Продукция рибонуклеаз клеточной культурой женьшеня тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Яснецкая, Елена Гурьевна

• Яснецкая, Елена Гурьевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яснецкая, Елена Гурьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности продукции ферментов первичного метаболизма культивируемыми клетками растений

1.2. Биотехнологические аспекты получения и использования рибонуклеаз

1.3. Физиологическая роль рибонуклеаз и участие в защитных реакциях растений

1.4. Классификация патогенобусловленных (PR) белков растений

1.5. Регуляция содержания PR белков в норме и условиях стресса

1.6. Рибонуклеазоподобные белки группы PR

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.2. МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Рибонуклеазная активность в культивируемых клетках растений

3.2. Стабильность продукции рибонуклеаз в штамме R-1. Ростовой цикл и динамика накопления рибонуклеаз

3.3. Иммуноферментный анализ рибонуклеаз

3.4. Специфичность и кинетические параметры рибонуклеаз женьшеня. Первичная структура белков Pgl и Pg

3.5. Механизмы индукции и возможные способы регуляции активности рибонуклеаз в культуре клеток женьшеня

3.5.1. Влияние стрессовых факторов на рибонуклеазную активность и ростовые характеристики клеточной культуры женьшеня

3.5.2. Влияние компонентов питательной среды на рибонуклеазную активность и ростовые характеристики клеточной культуры женьшеня

3.5.3. Регуляция активности рибонуклеаз веществами — индукторами защитных реакций растений

3.5.4. Влияние ингибиторов киназ и фосфатаз на активность и содержание рибонуклеаз в каллусах женьшеня

3.6. Роль рибонуклеаз в процессе ингибирования роста Agrobacterium tumefaciens при их культивировании с клетками женьшеня

3.7. Динамика активности и количества рибонуклеаз при совместном культивировании клеток женьшеня с Y. pseudotuberculosis

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Продукция рибонуклеаз клеточной культурой женьшеня»

Ферменты, катализирующие гидролиз нуклеиновых кислот, необходимы на многих стадиях биохимических превращений генетического материала. РНКазы играют важную роль в регуляции жизнедеятельности растительной клетки. Они вовлечены в деградацию РНК, рециркуляцию азотистых оснований и неорганического фосфата (Тарчевский, 1992; Raines,

1998).

Изучение вновь открываемых РНКаз чаще всего проводится с целью определения возможности их использования в биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии. В клинической практике эти ферменты применяют для лечения вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний, в терапии злокачественных новообразований (Wang and Ng, 2000). РНКазы растений ввиду их низкой токсичности для человека являются перспективным объектом для создания новых лекарственных препаратов. Трансгенные растения, экспресси-рующие РНКазы, отличаются повышенной устойчивостью к фитопатогенам (Sano et al.,

1999).

В настоящее время достаточно полно исследованы панкреатические РНКазы человека, а также РНКазы бактерий, грибов и земноводных (Leland and Raines, 2001; Matozek, 2002). Физиологическая роль и пути регуляции рибонуклеаз растений изучены недостаточно (Green, 1994). Особенно в этом отношении перспективны культуры клеток, поскольку, по сравнению с целым растением, они обладают повышенной вариабельностью по многим физиолого-биохимическим признакам. Велика вероятность обнаружения в коллекциях растительных культур продуцентов ферментов с уникальной специфичностью и активностью, удовлетворяющих практическим потребностям современной биотехнологии. Культуры клеток являются технологичными источниками ферментов, т.к. они обладают высокой скоростью роста и могут осуществлять синтез биологически активных веществ в контролируемых условиях. Клетки женьшеня в этом отношении представляют интерес, поскольку штамм R1 адаптирован к применению в промышленных масштабах. Поэтому изучение РНКаз клеток женьшеня является актуальным.

Культивируемые клетки женьшеня Panax ginseng, штамм R-l (ВСКК-ВР 38) обладают высокой стабильностью и скоростью роста, адаптированы к культивированию в промышленных масштабах (Булгаков и др., 1991). В качестве продуцента рибонуклеаз культура клеток женьшеня исследовалась впервые.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение культивируемых клеток женьшеня как продуцента рибонуклеаз. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить содержание рибонуклеаз в клеточной культуре женьшеня в процессе долговременного культивирования.

2. Установить степень корреляции между активностью и содержанием РНКаз в клетках женьшеня при различных условиях культивирования.

3. Изучить физико-химические характеристики и аминокислотные последовательности рибонуклеаз Pgl и Pg2.

4. Определить пути индукции рибонуклеаз и стабилизации продукционных характеристик культуры.

5. Исследовать влияние стрессовых факторов на продукцию РНКаз культивируемыми клетками женьшеня.

6. Определить характер изменений продукции рибонуклеаз при варьировании состава питательной среды для культивирования клеток.

7. Изучить влияние РНКаз на размножение фитопатогенных бактерий Agrobacterium tu-mefaciens при совместном культивировании с клетками женьшеня.

Положения, выносимые на защиту

• Культивируемые клетки женьшеня являются перспективными источниками РНКаз.

• Рибонуклеазы женьшеня относятся к патоген-обусловленным (PR) белкам группы PR-10.

• Активность и количество PR-10 РНКаз в культуре клеток женьшеня повышается под воздействием ключевых регуляторов защитных реакций растений - этилена и жасмоновой кислоты.

• Наиболее вероятная физиологическая роль Pg-PHKa3 состоит в защите растения от патогенов.

• Культивируемые клетки женьшеня с индуцированной РНКазной активностью демонстрируют устойчивость к заражению фитопатогеном (A. tumefaciens).

Научная новизна. Впервые установлено, что культивируемые клетки женьшеня могут служить перспективным источником для получения РНКаз. Показана высокая продуктивность и стабильность синтеза РНКаз в культивируемых клетках в течение долговременного пассирования.

Установлено, что РНКазы культивируемых клеток женьшеня представлены двумя изо-формами - Pgl и Pg2. Установлена первичная структура рибонуклеаз, определена их специфичность и кинетические параметры. РНКазы расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям, на З'-конце которых находятся гуанозин, аденин и уридин. На основании анализа аминокислотной последовательности Pg-РНКазы женьшеня отнесены к патоген-обусловленным белкам группы PR-10.

Впервые получены антитела к Pg-РНКазам женьшеня, модифицирована методика количественного определения Pg-PHKa3 иммуноферментным анализом.

Впервые показано увеличение количества и специфической активности PR-10 РНКаз, индуцированное этиленом и жасмоновой, но не салициловой кислотой. Приведены доказательства участия киназ и фосфатаз в индукции этилена Pg-PHKa3.

Варьирование условий культивирования (освещение, температура, компоненты сред, фи-тогормоны) влияет на продукцию РНКаз. Подбор оптимальных условий культивирования, способствует увеличению продукции РНКаз клетками женьшеня.

Изучено взаимодействие культивируемых клеток женьшеня с патогенными микроорганизмами. Показано, что повышенная РНКазная активность препятствует заражению и гибели растительных клеток. Определена возможная физиологическая роль Pg-РНКаз в защитной системе растительной клетки.

Практическая значимость. Впервые установлено, что культивируемые клетки растений могут служить источником получения рибонуклеаз. Показано, что штамм R-1 культуры клеток женьшеня является перспективным для биотехнологического использования. Модифицирована питательная среда для повышения продукции РНКаз, что позволяет более рационально использовать клеточную культуру в промышленных условиях.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференциях молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (1997, 1998, 2000), на международных конференциях «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, 1999), «Сигнальные системы растительных клеток» (Москва, 2001), «Сознание и наука: взгляд в будущее» (Владивосток, 2001), на 8-й международной конференции по женьшеню (Сеул, Корея, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Иммуноферментный анализ выполнен совместно с сотрудниками лаборатории основ неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Определение первичной аминокислотной последовательности проведено совместно с сотрудниками Л.И. Федореевой и Т.П. Моисеевым.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Яснецкая, Елена Гурьевна

ВЫВОДЫ

1. Культивируемые клетки женьшеня стабильно продуцирует значительное количество рибонуклеаз (2,0 -10,2 мг/л).

