Влияние клиностатирования на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.32, кандидат биологических наук Константинова, Наталья Александровна

• Константинова, Наталья Александровна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Константинова, Наталья Александровна

Список использованных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гравичувствительность клеток

1.2. Влияние гравитации на культивируемые клетки

1.2.1. Влияние мигрогравитации на культивируемые клетки

1.2.2. Влияние гипогравитации на культивируемые клетки

1.3. Влияние гравитации на клетки-предшественники

1.4. Влияние факторов космического полета на эмбриональное развитие

1.5. Характеристика эмбриональных стволовых клеток мыши

1.5.1. Факторы, поддерживающие эмбриональные стволовые клетки в 37 недифференцированном состоянии

1.5.2. Спонтанная и направленная дифференцировка эмбриональных 40 стволовых клеток

1.5.3. Роль ряда транскрипционных факторов (Oct-4, Рах-6, Prox-1, Ptx-2) 42 в процессах дифференцировки

1.5.4. Влияние физических, химических и биологических факторов 44 на начальные стадии развития эмбриональных стволовых клеток мыши

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1 50 и эмбриональных фибробластов мыши

2.1.1. Химические реактивы, культуральные среды и посуда для 50 культивирования клеток

2.1.2. Культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши линии 50 R

2.1.3. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов 51 мыши

2.1.4. Криоконсервация эмбриональных стволовых клеток линии R1 и 52 эмбриональных фибробластов мыши

2.2. Характеристики клиностата 53 2.2.1. Методы культивирования в условиях клиностатирования 54 эмбриональных фибробластов мыши, эмбриональных стволовых клеток мыши линии R

2.3. Методы оценки состояния эмбриональных стволовых клеток мыши 56 линии R

2.4. Клиностатирование эмбриоидных тел

2.5. Иммуноцитохимические методы исследования

2.5.1. Иммуноцитохимическое окрашивание кардиомиоцитов 59 антителами к тропонину I

2.5.2. Иммуноцитохимический тест эмбриональных стволовых клеток на 60 нейрональную дифференцировку

2.5.3. Иммуноцитохимия определения транскрипционного фактора Oct

2.6. Выявление актинового цитоскелета при помощи окраски 61 специфическими антителами на F-актин

2.7. Микроскопическое исследование полутонких срезов эмбриоидных 61 тел на световом и электронном микроскопе

2.8. Методы статистической обработки

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние клиностатирования на пролиферативную активность и 67 морфологию эмбриональных фибробластов мыши

3.2. Характеристика культивируемых эмбриональных стволовых клеток 72 мыши линии R

3.3. Влияние клиностатирования на образование колоний 78 эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1, культивируемых на подложке из эмбриональных фибробластов мыши

3.4. Влияние клиностатирования на образование колоний 84 эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1, культивируемых в присутствии фактора LIF

3.5. Оценка жизнеспособности клеток и образование эмбриоидных тел 89 после действия клиностатирования

3.6. Оценка плюрипотентного статуса эмбриональных стволовых клеток 94 по транскрипционному фактору Oct-4 после клиностатирования

3.7. Исследования влияния клиностатирования эмбриоидных тел на 96 последующую дифференцировку клеток in vitro

3.7.1. Кардиомиоцитарная дифференцировка

3.7.2. Нейрональная дифференцировка

3.8. Изучение морфологии эмбриоидных тел после действия 110 клиностатирования

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние клиностатирования на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro»

Эволюционные процессы на Земле осуществляются при постоянном участии гравитационного поля. Гравитация определяет нормальное развитие, функционирование и морфологию всех живых организмов в мире. В течение длительного периода становления жизни на планете все организмы приспосабливались к гравитационным условиям, начиная от становления структуры и функции отдельных органов, тканей и кончая целым организмом.

Известно много физиологических изменений, которые происходят во время пилотируемых космических полетов и при действии невесомости на животных. Некоторые из этих изменений включают атрофию мышечной системы и нарушения костного аппарата, перераспределение жидких сред организма, изменения в иммунной системе и сердечно-сосудистой системе организма человека [Газенко О.Г., 1984; Серова Л.В., 1996; Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1997; Оганов B.C. и Шнайдер B.C., 1997 и др.].

Исследования влияния факторов космического полета, в том числе микрогравитации, на процессы развития, дифференцировки и регенерации живых организмов (перепелов, тритонов и др.), проводившиеся с начала освоения космического пространства [Винников Я.А. и др., 1972; Мелехова О.П. и др., 1976; Сушков Ф.В., Руднева С.В., 1979; Оганесян С.С. и др., 1980; Мелешко Г.И., 1991; Гурьева Т.С. и др., 1993; Black S.B. et al., 1996; Mitashov V.I. et al, 1996; De Maziere A. et al., 1996; Almeida E.A. C. et al., 2006; Grigoryan E., et al, 2006], не потеряли свою актуальность до настоящего времени.

Использование различных биологических моделей позволило установить ряд важных закономерностей, в том числе возможность нормального развития живых систем при создании адекватных условий их существования в космическом полете [Сычев В.Н., 2000; Серова JI.B., 2002; Mitashov V.I. et al., 1996; Almeida E.A. C. et al, 2006; Grigoryan E., et al., 2006].

Однако исследования в космическом полете и при моделировании некоторых эффектов микрогравитации на Земле свидетельствуют о том, что нет живых систем, развитие которых бы не менялось в этих условиях. Изменения на клеточном уровне, происходящие в условиях как реальной, так и моделированной микрогравитации, не позволяют в настоящее время сформулировать общие закономерности этого воздействия. Поэтому вопрос о влиянии гравитации на клетку и механизмах развивающихся эффектов весьма актуален. Однако существует мнение, что чувствительность к изменению силы тяжести зависит от размеров биообъекта, чем он меньше, тем меньшее влияние стоит ожидать. По данным Парфенова Г.П. на исследуемые клетки действует не сила тяжести, а среда обитания биообъекта и только через нее последняя переходит на сами клетки [Парфенов Г.П., 1988]. В связи с этим необходимо наиболее тщательно подбирать условия исследования, дабы правильно интерпретировать полученные результаты.

Большое число экспериментальных данных, выполненных на различных типах клеток, свидетельствуют об их чувствительности к сдвигам гравитационной стимуляции, которые вызывают как структурные изменения, так и изменения функциональной активности клеток [Cogoli A. et al., 1988; 1989; Cogoli А., 1993, Cogoli М., 1992; Таирбеков М.Г., 1997; Романов Ю.А. и др., 2001; Буравкова Л.Б. и др., 2005].

Вопрос о механизмах влияния гравитационного фактора на организм на клеточном уровне крайне сложен и до сих пор остается открытым. Его решение позволит сформировать представления о процессах, которые служат основой перестроек живых организмов в условиях реальной и моделируемой микрогравитации и возможного использования результатов исследования в практике космической биологии и медицины.

Ввиду того, что смоделировать микрогравитацию в лабораторных условиях невозможно, широко используется клиностатирование, которое позволяет воспроизвести всего лишь некоторые эффекты мигрогравитации.

Но как модель, рандомизацию вектора гравитации можно использовать для изучения измененной гравитации [Moor D. et al., 1996]. Актуальность исследования.

