Выделение ингибиторов РНКаз хроматографическими методами и разработка технологии их производства. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Исаев, Андрей Султанович

• Исаев, Андрей Султанович
• кандидат биологических наук
• 1990

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Исаев, Андрей Султанович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Ингибирование рибонуклеазной активности при проведении экспериментальных работ с рибонуклеиновыми кислотами

2.2. Ингибирование рибонуклеазной активности с помощью сорбции РНКаз

2.3. Инактивация рибонуклеаз протеазами и химическими агентами

2.4. Внутриклеточные ингибиторы рибонуклеаз

2.4.1.Ингибиторы РНКаз из прокариотических клеток

2.4.2.Ингибиторы РНКаз из опухолевых клеток

2.4.3.Свойства ингибиторов рибонуклеаз из клеток тканей эукариотов

2.5. Методы выделения белковых ингибиторов рибонуклеаз и способы определения их активности

2.6. Применение белковых ингибиторов рибонуклеаз в молекулярно-биологических исследованиях

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 31 ЗЛ. Материалы и методы исследований 31 3.1 Л.Сырье, реактивы, материалы и буферные растворы

3,1,2.Подготовка исходного материалы для выделения плацентарного ингибитора и оценка качества

-33.2, Результаты и их обсувдение 37 3,2.1„Определение, активности ингибиторов

РНКаз

3,2,2.Сравнительное изучение лабораторных методов выделения ингибитора РНКаз из плаценты человека и оценка путей их усовершенствования

3.2.3„Разработка опытно-промышленной технологии ( "производственной методики") получения ингибитора РНКаз из плаценты человека

3.2.4.Поиск ингибиторов РНКаз в тканях,инфицированных РНК-содержащими вирусами

3.2.5.Выделение ингибитора РНКаз из печени цыплят, больных вирусом птичьего миелобластоза

3.2.6.Сравнительная оценка физико-химических и биологических свойств ингибиторов РНКаз из плаценты человека и из печени цыплят, больных острым миелоб-ластозом

3.2*7#Использование плацентарного ингибитора РНКаз в молекулярно-биологических экспериментах

4. ШВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение ингибиторов РНКаз хроматографическими методами и разработка технологии их производства.»

Актуальность темы. Ферментативный синтез двухцепочечной кДНК на поли ( А )+ - мРНК и встраивание этой ДНК в бактериальные f плазмиды стал основным методом молекулярной биологии эукариот.

Одним из главных моментов этого метода является сохранение натив-ной структуры мРНК, как в процессе ее выделения, так и при синтезе на ней кДНК. Основной задачей исследователей, занимающихся получением полноразмерных препаратов эукариотических мРНК, является сведение к минимуму рибонуклеазной активности на начальных стадиях выделения. Подавление возможной рибонуклеазной активности важно при обратной транскрипции, а также при синтезе белка в бесклеточной системе. Ингибирование РНКаз необходимо при выделении нативных полисом.

В настоящее время для снижения рибонуклеазной активности при работах с РНК используют различные типы ингибиторов РНКаз,но * наиболее удобными являютея ингибиторы белковой природы,например, из плаценты человека. К достоинствам белковых ингибиторов следует отнести их высокую специфичность, практически отсутствие влияния на протекание биохимических реакций и легкость удаления из реакционной смеси после реакции. В настоящее время такие фирмы, как BRL, Enzo Biochem. Inc., P-S Biochemicals, Paesel, Amersham и другие выпускают коммерческий препарат RNasin -высокоспецифич ный белковый ингибитор РНКаз, выделяемый из плаценты человека.

В нашей стране промышленно препараты ингибиторов рибонуклеаз не производятся. Лишь незначительная часть потребности удовлетворяется поставками из-за рубежа. Некоторое количество плацентарного ингибитора получают в лабораториях отдельных научно-исследовательских учреждений. Однако, объем получаемых препаратов недостаточен, качество значительно варьирует. Известные лабораторные методы / I - 4 / расчитаны на получение ингибитора в небольших количествах, в них отсутствуют технологические параметры выделения, полные характеристики качества получаемых препаратов. В связи с этим известные методы не пригодны для использования в условиях производства .

