Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Давыдов, Рустам Энверович

• Давыдов, Рустам Энверович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Давыдов, Рустам Энверович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологическое действие рибонуклеаз.

1.2. Зависимость биологического действия рибонуклеаз от особенностей структуры и каталитической активности.

1.3. Взаимодействие рибонуклеаз и поликатионов с мембраной клеток.

1.4. Изменение физико-химических свойств рибонуклеаз путем их химической модификации.

1.5. Участки мембраны клеток, взаимодействующие с рибонуклеазами

1.6. Мишень РНКаз в клетках эукариот.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius»

Актуальность проблемы К настоящему времени накоплен обширный материал по влиянию рибонуклеазы Bacillus intermedius на процессы жизнедеятельности клеток про- и эукариот. Показано, что рибонуклеаза В.intermedius способна вызывать различные биологические эффекты как на уровне клетки, так и на уровне организма. Она обладает противовирусным, противоопухолевым и иммуностимулирующим действием - стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет, неспецифические факторы резистентности. Рибонуклеазы вызывают стимуляцию гемопоэза и стимуляцию пролиферации некоторых клеток высших эукариот [Куриненко, 1991]. В зависимости от концентрации РНКазы могут стимулировать или ингибировать размножение клеток микроорганизмов [Солдатова, Беляева, 1972; Добротина и др., 1992; Колпаков, Куприянова-Ашина, 1992].

Имеются экспериментальные доказательства того, что иммуностиму-ляция, стимуляция гемопоэза и пролиферации являются следствием взаимодействия фермента с клетками, в т.ч. и с иммунокомпетентными, на уровне плазматической мембраны. Использование фотоокисленной и инактивированной методом сайт-специфического мутагенеза рибонуклеазы В.intermedius позволило установить, что ряд биологических эффектов рибонуклеазы каталитически обусловлен: с наличием ферментативной активности связаны противовирусное действие рибонуклеазы, токсическое и генотоксическое действие, цитотоксичность рибонуклеазы, ростстимули-рующее действие на микроорганизмы [Куриненко, 1991; Кипенская, 1998; Ильинская, 1998].

Известна гипотеза, объясняющая механизм биологического действия нуклеаз проявлением каталитической функции РНКаз, в комплексе с аффинным и неспецифическим взаимодействием с плазматической мембраной [Куриненко, 1991].

Очевидно, что степень выраженности биологических эффектов фермента на клеточном уровне зависит от его способности к контакту с клеткой, который определяется совокупностью свойств плазматической мембраны клетки и физико-химических свойств фермента. Это предполагает, что изменение любого элемента указанной совокупности свойств, например физико-химических свойств фермента, может существенным образом отразиться на эффективности его взаимодействия с клеткой, и, следовательно, на биологической активности фермента.

Одним из основных инструментов изменения физико-химических свойств белка является его химическая модификация. Методы химической модификации функционально-активных белков успешно применяются для выяснения механизма их действия и представляют интерес как с точки зрения изучения влияния модификации на физико-химические и биологические свойства белка, так и с точки зрения решения фундаментальной проблемы биохимии - о соотношении структуры и функции белка [Овчинников, 1987]. Очевидно, что метод химической модификации особенно перспективен в этом плане для белков хорошо изученных в структурном отношении, каким и является рибонуклеаза Bacillus intermedius.

Данные, полученные при изучении зависимости биологической активности фермента от структуры методами химической модификации, могут быть с успехом использованы для развития исследований на основе сайт-специфического мутагенеза. Плодотворность такого подхода продемонстрирована получением методом сайт-специфического мутагенеза серии мутантных по HislOl форм РНКазы В .intermedius после того, как методом химической модификации была показана важность этого аминокислотного остатка для проявления биологической активности фермента.

Химическая модификация интересна и с практической точки зрения: применение химической модификации позволило создать пролонгированные ферментные препараты, препараты с измененными иммуногенными и аллергенными свойствами [Ларионова, Торчилин, 1982; Чазов и др., 1985; Максименко, 1988].

Все вышеизложенное дает основание рассчитывать на плодотворность использования методов химической модификации для изменения физико-химических свойств РНКазы В.ШегтесИт и, как следствие, изменения ее биологической активности.

Цель и задачи исследований Целью исследования явилось изменение каталитически обусловленной биологической активности гуанилспеци-фичной РНКазы В.ШегтесИт методами химической модификации.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать условия модификации РНКазы В.ШегтесИт глутаро-вым альдегидом и диальдегиддекстраном, позволяющие получать продукт с высоким выходом по белку и высокой ферментативной активностью.

2. Исследовать энзиматические свойства, стабильность, гидрофоб-ность и электрофоретическую подвижность препаратов РНКазы В.ШегтесИт, модифицированных введением в молекулу фермента различных функционально-активных групп.

3. Изучить каталитически обусловленные цитотоксические свойства модифицированных препаратов РНКазы В.ШегтесИт с измененными физико-химическими и энзиматическими свойствами.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность направленного получения модифицированных ферментов с заданным числом связей фермент - полимерный носитель с использованием носителя с одной степенью активации. Получены гидрофобизированные препараты РНКаз с высоким уровнем ферментативной активности.