Развитие клеточных технологий позволило получить убедительные доказательства того, что на рост и развитие клеток in vitro могут влиять не только широкий спектр биологически активных веществ, но и ряд механических факторов. Исследования проводились как на Земле при моделировании эффектов микрогравитации, так и в условиях мигрогравитации на борту биоспутников и космических станций. Показано, что микрогравитация меняет морфо-функциональное состояние клеток in vitro, их пролиферативную активность, экспрессию генов и др. Особенно выражены эти эффекты у механочувствительных дифференцированных клеток, таких как остеоциты, фибробласты, миоциты, эндотелиальные клетки. В последнее время проводятся исследования, результаты которых свидетельствуют о влиянии клиностатирования на клетки-предшественники, выделенные из костного мозга человека или предшественники остеобластов [Tschopp A. et al., 1984; Cogoli A. et al., 1993; Таирбеков М.Г., 2000; Buravkova L.B. et al., 2004; Facer S. R, 2005; Crawford-Young S.J., 2006].

Вопрос о том, может ли гравитационный фактор влиять на клетки, находящиеся на самых ранних этапах развития и дифференцировки, а именно на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) млекопитающих, остается открытым. Эти клетки характеризуются несколькими весьма важными свойствами: неограниченной способностью к пролиферации при сохранении нормального кариотипа, и возможностью дифференцироваться во все известные виды клеток организма [Evans M.J., 1981; Guan К. et al., 1998; Keller G., 2005]. Поэтому ЭСК и сформированные ими в определенных условиях эмбриоидные тела (ЭТ) служат удобной моделью для изучения механизмов, регулирующих начальные стадии как спонтанной, так и индуцированной различными воздействиями дифференцировки клеток. К тому же известно, что развитие ЭТ in vitro является моделью эмбриогенеза in vivo. В связи с этим актуальность нашей работы становиться значительнее, в виду того, что никто еще не рассматривал начальные стадии развития на данной модели в условиях клиностатирования. Возможно, ответная реакция на возникновения изменения силы тяжести позволит более прояснить на какой стадии развития живой системы стоит задумываться об обнаруженных изменениях, и какой характер будут они носить.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось исследование эффектов клиностатирования на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) in vitro.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Отработать экспериментальную модель для клиностатирования культивируемых ЭСК мыши на различных субстратах.

2. Оценить динамику образования колоний ЭСК мыши при клиностатировании.

3. Исследовать жизнеспособность ЭСК мыши и их способность образовывать ЭТ после моделирования эффектов гипогравитации.

4. Изучить морфологические изменения ЭСК на начальной стадии дифференцировки (стадия ЭТ) при воздействии клиностатирования.

5. Оценить способность ЭСК к последующей спонтанной дифференцировке после воздействия клиностатирования.

Научная новизна. Впервые установлено, что in vitro ЭСК мыши могут сохранять свои морфо-функциональные свойства в условиях моделирования гравитационных изменений. Показано, что чувствительность ЭСК к клиностатированию возрастает в зависимости от стадий развития клеток: от колоний ЭСК до сформированных ЭТ. Впервые показано, что клиностатирование ЭТ приводит как запаздыванию начала кардиомиоцитарной дифференцировки, так и к существенному уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов. Продемонстрировано, что рандомизация вектора гравитации приводит к стимулированию образования клеток ранних стадий нейрональной дифференцировки и незначительному снижению их количества на поздних стадиях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание процессов роста и дифференцировки ЭСК в условиях моделирования эффектов гипогравитации. Создана и успешно апробирована экспериментальная модель, включающая как ЭСК, так и эмбриоидные тела, позволяющая исследовать влияние клиностатирования на начальные этапы эмбрионального развития млекопитающих in vitro.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), Конференциях молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007 гг.), XIII Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2006 г.), 27-м, 28-м Международных симпозиумах по гравитационной физиологии (Осака, Япония, 2006 г; Сан-Антонио, Техас, США, 2007 г.), Школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (С-Петербург, 2008 г.).

Заключение диссертации по теме «Авиационная, космическая и морская медицина», Константинова, Наталья Александровна

Выводы:

1. Подобрана и успешно апробирована экспериментальные условия для исследования начальных стадий дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.

2. Клиностатирование (72 ч) эмбриональных стволовых клеток мыши на подложке из эмбриональных фибробластов не оказывало выраженного влияния на образование колоний. Культивирование ЭСК при добавлении фактора LIF в тех же условиях на 80 % снижало этот процесс.

3. Выявлена тенденция к увеличению жизнеспособности эмбриональных стволовых клеток при их пассировании после клиностатирования, при этом образование эмбриоидных тел, было снижено.

4. Показано, что при клиностатировании в эмбриоидных телах существенно снижаются процессы аутофагии и обнаруживается меньшее число апоптотических клеток.

5. Клиностатирование эмбриоидных тел приводило к замедлению начала дифференцировки клеток в кардиомиоциты и к уменьшению количества спонтанно сокращающихся кластеров в 2 раза.

6. Клиностатирование эмбриоидных тел существенно увеличивало количество (3-III тубулин-положительных клеток и незначительно снижало число МАР2-положительных клеток в ходе спонтанной нейрональной дифференцировки.

7. Показано, что эмбриоидные тела являются уникальной моделью для изучения начальных этапов дифференцировки в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.

Рекомендации:

• Для моделирования эффектов микрогравитации в наземных условиях при использовании ЭСК на стадии колоний рекомендуется применять экспозиции от 24 до 72 ч и фидерную подложку для их культивирования.

• Клиностатирование культивируемых ЭСК мыши с малыми скоростями может быть использовано для поддержания недифференцированного состояния.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многочисленные исследования свидетельствуют о различных серьезных изменениях живых систем как в условиях микрогравитации в космическом полете, так и при моделировании ее эффектов в наземных условиях (клиностатирование). Безусловно, клетка воспринимает гравитационный стимул и воспроизводит механизм ответных реакций, в результате которого запускается сложный комплекс изменений. Несмотря на то, что число публикаций о влиянии микрогравитации на морфофункциональные характеристики различных типов клеток растет, механизмы выявленных эффектов до сих пор остаются неизвестными. Поскольку ряд изменений на клеточном уровне под влиянием микрогравитации (реальной или моделированной) зачастую одинаков, то это дает нам основание предполагать схожесть механизмов ответа клеткой. Но в то же время ряд ответных реакций разных типов клеток отличен друг от друга, и тем самым это говорит о разной чувствительности клетки к гравитационному стимулу.

Исследование ЭСК, служащих удобной моделью для изучения механизмов, регулирующих начальные стадии как спонтанной, так и индуцированной дифференцировки клеток, является важным для понимания процессов, происходящих на начальной стадии развития клеточных популяций.