Необходимо отметить, что свойства ингибитора РНКаз из пла* центы человека не позволяют подавить активность всего спектра природных рибонуклеаз / I /, в частности, он не подавляет активность РНКаз, оптимум действия которых лежит в кислой области рН. Например, РНКаз Т| и Т*> / 5 /, оптимум активности которых находится в интервале рН от 5,0 до 5,5. Эти РНКазы применяются в мо-лекулярно-биологических экспериментах по изучению первичной структуры ДНК и скорости элонгации природных РНК. В настоящее время в СССР и за рубежом белковые ингибиторы кислых РНКаз не производятся. Цель и задачи исследования.Целью данной работы явилась разработка промышленной технологии получения ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека, поиск ингибиторов кислых РНКаз, разработка лабораторного метода их выделения и очистки, изучение некоторых физико-химических свойств выделенных ингибиторов. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи: I) оптимизировать методики очистки и анализа плацентарного ингибитора РНКаз; 2)разработать на их основе лабораторную, а затем опытно-промышленную технологию получения ингибитора; 3) провести поиск ингибиторов кислых РНКаз, в частности, в печени цыплят, больных острым миелобластозом; 4) разработать методику очистки выделенного нового ингибитора, и на этой основе разработать лабораторный метод его получения в комплексе с РНК-зависимой ДНК-поли-меразой; 5)изучить некоторые физико-химические свойства выделенного нового ингибитора:оптимальные условия реакции ингибирования РНКаз, определить его молекулярную массу и изоэлектрическую точку. Научная новизна работы. Впервые показано, что в печени цыплят, больных острым миелобластозом, синтезируется белковый ингибитор кислых РНКаз. Разработан лабораторный метод его выделения.Изучены некоторые физико-химические свойства нового ингибитора.Разработана промышленная технология получения и анализа ингибитора рибонуклеаз из плаценты чнловека.

Практическое значение работы. Разработанная промышленная технология получения плацентарного ингибитора РНКаз внедрена в производство на Омутнинском химическом заводе. На основе лабораторного метода выделения ингибитора кислых РНКаз разработан проект опытно-промышленной технологии получения нового ингибитора. Намечено внедрить его в производство.

На защиту выносится. Экспериментальные данные по выделению нового белкового ингибитора кислых РНКаз, полученного из печени цыплят, больных острым миелобластозом. Данные по сравнительному изучению некоторых физико-химических свойств нового ингибитора РНКаз и ► ингибитора РНКаз из плаценты человека. Описание разработанной опытн< промышленной технологии получения ингибитора РНКаз из плаценты человека. г

-82. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

S2.I. Ингибирование рибонуклеазной активности при проведении экспериментальных работ с рибонуклеиновыми кислотами.

В течение последнего десятилетия выделение высокомолекулярных РНК, например, фаговых, вирусных, мРНК, трансляция мРНК in vitro стало использоваться особенно широко. Подобные работы заложили основу развития технологии рекомбинантной ДНК, с помощью которой в настоящее время удается получить много ценной информации в области биологии и медицины. Кроме того, изучение отдельных высокомолекулярных РНК, выделенных в чистом виде, и их продуктов трансляции внесло важный вклад в понимание регуляции экспрессии генов в клетке на различных уровнях. Всё это стало возможным благодаря разработке методов получения недеградированных биологически активных рибонуклеиновых кислот из разнообразных источников.

Одним из ключевых моментов при получении хороших препаратов высокомолекулярных РНК, а также при обратной транскрипций и трансляции MPHKin vitro является сведение к минимуму рибонуклеазной активности как на начальных стадиях выделения РНК, так и на той, которая может присутствовать в препаратах ферментов и в других реактивах, использующихся в реакцияхin vitro.Рибонуклеазы - очень активные ферменты, и достаточно ничтожного их количества, чтобы инактивировать РНК. Если экзогенного рибонуклеазного загрязнения из посторонних источников ( с лабораторной посудой, водой, реактивами и т.д. ) избежать достаточно просто с помощью соответствующей организации лабораторной работы, то для преодоления трудностей, связанных с эндогенной рибонуклеазной активностью биологического материала, приходится применять специальные ингибиторы РНКаз, которые условно можно разделить на три группы: ингибиторы, тормозящие рибонуклеазную активность с помощью

-сорбции РНКаз, белковые ингибиторы рибонуклеаз и инактиваторы РНКаз, к которым можно отнести протеолитические ферменты и неко -торые химические агенты, ь В ранних работах для адсорбции рибонуклеаз использовали диатомовую землю С бентонит) и макалоид / 6 /. В настоящее время с этой целью широко применяют сульфатированный полисахарид -гепарин. Другие полианионы, например, поливинилсульфат, дейст -вуют подобно гепарину / 7 /, видимо, связывая рибонуклеазы и конкурируя таким образом с РНК. Аналогами РНК являются комплексы, образованные ионом оксованадия и любым из четырех рибонуклеози-дов / 8 /. Такие комплексы временно связываются со многими РНКазами и практически полностью подавляют их активность.