Показано влияние изменения физико-химических свойств РНКазы В.ШегтесИт на каталитически обусловленную цитотоксичность фермента. Показано, что цитотоксичность РНКазы В.ШегтесИш возрастает при ее гидрофобизации - в большей степени при введении в молекулу фермента алкильных, а не ароматических радикалов. Увеличение цитотоксичности при гидрофобизации алкиламинами обусловлено не токсичностью последних, а изменением физико-химических свойств модифицированного фермента. Показано, что увеличение суммарного отрицательного заряда РНКазы В.ШегтесИт сопровождается снижением цитотоксичности фермента, тогда как увеличение суммарного положительного заряда не оказывает влияния на цитотоксические свойства. Влияния изменения Касс модифицированного фермента с З'-ГМФ на каталитически обусловленную цитотоксичность фермента не выявлено.

Результаты работы подтверждены авторским свидетельством об изобретении.

Практическое значение Разработан способ получения модифицированных форм рибонуклеазы с разным числом связей фермент - полимерный носитель при использовании носителя с одной и той же степенью активации. Разработан способ увеличения гидрофобности фермента с сохранением высокой ферментативной активности. Способы могут быть использованы для получения новых препаратов применяемых в медицине и биотехнологии, в практике научных исследований.

Полученный фотоокисленный нетоксичный препарат РНКазы В.ШегтесИш может быть использован вместо нативного фермента для стимуляции каталитически независимых биологических эффектов. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе получено одно авторское свидетельство об изобретении.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Давыдов, Рустам Энверович

ВЫВОДЫ.

1. Разработан способ модификации рибонуклеазы В.intermedins ди-альдегиддекстраном, позволяющий оптимизировать условия модификации с помощью обобщенного формализованного параметра, включающего в себя выход модифицированного фермента по белку и стабильность натив-ного фермента при условиях модификации.

2. Разработан способ селективного фотоокисления РНКазы B.intermedius по His 101 активного центра. Фотоокисленный фермент является структурным аналогом нативной РНКазы.

3. Цитотоксические свойства РНКазы B.inermedius, модифицированной объемной декстрановой матрицей или тримером глутарового альдегида резко снижаются при сохранении высокой каталитической активности.

4. Изменение физико-химических свойств РНКазы B.intermedius оказывает влияние на каталитически обусловленную цитотоксичность. Изменение Касс фермента с З'-ГМФ вследствие модификации фермента не существенно для его цитотоксичности.

5. Увеличение суммарного положительного заряда РНКазы В. intermedins не оказывает влияния на цитотоксические свойства фермента, тогда как увеличение суммарного отрицательного заряда сопровождается их снижением.

6. Цитотоксичность РНКазы B.intermedius возрастает при ее гидро-фобизации - в большей степени при введении в молекулу фермента ал-кильных, а не ароматических радикалов. Увеличение цитотоксичности при гидрофобизации алкиламинами обусловлено не токсичностью последних, а изменением физико-химических свойств модифицированного фермента.

7. Цитотоксичность димеров и полимерных форм РНКазы B.intermedius выше цитотоксичности нативного фермента, что позволяет использовать их в качестве аналогов РНКазы BS или искусственно диме

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные о возможности изменения цитотоксических свойств РНКазы В.ш^егтесПиз с помощью химической модификации фермента свидетельствуют о плодотворности использованного подхода. Этот подход открывает возможность значительно расширить ассортимент препаратов РНКазы для использования их в качестве биологически активных веществ, что позволит ему успешно конкурировать со скринингом ферментов из различных природных источников.

С помощью химической модификации можно успешно дискриминировать одни биологические эффекты с сохранением других. Эта возможность наглядно продемонстрирована на примере фотоокисленной РНКазы В1 - препарат модифицированного фермента практически не обладает ци-тотоксичностью и другими каталитически обусловленными эффектами, но сохранил каталитически независимую биологическую активность [Кури-ненко, 1991].

Слаботоксичные высокоактивные препараты РНКазы (РНКаза Вь Сц, РНКаза ВьГА) представляют несомненный интерес как потенциальные противовирусные препараты. Высокий уровень РНКазной активности, который может быть достигнут с помощью высокоактивных малотоксичных препаратов фермента, может обеспечить эффективный противовирусный барьер во внутренней среде организма. Такой барьер может существенно ограничить генерализацию инфекции дефектным пострепродуктивным потомством вируса, составляющим в зависимости от вида вируса от 50% до 90% потомства вируса, чувствительного к рибонуклеазе [Максимович, Лисовая, 1969; Максимович и др., 1977].

Гидрофобизированные производные РНКазы В1 требуют более углубленных исследований как потенциальные биологически активные вещества. Их использование может оказаться перспективным в медицине и биотехнологии, так как в соответствии со следствиями, вытекающими из правила обратного действия Агпс^-ЗсЛшк'а для веществ обладающих токсическим эффектом [Мейер, Готлиб, 1940], есть основания ожидать, что положительные эффекты фермента у гидрофобизированных производных будут наблюдаться при более низких концентрациях, чем у нативного фермента. Это можно прогнозировать основываясь на том, что увеличение цитотоксичности при гидрофобизации не связано с токсичностью гид-рофобизирующих групп.