2. РНКазная активность в клетках женьшеня в основном обусловлена наличием белков Pgl и Pg2.

3. Культура клеток женьшеня содержит новые РНКазы, представленные двумя изоформами -Pgl и Pg2, молекулярными массами 16473 и 16409 Да. Pg-РНКазы отнесены к патоген-обусловленными белками группы PR-10.

4. Pg-РНКазы женьшеня индуцируются этиленом и жасмоновой, но не салициловой кислотой. Влияние этилена на продукцию Pg-PHKa3 осуществляется при участии киназ и фосфатаз.

5. Активность Pg-PHKa3 в каллусах женьшеня увеличивалась под воздействием стрессовых факторов (УФ, асфиксия, солевой стресс).

6. Варьирование условий культивирования клеток женьшеня (освещение, температура, компоненты сред, фитогормоны) модулировало активность РНКаз.

7. Клетки женьшеня с индуцированной рибонуклеазной активностью подавляли размножение фитопатогенных бактерий A. tumefaciens.

8. Наиболее вероятная физиологическая роль растительных рибонуклеаз PR-10 группы заключается в защите растений от патогенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе впервые показано, что культивируемые клетки растений могут служить источником ценных биологически активных веществ - рибонуклеаз. Полученные результаты позволяют расширить возможности биотехнологического использования культур растительных клеток, которые рассматриваются в настоящее время в основном как источник получения вторичных метаболитов. В ходе работы получены данные о первичной структуре Pg-PHKa3 женьшеня, способах увеличения их количества в каллусных тканях и путях регуляции. Соответственно, обсуждение материала может быть разделено на три части: 1. Продукция РНКаз культивируемыми клетками женьшеня, первичная структура Pg-РНКаз. 2. Влияние условий культивирования клеток женьшеня на продукцию РНКаз. 3. Механизмы индукции синтеза РНКаз.

Из всех клеточных культур лекарственных растений, имеющихся в коллекции лаборатории биотехнологии, высокая РНКазная активность была обнаружена для С. monnieri, G. pentaphyllum и некоторых клеточных культур P. ginseng. Дальнейшее исследование проводилось с клеточной культурой P. ginseng (штамм R1), которая адаптирована к применению в промышленных масштабах (Булгаков и др., 1991).

По результатам иммуноферментного анализа продукция РНКаз клеточной культурой женьшеня варьировала от 2,0 до 10,2 мг/л. Это количество сопоставимо с продукцией РНКаз томата в дрожжевой экспрессионной системе - 0,5-10 мг/л (Oghi et al., 1997). В нативном корне женьшеня РНКазная активность оказалась значительно ниже, чем в большинстве каллусных линий и штаммов культивируемых клеток женьшеня.

РНКазная активность в штамме R1, прослеженная в течение одного пассажа (2 недельное культивирование клеток в суспензионной среде и 5-х недельное культивирование каллусов на агаровой среде), стабильно поддерживалось на высоких значениях. Максимум приходится на конец лаг-фазы - начало экспоненциальной фазы роста клеток (2-е сутки для суспензионной и 4-е сутки для каллусной культуры). Показано, что интенсивная продукция РНКазы сохраняется в условиях шестилетнего пассирования. Наибольшая амплитуда колебаний (30%) в продолжение годового цикла выявлена при противопоставлении сезонов "зима - осень". Таким образом, тестируемый штамм R-1 характеризуется высоким уровнем и стабильной продукцией РНКаз.

При исследовании первичной структуры было установлено, что исследуемая низкомолекулярная РНКаза женьшеня представлена двумя изомерами - Pgl и Pg2. Они состоят, соответственно, из 154 и 153 аминокислотных остатков, их молекулярная масса равна 16473 и 16409 Да. Коэффициент корреляции между РНКазной активностью и содержанием Pg-РНКаз, определенным иммуноферментным анализом, в отдельных пробах каллусной культуры достигал 0,95 единиц. Это свидетельствует о том, что рибонуклеазная активность в клетках женьшеня в основном обусловлена Pg-РНКазами.

Pg-РНКазы женьшеня не имеют гомологичных участков ни с одной из известных рибонуклеаз, в том числе и с растительными РНКазами. Вместе с тем, обнаружена высокая (6070%) гомология Pg-PHKa3 с внутриклеточными патоген-обусловленными белками петрушки рс PR1 и рс PR2, относящимися к семейству PR-10 белков (Eulgem et al., 1999). Все PR-10 белки характеризуются отсутствием сигнальной последовательности аминокислот, необходимой для секреции белка во внеклеточное пространство или вакуоль (Breiteneder et al., 1989; Breiteneder et al., 1993; Vanek-Krebitz et al., 1995; Moiseyev et al., 1997).

Физиологическая роль PR-10 белков до сих пор не определена. Известно, что PR-10 белки участвуют в защите растения от патогенов (Broderick et al., 1997; Ittiriaga et al., 1999; Euglem et al., 1999). С другой стороны, они обнаруживаются в здоровых растениях (Constabel and Brisson, 1995), по-видимому, играя роль в процессах физиологической адаптации, а также развитии и старении растений ( Crowell et al., 1992; Walter et al., 1996). Как было отмечено в обзоре литературы, существует точка зрения, согласно которой все патоген-обусловленные белки группы PR-10 обладают РНКазной активностью (Moiseyev et al., 1997). Однако она является дискуссионной, её экспериментальное подтверждение получено лишь в отдельных случаях (Walter et al., 1990; Swoboda et al., 1996; Bufe et al., 1996; Zhou et al., 2002).

Из данных, представленных в диссертации, следует, что экспозиция каллусных клеток под УФ облучением вызывала трехкратное, а пребывание под слоем воды (асфиксия) - двукратное повышение РНКазной активности. Выращивание каллусных клеток на свету и добавление КС1 в питательную среду также приводило к повышению РНКазной активности в клетках, однако оно сопровождалось подавлением роста клеток. Вместе с тем, при выращивании клеток в условиях повышенной (38°С) и пониженной (8°С) температуры рибонуклеазная активность падала спустя 1 и 4 часа соответственно. В отличие от многих антифризных PR-белков, таких как хитиназы, глюканазы группы PR-2 и осмотин (Hon et al., 1995), Pg рибонуклеазы, очевидно, не участвуют в холодовой адаптации клеток женьшеня. Известно, что акклиматизация находится под контролем абсцизовой кислоты (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994). В наших опытах как абсцизовая кислота, так и стрессовые температурные условия ингибировали РНКазную активность.

В стерильных условиях, в которых выращиваются каллусы в пробирках, на накопление PR-10 рибонуклеаз могут влиять компоненты питательной среды. Нами были исследованы минеральные компоненты питательной среды - соли меди, цинка, кобальта, кальция, фосфора, комплекс железа с хелатирующим веществом ЭДТА, сахароза и растительные гормоны, используемые в культивировании растительных клеток (табл. 11). Ряд компонентов среды индуцировал рибонуклеазную активность на фоне ингибирования роста каллусов. Например, сульфат меди в концентрации 2,5 мг/л индуцировал рибонуклеазную активность, но снижал накопление биомассы. Другие компоненты питательной среды индуцировали как повышение РНКазной активности, так и увеличение накопления биомассы. Повышенные по сравнению с содержанием в стандартной среде концентрации солей фосфора и кальция (КН2РО4 -2,5 г/л, СаСЬ'бШО - 1,9 мг/л) индуцировали рост и рибонуклеазную активность культивируемых клетках женьшеня. Подобные эффекты для культур тканей - продуцентов веществ вторичного метаболизма до сих пор не были отмечены.

