии некоторых тяжелых патологий у человека.

Положения, выносимые на защиту

• Под влиянием регуляторного гена tat ВИЧ-1 увеличивается пролиферативная активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и R1 линии эмбриональных стволовых клеток мыши.

• Регуляторный ген tat ВИЧ-1 вызывает морфологическую трансформацию псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2) и формирование фокусов трансформации в эмбриональных фибробластах крысы, что свидетельствует о его онкогенным потенциале.

• Существует кооперация между геном tat и известными онкогенами с-На-гау и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

• Под влиянием регуляторного гена nef ВИЧ-1 уменьшается пролиферативная активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и линии R1 эмбриональных стволовых клеток мыши.

• Регуляторный ген nef ВИЧ-1 инициирует образование многоядерных синцитиальных клеток только при трансфекции опухолевой линии феохромоцитомы крысы (PC 12), что указывает на клеточно-специфическое действие этого гена.

• Регуляторные гены tat и nef ВИЧ-1 оказывают влияние как на ранние стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (на уровне формирования эмбриоидных тел), так и на процесс спонтанной дифференцировки этих клеток в кардиомиоциты.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Шугурова, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Регуляторный ген tat ВИЧ-1 увеличивает пролиферативную активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и R1 линии эмбриональных стволовых клеток мыши.

2. Регуляторный Ген tat ВИЧ-1 обладает онкогенным потенциалом. Он вызывает морфологическую трансформацию псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2) и формирование фокусов трансформации в эмбриональных фибробластах крысы.

3. Существует кооперация между геном tat и известными онкогенами с-На-ras и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

4. Регуляторный ген nef ВИЧ-1 уменьшает пролиферативную активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и линии эмбриональных стволовых клеток мыши.

5. Регуляторный ген nef ВИЧ-1 инициирует образование многоядерных синцитиальных клеток только при трансфекции опухолевой линии феохромоцитомы крысы (PC 12), что указывает на клеточно-специфическое действие этого гена.

6. Регуляторные гены tat и nef ВИЧ-1 оказывают влияние как на ранние стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (на уровне формирования эмбриоидных тел), так и на процесс спонтанной дифференцировки этих клеток в кардиомиоциты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шугурова, Ирина Михайловна, 2005 год

1. Свердлов Е.Д., Тарантул В.З. Структурно-функциональная анатомия и вариабельность генома вирусов иммунодефицита приматов. Итоги науки и техники. Сер. Иммунология. М.: ВИНИТИ. 1992. - С. 3-82.

2. Karn J. Control of human immunodeficiency virus replication by the tat, rev, nef and protease genes // Curr. Opin. Immunol. 1991. - V. 3, № 4. - P. 526536.

3. Horwitz M.S., Boyce-Jacino M.T., Faras A.J. Novel human endogenous sequences related to human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1992. -V. 66.-P. 2170-2179.

4. Lotz М., Kekow J., Cronin М.Т. et al. Induction of transforming growth factor-beta by HIV-1 tat: a noncytopathic pathway of immunodeficiency in HIV infection // FASEB J. 1990. - V. 4. - P. A2014.

5. Sastry K.J., Reddy R.H.R., Pandita R. et al. HIV-1 tat gene induces tumor necrosis factor-beta (lymphotoxin) in a human B-lymphoblastoid cell line // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 20091-20093.

6. Buonaguro L., Barillari G., Chang H.K. et al. Effect of the human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on the expression of inflammatory cytokines // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 7159-7167.

7. Rautonen J., Rautonen N., Martin N.L., Wara D.W. HIV type 1 Tat protein induced immunoglobulin and interleukin 6 synthesis by uninfected peripheral blood mononuclear cells // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1994. - V. 10. - P. 781-785.

8. Шугурова И.М., Андреева Л.Е., Дубовая В.И. , Зуева JI.A., Серова И.А., Тарантул В.З. Влияние генов nef и tat вируса иммунодефицита человека типа 1 на клетки грызунов in vivo и in vitro // Генетика. — 1997. — Т. 33. С. 1202-1208.