Наконец расширение спектра модифицированных препаратов фермента и более детальное исследование их структурных, энзиматических

96 свойств и биологической активности позволит сформулировать четкие критерии зависимости "структура /энзиматические свойства /биологическая активность".

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Давыдов, Рустам Энверович, 2000 год

1.Адам H.K. Физика и химия поверхностей.- М.: ОГИЗ, Гостехиз-дат, 1947,- 552 с.

2. Альберт А. Избирательная токсичность: Физико-химические основы терапии.- М.: Медицина, 1989.- Т.2.- 432 с.

3. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран.- М.: Наука, 1982,- 150 с.

4. Первичная структура рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р /Афанасенко Г.А., Дудкин С.М., Каминир Л.Б. и др. //Биоорг. химия.-1979,- Т.5, № 2.- С. 187-202.

5. Баренбойм Г.М., Маленков А.Г. Биологически активные вещества. Новые принципы поиска.- М.: Наука, 1986.- 364 с.

6. Беляева М.И., Нужина A.M. Нуклеодеполимеразы бактерий и их противоопухолевое действие //Бактериальные нуклеазы и их действие на опухолевый рост.- Казань: Изд-во КГУ, 1969.- С.49-78.

7. Березов Т.Т. Некоторые вопросы использования ферментов в терапии опухолей // Роль аспарагеназы в энзимотерапии опухолей.- М.: Медицина, 1972,- С. 5-41.

8. Бессмертная Л. И., Антонов В.К. Химические методы иммобилизации ферментов // Введение в прикладную энзимологию / ред. Березин И.В., Мартинек К. М.: Изд-во.МГУ, 1982.- С.101-133.

9. Ю.Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Определение вторичнойструктуры в растворе методом КД /Болотина И.А., Дудкин С.М., Лугау-скас В.Ю. и др. //Биоорг. химия,- 1979,- Т.5.- С.203-209.

10. Основные биохимические свойства высокоочищенной экстра-целлюларной РНКазы Bac.intermedius /Булгакова Р.Ш., Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Егорова Г.С. //Биохимия,- 1974,- Т.39, Вып 2,- С.299-304.

11. Булычев А.Г. Сегрегационная функция клетки и ее молекулярные механизмы //Цитология,- 1986,- Т.28, № 4.- С.З87-402.

12. Синтез производных декстрана, содержащего ионогенные, ком-плексообразующие и электронообменные группировки /Вирник А.Д., Ла-летина О.П., Пененжик М.А. и др. //Высокомолекулярные соединения.-1968.- Т.1А.- С.362-372.

13. Вознесенский В.А. Статистические методы планирования эксперимента в технико-экономических исследованиях.- М.: Финансы и статистика.- 1981.- 263 с.

14. Вудворд Д. Иммобилизованные ферменты: адсорбция и кова-лентное присоединение / в кн. Иммобилизованные ферменты и клетки.-М.: Мир.- 1988,- С.12-28.

15. Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Очистка хроматографией на фосфоцеллюлозе и некоторые характеристики гомогенного фермента /Голубенко И.А., Балабан Н.П., Лещинская И.Б. и др. //Биохимия.- 1979.-Т.44, Вып.4.- С.640-647.

16. Голубенко И.А., Лещинская И.Б., Дудкин С.М. Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Исследование структурно-функциональной роли остатков триптофана с помощью химической модификации //Биоорганическая химия,- 1981,- Т.7, № 8,- С.1201-1208.

17. Изучение функциональной роли гистидина 101 рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р /Голубенко И.А., Лещинская И.Б., Карпейский М.Я., Яковлев Г.И. //Биоорганическая химия.- 1982.- Т.8, № 8.- С.1108

18. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях.- Д.: Медицина,- 1973.- 160 с.

19. Сравнительная характеристика биологической и иммуномодули-рующей активности некоторых ферментных препаратов микробного происхождения /Добротина Н.А., Ежова Г.П., Казацкая Ж.А. и др. //Биол. наук,- 1992,- Т.338, №.2,- С.90-96.

20. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки.- М.: Мир,- 1976.-364 с.

21. Ильинская О.Н. Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз //Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Казань, 1998.45 с.

22. Ильинская О.Н. Цитотоксичность биназы в культурах клеток животных и человека // Ферменты микроорганизмов. XI Всеросс. конф. Сборник докладов,- Казань: УНИПРЕСС, 1998. С.182-190.

23. Казанская Н.Ф., Кост О.А., Березин И.С. Свойства трипсина, модифицированного глутаровым альдегидом // Биоорг. химия.- 1975.- Т.1, №9,- С.1337-1344.

24. Калачева Н.В., Куприянов-Ашин Э.Г., Куриненко Б.М. Действие полимерной модификации на биологическую активность панкреатической рибонуклеазы // Биол. Наук.- 1992.- №2,- С.97-102.

25. Изучение субстратной специфичности и механизм действия рибонуклеазы Bacillus intermedins /Карпейский М.Я., Ханданян Л.Ж., Че-пурнова Н.К. и др. //Биоорганическая химия,- 1981.- Т.7, № 11,- С. 16691679.