В отсутствии таких важных компонентов питательной среды, как ЭДТА, цинк и кобальт, наблюдали значительное угнетение роста клеток. В то же время рибонуклеазная активность в таких клетках была заметно выше по сравнению с клетками, выращенными на стандартной среде. Двухвалентные катионы (медь, цинк, кобальт) являются кофакторами многих РНКаз (Rocckel et al., 1988), медь и цинк индуцируют PR-10 белки (Auriola et al., 1998). Зависимость активности некоторых рибонуклеаз от ЭДТА является установленным фактом (Csiszar et al., 2001). Однако, для повышения рибонуклеазной активности в культивируемых клетках женьшеня, оптимальным оказалось снижение количества ЭДТА и двухвалентных катионов в среде.

В клетках женьшеня Pg-РНКазы синтезируются в течение продолжительного времени культивирования ткани, в условиях отсутствия очевидного стресса. Сигнал, приводящий к сохранению постоянного и довольно высокого уровня синтеза этих белков в культуре женьшеня, пока не известен. Очевидно, что состояние активного синтеза рибонуклеаз в культуре in vitro не является специфической особенностью клеток женьшеня. Другие виды культивируемых клеток также обладали высокой рибонуклеазной активностью (табл.5). Роль индукторов РНКаз в культивируемых клетках могут выполнять экзогенные фитогормоны (ауксины, гиббереллины, абсцизовая кислота). Так, регулятор роста группы ауксинов, 4-хлорфеноксиуксусная кислота (4СРА), в концентрациях от 0,001 и 0,01 мМ увеличивала рост биомассы клеток и активность РНКаз. 4СРА повышает продукцию эндогенного этилена (Kende et al., 1993) который, как известно, индуцирует накопление белков группы PR-10 (Broderick et al., 1997). Возможно, этим объясняется способность 4СРА повышать рибонуклеазную активность в клетках женьшеня. ГКз является активатором некоторых гидролитических ферментов, в том числе и РНКаз (Rogers et al., 1999). Её добавление в питательную среду в возрастающих концентрациях (от 0,0001 мМ до 0,.1 мМ) незначительно увеличивало РНКазную активность. Фитогормон абсцизовая кислота известна как индуктор некоторых связанных со старением рибонуклеаз (Lers et al., 1998). Абсцизовая кислота, добавленная в среду, заметно ингибировала рост клеток и рибонуклеазную активность во всех испытанных концентрациях. Возможно, это обусловлено ингибированием транскрипции PR-10 генов женьшеня, как это было показано для PR-10 генов лилии (Wang et al., 1999).

Возможно, Pg-РНКазы являются не только стресс-обусловленными белками, но и принимают участие в процессах клеточного метаболизма, контролируемых гибберелловой кислотой и ауксином в отсутствии стресса.

На основании полученных результатов была модифицирована питательная среда для культивирования клеток штамма R1. На модифицированной среде клетки отличались повышенной рибонуклеазной активностью, но накопление биомассы было ниже по сравнению с клетками, выращенными на стандартной питательной среде. Поэтому модифицированную нами питательную среду можно использовать для доращивания каллусов - этот биотехнологический прием широко применяется в культивировании клеток растений - продуцентов вторичных метаболитов.

Полученные результаты демонстрируют стрессовую обусловленность повышения РНКазной активности в каллусах женьшеня. Вероятно, повышение активности РНКаз является частью неспецифического ответа клеток, и обусловлено тем, что сигнал, активирующий синтез РНКаз, включает общие пути защитных реакций, как на стрессы, так и на воздействие патогенов.

Механизм активации PR-10 генов связан с включением сигнальных систем этилена, жасмоновой и салициловой кислот (Chang and Raskin, 1992; oTDonnellet al., 1996; Broderick et al., 1997; Rakwal et al., 2001). В наших экспериментах метиловый эфир жасмоновой кислоты статистически достоверно индуцировал активность и количество РНКаз в культивируемых клетках женьшеня. Сходное влияние оказывал этефон, который разрушается при добавлении в питательную среду с высвобождением этилена. Действие этефона предупреждалось хлоридом кобальта, который является ингибитором биосинтеза этилена (Yu et al., 1979). Подавление продукции РНКаз, стимулированной этефоном, происходило также под влиянием цикло-гексимида. Циклогексимид - ингибитор белкового синтеза, следовательно, увеличение количества РНКаз, вызванное этефоном, обусловлено образованием фермента de novo. Индуцирующее влияние этефона на РНКазную активность хорошо согласуется с описанным выше повышением РНКазной активности под влиянием ГК3. Гибберелловая кислота индуцирует продукцию эндогенного этилена, влияя на синтез предшественника этилена, АСС (Kaneta et al., 1997).

Дополнительную информацию о вовлечении этилена в регуляцию продукции РНКаз дают результаты опытов со спермидином. Как оказалось, добавление спермидина к питательной среде снижало РНКазную активность клеток. Спермидин относится к группе полиаминов, которые имеют с этиленом общий предшественник - S-аденозинметионин. Между этиленом и полиаминами существуют конкурентные отношения (Appelbaum, 1981), при этом спермидин подавляет синтазу 1-аминоциклопропан- 1 карбоксаловой кислоты, ключевого фермента биосинтеза этилена (Matto et al., 1994).

В отличие от жасмоновой кислоты и этефона, салициловая кислота, добавленная к питательным средам, не индуцировала активность и количество РНКаз. Согласно литературным данным, салициловая кислота усиливает экспрессию PR-10 гена фасоли в ответ на обработку листьев растения в концентрации 5 мМ (Walter et al., 1996), однако применяемая авторами концентрация слишком высока в сравнении с обычно регистрируемым содержанием эндогенной СК в растении (менее 70 мкМ) (Shirasu et al., 1997).

Важнейшим этапом в формировании этилен обусловленных защитных реакций растения является фосфорилирование белков (Chang et al., 1995). Ингибиторы киназ и фосфатаз, катализирующих процесс фосфорилирования, подавляют индуцированное этиленом образование PR-10 (Rakwal et al., 2001) и других PR белков (Raz et al., 1993; Kolahukuoly et al., 1995). В наших опытах ингибитор протеинзависимых протеинкиназ и протеин-киназ С, Н-7, уменьшал содержание белков Pg и рибонуклеазную активность клеток женьшеня как в присутствии этефона, так и без него. Поэтому можно предположить, что Н-7 ингибирует сигнал как от эндогенного, так и от экзогенного этилена.

Ингибитор фосфатаз, кантаридин, подавлял индуцированное этефоном увеличение активности и количества РНКаз. Считается, что в активном состоянии мембранные этиленсвязывающие белки фосфорилироваиы (Hall et al., 2001). По-видимому, в клетках женьшеня кантаридин ингибирует фосфорилирование этилен-связывающих белков, препятствуя восприятию сигнала этилена.

Совокупность литературных и собственных данных позволяет смоделировать возможную схему переноса сигнала этилена к индукции PR-10 генов женьшеня (рис. 29). экзогенный этилен I этиленсвязывающии белок активный ю т о неактивный ингибитор фосфааз кантаридин

Киназа киназный каскад) I

Н-7

S-аденозинметионин 11— Спермидин асс I эндогенный этилен

Активаторный белок оу^.,у i го. активирован О инактивирован

Рисунок 29. Предполагаемая схема активации генов PR-10 белков в клеточной культуре женьшеня.

АСС - 1- аминоциклопропан-1-карбоксиловая кислота.