9. Vogel J., Hindrichs S.H., Reynolds R.K. et al. The HIV tat gene induces dermal lesions resembling Kaposi's sarcoma in transgenic mice // Nature. -1988.-V. 335.-P. 606-611.

10. Corallini A., Altavilla G., Pozzi L. et al. Systemic expression of HIV-1 tat gene in transgenic mice induced endothelial proliferation and tumors of different histo types // Cancer Res. 1993. V. 53. - P. 5569-5575.

11. Campioni D., Corralini A., Zaula G. et al. HIV type 1 extracellular Tat protein stimulates growth and protects cells of BK virus/tat transgenic mice from apoptosis // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1995. - V. 11. № 9. - C. 10391048.

12. Karn J. Tackling Tat. J Mol Biol. 1999. - Oct 22. -293(2). - P.235-54. Review.

13. Ensoli В., Barillari G., Salahuddin S.Z. et al. Tat protein of HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi's sarcoma lesions of AIDS patients // Nature. 1990. - V. 345. - P.84-86.

14. Milani D., Mazzoni M., Zauli G. et al. HIV-1 Tat induces tyrosine phosphorytion of pl25FAK and its association with phosphoinositide 3-kinase in PC12 cells // AIDS. 1998. - V. 12. - P. 1275-1284.

15. Lotz M., Clark-Lewis I., Ganu V. HIV-1 transactivator protein Tat induces proliferation and TGF beta expression in human articular chondrocytes // J. Cell. Biol. 1994. - V. 124. - P. 365-371.

16. Patki A.H., Lederman M.M. HIV-1 Tat protein and its inhibitor Ro 24-7429 inhibit lymphocyte proliferation and induce apoptosis in peripheral blood mononuclear cells from healthy donors // Cell. Immunol. 1996. - V. 169. - P. 40^6.

17. Shi В., Ranina J., Lorenzo A. et al. Neuronal apoptosis induced by HIV-1 Tat protein and TNF-alpha: potentiation of neurotoxicity mediated by oxidative stress and implications for HIV-1 dementia // J. Neurovirol. 1998. - V. 4. - P. 281-290.

18. New D.R., Maggirwar S.B., Epstein L.G. et al. HIV-1 Tat induces neuronal death via tumor necrosis factor-alpha and activation of non-N-methyl-D-aspartate receptors by a NF-kappaB-independent mechanism // J. Biol. Chem.

19. Zauli G., Gibellini D., Milani D. et al. Human immunodeficiency virus type 1 Tat protein protects lymphoid, epithelial, and neuronal cell lines from death apoptosis // Cancer Res. 1993. - V. 53. - P. 4481-4485.

20. Maggirwar S.B., Tong N., Ramirez S., Gelbard H.A., Dewhurst S. HIV-1 Tat-mediated activation of glycogen synthase kinase-3beta contributes to Tat

21. Romano G., Kasten M., De Falco G., Micheli P., Khalili K., Giordano A. Regulatory functions of Cdk9 and of cyclin T1 in HIV tat transactivation pathway gene expression // J. Cell Biochem. 1999. - V. 75. - P. 357-368.

22. Srivastava D.K., Tendler C.L., Milani D., English M.A., Licht J.D., Wilson S.H. The HIV-1 transactivator protein Tat is a potent inducer of the human DNA repair enzyme beta-polymerase // AIDS 2001. - V. 15. - P. 433^140.

23. Teitell M., Damore M.A., Sulur G.G., Turner D.E., Stern M.-H., Said J.W., Denny C.T., Wall R. TCL1 oncogene expression in AIDS-related lymphomas and lymphoid tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96. - P. 9809-9814.

24. Arora V.K., Fredericksen B.L., Garcia J.V. Nef: agent of cell subversion. // Microbes Infect. 2002 Feb. - V. 4, № 2. - P. 189-199.

25. Wei B.L., Arora V.K., Foster J.L., Sodora D.L., Garcia J.V. In vivo analysis of Nef function // Curr HIV Res. 2003 Jan. - V. 1, № 1. - P. 41-50.

26. Jamieson B.D., Aldrovandi G.M., Planelles V. et al. Requirement of human immunodeficiency virus type 1 nef for in vivo replication and pathogenicity // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 3478-3485.