26. Карпейский М.Я., Яковлев Г.И. Топохимические аспекты субстратной специфичности рибонуклеаз,- М.: Итоги науки и техники.

27. ВИНИТИ,- 1986,- Т.22, биологическая химия.- 180 с.

28. Кипенская JI.B. Биологические эффекты нативных и мутантных рибонуклеаз Bacillus intermedins //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. -Казань, 1998,- 24 с.

29. Влияние нуклеаз на клетки и организмы животных: клеточные механизмы их противовирусного действия /Коваленко Г.А., Долгих М.П., Лапик А.С. и др. // Всес. конф. "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование",- Рига, 1985.- С.19-23.

30. Коваленко Г.А. Влияние панкреатических нуклеаз на клетки и организм животных: клеточный механизм противовирусного действия. //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Новосибирск, 1986.- 18 с.

31. Колпаков А.И., Куприянова Ф.Г. Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей Candida tropicalis //Микробиология.- 1992.-Т.61, вып.6.- С.969-974.

32. Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф.Г. Биохимические аспекты симулирующего действия экзогенных РНКаз //Биол.наук.- 1992.- №.2.-С.103-107.

33. Колпаков А.И. Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей рода Candida. //Автореф. дисс. . канд. биол. наук.- Казань.-1993.- 23 с.

34. Изменение функций плазматической мембраны под действием рибонуклеаз Bacillus intermedins /Колпаков А.И., Ильинская О.И., Кипен-ская Л.В. и др. // Ферменты микроорганизмов. XI Всеросс. конф. Сборник докладов.- Казань: УНИПРЕСС, 1998. С.201-210.

35. Крешков А.П. Основы аналитической химии / Качественный и количественный анализ //М.: Химия,- 1965.- Т.2.- С.215-216.

36. Экспериментальное исследование противоопухолевой эффективности РНКазы Bac.intermedius /Куриненко Б.М., Собчук Л.И., Хайбуллина С.А., Булгакова Р.Ш.//Эксперим. онкология.- 1988.- Т. 10, №6.- С.54-57.

37. Изучение токсичности РНКазы Bac.intermedius in vitro и in vivo /Куриненко Б.М., Сергеева Е.В., Собчук Л.И. и др. //Антибиотики и химиотерапия,- 1989.- Т.34, №.4,- С.266-270.

38. Куриненко Б.М. Механизмы биологического действия нуклеаз /в кн. Лещинская И.Б., Варламов В.П., Куриненко Б.М. Нуклеазы бактерий. //Казань.: Изд-во КГУ, 1991,- С.153-230.

39. Куриненко Б.М., Собчук Л.И., Сергеева Е.В. Механизм противоопухолевого действия рибонуклеазы Bacillus intermedins //Антибиотики и химиотерапия.- 1995.- Т.40, № 5.-С.12-15.

40. Куриненко Б.М., Зеленкова Н.П. Изменение размеров и морфологии клеток под влиянием бактериальной рибонуклеазы //Цитология.-1996,- Т.38, № 7.- С.667-673.

41. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Применение иммобилизованных физиологически активных веществ белковой природы в медицине // Введение в прикладную энзимологию / ред. Березин И.В., Мартинек К. М.: Изд-во.МГУ, 1982.- С.284-305.

42. Исследование иммобилизованных ферментов физическими методами /Лаш Ю., Козлов Л.В., Бессмертная Л.Я., Антонов В.К. //Химическая энзимология/ ред. Березин И.В., Мартинек К,- М.: Изд-во МГУ, 1983.- С.250-260.

43. Препаративное получение высокоочищенной рибонуклеазы Bac.intermedius /Лещинская И.Б., Булгакова Р.Ш., Балабан Н.П., Егорова

44. Г.С. //Прикл. биохим. микробиол.- 1974.- Т.Х, вып 2,- С.242-247.

45. Методы определения нуклеаз и родственных ферментов /Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Капранова М.Н., Голубенко И.А. // в кн. Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов.- Казань.: Изд-во КГУ.- 1980.-С.53-60.

46. Изучение некоторых физико-химических и энзиматических свойств полимерных производных трипсина на основе декстрана /Линденбаум Г.М., Богачева Т.И., Миргородская O.A. и др. //Прикл. биохим. микробиол.- 1977.- Т. 13.- С. 685-691.

47. Л.инденбаум Г.М., Миргородская O.A. Химическая модификация трипсина водорастворимыми декстранами // Прикл. биохим. микробиол,- 1978,- Т. 14.- С.719-723.

48. Максименко A.B. Химическая модификация ферментов медицинского назначения как инструмент повышения эффективности их действия // Биотехнология. Итоги науки и техники М.: ВИНИТИ АН СССР.-1988.- Т.8.- С.5-49.

49. Максимович М.Б., Лисовая С.П. Соотношение интер- и пострепродуктивного распространения инфекции аденовирусами в клетках амниона человека //Вопросы вирусологии.- 1969.- № 5.- С.566-569.

50. Максимович М.Б., Парфенова М.С., Зацепин М.И. Вирусы и нуклеазы //Микробиологический журнал АН УССР.- 1977.- Т.39, №.1.-С.46.

51. Маленков А.Г. Ионный гомеостаз и автономное поведение опухоли. М.: Наука, 1976,- 171 с.