Увеличенный уровень транскрипции PR-10 генов достигается при связывании актива-торных белков со специфическим сайтом промотора PR-10 гена (Despres et al., 1995; Somssich et al., 1988; Chiang and Hadwier, 1990; Warner et al., 1992). Белок-активатор может выполнять свою функцию, если достигается некоторый уровень его фосфорилирования. Фосфорилирование белка-активатора осуществляет киназа, компонент киназного каскада (Chang et al., 1995). Киназа активируется экзогенным этиленом посредством трансмембранного сенсорного белка - первого компонента киназного каскада (Scalier et al., 1995), либо эндогенным этиленом ("точка приложения" которого неизвестна). Эти процессы, по-видимому, приводят к индукции синтеза рибонуклеаз под воздействием этилена. Ингибитор Н-7 блокирует действие киназ(ы), снижая уровень рибонуклеазной активности.

Открытые нами пути индукции Pg рибонуклеаз сходны с описанными в литературе путями индукции защитных белков класса PR-6, ингибиторов протеиназ. Ген OsBBPI, кодирующий PR-6 ингибитор протеиназ из риса (Oryza sativa L.) быстро индуцируется в ответ на поранение, жасмоновую кислоту и этефон. При этом СК и АБК блокировали экспрессию гена OsBBPI (Rakwal et al., 2001). Сходство путей индукции может указывать на возможную физиологическую роль Pg рибонуклеаз, аналогичную ингибиторам протеиназ, активных компонентов защитной реакции клетки.

Поскольку некоторые из описанных в литературе PR-10 белков участвуют в защите растения от грибков и бактерий (Ittiriaga et al., 1994; Broderick et al., 1997; Euglem et al., 1999), мы предположили, что рибонуклеазы женьшеня способны ингибировать рост фитопатоге-нов. Поэтому было интересно изучить влияние Pg-PHKa3 на рост агробактерий А. tumefaciens. В условиях совместного культивирования клетки женьшеня с повышенной рибонуклеазной активностью (4000 Ед/г) более активно подавляли рост агробактерий, чем клетки с пониженной рибонуклеазной активностью (1600 Ед/г). Полученные результаты согласуются с описанным в литературе повышением РНКазной активности в листьях табака, происходящим под влиянием вируса табачной мозаики. Повышение активности РНКаз препятствовало патогена (Власов и др., 1981; Торопкова, 1983).

В системе с клетками женьшеня грамотрицательные микроорганизмы У. pseudotuberculosis активно размножались в течение первых трех суток культивирования, после чего число бактерий заметно снизилось и на 11-е сутки живых бактерий уже не было обнаружено.

Уменьшение числа жизнеспособных бактерий происходило на фоне гибели клеток женьшеня, к 18 суткам в культуре было 100% некротизированных каллусных клеток. Количество и активность рибонуклеаз в клетках женьшеня, зараженных бактериями псевдотуберкулеза, снижалось. Таким образом, культура клеток женьшеня не ингибирует размножения Y. pseudotuberculosis.

Эти результаты позволяют рассматривать возможную физиологическую роль PR-10 белков в свете двух сформировавшихся в последнее время гипотез. По одной из них, PR-10 РНКазы могут подавлять развитие патогенов, либо непосредственно, либо опосредованно путем деградации внутриклеточной РНК при распознавании патогена с последующим развитием реакции гиперчувствительности (Swoboda et al., 1996). Согласно второй гипотезе PR-10 белки с РНКазной активностью разрушают м-РНК защитных генов растения после того, как необходимость защиты от патогенов отпала, возвращая клетку к нормальному физиологическому состоянию (Walter et al., 1996). В пользу второй гипотезы склоняются авторы недавней публикации (Zhou et al., 2002), мотивируя свое мнение тем, что экспрессия PR-10 белков имеет отсроченный характер, т.е. пик активности экспрессии PR-10 генов наступает позже того времени, когда наблюдается пик активности экспрессии основных защитных генов.

Наши экспериментальные данные свидетельствуют в пользу первой гипотезы. В её рамках Pg-РНКазы могут быть охарактеризованы как индуцибельные защитные вещества пролонгированного действия, либо конститутивно экспрессируемые защитные вещества.

Полученные результаты, на наш взгляд, расширяют недостаточно разработанное в науке представление о продукции рибонуклеаз культивируемыми клетками растений. Культура клеток женьшеня относится к числу немногих объектов, способных накапливать значительные количества рибонуклеаз. штамм R-1 в этом отношении является перспективным объектом, поскольку он адаптирован к культивированию в промышленных масштабах.

Представленные в работе данные о продукции, структуре и биологических свойствах РНКаз женьшеня могут рассматриваться как научная основа для промышленного освоения этого нового объекта.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Яснецкая, Елена Гурьевна, 2003 год

1. Булгаков В. П., Журавлев Ю. Н. Козыренко М. М. Содержание даммарановых гликози-дов в различных каллусных линиях Panax ginseng С.А. Меу. Растительные ресурсы. 1991. Т. 27(3). С. 94-100.

2. Власов Ю.И., Тютерев C.JL, Хрущева И.В., Торопкова О.А. Рибонуклеазная активность в листьях томатов, инфицированных штаммами вируса табачной мозаики различной патоген-ности. Штаммы вирусов растений и их использование. Елгава: J1CXA. 1981. С.29-33.

3. Глинка Е. М., Проценко М. А. Функции белкового ингибитора полигалактуроназы в растении. Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т.35(1). С. 3-9.

4. Гречкин А. Н., Тарчевский И. А. Липоксигеназная сигнальная система. Физиология растений. 1999. Т.46 (1). С. 132-142.

5. Дроздова Ю. И. Выделение и изучение свойств СОД человека из рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomicias cerevisiae: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия. С-Пб., 1997. - С.20.

6. Елякова Л. А. Регуляция (3-1,3;1,6-глюканами растительного и животного иммунитетов. Вестник ДВО РАН. 1995.С. 5-9.

7. Жеребчик Л. К., Олевинская 3. М. Изменение активности рибонуклеазы листьев растений картофеля под воздействием вируса X и гиббереллина. Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1980. С. 21-25.

8. Журавлев Ю. Н., Булгаков В. П., Мороз Л. А. Накопление гинзенозидов в культуре клеток женьшеня Panax ginseng С.А. Меу., трансформированных с помощью Agrobacterium rhi-sogenes. Доклады АН СССР. 1991. Т. 311. С. 1017-1019.

9. Иванова Е. П., Романенко Л. А., Плисова Е. Ю., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Горшкова Н. М., Ивановский В. В., Рассказов В. А. Распространение рибонуклеаз среди морских микроорганизмов. Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. С. 384-388.

10. Калинин Ф. JI. Биологически активные вещества в растениеводстве. Киев. Наукова думка, 1984. - С.80.

11. Каранова В. В., Урманцева В. В. Селекция вариантных клеточных линий люцерны с повышенной активностью пероксидазы. Физиология растений. 1996. Том.43(1). Стр. 104-110.

12. Кириллова Н. В., Смирнова М. Г., Комов В. П. Последовательное выделение супероксид-дисмутазы и аймалина из культуры клеток Rauwolfia serpentina Benth. Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37(2). С.181-185.

13. Колосова А. Ю., Блинцов А. Н., Самсонова Ж. В., Егоров А. М. Разработка твердофазного иммуноферментного анализа гентамицина в сыворотке крови человека. Антибиотики и химиотерапия. 1998. Т.43(2). С.9-13.

14. Лахматова И. Т. Индукция устойчивости растений к вирусам биологически активными веществами (иммунизация). С.-х. биология. 1992

15. Малецкий С. И. Введение в популяционную биологию и генетику растений. Новосибирск. 1995.-С. 19.