27. Kestler H.W., Ringler D.J., Mori K. et al. Importance of the nef gene for maintenance of high virus loads and for development of AIDS // Cell. 1991. — V. 65.-P. 651-662.

28. Fackler O.T., Baur A.S. Live and let die: Nef functions beyond HIV replication // Immunity. 2002 Apr. V. 16, № 4. - P. 493-497.

29. Arendt C.W., Littman D.R. HIV: master of the host cell // Genome Biology -2001.-V. 2(11). Reviews 1030.1-1030.4.

30. Schwariz 0., Marechal V., Le Gall S. et al. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein // Nature Medicine 1996. - V. 2. - P. 338-342.

31. Levesque K., Finzi A., Binette J., Cohen E.A. Role of CD4 receptor down-regulation during HIV-l infection // Curr HIV Res. 2004 Jan. - V. 2, № 1. -P. 51-59.

32. James C.O., Huang M.B., Khan M., Garcia-Barrio M., Powell M.D., Bond V.C. Extracellular Nef protein targets CD4+ T cells for apoptosis by interacting with CXCR4 surface receptors // J. Virol. 2004 Mar. - V. 78, № 6. - P. 30993109.

33. Simmons A., Aluvihare V., McMichael A. Nef triggers a transcriptional program in T cells imitating single-signal T cell activation and inducing HIV virulence mediators // Immunity. 2001 Jun. - V. 14, № 6. - P. 763-777.

34. Meylan P.R., Baumgartner M., Ciuffi A. et al. The nef gene controls syncytium formation in primary human lymphocytes and macrophages infected by HIV type 1 // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1998. - V. 14. - P. 1531-1542.

35. Мудрик H.H., Андреева JI.E., Дубовая В.И. и др. Эффект гена nef ВИЧ-1 на соотношение клеток в костном мозге и периферической крови у трансгенных животных // Докл. Акад. наук. 1992. - Т. 325. - № 3. - С. 606-608.

36. Skowronski J., Parks D., Mariani R. Altered T cell activation and development in transgenic mice expressing the HIV-1 nef gene // EMBO J. -1993.-V. 12.-P. 703-713.

37. Piguet V., Trono D. The Nef protein of primate lentiviruses // Rev Med Virol. 1999. - Apr-Jun. - 9(2). - P. 111-20. Review.

38. Graziani A., Galimi F., Medico E. et al. The HIV-1 Nef protein interferes with phosphatidylinosol 3-kinase activation 1 //J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. -P. 6590-6593.

39. Greenwey A., Azad A., McPhee D. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein inhibits activation pathways in peripheral blood mononuclear cells and T-cell lines // Virol. 1995. - V. 69. - P. 1842-1850.

40. Wang J.K., Kiyokawa E., Verdin E., Trono D. The Nef protein of HIV-1 associates with rafts and primes T cells for activation // Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jan 4. - V. 97, № 1. - P. 394-399.

41. Krautkramer E., Giese S.I., Gasteier J.E., Muranyi W., Fackler O.T. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Nef Activates p21-Activated Kinase via Recruitment into Lipid Rafts // J. Virol. 2004 Apr. - V. 78, № 8. - P. 40854097.

42. Tobiume M., Lineberger J.E., Lundquist C.A., Miller M.D., Aiken C. Nef does not affect the efficiency of human immunodeficiency virus type 1 fusion with target cells // J. Virol. 2003 Oct. - V. 77, № 19. - P. 10645-10650.

43. Swingler et al. HIV-1 Nef intersects the macrophage CD40L signalling pathway to promote resting-cell infection Nature. 2003. - V. 424. - P. 213219.

44. Scowronski J., Parks D., Mariani R. Altered T cell activation and development in transgenic mice expressing the HIV-1 nef gene // EMBO J. -1993.-V. 12.-P. 703-713.

45. Pennington et al. Genes and Function. 1997. - V. 1. - P. 321-335.

46. Wu Y., Marsh J.W. Selective transcription and modulation of resting T cell activity by preintegrated HIV DNA // Science 2001 Aug. - V. 24, № 293 (5534).-P. 1503-1506.