52. Манойлов С.Е. Биохимические основы злокачественного роста.-Л.: Медицина, 1971.- 229 с.

53. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / Туркова Я., Мелоун Б., Мота О. и др. под ред. О. Микеша.1. M.Мир, 1982,- Ч.И.-381 с.

54. Оптимизация условий иммобилизации кислой протеиназы из Aspergillus awamori /Можина Л.И., Самошина Н.М., Эрин А.Э. и др. //Прикл. биохимия и микробиология.- 1978.- Т.14. № 3.- С.410-413.

55. Муронец В.И., Наградова Н.К. Иммобилизованные олигомерные ферменты,- М.: Наука, 1984.- 208 с.

56. Налимов В.В., Чернова H.A. Статистические методы планирования экстремальных экспериментов.- М.: Наука.- 1965.- 340 с.

57. Нехорошкова З.М. Влияние рибонуклеазы Bacillus intermedius на имунный ответ и гемопоэз экспериментальных животных : Автореф. дисс. . канд. биол. наук.- Москва, 1988.-16 с.

58. Ныс П.С., Бирюков В.В. Интегральные критерии эффективности процесса иммобилизации ферментов //Антибиотики.- 1981.- Т.26, № 5.-С.332-337.

59. Сергеева Е.В. Токсические свойства рибонуклеазы Bacillus intermedius in vitro и in vivo //Авторефер. дисс. . канд. биол. наук. Казань,- 1991,- 17 с.

60. Сливинский Г.Г. Ростстимулирующая активность веществ и их влияние на ионный гомеостаз клеток // Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: НИИ по БИХС,- 1976.- 24 с.

61. Солдатова Н.Г., Беляева М.И. Действие нуклеазы Serratiasmasrcescens на кишечную палочку / в кн.:Некоторые подходы к изучению биологической роли нуклеаз.- Казань: Изд-во КГУ, 1972.- С. 53-70.

62. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия.- М.: Высшая школа, 1973.- С.350-351.

63. Тенникова Т.Б., Москвичев Б.В., Самсонов Г.В. Изучение физико-химических свойств протеолитического фермента террилитина, модифицированного сополимером на основе винилпирролидона. //Биохимия.-1980.- Т.45, вып.З.- С.438-448.

64. Ханданян А.Ж., Дудкин С.М. Рибонуклеаза Bacillus intermedius. Исследование состояния остатков тирозина и триптофана с помощью разностных спектров поглощения //Биоорганическая химия.- 1979.- Т.5, №11.- С.1700-1709.

65. Синтез диальдегид- и дикарбоксилдекстрана /Хомяков К.П., Пе-нежик М.А., Вирник А.Д., Роговин З.А. //Высокомолекулярные соединения.- 1965,- Т.7, №.6.- С.1030-1034.

66. Макромолекулярные лекарственные препараты в кардиологии /Чазов Е.И., Смирнов В.Н., Мазаев A.B., Торчилин В.П. //ЖВХО им. Д.И. Менделеева.- 1985.- № 4.- С.365-372.

67. Рибонуклеаза Bacillus intermedius в синтезе олигорибонуклеоти-дов /Шарипова Ф.Р., Балабан Н.П., Рязанов С.М., Лещинская И.Б. и др. //Биоорг. химия.- 1983.- Т.9.- С.505-510.

68. Ardelt W., Mikulski S.M., Shogen К. Amino acid sequence of an antitumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases. //J. Biol. Chem.-1991.- V.266, N 1.- P.245-251.

69. Arnold L.J., Dagen A., Kaplen N.O. Poly(L-lisine) as an antieoplastic agent and tumor specific drug carrier //Polymers in Biology and Medicine, V.2. Targeted drugs /Ed. E.P.Goldberg.- N.-Y., 1983,- P.89-112.

70. Ball A.K., Kroja P.L., Gilles H. Localisation of ribonucleic acid in the membrane system of developing embryosof sea urchins //J. Cell Biol.-1967,- V.35.-P.8-13.

71. Bartholeyns J., Baudhuin P. Inhibition of tumor cell proliferation by dimerized ribonuclease //Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1976.- V.73, N 2.- P.573-576.

72. Bartholeyns J., Zenebergh A. In vitro and in vivo antitumor effect of dimerized ribonuclease A //Eur. J.Cancer.-1979.- V.15.- P.85-91.

73. Bartholeyns J., Baudhuin P. Effect of cross-linked dimers of ribonuclease A or of lisozime of the processing of endocytosed peroxydase by hepa-tome cells //Biochem.J.- 1982,- V.292.- P.543-550.

74. Role of the N terminus in RNase a homologues: Differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity /Boix E., Wu Y.N., Vasandani V.M. et al. //J. Mol. Biol.- 1996,- V.257, N 5,- P.992-1007.

75. Burka E.R, Schreme W., Klok C.I. Membrane-bound ribonucleic acid in mammalian erythroid cells. //Biochem.- 1967.- V.6.- P.2840-2847.

76. Burka E.R., Schickling L.F. Attachment of reticulocyte ribosomes toerythroid cell membranes in vitro //Biochem.- 1970.- V.9.- P.459-465.