16. Реунов А. В. Цитопатология пораженной вирусами (ВТМ, ХВК) растительной клетки и проблема устойчивости растений. Автореф. дисс. д-ра биол. наук. Киев. - 1989.

17. Тарчевский И. А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов. Физиология растений. 1992. Т.39(6). С. 1215-1223.

18. Тарчевский И. А. Элиситор-индуцируемые сигнальные пути и их взаимодействие. Физиология растений. 2000.Т. 47. С. 285-294.

19. Тарчевский И. А., Максутова Н. Н., Яковлева В. Г. Влияние жасмоновой, салициловой и абсцизовой кислоты на вставку С-14. лейцина в белки в листьях гороха. Биохимия. 2001. Т. 66(1). С. 68-71.

20. Тарчевский И. А., Чернов В. М. Молекулярные аспекты фитоиммунитета. Микология и фитопатология. 2000. Т. 34(3). С. 1-10.

21. Торопкова О. А. Интенсивность размножения вакцинного штамма вируса табачной мозаики и активность рибонуклеазы в растениях томатов. Бюл. ВНИИ защиты растений. 1983. № 56. С. 57-60.

22. Трифонова Е. А., Комарова М. JL, Сырник О. А., Кочетов А. В., Шумный В. К. Трансгенные растения табака Nicotiana tabaccum SRI, экспрессирующие ген, кодирующий нуклеазу Serratia marcescens. Генетика. 2002. Т. 38(1). С. 1-4.

23. Хадеева Н. В., Майсурян А. Н., Бобкова А. Ф. Образование пероксидазы в культуре ткани хрена. Физиология растений. 1993. Т.40(2). Р. 295-299.

24. Цаплина И. А. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. М.: Мысль, 1979. -С.238.

25. Abel S., Glund К. Localization of RNA-degrading enzyme activity within vacuoles of cultured tomato cells. Physiol. Plant. 1986. V.66. P.79-86.

26. Abel S., Glund K. Ribonuclease in plant vacuoles: purification and molecular properties of the enzyme from cultured tomato cells. Planta. 1987. V. 172. P. 71-78.

27. Anticainen M., Griffith M., Zhang J., Hon W-C. Immunolocalization of antifreeze proteins in winter rye leaves, crowns, and roots by tissue printing. Plant physiology. 1996. V. 110. P. 845-857.

28. Antoniw J., Kueh J., Walkey D., White R. The presence of pathogenesis-related proteins in callus of Xanti-nc tobacco. Phytopathologische zeitschrift. 1981. V. 101. P. 179-184.

29. Arata Y., Kimura S., Matsuo H., Narita K. Proton and phosphorus nuclear magnetic resonance studies of ribonuclease Tl. Biochemistry. 1979. V. 18. P.18-24.

30. Ardelt W., Mikulski S.M., Shogen K. Amino acid sequence of an antitumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases. J. Biol. Chem. 1991. V. 266(1). P. 245-251.

31. Auriola S., Sarrazin O., Karenlampi S. PR-10 protein is induced by copper stress in roots and leaves of a Cu/Zn tolerant clone of birch, Betula pendula. Plant cell and environment. 1998. V. 21 P. 821- 828.

32. Bariola P.A., Howard C.J., Taylor C.B., Verburg M.T., Jaglan V.D., Green PJ. The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation. Plant J. 1994. V.6. P. 673-685.

33. Beecher В., Murfett J., McClure B.A. RNAse I from Escherichia coli cannot substitute for S-RNAse in rejection of Nicotiana plumbaginifolia pollen. Plant Mol. Biol. 1998. V.36(4). P.553-563.

34. Beffa R.S., Szell M., Meuwly P., Pay A., Vogeli-Lange R., Metraux J.-P., Neuhaus G., Meins F. Cholera toxin elevates pathogen resistance and induces pathogenesis-related gene expression in ta-bacco. EMBO J. 1995.V.14. P.5753 -5755.

35. Blank A., McKeon T. A. Single-strand-preferring nuclease activity in wheat leaves is increased in senescence and is negatively photoregulated. PNAS USA 1989. V. 86. P. 3169-3173.

36. Breda C., Sallaud C., El-Turk J. Defence reaction in Medicago sativa: a gene encoding a class 10 PR protein is expressed in vascular bundles. Mol. Plant-Microbe interaction. 1996. V. 9. P. 713719.

37. Brederode F. Т., Linthorst H. J. M., Bol J. F. Differential induction of acquired resistance and PR gene expression in tobacco by virus infection, ethephon treatment UV light and wounding. Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 1117-1125.

38. Breiteneder H., Pettenburger K., Bito A., Valenta R., Kraft D., Rumpold H., Scheiner O.M. The gene coding for the major birch allergen Betv 1 is highly homologous to a pea disease resistance response gene. EMBO J., 1989. V. 8. P. 1935-1938.

39. Brinner F., Stintzi A., Fritig В., Legrand M. Substrate specificities of tobacco chitinases. The Plant journal. 1998. V. 14. P. 225-234.

40. Bufe A., Betzel C., Schramm G. Crystallization and preliminary data of a major pollen allergen. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 27193-27196.

41. Chang C., Meyerowitz E. The ethylene hormone response in Arabidopsis: a eukariotic two-component signalling system. PNAS USA. 1995. V. 92. P. 4129-4133

42. Chiang C.C., Hadwier L.A. Cloning and characterisation of a disease resistance response gene in pea inducible by Fusarum solani. Mol. Plant microbe interact. 1990. V. 3. P. 78-85.

43. Cho G. H., Kim D. I., Pederesen H., Chin C-K. Ethephon enhancement of secondary metabolite synthesis in plant cell cultures. Biotechnol. Progr. 1988. V.4. P. 184-188.

44. Conrath U., Silvia H., Klessig D.F. Protein dephosphorilation mediates salicylic acid-induced expression of PR-1 genes in tabacco. Plant J. 1997. V.ll. P.747-749.

45. Constable P.C., Brisson N. Stigma- and vascular specific expression of the PR-10 a gene of potato: a novel pattern of expression of a pathogenesis-related gene. Molecular plant-microbe interactions. 1995. V.8. P. 104-113.

46. Cordero M.J., Raventos D., San Segundo B. Expression of a maize proteinase inhibitor gene is induced in response to wounding and fungal infection: systemic wound-response of a monocot gene. Plant J. 1994. V. 6. P. 141-143.

47. Crowell D.N., Maliyakal E.J., Russell D., Amasino R.M. Characterisation of a stress-induced, developmentally regulated gene family from soybean. Plant Mol. Biol. 1992. V. 18. P. 459-466.

48. Csiszar E., Losonczi A., Szakacs G., Rusznak I., Bezur L., Reicher J. Enzymes and chelating agent in cotton pretreatment. Journal of Biotechnology. 2001.V.89. P. 271-279.

49. Despres С., Subramaniam, R., Matton, D.P., Brisson N. The activation of the potato PR-lOa gene requires the phosphorylation of the nuclear factor PBF-1. The Plant Cell. 1995. V.7. P.589-598.

50. Dudler R., Mauch F., Reimmann C. Taumatin-like proteins, in Thaumatin. Witty M., Higgin-botham J.D. (eds)., CRC Press, Boca Ration, FL, 1994. P.193

51. Duff S.M.G., Plaxton W.C., Lefebvre D.D. Phosphate-starvation response in plant cells: de novo synthesis and degradation of acid phosphatases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88(21). P. 9538-9542.

52. Ebner C., Hoffmann-Sommergruber K., Breiteneder H. Plant food allergens homologous to pathogenesis-related proteins. Allergy. 2001. V. 56. P. 43-44.

53. Ehness R., Ecker M., Godt D., Roitsch T. Glucose and stress independently regulate source and sink metabolism and defence mechanisms via signal transduction pathways involving protein phosphorylation. Plant cell. 1997. V. 9. P. 1825-1841.