Эмбриональные фибробласты мыши, использующиеся в качестве подложки для культивирования ЭСК в недифференцированном состоянии, имеют, как было, показано свои ответные реакции на влияние гравитационного стимула. Обнаруженная стимуляция пролиферативной активности интактных эмбриональных фибробластов в условиях клиностатирования (144 ч), говорит о положительном влиянии изменения • гравитации на этот тип клеток. Однако полученные результаты, отличаются от данных ряда авторов, показавших, что пролиферативная активность таких клеток, как фибробласты человека, эндотелиальные, мезенхимальные клетки, остеобласты в культуре снижалась при аналогичных условиях клиностатирования [Таирбеков М. Г, 1999; Романов Ю. А. и др, 2001; Буравкова JI. Б. и др, 2004 и др.]. Возможно, подобная ответная реакция интактных эмбриональных фибробластов мыши связана с принадлежностью клеток к тому или иному типу. К примеру, известно, что некоторые низкодифференцированные клетки, такие, как эмбриональные клетки почек хомяка, эмбриональные фибробласты легких человека и эмбриональные клетки почек человека, в ответ на изменение гравитационного стимула реагировали по-разному: либо увеличением пролиферации, либо отсутствием изменений этого параметра [Zhukov-Verezhnikov N.N. et al, 1971; Gaubin Y. et al, 1991; Montgomery PO'B, 1978; Lorenzi G. et at, 1993]. Нельзя исключить, что активация пролиферации в ответ на микрогравитацию характерна только для определенного типа эмбриональных клеток. Безусловно, различия в пролиферативных свойствах фибробластов, по сравнению с другими типами клеток можно объяснить разной схемой5 экспериментов (сроками клиностатирования, скорость вращения и типом использованного устройства - 2Д, ЗД-воздействие).

Следует отметить, что исследования, осуществляемые как в космическом полете, так и при имитировании условий микрогравитации на земле говорят об изменении структуры цитоскелета [Gruener R, Hoeger G, 1990; 1993; Harris S.A. et al, 2000; Guignandon A. et al, 2001; Vassy J. et al, 2001]. Наши данные, полученные при исследовании инактивированных эмбриональных фибробластов мыши в условия длительного клиностатирования (72 ч), показали реорганизацию актиновых филаментов. При этом пролиферативная активность и морфологические свойства ЭСК, которые культивировались на данной подложке, не подверглись существенному изменению.

Несущественное изменение образования колоний ЭСК, полученное при клиностатировании (72 ч), согласуется с данными, описанными в литературе, когда достоверных изменений пролиферации не выявлялось, либо имелась тенденция к ее увеличению [Zhukov-Yerezhnikov N.N. et al., 1971; Gaubin Y. et al., 1991; Montgomery PO'B, 1978; Lorenzi G. et at., 1993]. Причина отсутствия влияния клиностатирования на колониеобразование ЭСК мыши связана, скорее всего, с принадлежностью клеток к ранней стадии развития. Они менее подвержены действию клиностатирования. По-видимому, культивирование ЭСК на стадии колоний создает условия клеткам для устойчивости к механическому стимулу.

В отличие от полученных результатов образования колоний при культивировании ЭСК в условиях клиностатирования на подложке из эмбриональных фибробластов мыши, культивирование клеток с добавлением в среду фактора LIF выявило некоторые изменения пролиферации этих клеток. Напомним, что исследования колониеобразования ЭСК в условиях клиностатирования с добавлением в среду культивирования фактора LIF, было осуществлено в двух вариантах: на чашках Петри и флаконах.

Культивирование ЭСК на флаконах на желатиновой подложке с добавление LIF в условиях клиностатирования показало достоверное снижение образования колоний и отсутствие значимых морфологических изменений при сравнении с контролем. При этом образование колоний при культивировании их на чашках Петри в условиях клиностатирования (48 ч) не привело к достоверному изменению пролиферации, зафиксирована лишь тенденция к ее уменьшению. Динамика образования колоний в контрольных образцах была противоположна в двух этих экспериментах.

Можно предположить, что способы культивирования ЭСК на разной культуральной посуде (флакон, чашка Петри) неодинаково влияли на адгезивные свойства клеток к пластику, обработанному желатином, помимо фактора LIF. При этом можно отметить, что на чашках Петри, несколько снижается открепление колоний в условиях клиностатирования, в отличие от флаконов. Этот факт подтверждался недостоверным снижением пролиферации клеток, что можно объяснить, скорее всего, только частичным влиянием клиностатирования на клетки, а, возможно, в большей степени использованием фактора LIF и разной культуральной посуды. Таким образом, подложка из эмбриональных фибробластов мыши способствует лучшему сохранению адгезии клеток к пластику и увеличению пролиферации ЭСК в условиях клиностатирования по сравнению со статическим контролем (изменения носят характер тенденции), в отличие от фактора, ингибирующего лейкемию.

Таким образом, в экспериментах с клиностатированием ЭСК для сохранения их недифференцированного состояния предпочтительнее использовать «фидерную» подложку, а не добавлять LIF.

Условия моделирования эффектов гипогравитации в некоторой степени влияли на жизнеспособность клеток в периоде последействия клиностатирования и способности их образовывать ЭТ, т.е. вступать на начальный путь дифференцировки.

В результате проведенных исследований в периоде последействия нами была выявлена тенденция к увеличению жизнеспособности клеток в последующих пассажах после воздействия изменения гравитации по сравнению с контролями. Обнаружено существенное увеличение размеров колоний (в 2 раза) в опытной серии по сравнению с дополнительным динамическим и статическим контролями. Процент жизнеспособных колоний в периоде последействия клиностатирования был одинаков и соответствовал норме: 3% для серий исследований по культивированию клеток в условиях измененной гравитации на «фидере» и с добавлением LIF. Количество жизнеспособных клеток, выявленных методом проточной цитофлуориметрии в серии исследований по клиностатированию клеток с добавлением фактора LIF, достоверно ниже в варианте, который подвергался клиностатированию, по сравнению со статическим контролем. Показано, что клетки в периоде последействия клиностатирования преимущественно гибнут по пути некроза.

Образование эмбриоидных тел, указывающих на начало процессов дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, имело тенденцию к снижению после воздействия длительного клиностатирования при культивировании клеток на «фидере».

Al-Ajmi N. et al, напротив, показали, что при клиностатировании 8 об/мин крысиных эмбриональных остеобластов двух линий (17/2.8 ROS линия и клетки кости плода крысы) происходит уменьшение числа клеток и их деления, и к тому же увеличивается дифференцировка этих клеток, в виду снижения экспрессии эндогенной щелочной фосфатазы [Al-Ajmi N et al, 1996].

Если на стадии колоний влияние измененной гравитации было не существенным, то на следующих этапах развития ЭСК, на стадии ЭТ, мы наблюдали разнообразные изменения, которые касались не только стадий дифференцировки, но и внешней и внутренней морфологии ЭТ.

Исследования влияния клиностатирования (72 ч) на ЭТ показало, что происходит последующее запаздывание начала спонтанной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты (р<0,01). И, как следствие, количество кластеров в ЭТ в максимальный период их появления была достоверно ниже (в 2 раза) в группе после действия измененной гравитации по сравнению с контролями. Однако сокращения в одном ЭТ в опытной группе незначимо отличались от контроля, наблюдалась лишь тенденция к уменьшению. Постоянное перемешивание среды культивирование как дополнительный фактор воздействия достоверно снижало возникновение количества этих сокращений по сравнению с контролем. Можно предположить, что на самом раннем этапе развития клеток, изменения в дифференцировке и скорости их развития, могут иметь место и быть существенными для дальнейшего развития клеток.