77. The antitumor action of seminal ribonuclease and its quaternary conformations /Cafaro V., Delorenzo C., Piccoli R. et al. //FEBS Letters.- 1995.-V.359, N 1.- P.31-34.

78. Bull semen ribonucleases. 1. Purification and physico-chemical properties of the major component /D'Alessio G., Floridi A., De Prisco R., Pignero A., Leone E. //Eur. J. Biochem.- 1972,- V.26, N 2,- P. 153-161.

79. Seminal RNase: a unique member of the ribonuclease superfamily. /D'Alessio G., Di Donato A., Parente A., Piccoli R. //Trends Biochem Sci.-1991.- V.16, N 3.- P.104-106.

80. Deonarain M.P., Epenetos A.A. Targeting enzymes for cancer therapy: Old enzymes in new roles //British Journal of Cancer.- 1994.- V.70, N 5.-P.786-794.

81. Di Donato A., Galletti P., D'Alessio G. Selective deamidation and enzymatic methylation of seminal ribonuclease. //Biochem.- 1986.- V.25.-P.8361-8368.

82. The determinants of the dimeric structure of seminal ribonuclease are located in its N-terminal region. /Di Donato A., Cafaro V., de Nigris M. et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1993,- V.194.- P. 1440-1445.

83. Di Donato A., Cafaro V., D'Alessio G. Ribonuclease A can be transformed into a dimeric ribonuclease with antitumor activity //J. Biol. Chem.-1994.- V.269.- P.17394-17396.

84. Hints on the evolutionary design of a dimeric RNase with special bioactions /Di Donato A., Cafaro V., Romeo I. et al. //Protein Science.- 1995.1. V.4.- P.1470-1477.

85. Endo Y., Wool J.G. The site of action of -sarcine cleavage site in 28S ribosomal ribonucleic acid //Biol. Chem.- 1982,- V.257, N 15,- P.9054-9060.

86. Fields R. The measurement of amino group in proteins and peptides //Biochem.J.- 1971,- V.124.- P.581-590.

87. Finter N.B. Dye uptake methods for accessing viral cytopathogenicity and their application to interferon assays //J. Gen. Virol.- 1969.- V.9.- P.419-427.

88. Goldstein L., Manecke G. The chemistry of enzyme immobilization //Appl. Biochem. Bioeng.- 1976.- V.I.- P.23-126.

89. Hallahan T.W., Shapiro R., Vallee B.L. Dual site model for the organogenic activity of angiogenin //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- V.88.-P.2222-2226.

90. Hall J.O., Novakofski J.E., Beasley V.R. Neutral red assay modification to prevent cytotoxicity and improve reproducibility using E-63 rat skeletal muscle cells //Biotech. Histochem.- 1998,- V.73.- P.211-221.

91. Harper J.W., Vallee B.L. A covalent angiogenin/ribonuclease hybrid with a fourth disulfide bond generated by regional mutagenesis //Biochemistry.- 1989.- V.28, N 4,- P. 1875-1884.

92. RNase 1 /Jinno H., Ueda ML, Ozawa S., Ikeda T. et al. //Life Sciences.- 1996a.-V.58, N21.- P.1901-1908.

93. Levy C.C., Karpetsky T.P. Enzymes as drugs. //Ed. S. Holcenberg, J. Roberts.-N.-Y. Chichester, Brisbane, Toronto.- 1981.- P.103-166.

94. Kim J., Raines R.T. A misfolded but active dimer of bovine seminal ribonuclease //Eur. J. Biochem.- 1994,- V.224, N1.- P. 109-114.

95. Kim J.S., Soucelc J., Matousek J., Raines R.T. Catalytic activity of bovine seminal ribonuclease is essential for its immunosuppressive and other biological activities //Biochem. J.- 1995a.- V.308, Part 2,- P.547-550.

96. Kim J.S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. Mechanism of ribonuclease cytotoxicity //J. Biol. Chem.- 1995b.- V.270, N52,- P.31097-31102.

97. Kim J.S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. Structural basis for the biological activities of bovine seminal ribonuclease //J. Biol. Chem.-1995c.- V.270, N.18.- P.10525-10530.

98. Kobe B., Deisenhofer J. Mechanism of ribonuclease inhibition by ribonuclease inhibitor protein based on the crystal structure of its complex with ribonuclease A//J. Mol. Biol.- 1996,- V.264, N 5.- P.1028-1043.

99. In vivo and in vitro growth-inhibitory effect of bovine seminal ribonuclease on a system of rat thyroid epithelial transformed cells and tumors. /Laccetti P., Portella G., Mastronicola M.R. et al. //Cancer Res.- 1992.- V.52, N17,- P.4582-4586.

100. Ledoux L., Baltus E. Action de la ribonuclease sur les cellules du carcinome d'Ehrlich //Experementia.- 1954,- V.10.- P.500-503.

101. Lee F.S., Shapiro R., Vallee B.L. Tight-binding inhibition of angio-genin and ribonuclease A by placental ribonuclease inhibitor //Biochem. 1989.- V.28.- P.2354-2359.

102. Lee F.S., Vallee B.L. Structure and action of mammalian ribonuclease (angiogenin) inhibitor //Series: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology.- 1993,- V.44.- P. 1-30.