54. Epple P., Apel K., Bohlmann H. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis related proteins. Plant physiology. 1995. V. 109. P.813-820

55. Eulgem Т., Rushton P.J., Schmelzer E., Hahlbrock K., Somssich I. E. Early nuclear events in plant defence signalling: rapid gene activation by WRKY transcription factors. EMBO Journal. 1999. V. 18. P. 4689-4699.

56. Eyal Y., Meller Y., Lev Yadun S., Ruhr R. A basic type PR-1 promoter directs ethylene responsiveness, vascular and abscission zone - specific expression. Plant J. 1993. V.4 . P.225 - 228.

57. Eyal Y., Sagee O., Fluhr R. Dark-induced accumulation of a basic pathogenesis-related (PR-1) transcript and a light requirement for its induction by ethylene. Plant Mol. Biol. 1992. V. 19. P.589-592.

58. Farkas G.L. Ribonucleases and ribonucleic acid breakdown. Encyclopaedia of Plant Physiology, New Sere. 1982. V. 14 B. P. 224-262.

59. Farmer E., Ryan C. Octadecanoid precursors of jasmonic acid activate the synthesis of wound-inducible PI. Plant ell. 1992. V. 4. P. 129-131.

60. Franklin D., Morgan P.W. Rapid production of auxin-induced ethylene. Plant Physiol. 1978. V.62. P. 161-162.

61. Frearson E.M., Power J.B., Cocking E.C. The isolation, culture and regeneration of Petunia leaf protoplasts. Dev. Biol. 1973. V. 33. P. 130-137.

62. Green P., Kastenmayer J., Macintosh G., LeBrasseur N. Genetics and genomics of eucariotic ribonucleases. in Proceeding of the 6th International Conference on Ribonucleases (19-23 June, 2002). Bath, UK. P.48.

63. Green P.J. The ribonucleases of higher plants. Annual Revue Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994. V. 45. P. 421-445.

64. Gruner R., Pfitzner U. M. The upstream region of the gene for the pathogenesis-related protein la from tobacco responds to environmental as well as developmental signals in transgenic plants. Eur. J. Biochem. 1994. V.220. P. 247-250.

65. Gunawardena A., Pearce D., Jackson M., Hawes C., Evans D. Characterisation of programmed cell death during aerenchima formation induced by ethylene of hypoxia in roots of maize (Zea mays L.). Planta. 2001. V. 212. P. 205-214.

66. Guo Z.-J., Lamb C., Dixon R.A. Release and biological activity of diffusible signal compounds from elicited plant cells. J. Plant physiol. 1997. V. 151. P. 699-710.

67. Hall M.A., Moshkov I.E., Novikova G.V., Mur L.A.J., Smith A.R. Ethylene signal perception and transduction: multiple paradigms? Biol. Rev. 2001. V. 76. P. 103-128.

68. Hammond J. Repelling plant pathogens with ribonuclease. Nature biotechnology. 1997. V. 15. P. 1247-1247.

69. Hirt H. Connecting oxidative stress, auxin, and cell cycle regulation through a plant mitogen-activated protein kinase pathway. Proc. Acad. Sci. USA. 2000 V.97. P. 2405-2407.

70. Hon W.C., Griffit M., Mlynarz A., Kwok Y.C., Yang D.S.C. Antifreeze proteins in winter rye are similar to pathogen-related proteins. Plant Physiol. 1995. V.109. P.879-883.

71. Honee G. Engineered resistance against fungal plant pathogenes. European journal of plant pathology. 1999. V. 105. P. 319-326.

72. Howard C., Taylor C. The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation. Plant J. 1989. V.6. P. 673-685.

73. Hseih L.S., Moos M., Lin Y. Characterisation of apple 18 and 31 kD allergens by microse-quencing and evaluation of their content during storage and ripening. J. Allergy Clin. Immunol. 1995. V.96. P.960-970.

74. Huang J.C., Chang F.C., Wang, C.S. Characterisation of a lily tapetal transcript that shares sequence similarity with a class of intracellular pathogenesis-related (IPR) proteins. Plant Mol. Biol. 1997. V.34. P.681-686.

75. Huynh Q., Borgmeyer J., Amith C., Bell L., Shah D. Isolation and characterisation of a 30 kDa protein with antifungal activity from leaves of Engelmannia pinnatifida. Biochem. J. 1996. V. 316. P. 723-727.

76. Iturriaga E.A., Leech M.J., Barratt D.H.P., Wang T.L. Two ABA-responsive proteins from pea {Pisum sativum L.) are closely related to intracellular pathogenesis-related proteins. Plant Mol. Biol. 1994. V. 24. P. 235-240.

77. Jacobsen S., Olszewski N. Gibberellins regulate the abundance of RNAs with sequence similarity to proteinase inhibitors, dioxygenases. Planta. 1996. V. 198. P. 78-80.

78. Jost W., Bak H., Glund K., Terpstra P., Beintema J.J. Amino acid sequence of an extracellular, phosphate-starvation-induced ribonuclease from cultured tomato (Lycopersicon esculentum) cells. Eur J. Biochem. 1991. V.198. P.l-6.

79. Jung J.L., Maurel S., Fritig В., Hahne G. Different pathogenesis-related proteins are expressed in sunflower (Helianthus annuus L.) in response to physical, chemical and stress factors. J. Plant Physiol. 1995. V. 145. P. 153-157.J •

80. Kaneta Т., Kakimoto Т., Shibaoka H. Gibberellin A3 cause a decrease in the accumulation of mRNA for ACC oxidase in the activity of the enzyme in azuki bean (Vigna angularis) epicots. Plant cell physiol. 1997. V. 38(10). P. 1135-1141: ::.

81. Kariu Т., Sano K., Shimokawa H., Itoh Ri, YamaSaki N., Kimura M. Isolation and characterization of a wound-inducible ribonuclease frorii Nicotiana glutinosa leaves. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. V.62. P.1144-1151. .

82. Kawchuk L.M., Prufer D. Molecular strategies for engineering resistance to potato viruses. Can. J. Plant Pathol. 1999. V. 21.P. 231-247.

83. Kochetov A.V., Trifonova E.A., Komarova M.L. Model transgenic plants to study antiviral effect of ribonuclease. in Plant III Genome Conf. San Diego, USA (Jan 15-19,1995). p.201.

84. Коек M, Theierl K, Stenzel I, Glund K. Extracellular administration of phosphate-sequestering metabolites induces ribonucleases in cultured tomato cells. Planta. 1998. V. 204. P. 404-407.

85. Koiwa H., Sato F., Yamada Y. Characterisation of accumulation of tobacco PR-5 proteins by IEF- immunoblot analysis. Plant Cell Physiol. 1994. V.35. P. 821-824.

86. Kolattukudy P.E., Rogers L.M., Li D., Hwang C.S., Flaishman M.A. Surface signaling in pathogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92(10). P.4080-4087.

87. Kondo H., Ijiri S., Abe K. Inhibitory effect of oryzostatins and a truncation mutant on replication of poliovirus in infected vero cells. FEBS Lett. 1992. V. 299. P. 48-50.

88. Kumar D., Klessig D.F. Differential induction of tobacco MAP kinases by the defence signals nitric oxide, salicylic acid, ethylene, and jasmonic acid. Mol. plant-microbe interactions. 2000. V.13(3). P. 347-351.

89. Kusano A., Iwama M., Ohgi K., Irie M. Primary structure of a squid acid and base non-specific ribonuclease. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. V.62. P.87-94.

90. Lam S.K., Ng T.B. Isolation of a novel thermostabile heterodimeric ribonuclease with antifungal and antiproliferative activities from roots of the sanchi ginseng Panax notoginseng. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 285(2). P. 419-423.