В литературе развитие ЭТ от ЭСК до полного его формирования (3-5 день) часто сравнивают с развитием эмбриона от бластоцисты (3,5 день) до стадии гаструляции (7,5 дней) [Desbaillets I., et al., 2000; Keller G., 2006]. В связи с этим, часто сопоставляют эмбриогенез в организме in vivo и создание in vitro условий эмбрионального развития. Поэтому подтверждением предположения о возможной задержке эмбрионального развития, обнаруженного нами, могут быть работы, описывающие исследования измененной гравитации на раннее развитие различных млекопитающих и позвоночных in vivo [Серова JI. В., 1996; Мелешко Г.И. и др, 1991; Гурьева Т.С. идр, 1993].

Мы также рассматривали появление спонтанной нейрональной дифференцировки в периоде последействия клиностатирования ЭТ (48 ч). Было показано, что в условиях клиностатирования ЭТ происходило существенное увеличение количества $-111 тубулин-положительных нейронов (на 50 %) и уменьшение количества МАР2-положительных нейронов (на 22 %) по сравнению с контролем. Постоянное перемешивание среды культивирования усиливало степень нейрональной дифференцировки ранних и поздних стадий. Таким образом, при определении маркера поздних стадий нейрональной дифференцировки мы повторяем ответную реакцию клеток при кардиомышечной дифференцировки, и как следствие, подтверждаем факт задержки эмбрионального развития. Однако повышенная экспрессия маркера нейрональной дифференцировки ранних стадий в культурах после клиностатирования, выявленная на сроке 18 суток культивирования ЭТ дала обратную картину. По-видимому, дифференцировка существенной части ЭСК на стадии нейробластов просто останавливалась, и соответственно своей терминальной стадии дифференцировки клетки достигали в значительно меньшем количестве. В связи с вышеизложенным, мы вправе предположить, что клиностатирование создает условия для определенной задержки дифференцировки ЭСК в нейрональном направлении применительно к поздним стадиям этого процесса.

Безусловно, процессы спонтанной дифференцировки ЭСК реагируют на условия культивирования, а также на эффекты таких механовоздействий, как клиностатирование и постоянное перемешивание среды.

Как было уже сказано выше, эмбриональное развитие животных в условиях измененной силы тяжести является весьма актуальной проблемой. Наша модель начальных стадий эмбрионального развития показала зачастую схожие ответные реакции на изменение силы тяжести, которое многими авторами изучалось как в условиях реальной, так и моделированной микрогравитации в лаборатории.

Рядом авторов было показано увеличение регенерации и скорости пролиферации разных органов у низших позвоночных (тритон) в условиях космического полета и после него, при снижении дифференцировки клеток [Mitashov V.I. et al., 1996; Almeida E.A.C. et al, 2007; Grigoryan E., et al, 2006].

Интересные данные получены на тритонах и амфибиях. Так показано, что развитие эмбрионов лягушки из оплодотворенного яйца в условиях микрогравитации происходит нормально. Формирование глаз, уха, хвоста лягушки не отличается от земных условий. Однако были обнаружены некоторые отклонения, связанные с развитием эмбриона внутри яйца: слегка раннее кортикальное сужение, более вегетативная локализация бластоцеле, и тенденция к формированию более толстой верхней части бластоцеле (большее количество клеток) [De Maziere A. et al, 1996].

В работах Сычева В.Н. и коллег также обнаружено, что, несмотря на возникающие аномалии эмбриона японского перепела, микрогравитация не оказывает существенных, необратимых изменений [Сычев В.Н., 2000].

Таким образом, самые видимые, отличимые от контроля изменения могут происходить на самых ранних стадиях развития эмбрионов (до формирования бластоцисты). Безусловно, сравнение эмбрионегеза в организме и на стадии развития ЭТ носит условный характер, в виду того, что дифференцировка клеток из ЭТ всего лишь модель. Поэтому в полной мере сравнивать наши результаты по влиянию измененной гравитации с результатами, полученными на различных видах реплилий и млекопитающих, будет некорректно. Можно говорить только о некоей аналогии.

После клиностатирования ЭТ обнаружено достоверно значимое снижение количества эмбриональных стволовых клеток, вступивших в процессы апоптоза, в эмбриоидных телах, подвергавшихся клиностатированию, а также наблюдалось отсутствие существенное снижение относительной площади пустот в клиностатируемых эмбриоидных телах по сравнению с контрольными ЭТ. Возможно, что отсутствие кавитационных полостей при клиностатировании может быть связано с замедлением процесса аутофагии и морфогенеза в ЭТ. Эти изменения могли быть причиной последующей задержки дифференцировки, обнаруженной нами после клиностатирования.

Суммируя результаты исследований, можно говорить об относительной чувствительности изучаемого объекта на снижения гравитационных возмущений. К тому же существенным является стадия развития эмбриона, на каком сроке подвергается он действию как клиностатирования, так и микрогравитации. По-видимому, чем раньше при эволюции живой организм оказывается в условиях измененной гравитации, тем ощутимее эмбриональные аномалии, которые, однако, на последующих стадиях эмбриогенеза не выявляются. Но, безусловно, ответом на вопрос о влиянии имитированной или реальной микрогравитации является то, что изменения имеют место, и развитие носит характер задержки, которая в последствии нивелируется.

Из утверждения Парфенова Г.П. о том, что измененная сила тяжести на клетки губительно не влияет, но встречаются некоторые смещения клеточных параметров, можно сделать вывод о чувствительности клеток к гравитационному возмущению, что может быть обратимо [Парфенов Г.П., 1988]. К тому же в исследованиях того времени отсутствовала возможность контролировать внешние параметры среды окружения, например, температурные изменения, что возможно, сказывалось на незначительных ответных реакциях клеток на микрогравитацию [Сушков Ф.В., Руднева С.В, 1979]. Процессы развития идут в измененных условиях нормально, что показано и в нашей работе, характер задержки развития не оказывает губительных отличий от контроля.

Таким образом, эффект клиностатирования проявляется в основном на последующих стадиях развития ЭСК. Если на стадии колоний практически нет изменений, можно говорить только о тенденции, то на стадии ЭТ и при спонтанной дифференцировки клеток в кардиомышечном и нейрональном направлениях выявлялись весьма существенные изменения.

Подводя итог полученным результатам, можно сказать, что нами была к разработана модель, которую можно использовать для исследования начальных стадий дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в условиях моделирования эффектов гипогравитации.

Положения, выносимые на защиту.

1. Оценка двух способов культивирования ЭСК мыши линии R1 в условиях клиностатирования выявила большую эффективность использования в качестве подложки эмбриональных фибробластов мыши, позволяющей осуществлять длительное моделирование эффектов гипогравитации.

2. Изменение гравитационного фактора не оказывает влияния на пролиферацию, а также на последующую жизнеспособность и образование ЭТ недифференцированными ЭСК мыши линии R1.

3. На начальных стадиях дифференцировки ЭСК in vitro происходило замедление начала спонтанной дифференцировки в кардиомиоциты, существенное увеличение количества (В-Ш тубулин положительных нейронов и уменьшение количества МАР2-положительных нейронов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Константинова, Наталья Александровна, 2008 год

1. Буравкова JI. Б., Мерзликина Н. В., Романов Ю. А. Первичные эффекты, наблюдаемые при клиностатировании культивируемых мезенхимальных стволовых клеток // Цитология. 2004. Т. 46. № 10. С. 900-901.