103. Ribonuclease A variants with potent cytotoxic activity /Leland P.A., Schultz L.W., Kim B.M., Raines R.T. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.-V.95, N18.- P.10407-10412.

104. Libonati M., Sorrentino S. Revisiting the action of bovine ribonuclease A and pancreatic- type ribonucleases on double-stranded RNA //Mol. Cell. Biochem.- 1992,- V.l 17, N2.- P.139-151.

105. Libonati M., Bertoldi M., Sorrentino S. The activity on double-stranded RNA of aggregates of ribonuclease A higher than dimers increases as a function of the size of the aggregates //Biochem. J.- 1996.- V.318, Part 1,-P.287-290.

106. Madan T., Arora N., Sarma P.U. Ribonuclease activity dependent cytotoxicity of Asp fl, a major allergen of A.fumigatus //Mol. Cell. Biochem.1991.- V.175, N1-2.- P.21-27.

107. Bovine seminal ribonuclease destabilizes negatively charged membranes /Mancheno J.M., Gasset M., Onaderra M. et al. //Biochem. Biophys. Res. Comraun.- 1994,- V. 199, N. 1.- P. 119-124.

108. Predictive study of the conformation of the cytotoxic protein alpha-sarcin: a structural model to explain alpha-sarcin-membrane interaction /Mancheno J.M., Gasset M., Lacadena J. et al. //J. Theor. Biol.- 1995.- V.172.-P.259-267.

109. Immunosuppressive activity of angiogenin in comparison with bovine seminal ribonuclease and pancreatic ribonuclease /Matousek J., Soucek J., Riha J. et al. //Compar. Biochem. Physiol. B Biochem. & Mol. Biol.- 1995.-V.l 12, N2.- P.235-241.

110. Ribonucleases endowed with specific toxicity for spermatogenic layers /Matousek J., Kim J.S., Soucek J. et al. //Compar. Biochem. Physiol. B -Biochem.& Mol. Biol.- 1997,- V.l 18, N 4.- P.881-888.

111. Mayhew E., Weiss L. RNA at the periphery of different cell types and effect of growth rate on ionogenic groups in the periphery of cultured cells //Exper. Cell Res.- 1968,- V.50.- P.441-452.

112. Mayhew E. Electrophoretic mobility of Ehrlich ascites carcinoma cells grown in vitro or in vivo. //Cancer Res.- 1968.- V.28.- P.1590-1595.

113. Mayhew E., Weiss L. RNA in the cell periphery //Surface chemistryof biological systems /Ed. M.Blank. -N.-Y., 1969.- P.191-208.

114. Means G.E., Feeney R.E. Chemical modification of proteins //San Francisco, Holden-Day.- 1971

115. Enhanced in vitro cytotoxicity and cytostasis of the combination of onconase with a proteasome inhibitor. /Mikulski S.M., Viera A., Deptala A., Darzynkiewicz Z. //Int. J. Oncol.- 1998.- V.13.- P.633-644.

116. Murthy B.S., Sirdeshmukh R. Sensitivity of monomeric and dimeric forms of bovine seminal ribonuclease to human placental ribonuclease inhibitor//Biochem J.- 1992,- V.281, Part 2,- P.343-348.

117. Effects of protein RNase inhibitor and substrate on the quaternary structures of bovine seminal RNase /Murthy B.S., Delorenzo C., Piccoli R. et al. //Biochem.- 1996,- V.35, N 13.- P.3880-3885.

118. Cytotoxic ribonuclease chimeras. Targeted tumoricidal activity in vitro and in vivo. /Newton D., Ilercil O., Laske D.W. et al. //J Biol Chem.-1992.- V.267, N27,- P.19572-19578.

119. Expression and characterization of recombinant human eosino-philderived neurotoxin and eosinophil-derived neurotoxin-anti-transferrin receptor sFv /Newton D.L., Nicholls P.J., Rybak S.M., Youle R.J. //J. Biol. Chem.- 1994,- V.269, N43,- P.26739-26745.

120. Toxicity of an antitumor ribonuclease to Purkinje neurons. /Newton D.L., Walbridge S., Mikulski S.M. et al. //J.Neuros.- 1994,- V.14, N2.- P.538-544.

121. Expression and characterization of a cytotoxic human-frog chimeric ribonuclease: potential for cancer therapy /Newton D.L., Xue Y., Boque L. et al. //Protein Eng.- 1997,- V.10.- P.463-470.

122. Freezing of dCMP aminogidrolase in the activated conformation by glutaraldehyde /Nucci R., Raia C.A., Vaccaro C. et al. //J. Mol. Biol.- 1978.-V.124, N1.- P.133-145.

123. Papahadjopoulos D., Kimelberg H.K. Phospholipid vesi-cles(liposomes) as models for biological membranes: Their properties and interactions with cholesterol and proteins //Progr.Surface Sci.- 1973,- V.4.-P.141-232.

124. Parente A., D'Alessio G. Reacquisition of quaternary structure by fully reduced and denatured seminal ribonuclease //Eur. J. Biochem. 1985.-V.149.- P.381-387.