91. Lamb C. J., Ryals J. A., Ward E. R., Dixon R. A. Emerging strategies for enhancing crop resistance to microbial pathogens. Biotechnology. 1992. V.10. P.1436-1440.

92. Lan V.T.T., Neuhaus J.-M., Boiler Т., Broughton W.J., Krause A. Molecular cloning of Vigna cDNAs encoding class I (Accession No. X88800) and class IV ( Accession No. X88803). Plant Physiol. 1996. V.110. P.335-339.

93. Langenberg W., Zhang L., Court D., Giunchedi L., Mitra A. Transgenic tobacco plants expressing the bacterial rnc gene resist virus infection. Mol. Breeding. 1997. V. 3. P. 391-399.

94. LaRosa P.C., Singh N.K. Hasegawa P.M., Bressan R.A. Stable NaCl tolerance of tobacco cells is associated with enhanced accumulation of osmotin. Plant Physiol. 1989. V.91. P. 855-858.

95. Leland P., Raines R. Cancer chemiotherapy ribonucleases to the rescue. Chemistry&Biology. 2001. V. 8. P. 405-413.

96. Lers A., Khalchitski A., Lomaniec E., Burd S., Green P.J. Senescence-induced RNAses in tomato. Plant molecular biology. 1998. V. 36. P. 439-449.

97. Leubner-Metzger G., Frundt C., Vogeli-Lange R. Class (3-1,3 glucanase in the endosperm of tobacco during germination. Plant Physiol. 1995. V. 109. P.751-758.

98. Li J.-H., Nass N., Kusaba M., Dodds P.N., Treloar N., Clarke A.E., Newbigin E. A genetic map of the Nicotiana alata S locus that includes three pollen-expressed genes. Theoretical and Applied Genetics. 2000. V. 100(6). P. 956-964.

99. Lo S.-C., Nicolson R. L. Reduction of light-induced anthocyanin accumulation in inoculated Sorghum mesocotyls. Plant physiology. 1998. V. 116. P. 979-989.

100. L6ffler A., Abel S., Jost W., Beintema J.J., Glund K. Phosphate-regulated induction of intracellular ribonucleases in cultured tomato (Lycopersicon esculentum) cells. Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 1472-1478.

101. Loffler A., Glund K., Irie M. Amino acid sequence of an intracellular, phosphate starvation-induced ribonuclease from cultured tomato (Lycopersion esculentum) cells. Eur. J. Biochem. 1993. V.214. P.627-633.

102. Lozoya E., Block A., Lois R., Hahlbrock K., Scheel D. Transcriptional repression of light-induced flavonoid synthesis by elisitor treatment of cultured parsley cells. Plant J. 1991. V. 1. P. 227-234.

103. Malamy J., Henning J., Klessig D.F. Temperature-dependent induction of salicylic acid and its conjugates during the resistance response to tobacco mosaic virus infection. Plant Cell. 1992. V.4. P. 359-361.

104. Marshall M. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 1995 V. 80. P. 179-185.

105. Martineau В., McBride К. E., Hauck C. A. Regulation of metallocarboxypeptidase inhibitor gene expression in tomato. Mol.Gen.Genet. 1991. V.228. P. 281-284.

106. Matousek J. Ribonucleases and their antitumor activity. Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2001. V.129(3). P.175-191.

107. Matto A.K., Suttle J.C. The plant hormone ethylene. CRC Press, Boca Ration, Florida. 1994. P.98.

108. Michaelis M., Mikulski S.Shogen K.Doerr H.W., Cinatl J. Antiviral effects of onconase (R) (Ranpirnase). in Proceeding of the 6th International Conference on Ribonucleases (19-23 June, 2002). Bath, UK. P.62.

109. Molina A., Segura A., Garcia-Olmedo F. Lipid transfer proteins (nsLTPs) from barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens. FEBS Letters. 1993. V. 316. P. 119-112.

110. Moreno R. Vazquez-Duhalt N., Nolasco H. Extracellular accumulation of high specific-activity peroxidase by cell suspension cultures of cowpea. Plant cell reports. 1990. V.9. N.3. P.147-148.

111. Moreno R., Vazquez-Duhalt R., Ochoa J.L. Peroxidase activity of calluses and cell suspension cultures of radish raphanus sativus var. Cherry Bell. Plant cell, tissue and organ culture. 1989. V. 18(3). P.321-322.

112. Mourgues F., Brisset M.N, Chevreau E. Strategies to improve plant resistance to bacterial diseases through genetic engineering. Trends Biotechnol. 1998. V. 16 P.203-210.

113. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. V. 15. P.437-439.

114. Neale A., Wahleithner J., Lund M., Bonnett H. Chitinase, (3-1,3- glucanase, osmotin, and ex-tensin are expressed in tobacco explants during flower formation. The Plant cell. 1990. V. 2. P. 673684.

115. Newton D., Wataridge S., Mikilski S., Ardelt W., Shogen K. Toxicity of an antitumor ribonu-clease to Purkinje neurons. J. Neuroscience. 1994. V. 14. P. 538-544.

116. Pastorello E. A., Conti A., Pravettoni V., Farioli L., Rivolta F., Ansaloni R. Identification of actinidin as the major allergen of kiwi fruit. J. Allergy Clin Immunol. 1988. V. 101. P. 531-537.

117. Pearce G., Strydom D., Johnson S., Ryan C.A. A polypeptide from tomato leaves activates the expression of proteinase inhibitor genes. Science. 1991. V. 253. P. 895-898.

118. Raines R. T. Ribonuclease A. Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1045-1065.

119. Raskin I. Role of salicylic acid in plants. Annual rev. plant physiol. plant mol. biol. 1992. V.43. P.439-463.

120. Raz V., Fluhr R. Ethylene signal is transduced via protein phosphorylation events in plants. Plant Cell. 1993. V.3. P. 523-525.

121. Reddi K.K. Ribonuclease induction in cells transformed by Agrobacterium tumifaciens. PNAS USA. 1966. V. 56. P. 1207 1214.

122. Repka V. Elisitor-stimulated induction of defence mechanisms and defence gene activation in grapevine cell suspension cultures. Biologia plantarum. 2001. V. 44. P. 555-565.

123. Ribo M., del Cardayre S., Raines R., Llorens R., Cuchillo C. Production of human pancreatic ribonuclease in Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli. Protein expression and purification. 1996. V. 7. N.3. P. 253-261.

124. Roeckel P., Heizmann P., Dubois M., Dumas C. Attempts to transform Zea mays via pollen grains: effect of pollen and stigma nuclease activities. Sex. Plant. Reprod. 1988. V. 1. P. 156-163.

125. Rogers S.W., Rogers J.C. Cloning and characterisation of a gibberellin-induced RNAse expressed in barley aleurone cells. Plant Physiol. 1999. V. 119. P.1457-1464.

126. Rosenberg H., Dyer K. Eosinofil cationic protein and Eosinofil neurotoxin. Evolution of novel function in a primate ribonuclease gene family. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 21539-21544.

127. Royo J., Nas N., Matton D. A retroposon-like sequence linked to the S-locus of Nicotiana alata is expressed in styles in response to touch. Mol. Genet. 1996. V.250. P. 180-188.

128. Ryan C.A. Protease inhibitors in plants: genes for improving defences against insects and pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 1990. V. 28. P.425-428.

129. Salganic R.I. Antiviral activity of nucleases: molecular mechanisms and applications. Current Trends in Life Sci., Biol. Macromolecules. 1984. V. 12. P. 115-123.

130. Sano T. Transgenic potato expressing a double-stranded RNA-specific ribonuclease is resistant to potato spindle tuber viroid. Nat. Biotechnol. 1997. V. 15. P. 1290-1294.