2. Буравкова Л.Б., Рыкова М.П., Антропова Е.Н., Григорьева О.В. Модификация метода изучения цитотоксической активности лимфоцитов-естественных киллеров для полетных экспериментов в космосе// Авиакосмич. и эколог, медицина. 2005. № 1. С. 55-59.

3. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 1. Живые нити // Соросовский образовательный журнал. 1996а. № 2. С. 36-43.

4. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 2. Цитоскелет, способный чувствовать и помнить // Соросовский образовательный журнал. 19966. № 4. С. 4-10.

5. Васильев Ю.М. Клетка как чудо архитектуры. Ч. 4. натяжение цитоскелета контролирует архитектуру клетки и тканей // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 6. С. 2-6.

6. Вермель А. Е. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике // Клиническая медицина. 2004, №1. С. 5-11.

7. Викторов И. В. Стволовые клетки мозга млекопитающих: биология стволовых клеток in vivo и in vitro. Известия ан. серия биологическая. 2001, №6, С. 646-655.

8. Ю.Газенко О.Г. Человек в космосе // Косм, биология и авиакосм. мед. 1984. Т. 18. № 1.С. 3-8.

9. П.Гинзбург А.С. Возникновение билатеральной симметрии в яйцах осетровых рыб // Докл. АН СССР. 1953. Т. 90. № 3. С. 953.

10. Глазко Т.Т., Межевикина Л.М., Бойко А.А., Фесенко Е.Е. «Цепная» кариотипическая эволюция эмбриональных стволовых клеток линии R1 in vitro // Цитология. 2005. Т. 47. № 8. С. 679-685.

11. Гланс С. Медико-биологическая статистика // М. Практика. 1999.

12. Гордеева О.Ф., Мануйлова Е.С., Гривенникова И. А. и др. Характеристика плюрипотентной популяции на начальных стадиях дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в культуре // Доклады Академии наук. 2002. Т. 386. № 4. С. 555-558.

13. Гривенников И.А., Мануйлова Е.С. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития. В кн.: Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Под ред. Академика Свердлова Е.Д. М.: Наука. 2003. Т. 1. С. 290-306.

14. П.Григорьев А.И., Егоров А.Д. Длительные космические полеты. В кн.: Человек в космическом полете. Москва. Наука. 1997. Т. 3. Кн. 2. С. 368447.

15. Гурьева Т.С, Дадашева О.А, Мелешко Г.И, Шепелев Е.Я, Боря К, Сабо В. Эмбриональное развитие перепела в невесомости // Космическая биология и авиакосмическая медицина. 1993. Т. №. С. 7376.

16. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития (генетический аспект) / Учебник. М.: Изд-вл МГУ. 2002. 264 С.

17. Корочкин Л.И, Ревищин Ф.В, Охотин В.Е. Нейральные стволовые клетки и их значение в восстановительных процессах в нервной системе // Морфология. Обзорные и общетеоретические статьи. 2005. С. 7-16.

18. Крылова Т.А, Зенин В.В, Мусорина Н.С. Баранов В.С, Бичевая Н.К, Корсак В.С, Никольский Н.Н, Пинаев Г.П, Полянская Г.Г. Получение и характеристика постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека//Цитология. 2003. Т. 45. № 12. С. 1172-1178.

19. Крылова Т.А, Михайлова Н.А, Зенин В.В, Пинаев Г.П, Никольский Н.Н, Полянская Г.Г. Постоянные линии эмбриональных стволовых клеток человека // Цитология. 2005. Т. 47. № 2. С. 121-128.

20. Мануйлова Е.С, Гордеева О.Ф, Гривенников И.А, Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки: спонтанная и направленная дифференцировка // Известия Ан. Серия биологическая. 2001. №6. С. 704-710.

21. Мелешко Г.И., Шепелев Е.Я., Гурьева Т.С., Бодя К., Сабо В. Эмбриональное развитие птиц в условиях невесомости // Космическая биология и авиакосмическая медицина. 1991. Т. 25. № 1. С. 37-39.

22. Мелехова О.П., Шилейко JI.B., Игнатьева О.Ю. Влияние клиностатирования на эмбриональное развитие птиц // В сб. Гравитация и организм. 1976а.

23. Мелехова О.П., Шилейко JI.B., Бурлакова О.В. Клиностатирование зародышей амфибий различного возраста // В сб. Гравитация и организм. 19766.

24. Мерзликина Н.В. Морфофункциональные особенности культивируемых эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененной силы тяжести // Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 2006.

25. Пальмбах Л.Р. Сила тяжести и развитие позвоночных животных // В кн.: под редакцией Черниковского В.Н. Проблемы космической биологии. 1976. Т. 33. С. 74-92.

26. Пальцев М.А., Смирнов В.Н., Романов Ю.А., Иванов А.А. Перспективы использования стволовых клеток в медицине // Вестник Рос. АН. 2006. Т. 76. № 2. С. 99-111.

27. Парфенов Г.П. Невесомость и элементарные биологические процессы // Серия: «Проблемы космической биологии». Л. 1998. Т. 57.

28. Репин В. С. Эмбриональная стволовая клетка (от фундаментальной биологии к медицине). Успехи физиологических наук. 2001, Т. 32. №1. С. 3-18.

29. Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Буравкова Л.Б. Гравичувствительность эндотелия человека // Авиакосм, и экол. медицина. 2000. Т. 34. № 4. С. 23-26.

30. Романов Ю. А., Буравкова Л. Б., Кабаева Н. В. И др. Изменение актинового цитоскеклета и скорости репарации механически поврежденного монослоя эндотелия человека в условиях клиностатирования // Авиакосм, и экол. медицина. 2001. Т. 35. № 1. С. 37-40.

31. Савченко В.Г. Реакция трансплантат против лейкоза // Вестник Рос. АМН. 2004. №9. С. 61-71.

32. Сапин М. Р., Сивоглазов В. И. Анатомия и физиология человека (с возрастными особенностями детского организма). Учебное пособие для судентов средних педагогических учебных заведений. Изд. 4-е // 2004. 448 С.

33. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. 2000. Т. 65. № 8. С. 1029-1046.

34. Серова Л. В. Невесомость и приспособительные возможности млекопитающих / М. ИПГМ. 1996. С. 128.

35. Серова Л.В. Невесомость и онтогенез млекопитающих // Актовая речь. 2002. 34 С.

36. Сидоренко Е.В. Методы математической обработки в психологии // СПб. Речь. 2001.С. 72-109.

37. Сухих Г.Т., Малайцев В.В. Нейральная стволовая клетка: биология и перспективы нейротрапеплантации // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2001. Т. 131. №3. С. 244-255.

38. Сушков Ф.В., Руднева С.В. Эксперименты с культурами клеток млекопитающих //Биологические исследования на биоспутниках «Космос». М.: Наука. 1979. С. 199-213.

39. Сычев В.Н. Исследование влияния невесомости на биологические объекты звенья замкнутых экологических систем жизнеобеспечения и создание технологий их культивирования // Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва. 2000.

40. Таирбеков М.Г. Грпвитационная биология клетки (теория и эксперимент). Москва. 1997. 128 С.

41. Таирбеков М.Г. Клетка как гравитационно-зависимая биомеханическая система//Авиакосм, и экол. медицина. 2000. Т. 34. №2. С. 3-17.

42. Таирбеков М.Г. Молекулярные и клеточные основы гравитационной чувствительности//Москва. 2002. 104 С.