47. Adriaansen H.J., Osman C., Van Dongen J.J.M. et al. Immunological marker analysis of mitogen-induced proliferating lymphocytes using BrdU incorporation or screening of metaphases // Scand. J. Immunol. 1990. - V. 32. -P. 687-694.

48. Quaranta M.G., Camponeschi В., Straface E., Malorni W., Viora M. Induction of interleukin-15 production by HIV-1 Nef protein: a role in the proliferation of uninfected cells // Exp. Cell Res. 1999. - V. 250. - P. 112— 21.

49. Otake K., Fujii Y., Nakaya T. et al. The carboxyl-terminal region of HIV-1 Nef protein is a cell surface domain that can interact with CD4+ T cells // J. Immunol. 1994. - V. 153. - P. 5826-5837.

50. Tangsinmankong N., Day N.K., Good R.A., Haraguchi S. Monocytes are target cells for IL-10 induction by HIV-1 nef protein // Cytokine. 2000. - V. 12. - P. 1506-1511.

51. Robichaud G.A., Poulin L. HIV type 1 nef gene inhibits tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis and promotes cell proliferation through the action of МАРК and JNK in human glial cells // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. - V. 16.-P. 1959-1965.

52. Collette Y., Dutartre H., Benziane A., Ramos-Morales F., Olive D. Physical and functional interaction of Nef with Lck-HIV-1 Nef induced T-cell signalling defects // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 6333-6341.

53. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. - V. 292. - P. 154-156.

54. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. -P. 7634-7638.

55. Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Establishment of germlinecompetent embryonic stem (ES) cells using differentiation-inhibiting activity (LIF) // Development. 1990. - V. 110. - P. 1341-1348.

56. McMahon A.P., Bradley A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a larch region or the mouse brain // Cell. 1990. - V. 62. -P. 1073-1085.

57. Nichols J., Chambers I., Smith A. Derivation of germ line competent embryonic stem cells with combination of interleukin-6 and solube interleukin-6 receptor//Exp. Cell Res. 1994. -V. 215. - P. 237-239.

58. Rose T.M., Bruce G. Oncostatin M is a member of a cytokine family that includes leukaemia inhibitory factor granulocyte colony stimulating factor and interleukin-6 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 88. - P. 8641-8645.

59. Conover J.C., Ip N.I., Poueymirou W.T., Bates В., Goldfarb M.P., DeChiara T.M., Yancopoulos G.D Ciliary neutrophic factor maintains thepluripotentiality of embryonic stem cells // Development. 1993. - V. 119. - P. 559-565.

60. Pease S., Braghetta P., Gearing D., Grail D., Williams R.L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media suplemented with recombinant leukemia inhibiting factor (LIF) // Dev. Biol. 1990. - V. 141. - P. 344-352.

61. Robertson E.J., Bradley A. Experimental approaches to mammalian embryonic development Cambridge: Cambridge University Press. 1986. — P. 475-508.

62. Миталипов Ш.М., Миталипова M.M., Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток in vitro и in vivo // Онтогенез. 1994. - № 25. - С. 19-27.

63. Wobus A.M., Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of pluripotent stem cell line derived from mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. - V. 152.-P. 212-219.

64. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. JI.: Наука. - 1988. — С. 34-49.

65. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. - V. 282. - P. 1145-1147.

66. Reddel R.R., Yeager T.R. Constructing immortalized human cell lines // Cur. Opion in Biotechnology 1999. - V. 10. - P. 455^169.

67. Kemler R., Morello D., Jacob F. In Cell lineage, stem cells an cell determination (Le Douarin, N, ed) North-Holland, Amsterdam. 1979. - P. 101-113.

68. Bain G., Kitchens D., Yao M., Huettner J.E., Gottlieb D.I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro // Dev. Biol. 1995. - V. 168. - P. 342-357.

69. Doetschman T.C., Eistetter H., Katz M. et al. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium // J. Embryol. and Exp. Morphol. 1985. - V. 87.-P. 27^15.

70. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 84248428.

71. Лойда 3., Госсрау P., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир. - 1982. - С. 64-67.

72. Межевикина Л.М., Мануйлова Е.С., Попов В.И., Савченкова И.П. Физико-химические аспекты роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в условиях культуры. Консервация генетических ресурсов. Пущино. - 1998. - С. 182-186.