Сильными ингибиторами РНКаз являются белки, выделенные и очищенные из печени крысы / 9 / и из плаценты человека / 10 /. Ингибирование при применении белков-ингибиторов носит обратимый характер. Такой метод подавления активности РНКаз имеет ряд преимуществ ( например, белки легко экстрагируются фенолом).

Протеолитические ферменты ( протеиназа К и др. ) быстро инактивируют нуклеазы из многих источников. Некоторые химические агенты, например, 4 М гуанидинизотиоцианат в присутствии восстановителей, подобных 2-меркаптоэтанолу, практически полностью инактивирует РНКазы / II /.

В последующих главах обзора будут рассмотрены основные свойства наиболее широко применяемых ингибиторов РНКаз.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Исаев, Андрей Султанович

-954. В Ы В О Д Ы

I.Разработан метод выделения ингибитора РНКаз из плаценты человека, включающий гомогенизацию, солевое фракционирование сернокислым аммонием и хроматографичекую очистку на аффинном сорбенте РНКаза А-сефарозе и ионообменном ДЭАЭ-целлюлозе ДЙ-о2, позволяющий получать высокоочищенные препараты с удельной активностью от 40 до 80 ед.а/мкл, свободные от рибонуклеазных пшме-сей. Выход составляет 40-50 %.

2.Разработан метод синтеза биоаффинного сорбента РНКазам,-сефарозы, обладающего низкой степенью неспецифической сорбции. Полученный сорбент использовали при получении препаратов белковых ингибиторов РНКаз из плаценты человека и из печени цыплят, больных острым миелобластозом.

3.На основе разработанного метода получения белкового ингибитора РНКаз из плаценты человека создана и внедрена в производство опытно-промышленная технология его выделения. Качество выпускаемого промышленного белкового ингибитора РНКаз из плаценты человека, позволяет использовать его для проведения работ в области молекулярной биологии. Например, для синтеза к-ДНК с помощьк РНК-зависимой ДНК-полимеразы, для синтеза м-РНК в бееклеточных системах с помощью РНК-полимераз Т7 и БР6 для синтеза белка в бесклеточных системах и других.

4.Разработана и утверждена нормативно-техническая документация, необходимая для постановки препарата белкового ингибитора РНКаз из плаценты человека на производство:

-производственная методика на ингибитор РНКаз из плаценты человен£ -технические условия на препарат белкового ингибитора РНКаз из плаценты человека сроком на 3 года; -техническое задание;

-карта технического уровня на препарат белкового ингибитора

-РНКаз из плаценты человека.

5.Впервые установлено, что в печени цыплят, больных острым миелобластозом присутствует белковый ингибитор рибонуклеаз.

6.Разработанный лабораторный метод получения электроФооети-чески гомогенного стабилизированного препарата нового ингибитора РНКаз, свободного от рибонуклеазной активности может стать составной частью комплексного метода использования тушей цыплят, больных острым миелоблаетозом.Это позволит повысить эффективность использования биологического материала.

7.Изучены некоторые биохимические особенности нового ингибитора РНКаз.Показано, что это белок с молекулярной массой

80 кДа, диапазон блокирующего действия на рибонуклеазы, в отличие от известных ингибиторов, находится в области кислых значений рН.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основании проведенных исследований и разработанной нормативно-технической документации создана опытно-промышленная технология выделения белкового ингибитора РНКаз из плаценты человека, В 1989 году по этой технологии Омутнинский химический завод приступил к серийному выпуску препарата. В настоящее время произведено 800 ООО ед,.а. ГШ-ингибитора. Из биологических отходов при производстве РНК-зависимой ДНК-полимеразы-печени цыплят, болънътт острым миелобластозом, впервые выделен новый белковый ингибитор РНКаз. Разработана лабораторная методика его выделения, которая может стать основой промышленной технологии его производства.

Выражаю глубокую благодарность директору Омутнинского химического завода тов.Валову В.А. за возможность проведения научно-исследовательских работ, за постоянный интерес к работе и всемерную помощь.