43. Туровецкий В.Б, Андреев А.И, Буравкова Л.Б, Рубин А.Б. Использование микрофлуориметрического анализа для изучения влияния измененной силы тяжести на изолированные лимфоциты селезенки мышей // Авиакосм, и экол. медицина. 1999. Т. 33. № 2. С. 12-15.

44. Фултон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки // М: Мир. 1987. 120 С.

45. Хансон К.П, Моисеенко В.М, Балбуева И. А. Использование клеточных технологий в онкологии // Вестник Рос. АМН. 2004. № 9. С.58-61.

46. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию // Академкнига. Москва. 2004. 495 С.

47. Чуйкин И. А. Лянунова М.С, Поспелов В. А. Механизмы антипролиферативного действия ингибиторов деацетилаз гистонов на эмбриональные стволовые клетки мыши // Цитология. 2006. Т. 48. № 8. С. 674-683.

48. Чуйкин И.А, Лянгузова М.С, Поспелов В.А. Сигнальные пути, определяющие пролиферативную активность эмбриональных стволовывх клеток мыши // Цитология. 2007. Т. 49. № 5. С. 370-384.

49. Щегельская Е.А, Микулинский Ю.Е, Ревищин А.В, Омельченко Е.А, Кулынин В.Е, Грищенко В.И, j Коро^кин !я.И. Индуцированная дифференцировка клеток стромы костного могза мыши в нервные клетки //Цитология.2000. Т. 44. № 7. С. 637-641.

50. Ярыгин В.Н. Тканевые клеточные системы основа биомедицинских клеточных технологий нового поколения: контуры идеологии // Вестник Рос. АМН. 2004. № 9. С. 12-18.

51. A1-Ajmi N, Braidman IP, Moore D. Effect of clinostat rotation on differentiation of embryonic bone in vitro // Adv Space Res. 1996. V. 17(6-7). P. 189-92.

52. Ancel P, Raynaud A. Preliminary findings on the orientation of the embryo in the blindworm egg (Anguis fragilis) // С R Hebd Seances Acad Sci. 1959. V. 248(8). P. 1087-1090.

53. Ancel P, Raynaud A. New observations on the orientation of the embryo in the egg of the blindworm (Anguis fragilis L.) // С R Hebd Seances Acad Sci. 1960. V. 250. P. 39-42.

54. Arase Y, Nomura J, Sugaya S, Sugita К et al. Effects of 3-D clino-rotation on gene expression in human fibroblast cells // Cell. Biol. Int. 2002. V. 26(3). P. 225-233.

55. Babaie Y, Herwig R, Greber B, Brink T.C, Wruck W, Groth D, Lehrach H, Burdon T, Adjaye J. Analysis of Oct4-dependent transcriptional networks regulating self-renewal and pluripotency in human embryonic stem cells // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 500-510.

56. Bader A. Al-Dubai H. and Weizer G. Leukemia inhibitory factor modulates cardiogenesis in embryoid bodies in opposite fashions // Circ. Res. 2000. V. 86. P. 787-794.

57. Bain G., Kitchens D.,Yao M., Huettner J.E., Gottlieb D.I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro // Dev. Biol. 1995. V. 168. P. 342357.

58. Bagutti C., Wobus A.M., Fassler R, Watt F.M. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes: Comparison of wild-type and integrin-deficient cells // Devel. Biol. 1996. V. 179. P. 184-196.

59. Becher В., Cogoli A., Cogoli-Greuter M., Muller O., Hunzinger E., Criswell S.B. Activation of microcarrier-attached lymphocytes in microgravity // Biotech. Bioeg. 1992. V. 40. P. 991-996.

60. Black S, Larkin K, Jacqmotte N, Wassersug R, Pronych S, Souza K. Regulative development of Xenopus laevis in microgravity // Adv Space Res. 1996. V. 17(6-7). P. 209-217.

61. Boheler K.R., Czyz J., Tweedie D., Yang H.T., Anisimov S.V., Wobus A.M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes // Circ. Res. 2002. V. 91. P. 189-201.

62. Boonyaratanakornkit J.B., Cogoli A., Li C.-F., Schopper Т., Pippia P., Galleri G., Meloni M.A., and Hughes-Fulford M. Key gravity-sensitive signaling pathways drive T-cell activation // FASEB J. 2005. P. 2020-2.

63. Buravkova L.B, Romanov Y.A. The role of cytoskeleton in cell changes under condition of simulated microgravity // Acta Astronaut. 2001. V. 48(5-12). P. 647-50.

64. Buravkova L.B., Rykova M.P., Grigorieva O.V., Andropova E.N. Cell interactions in microgravity: cytotoxic effects of natural killer cells in vitro // J. Gravit. Physiol. 2004. V. 11(2). P. 177-180.

65. Burdon Т., Smith A., Savatier P. Signalling, cell cycle and pluripotence in embryonic stem cells // Trends in Cell. Biol. 2002. V. 12. P. 432-438.

66. Carmeliet G. and Bouillon R. The effect of microgravity on morphology and gene expression of osteoblasts in vitro // FASEB J. 1999. V. 13. P. SI29-S134.

67. Cartwright P., McLean C., Sheppart A., Rivett D., Jones K., Dalton S. LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism // Dev. 2005. V. 132. P. 885-896.

68. Chambers I., Smith A. Self-senewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells // Oncogene. 2004. V. 23. P. 7150-7160.

69. Cogoli A., Bechler В., Muller O., Hunzinger E. Effect of microgravity on lymhocyte activation // In: Biorack on Spacelab D-l. Ed. by Longton N. David V. ESTEC.ESA Publications Division. 1988. P. 89-100.

70. Cogoli A., Inversen Т.Н., Johnsson A., Mesland D., Oster H. Cell biology // In: Life Science Research in Space. Ed. by Oser H., Battrick B. Paris, Europeun Spase Agency. 1989. P. 49-64.

71. Cogoli M. The fast rotating clinostat: a history of its use in gravitational biology and a comparison of ground-based and flight experiment results // ASGSB Bull. 1992. V. 5(2). P. 59-67.

72. Cogoli A., Bechler В., Cogoli-Greuter M., Criswell S.V., Joller P., Hunzinger E., Muller O. Mitogenic signal transduction in T lymphocytes in microgravity // J. Leukocyte Biol. 1993. V. 53. P. 569-575.

73. Cogoli A. The effect of hypogravity and hypergravity on cells of the immune system // J. Leukocyte Biol. 1993. V. 54. P. 259-268.

74. Cogoli A. Gravitational physiology of human immune cells: a review of in vivo, ex vivo and in vitro srudies // J. Gravit. Physiol. 1996. V. 3. P. 1-9.

75. Conover J.С., Ip N.Y., Poueymirou W.T., Bares B. et al. Ciliary neutrophic factor maintains the pluripotentiality of embryonic stem cells //Development. 1993. V. 119. P. 559-565.

76. Coucouvanis E. and Martin G.R. Signals for death and survival: a two-step mechanism for cavitations in the vertebrate embiyo // Cell. 1995. V. 83. P. 297-287.

77. Crawford-Young S. J. Effects of microgravity on cell cytoskeleton and embryogenesis // Int. J. Dev. Biol. 2006. V. 50. P. 183-191.