73. Межевикина Л.М., Смирнов С.В., Смолихина Т.П., Глазко Т.Т., Костенко С.А., Мануйлова Е.С. Плюрипотентность и генетическое разнообразие эмбриональных стволовых клеток линии D3 в зависимости от условий культивирования // Цитология. 2001. - № 4. - 363 с.

74. Schuldiner M., Yanuka O., Itskovitz-Eldor J., Melton D.A., Benvensity N. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived human embryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 11307-11312.

75. Bagutti С., Wobus A.M., Fassler R., Watt F.M. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes. Comparison of wild-type and integrin-deficient cells // Dev. Biol. 1996. - V. 179. - P. 184-196.

76. Bar-Sagi D., Feramisco J.R. Microinjection of the ras oncogene protein into PC12 cells induces morphological differentiation // Cell. 1985. - V. 42. - P. 841-848.

77. Bondioli K.R., Westhusin M.E., Looney C.R. Production of identical bovine offspring by nuclear transfer // Theriogenology. 1990. - V. 33. - P. 165-173.

78. Stice S.L., Robl J.M. Current successes in cloning mammalian embryos // Age. 1989. - V. 12. - P. 83-88.

79. Campbell K., Me Whir J., Ritchie В., Wilmut I. Production of live lambs following nuclear transfer of cultured embryonic disc cells // Theriogenology. -1995.-V. 42.-P. 181.

80. Sanes J.K., Rubenstein L.R., Nicolas J.-F. EMBO J. 1986. - V. 5. - P. 3133-3142.

81. Hansen M.B., Nielsen S.E., Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill // J. Immunol. Methods. 1989. - V. 119, № 2. - P. 203-210.

82. Kirn S., Ikeuchi K., Byrn R. et al. Lack of a negative influence on viral grosth by the nef gene of human immunodeficiency virus type 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 9544-9548.

83. Маниатис "Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование". 1984.

84. Hammes S.R, Dixon E.P., Malim L.H. et al. Nef protein of human immunodeficiency virus type 1: evidence against its role as a transcriptional inhibitor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 9549-9553.

85. Shih C., Weinberg R.A. Isolation of a transforming sequence from a human bladder carcinoma cell line // Cell. 1982. - V. 29. - P. 161-169.

86. Land H., Parada L.F., Weinberg R.A. Tumorogenic conversion of primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes // Nature. -1983. V. 304. - P. 596-602.

87. Southern P.J., Berg P. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter // Mol. Appl. Genet. 1982. - V. 1. - P. 327-341.

88. Huttner K.M., Scangos G.A., Ruddle F.M. DNA-mediated gene transfer of a circular plasmid into murine cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76.-P. 5820-5824.

89. Chung S., Andersson Т., Sonntag K.C. et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines // Stem Cells. 2002. - V. 20. - P. 139-145.

90. Гордеева О.Ф., Мануйлова E.C., Гуляев Д.В., Гривенников И.А. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в культуре. Морфологические аспекты // Цитология. 2001. — Т. 43. - № 9. - 851 с.

91. Chang L.-J., Chen C.-H., Urlacher V., Lee T.-F. Differential apoptosis effect of primate lentiviral Vpr and Vpx in mammalian cells // J. Biomed. Sci. -2000.-V. 7.-P. 322-333.

92. Macreadie I.G., Thorburn D.R., Kirby D.M., Castelli L.A., de Rozario N.L., Azad A.A. HIV-1 protein Vpr causes gross mitochondrial dysfunction inthe yeast Saccharomyces cereviciae // FEBS Lett. 1997. - V. 410. - P. 145149.

93. Шугурова И.М., Бобрышева И.В., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Эффекты генов nef и tat вируса иммунодефицита человека типа 1 на клетки феохромоцитомы крысы PC 12 // Генетика. — 2000. — № 36. С. 1140-1146.

94. Beniasz P.D., Cullen B.R. Multiple blocks to human immunodeficiency virus type 1 replication in rodent cells // J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 98689877.

95. Briggs S.D., Lerner E.C., Smithgall Т.Е. Affinity of src family kinase SH3 domains for HIV nef in vitro does not predict kinase activation by nef in vivo // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 489-495.