Благодарю младшего научного сотрудника Новосибирского института Биоорганической химии Сибирского отделения АН СССР тов. М.А.Зенкову за большую помощь в работе и ценные советы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Исаев, Андрей Султанович, 1990 год

1. Blackburn P., Wilson G. and Moore S.Ribonuclease inhibitor from human placenta // J. Biol. Chem.- 1977.- V. 252,- Я 16.-P. 5.904-5910.

2. Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: rapid purification and assay // J. Biol. Chem.- 1979.- V. 24,-N 24.- P. 12484-12487.

3. ОрнаЛ.А., Безбородова. С.И. Получение специфического ингибитора РНКа,зы животных из плапенты человека // Методы полученияи анализа биохимических препаратов: Тез. докл. v Всесоюз. конф,- Юрмала, 1987. С.46.

4. Зимницкий А.Н. Выделение препаратов ддя генной инженерии и биотехнологии из плапенты человека // Метода получения и анализа биохимических препаратов: Тез. докл. V Всесоюз.конф,-Юрмала., 1987. С. 48.

5. Хеймс Б., Хиггенс С. Транскрипция и трансляция. Метода: Пер. с анг. М.: Мир, 1987. - 260 с.

6. Шалот B.C. Нуклеазы. М.: Мир, 1968. - 220 - 300 с.

7. Felling J., Willey С.Е. The inhibition of pancreatin ribonuclease by anionic polimers // Arch. Biochem. Blophys. Acta.-1959.- V. 85.- P. 313-325.

8. Berger S. L. and Birkenmeier S.A. Inhibition of iateractable , nucleases with ribonucleosid-vanadil complexes: Isolationwof messenger ribonucleic acid from resting limophocytes // Biochemistry.- 1979.- V. 18.- P. 5143-5150.

9. Shortman K. Studies on cellular inhibitors of ribonuclease 1. The assay of the ribonuclease-inhibitor system and the purification of the inhibitor from rat liver /'/' Biochim. Biophys. Acta.- 1961.- V. 51.- P. 37-49.

10. Bardon A., Pamula Z. and Hiller M. Isolation and purificationof an alkaline ribonuclease from human placenta // Acta Biochim. Pol.- 1969.- V. 16.- P. 119-126.

11. Sela M., Anfinsen C.B., Harrington W.P. The correlation of ribonuclease activity with specific aspects of teritary structure // Biochim. Biophys, Acta.- 1957.- V, 26.- P. 506513.

12. Brownhill T.Y., Jones A.S., Stacey M. The inactivation of ribonuclease during the isolation of ribonuclease acids and ribonucleoproteins from yeast // Biochem. J.- 1959.- V. 73,-N 3.- P. 434-440.

13. Singer B., Fraenkel-Conrat H. Effect of bentonite on infectivi-ty and stability of TMV-RNA // Virology.- 1961.- V. 13,- N ' 1 P. 59-61.

14. Richmond A,E,, Cherry J.H, An artifact associated with the use of bentonite clay in assay for ribonucleic acid polymerization in peanut cotyledons // Biochim. Biophys. Acta.-1964.- V. 91,-N 2.- P. 330-340.

15. Tyulkina L.G., Mankin A.S. Inhibitor of ribonuclease contamination in preparations of T4 RNA ligase, polynucleotide kinase and bacterial alkaline phosphatase // Anal. Biochem.-1984. -V. 138.- P. 285-290.

16. Roth J.S. Ribonuclease II. Activation and inhibitors for ribonuclease // Arch. Biochem. Biophys.- 1953.- V. 44.-P. 265-280.

17. Zollner N., Felling J. Hemmung der Ribonuclease durch Heparin//, Naturwissenshaften.- 1952.- B. 39.- S, 523-524.

18. Zollner N., Pelling J. Nature of ribonuclease inhibitor of heparin // Am. J. Physiol.- 1953.- V. 173,- N 2.- P. 223-250.

19. Ukita Т., Terao T. and Irie M. Inhibition of pancreatic ribonuclease I activity by heparin // J. Biochem.- 1962.- V. 52,-N 6.- P. 455.

20. Кречетова. Г.Д., Чудинова И.А., Шалот B.C. О свойствах поливинил сульфата как ингибитора рибо и дезоксирибонуклеаз //

21. Биохимия.-1963.-Т.28.-вып.4.-С.682-690.