78. De Maziere A, Gonzalez-Jurado J, Reijnen M, Narraway J, Ubbels GA. Transient effects of microgravity on early embryos of Xenopus laevis // Adv Space Res. 1996. V. 17(6-7). P. 219-223.

79. Desbaillets I., Ziegler U., Groscurth P., and Gassmann M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse emvryogenesis // Exp. Physiol. 2000. V. 85. P. 645-651/

80. Doetschman T.C., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro sevelopment of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium // J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. V. 87. P. 27-45.

81. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. V. 292. P. 154-158.

82. Facer S. R, Zaharias R. S, Andracki M. E. et al. Rotary culture enhances pre-osteoblast aggregation and mineralization // J. Dent. Res. 2005. V. 84(6). P. 542-547.

83. Foshay K., Rodriguez G., Hoel В., Narayan J. and Gallicano I. JAK/STAT3 directs cardiomyogenesis within murine embryonic stem cells in vitro // Stem Cells. 2005. V. 23. P. 530-543.

84. Fraichard A. Chassande O., Bilbaut G., Gehay C., Savatier P., Samarut J. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons//J. Cell Sciens.1995. V. 108. P. 3181-3188.

85. Gaubin Y., Croute F., Pianezzi В., Prevost MC & Soleilvahoup JP. Effects of hypergravity on adherent human cells // Microgravity Sci. Technol. 1991. V. 3. P. 246-250.

86. Chambers, Smith A.G. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells // Jncogene. 2004. V. 23. P. 7150

87. Grigorieva O.V., Buravkova L.B., Rykova M.P. Cytotoxic activity of NK lymhocytes in vitro under microgravity // J. Gravit. Physiol. 2005. V. 12(1). P. 173-174.

88. Grigoryan E., Almeida E., Domaratslcaya E., PoplinskayaV., Aleinikova K., Tairbekov M., Mitashov V. Experiment "Regeneration" Performed Aboard The Russian Spacecraft Foton-M2 // J. Gravit. Physiol. 2006. V. 13(1). P. 189-192.

89. Grimm D., Kossmehl P., Shakibaei M., Schulze-Tabzil G., Pickenhabn H., Bauer J., Paul M., and Cogoli A. Effects of simulated microgravity on thyroid carcinoma cells // J. Gravit. Physiol. 2002. V. 9(1). P. 253-256.

90. Guan K., Rohwedel J., Wobus A. M. Embryonic stem cell differentiation models: cardiogenesis, myogenesis, neurogenesis, epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro II Cytotechnology. 1999. V. 30. P. 211-226.

91. Guignandon A., Lafage-Proust M.-H., Usson Y., Alexandre C., Vico L. Cell cycling determines integrin-mediated adhesion in ostejblastic ROS 17/2.8 cells exposed to space-related conditions // FASED J. 2001. V. 10. P. 1096-1102.

92. Gruener R., Hoeger G. Vector-free gravity disrupts synapse formation in cell culture // Am. J. Physiol. 1990. V. 258. P. 489-494.

93. Gruener R., Roberts R., Reitstetter R. Exposure to microgravity alters properties of cultured muscle cells // ASGSB Bulletin 7. 1993. P. 65.

94. Harris S.A, Zhand M, Kidder L.S, Evans G.I, Spelsberg T.C, Turner R.T. Effects of orbital spaceflight on human osteoblastic cell physiology and gene expression // Bone. 2000. V. 26. P. 325-331.

95. Hughes-Fulford M, Lewis M.L. Effects of microgravity on osteoblast growth activation//Exp. Cell Res. 1996. V. 224. # 1. P. 103-109.

96. Hughes-Fulford M. The role of signaling pathways in osteoblast gravity perception // J. of Gravit. Physiol. 2002. V. 9(1). P. 257-259.

97. Imada K, Leonard WJ. The Jak-STAT pathway // Mol. Immunol. 2000. V. 37. P. 1-11.

98. Jack J.W.A. van Loon. Some history and use of the random positioning machine, RPM, in gravity related research // Advances in Space Research. 2007. № 39. P. 1161-1165.

99. Jack J.W.A. van Loon. The Gravity environment in space experiments // In: biology in space and life on eartheffects of spaceflight on biological systems. 2007. P. 17-32.

100. Klaus D.M. Clinostats and bioreactors // Gravit. Space. Biol. Bull.2001. V. 14. P. 55-64.

101. Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine // Genes & Dev. 2006. V. 19. P. 1129-1155.

102. Kishimoto T, Taga T, Akira S. Cytokine signal transduction // Cell. 1994. V. 76. P. 253-262.

103. Klement B.J,George B.J, Young Q.M, and Spooner B.S. Tissue growth and mineralization in the rotating wall vessel and in spaceflight // J. Gravit. Physiol. 2004. V. 11(3). P. 67-81.

104. Kumei Y. Phenotypes, signaling, and apoptotic features of osteoblasts in microgravity // J. Gravit. Physiol. 2006. V. 13(1). P. 125-128.

105. Kunath Т., Arnaud D., GD Uy., Jkamoto I., Chureau C., Yamanaka Y., et al. Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts // Development. 2005. V. 132. P. 1649-1661.

106. Kurosawa H. Kimura M., Noda T. and Amano Y. Effect of oxygen on in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells // J. Biosience and Bioengineering. 2006. V. 101. № 1. P. 26-30.

107. Landis W.J., Hodgens K.J., Block D., Toma C.D., Gerstenfeld L.C. Spaceflight effects on cultures embryonic chick bone cells // J. Bone Miner. Res. 2000. V. 15. № 6. P. 1099-1112.

108. Levine B. and Yuan J. Autophagy in cell death: an innocent convict? // J. Clin. Invest. 2005. V. 115. P. 2679-2688.

109. Loesberg W.A., van loon JJWA., Walboomers XF, Jansen J.A. On gravity and grooves // J. Gravit. Physiol. 2006. V. 13(1). P. 129-130.

110. Lorenzi G., Gmiinder F.K. Cogoli A. Cultivation of hamster kidney ceils in a dynamic cell culture system in space (Spacelab 1ML-1 mission)//Microgravity Sci. Technol. 1993. V. 6. P. 3 4-3 8 .

111. Malzev V.A., Rohwedel J., Hesheler J., Wobus A.M. Embryonic stem cells differentiate in vitro into cardiomyocytes representing sinusoidal, atrial and ventricular cell types //Mech. Dev. 1993. V. 44. P. 41-50.

112. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell kine from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1981. V. 78. P. 7634-7638.

113. Martin G.R., Evans M.J. Differentiation of clonal line of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 1441-1445.

114. Matsui Y., Zsebo K., Hogan D.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

115. Meyers V.E, Zayzafoon M, Gonda S.R, Gathings W. E, and McDonald J.M. Modeled microgravity disrupts collagen I/Integrin signaling during osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells // J. of Cell Biol. 2004. V. 93. P. 697-707.

116. Mirzlikina N.V, Buravkova L.B, Romanov Yu.A. The primary effects of clinorotation on cultured human mesenchymal stem cells // J. Gravit. Physiol. 2004. V. 11(2). P. 194-194.

117. Mitashov VI, Brushlinskaya NV, Grigoryan EN, Tuchkova SYa, Anton HJ.Regeneration of organs and tissues in lower vertebrates during and after space flight // Adv. Space. Res. 1996. V. 17(6-7). P. 241-55.