96. Kohleisen В., Shumay E., Sutter G., Foerster R., Brack-Werner R., Nuesse M., Erfle V. Stable expression of HIV-1 Nef induces changes in growth properties and activation state of human astrocytes // AIDS. 1999. - V. 13. -P. 2331-2341.

97. Kosaka M., Nishina Y., Takeda M., Matsumoto R., Nishimune Y. Reversible effects of sodium butyrate on the differentiation of F9 embryonal carcinoma cells // Exp. Cell Res. 1991. - V. 192. - P. 46-51.

98. Мануйлова E.C., Гордеева О.Ф., Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки; спонтанная и направленная дифференцировка // Известия АН. 2001. - № 6. - С. 704-710.

99. Шугурова И.М., Мануйлова Е.С., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Влияние генов tat и nef вируса иммунодефицита человека типа 1 на эмбриональные стволовые клетки мыши в культуре // Цитология. 2001. -№43.-С. 415-416.

100. Green L.A., Tischler A.S. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V. 73. - P. 2424-2428.

101. Garcia J.V., Miller A.D. Serine phosphorylation-independent downregulation of cell-surface CD4 by nef II Nature. 1991. - V. 350. - P. 508-511.

102. Zauli G., Secchiero P., Rodella L. et al. HIV-1 Tat-mediated inhibition of the tyrosine hydroxylase gene expression in dopaminergic neuronal cells // J. Biol. Chem. 2000 Feb 11. - V. 275, № 6. - P. 4159-4165.

103. Гордеева О.Ф., Мануйлова E.C., Гуляев Д.В., Гривенников И.А. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в культуре. Морфологические аспекты // Цитология. 2001. - Т. 43. - № 9. - 851 с.

104. Федченко В.И., Межевикина JI.M., Гурьев С.О., Мануйлова Е.С. Поддержание устойчивой плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro в результате трансформации этих клеток геном lif // Цитология. 2001. - Т. 43. - № 4. - 407 с.

105. Рахманова А.Г., Виноградова Е.Н., Воронин Е.Н., Яковлев А.А. ВИЧ-инфекция. 21 век. 2004. - 694 с.

106. Белозеров Е.С, Змушко Е.И. ВИЧ-инфекция. Питер. - 2003. - 368 с.

107. Pavlakis G.N., Felber В.К. Regulation of expression of human immunodeficiency virus // New Biol. 1990 Jan. - V. 2, № 1. - P. 20-31.

108. Berkhout В., Gatignol A., Rabson A.B., Jeang K.T. TAR-independent activation of the HIV-1 LTR: evidence that tat requires specific regions of the promoter // Cell. 1990 Aug 24. - V. 62, № 4. - P. 757-767.

109. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1. — М.: Наука.-2003.-372 с.

110. Arendt Ch. W., Littman D. R. HIV: master of the host cell // Genome Biology. 2001. - V. 2, № 11. - Reviews 1030.1-1030.4.

111. ОСОБАЯ БЛАГОДАРНОСТЬ И ПРИЗНАТЕЛЬНОСТЬ МАНУЙЛОВОЙ Е.С., ПРЕКРАСНОМУ ЧЕЛОВЕКУ, ЗА МНОГОЛЕТНЮЮ ПОДДЕРЖКУ И УЧАСТИЕ, БЕЗ ПОМОЩИ КОТОРОЙ МНОГИЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ БЫЛИ НЕВОЗМОЖНЫ.

112. ХОЧУ ПОБЛАГОДАРИТЬ МОИХ ЗАМЕЧАТЕЛЬНЫХ ОППОНЕНТОВ МАНСУРА МУХАМЕТОВИЧА ГАРАЕВА И ИНГУ ПАВЛОВНУ АРМАН ЗА ВНИМАТЕЛЬНОЕ ОТНОШЕНИЕ К МОЕЙ РАБОТЕ И ЦЕННЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ, КОТОРЫЕ ПОЗВОЛИЛИ В ЗНАЧИТЕЛЬНОЙ СТЕПЕНИ УЛУЧШИТЬ ДИССЕРТАЦИЮ