125. Three-dimensional structure of ribonuclease from Bacillus intermedius 7P at 3.2 A resolution / Pavlovsky A.G., Vagin A.A., Vainstein B.K. et al.//FEBS Lett.- 1983,- V.162, N.l, P. 167-170.

126. Piccoli R., DiDonato A., D'Alessio G. Co-operativity in seminal ribonuclease function. Kinetic studies //Biochem. J.- 1988.- V.253, N2.- P.329-336.

127. The antitumor action of seminal ribonuclease tested with the plasmacytoma spleen colonization assay /Piccoli R., Vescia S., Bridges S.H., D'Alessio G. //Ital. J. Biochem.- 1990,- V.39, N 4,- P.242-249.

128. The dual-mode quaternary structure of seminal RNase /Piccoli R., Tamburrini M., Piccialli G. et al. //Proc Natl Acad Sci USA.- 1992,- V.89, N 5,- P.1870-1874.

129. Antitumor action of bovine seminal ribonuclease /Pouckova P., Soucek J., Matousek J. et al. //Folia Microbiol. (Praha).- 1998.- V.43, N5,-P.511-512.

130. Privalov P.L. Scanning microcalorimeters for studying macromole-cules //Pure and Appl. Chem.- 1980.- V.52, N 2,- P.479-497.

131. Rathore D., Batra J.K. Cytotoxic activity of ribonucleolytic toxin re-strictocin-based chimeric toxins targeted to epidermal growth factor receptor //FEBS Lett.- 1997,- V.407, N 3.- P.275-279.

132. Replacing a surface loop endows ribonuclease A with angiogenicactivity /Raines R.T., Toscano M.P., Nierengarten D.M. et al. //J. Biol. Chem.-1995,- V.270, N 29.- P.17180-17184.

133. Russell A.J., Fersht A.R. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge //Nature.- 1987.- V.328.- P.496-500.

134. Cytotoxic potential of ribonuclease and ribonuclease hybrid proteins /Rybak S.M., Saxena S.K., Ackerman E.J., Youle R.J. //J. Biol. Chem.- 1991.-V.266, N 31,- P.21202-21207.

135. Enhancement of vincristine cytotoxicity in drugresistant cells by simultaneous treatment with Onconase, an antitumor ribonuclease /Rybak S.M., Pearson J.W., Fogler W.E. et al. //J. Nat. Cancer Inst.- 1996.- V.88, N 11.-P.747-753.

136. Schmid R.D. Stabilized soluble enzymes //Advances in Biochemical engineering.- 1979.- V.12.- P.41-118.

137. Interaction of a lytic polypeptide, melittin, with lipid membrane systems /Sessa G., Freer J.H., Colacicco G., Weissmann G. //J. Biol. Chem.-1969.- V.244.- P.3575-3582.

138. Shapiro R., Vallee B.L. Site-directed mutagenesis of histidine-13 and histidine-114 of human angiogenin. Alanine derivatives inhibit angio-genin-induced angiogenesis //Biochemistry.- 1989.- V.28, N 18 P.7401-7408.

139. Shapot V.S., Davidowa S. Ya. Liporibonucleoprotein as an integral part of animal cell membranes //Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol.- 1971.-V.ll.- P.81-101.

140. Startorelli A.C. Combination chemotherapy with actinomycin D and ribonuclease: an example of complementary inhibition //Nature.- 1964.- V.203, N4947.- P.877-878.

141. Engineering receptor-mediated cytotoxicity into human ribonucle-ases by steric blockade of inhibitor interaction /Suzuki M., Saxena S.K., Boix E. et al. //Nat. Biotechnol.- 1999.- V.17, N 3.- P.265-270.

142. Immunosuppressive activity of bovine seminal RNase on T-cell proliferation /Tamburrini M., Scala G., Verde C. et al. //Eur. J. Biochem.-1990.- V.190.- P.145-148.

143. The principles of enzyme stabilization. Ill Effect of the length of intra-molecular cross-linkages on thermostability of enzyme /Torchilin V.P., Maksimenko A.V., Smirnov V.N. et al. //Biochim. Biophys. Acta.- 1978.-V.522.- P.277-283.

144. Wang D., Wilson G., Moore S. Preparation of cross-linked dimers of pancreatic ribonuclease //Biocemistry.- 1976.- V.15, N 3.- P.660-665.

145. Wase A., Cardenas J., Podolsky S. Some effects of ribonuclease on ascites tumor cells //Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.- I960.- V.3.- P. 160

146. Weiss L., Mayhew E. The presence of ribonucleic acid within the periferal zones of two types of mammalian cells //Cell Physiol.- 1966.- V.68.-P.345-359.

147. Weiss L., Mayhew E. Ribonuclease susceptible charged groups at the surface of Ehrlich ascites tumour cells //Intern. J. Cancer.- 1969.- V.4.-P.625-635.

148. Weiss L., Sinks L.F. The electrokinetic surfaces of human cells of lymphoid origin and their RNase susceptibility //J. Cancer Res.- 1970.- V.30.-P.90-94.

149. Cross-linking of miosin subfragment. 1 .Nucleotide-enhanced modification by a variety of bifunctional reagents /Wells J.A., Knoeber C., Sheldon