118. Montgomery PO'B, Cook J. E, Reynolds R. C. et. at. The response of single human cells to zero gravity // In Vitro. 1978. V. 14. P. 165-173.

119. Moore D, Cogoli A. Gravitational and spase biology at the cellular level. In Biological and medical reserch in space // An overview of life sciences reseach in microgravity. Ed. by Moore D, Bie P, Oser H. Springer. 1996. P. 1-107.

120. Neubert J, Schatz A, Briegleb W, Bromeis B, Linke-Hommes A, Rahmann H, Slenzka K, Horn E. Early development in aquatic vertebrates in near weightlessness during the D-2 Mission STATEX project // Adv Space Res. 1996. V. 17(6-7). P. 275-279.

121. Nichols J, Evans E.P, Smith A.G. Establishment of germlinecompetent embryonic stem (ES) cells using differentiation-inhibiting activity (LIF) // Development. 1990. V. 110. P. 1341-1348.

122. Nichols J, Chambers I, Smith A. Derivation of germ line competent embryonic stem cells with combination of interleukin-6 and solube interleukin-6 receptor // Exp. Cell. Res. 1994. V. 215. P. 237239.

123. Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K, Niwa H, Klewe-Nebenius D, Chambers I, Scoler H, Smith S. Formation pf pluripotent stem cells in themammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct-4 // Cell. 1998. V. 95. P. 379-391.

124. Pasteels J. The morphogenetic role of the cortex of the amphibian egg // Adv. Morphogen. 1964. V. 3. P. 27.

125. Pease S., Braghetta P., Gearing D, et al. Isolation of embryonic stem (ES) ceils in media suplemented with recombinant leukemia inhibiting factor (LIP) // Develop. Biol. 1990. V. 141. P. 344-352.

126. Popov V.V., Palmbach L.R., Kuznetsov E.V. The influence of variable gravitational fields on the embryonic development of some ecaudate amphibians // Life Sciencees and Space Research, XIII. Akad. Verlag. Berlin .1975. P. 29.

127. Qu X., Zou Z., Sun Q., Luby-Phelps 1С., Cheng P., Hogan R.N., Gilpin C. and Levine B. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development// Cell. 2007. V. 128. P. 931-946.

128. Raz R., Lee C.-K., Cannizzaro L.A., d'Eustachio P., Lary D. Essential role of STAT 3 for embryonic stem cell pluripotency // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 2846-2851.

129. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L. Donovan P.J. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture // Nature. 1992. V. 359. P. 550-551.

130. Robertson E.J. Embryo-derived stem cell lines. In book Terarocarcinomas and embryonic stem cells // A Practical Approach. Ed. by Rorertson E.J. Oxford. Washington DC: IRL Press. 1987. P. 71-112.

131. Rose T.M., Bruce G. Oncostatin M is a member of a cytokine family that includes leukemia inhibitory factor granulocyte colony stimulating factor and interleukin-6 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 88. P. 86418645.

132. Saitou M., Fujimoto K., Doi Y. et al. Occludin-deficient embryonic stem cells can differentiate into polarized epithelial cells bearing tight junctions//J. Cell. Biol. 1998. V. 141. P. 397-408.

133. Sarcar D., Nagava Т., Koga K., Kambe F., Nomura Y., Seo H. J. Rotation in clinostat results in apoptosis of osteoblastic ROS 17/2.8 cells// J. of Gravit. Physiol. 2000. V. 7. № 2. P. 71-2.

134. Saretzki G., Armstrong L., Leake A., Lako M., von Zglinicki T. Stress defense in murine embryonic stem cells is superior to that of various differentiated murine cells // Stem Cells. 2006. V. 22. P. 962-971.

135. Scholer H.R., Dressier G.R., Balling R., Rohdewohld H., Gruss P. Oct-4: A germiline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex // EMBO J. 1990. V. 9. P. 2185-2195.

136. Schuldiner et al., 2000 Schuldiner M, Yanuka O, Itskovitz-Eldor J, Melton DA, Benvenisty N. Effects of eight growth factors on thedifferentiation of cells derived from human embryonic stem cells // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97(21). P. 11307-12.

137. Skok M.V, Koval L.M., Petrova Y.I., Lykhmus O.Y., Kolibo D.V., Romanyuk S.I., Yevdokimova N.Y., Komisarenko S.V. The effect of simulated microgravity on hybridoma cells // Acta Astronaut. 2005. V. 56(8). P. 721-8.

138. Smith A.H., Abbott U.K. Embryonic development during chronic acceleration // Ibid. 1985

139. Tairbekov M.G. Mechanisms of the gravitational sensitivity cells // J. Gravit. Physiol. 2004. V. 11(2). P. 181-183.

140. Tanaka S., Kunath Т., Hadjantonakis A.K., Nagy A., Rossant J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4 // Science. 1998. V. 282: P. 2072-2075.

141. Terada N., Hamazaki Т., Oka M et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion // Nature. 2002. V. 416. P. 542-545.

142. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor. J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic germ cells lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

143. Topper J.N., Gimbrone M.A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype // Mol. Med. Today. 1999. V. 5. P. 40-46.

144. Tremblay P., Gruss P. Pax: genes for mice and men // Pharmat. Ther. 1994. V. 1994. P. 205-226.

145. Tremor J. W., Souza K. A. Influence of clinostat rotation on the fertilized amphibian egg // Space Life Sci. 1972. V. 3. P. 179.

146. Tschopp A, Cogoli A, Lewis M. L. et. al. Bioprorocessing in space: human cells attach to beads in microgravity // J. Biotechnol. 1984. V. 1. P. 287-293.

147. Vintemberger P, Clavert J. Experimental return of the ovum to the uterus and its repercussion on the orientation of the embryo in pigeons // С R Hebd Seances Acad Sci. 1956. vol. 242(11). P. 1523-4.

148. Wang B, Zhang S, Wu Yan-Hong, Wu Xing-Yu. Effects of simulated weightlessness on the kinase activity of MEK1 induced by BMP-2 in rat osteosarcoma cells // J. Gravit. Physiol. 2006. V. 13(1). P. 141-142.

149. Wang P, Zhang S, Wang B, Xi Qing Sun. Changes of mechanotransduction in MG-63 osteosarcoma cells induced by simulated weightlessness // J. Gravit. Physiol. 2006. V. 13(1). P. 143-144.

150. Wei H, Juhasz O, Li J, Tarasova E.S, Boheler K.R. Embrionic ste, cells and cardiomyocyte differentiation: phenotypic and molecular analyses // J. Cell. Mol. Med. 2005. V. 9. № 4. P. 804-817.

151. Ying Q, Nichols J, Chambers I, Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration WITH STAT3 // Cell. 2003. V. 115. P. 281-292.

152. Young R.S, Tremor J.W, Willoughby R, Corbett R.L, Souza K.A, Sebesta P.D. The effect of weightlessness on the dividing eggs of Rana pipiens // In The experiments of Biosatellite II. Washington, D.C, NASA. 1971. P. 251.

153. Zhong H et Activation of signal transducers and activators of transcription by alpha(lA)-adrenergic receptor stimulation in PC 12 cells // Mol Pharmacol. 2000. V. 57(5). P. 961-967.