131. Saraste M., Sibbald P.R., Wittinghofer A. The P-loop-a common motif in ATP-and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sci. 1990. V. 15. P. 430-434.

132. Sassa H., Nishino Т., Kowyama Y., Hirano H., Koba Т., Ikehashi H. Self incompatibility (S) alleles of the Rosaceae encode members of a distinct class of the T2/S ribonuclease superfamily. Mol.&Gen. Genet. 1996. V.250. P. 413-415.

133. Sawai Y., Sugano N., Tsukada K. Ribonuclease H activity in cultured plant cells. Biochim Bio-phys. Acta. 1978. V. 518. P. 181-185.

134. Schaller G. E., Bleecker A. B. Ethylene-binding sites generated in yeast expressing the Arabi-dopsis ETR1 gene. Science. 1995. V. 270. P. 1809-1811.

135. Schein C.H. From housekeeping to microsurgeon: the diagnostic and therapeutic potential of ribonucleases. Nature Biotechnology. 1997. V. 15. P. 529-536.

136. Shinshi H., Mohnen D., Meins F. Regulation of plant pathogenesis-related enzyme: inhibition of chitinase and chitinase mRNA accumulation in cultured tobacco tissues by auxin and cytokinin. PNAS USA 1987. V. 64. P. 89-93.

137. Singh N., Bracker C., Hasegawa P., Handa A. Characterization of osmotin. A thaumatin-like protein associated with osmotic adaptations in plant cells. Plant physiology. 1987. V. 85. P. 529536.

138. Swoboda I., Scheiner O., Heberle-Bors E., Vicente O. cDNA cloning and characterisation of three birch genes, members of the Betv 1 gene family of pollen allergens, that encode pathogenesis-related proteins. Plant Cell Environ. 1995. V. 18. P. 865-874.

139. Tailor В., Young R., Schering C. Induction of a proteinase inhibitor 2 class gene by auxin in tomato roots. Plant. Mol. Bio. 1993. V. 23. P. 1005-1009.

140. Takeda S., Sato F., Ida K., Yamada Y. Characterization of polipeptides that accumulate in cultured Nicotiana tabacum cells. Plant & Cell physiology. 1990. V. 31. P. 215-221.

141. Terras F., Schoofs H., de Bolle M., van Leuven F., Rees S., Vanderleyden J. Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish {Raphanus sativus L.) seeds. Journal of biological chemistry. 1992. V. 267. P. 15301-15111.

142. Treisman A. Regulation of transcription by MAP kinase cascades. Curr. Opin. Cell. Biol. 1996. V.8. P.205-215.

143. Vogeli-Lange R., Frundt C., Hart C., Beffa R., Nagy F. Evidence for a role of 3-1,3-glucanase in dicot seed germination. The Plant Journal. 1994. V. 5. P. 273-278.

144. Vriezen W.H., Hulzink R., Mariani C., Voesenek L.A. 1-aminocyclopropane-l-carboxylate oxidase activity limits ethylene biosynthesis in Rumex palustris during submergence. Plant Physiol 1999. V.l. P. 189-196.

145. Walter M.H., Liu J.W., Wunn J., Hess D. Bean ribonuclease-like pathogenesis-related protein genes (YprlO) display complex patterns of developmental, dark-induced and exogenous-stimulus-dependent expression. Eur. J. Biochem. 1996. V. 239 P. 281-293.

146. Wang C.S., Huang J.C., Hu J.H. Characterization of 2 subclasses of PR-10 transcripts in lily anthers and induction of their genes through separate signal-transduction pathways. Plant mol. biol. 1999. V. 40. P. 807-814.

147. Warner S., Gill A., Draper J. The developmental expression of the asparagus intracellular PR protein (AoPRl) gene correlates with sites of phenilpropanoid biosyntesis. Plant J. 1994. V. 6. P. 31-43.

148. Warner S.A.J., Scott R., Draper J. (1993) Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPRl) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization transgenic tobacco. Plant J. 3.191-201.

149. Warner S.A.J., Scott R., Draper J. Characterisation of a wound-induced transcript from the monocot asparagus that shares similarity with a class of intracellular pathogenesis-related (PR) proteins. Plant Mol. Biol. 1992. V. 19. P. 555-561.

150. Watanabe Y., Ogawa Т., Takashahi H. Resistance against multiple plant viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specific ribonuclease. FEBS Letters. 1995. V. 372. P. 165-168.

151. Waters E.J., Shirley N.J., Williams P.J. Nuisance proteins of wine are grape pathogenesis-related proteins. J. Agric. Food Chem. 1996. V. 44. P.3-6.

152. Wise A.L., Naylor A.W., Chilling-enchanced photooxidation. The peroxidative destruction of lipids during chilling injury to photosynthesis and ultrastructure. Plant physiol. 1987. V.83(2). P. 272-277.

153. Wood N. Т., Allan A. C., Haley A., Viry-Moussa'id M., Trewavas A. J. The characterization of differential calcium signalling in tobacco guard cells. The Plant Journal. 2001. V. 24 (3). P. 335344.

154. Xu D., Xue Q., McElroy D.,Mawal Y., Hilder V. A., Wu R. Constitutive expression of a cow-pea trypsin inhibitor gene, CpTi, in transgenic rice plants confers resistance to two major rice insect pests. Mol. Breeding. 1996. V. 2. P.167-170.

155. Xu Y., Chang P. F. L., Liu D., Narasimban M. L., Ragothama K. G., Hasegawa P.M., Bressan R.A. Plant defense genes are synergistically induced by ethylene and methyl jasmonate. Plant Cell. 1994. V.6. P. 1077-1080.

156. Yamada A., Kobayashi S., Watanabe K. Production of horse radish peroxidase by plant cell culture. J. of Chemical technology and biotechnology. 1987. V.38.N.1. P.31-34.

157. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. A novel ds-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low temperature, or high-salt stress. The Plant Cell. 1994. V.6. P.251-264.

158. Yang S.F., Hoffmann N.E. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 1984. V.35. P. 155-159.

159. Yang Y., Shah J., Klessig D. F. Signal perception and transduction in plant defence responses. Genes Dev. 1997. V. 11. P. 1621.

160. Ye Z., Droste D. Isolation and characterization of cDNAs encoding xylogenesis-associated and wound-inducing ribonucleases in Zinnia elegans. Plant Mol. Biol. 1996. V. 30. P. 697-709.

161. Youle R.J., Newton D., Wu Y.-N., Gadina M., Rybak S.M. Cytotoxic ribonucleases and chimeras in cancer therapy. Crit. rev. therap. drug carrier syst. 1993. V.10. P.l-28.

162. Youle R.J., Wu Y.-N., Mikulski S., Shogen K. Hamilton R., Newton D., D'Alesio G. RNAse inhibition of human immunodeficiency virus infection of H9 cells. PNAS. 1994. V. 91. P. 60126016.

163. Yu Y., Yang S. F. Auxin-induced ethylene production and its inhibition by aminoethoxyvinyl-glycine and cobalt ion. Plant. Physiol. 1979. V. 64. P. 1074-1077.

164. Zhang L., French R., Langenberg W., Mitra A. Accumulation of barley striple mosaic virus is significantly reduced in transgenic wheat plants expressing a bacterial ribonuclease. Transgenic research. 2001. V. 10. P. 13-19.

165. Zhang S., Li J., Wang C.-C., Tsou C.-L. Metal regulation of metallothionein participation in redox reactions. FEBS Letters. 1999. V. 462(3). P.383-386.

166. Zhou X.-J., Lu S., Xu Y.-H., Wang J.W., Chen X.-Y. A cotton cDNA (GaPR-10) encoding a pathogenesis-related 10 protein with in vitro ribonuclease activity. Plant Science. 2002. V. 162. P. 629-636.