22. Dickman S.R., Ring В. Effect of strength on ribonucleic acidstructure and ribonuclease activity //J. Biol. Chem.- 1958.-Y. 231,- N 2.- P. 741-750.

23. Hummel J.P., Plorens M., Nelson G. Anionic polimers //J. Biol. Chem.- 1958.- V. 233,- N 3.- P. 717-725.

24. Houck J.C. The inhibition of ribonuclease // Biochim. Biophys. Acta.- 1957.- V. 26,- N 3.- P. 649-670.

25. Stockx J., Dierich W. Inhibitory effect of anionic polimers on the decyclization of cytidin 23'-phosphate by pancreas ribonuclease // Enzimologia.- 1959.- V. 21.- P. 189-201.

26. Nomura M., Hosodo J., Nashimura S. Enzime roformation in lyso-syme lysate of Bacillus subtilis // Biochem. Biophys. Acta.-1958.- V. 29,- N 1.- P. 161-172.

27. Roth J.S. Methods Cancer Res.- New York: 1967.- V. 3.- P. 208209.

28. Шалот B.C., Чудинова И.А., Кречетова, Г.Д. Современные метода в биохимии.-М.: Мир, 1964.-247-262 С.

29. Лениджер А. Биохимия.-М.:Мир, 1976.-370с.

30. Zittle С.A. and Reading Е.Н. Ribonuclease I. Manometric determination of ribonuclease in blood and tissues of the rat and therabbit // J. Biol. Chem.- 1945.- V. 160,- N 2.- P. 519.

31. Davis P.P. and Allen F.W. Studies of the enzymes of purine metabolism in skin // J. Biol. Chem.- 1955.- V. 217,- N 1.-P. 43-50.

32. Муег Y.P., Schellman J.A. The interaction of ribonuclease with purine and pyrimidine phosphates // Biochim. Biophys. Acta.-1962.- V. 55,- N 3.- P. 361-373.

33. Maniatis Т., Pritsch E.P., Sambrook J. Molecular cloning.-New York: 1982.- 230 p.

34. M* 37.Sela M. Inhibition of ribonuclease by copolymers of glutamicacid and aromatic amino acids // J. Biol. Chem.- 1962.— V. 237,-N 2.- P. 418-427.

35. Богданов А.А., Прокофьев М.А., Антонович Е.Т, и др. К вопросуо структуре нуклеотид-пептидов, входящих в состав рибонуклеиновой кислоты, выделенной из под желудочной железы // Биохимия.-1962.-Т.27.-вып.2♦-С.266-270,

36. Smeaton J.R., Elliot W.H., Coleman G. Isolation and properties of A-specific bacterial ribonuclease inhibitor // Biochim. Biophys. Acta.- 1967.- V. 145,- 2i 3.- P. 547-561.

37. Shenk Т.Е. Defective-interfering particles of Sindbis virus I. Isolation and some chemical and biological properties // Virology.- 1973.- V. 53,- N 1.- P. 162-173.

38. Roth J.S., Hilton S., Morris H.P. Ribonuclease activity in some transplantable rat hepatomas // Cancer Res.- 1964.- V. 24,-Pt. 1.- P. 294-301.

39. Colter J.S., Brown R.A. Preparation of nucleic acids from Ehrlich ascites tumor cells // Science.- 1956,- V. 124,- N 3231.-P. 1077-1080.

40. Djikstra J., Jouw J., Halsema J., Gruber M. and Geert A. The isolation of non-degraded polysomes from avian liver using an endogenous ribonuclease inhibitor // Biochim. Biophys. Acta.-1978.- V. 521.- P. 363-373.

41. Roth J.S. Ribonuclease IX. Further studies on ribonuclease inhibitor // Biochim. Biophys. Acta.- 1962.- V. 61.- N 6.-P. 903.

42. Brody S. Ribonuclease activity and cellular growth // Biochim. Biophys. Acta.- 1957.- V. 24,- N 3.- P. 502-506.

43. Wojnar R.J. and Roth J.S. Metal ions in ribonuclease acid: Their nature and interference with the assay for ribonuclease and ribonuclease inhibitor // Biochim. Biophys. Acta.- 1964.

44. Some properties of the inhibitor from rat liver // Biochim. Biophys. Acta.- 1962.- V. 55.- P. 88-96.

45. Blobel G., Van Potter R. Relation of ribonuclease and ribonuclease inhibitor to the isolation of polisomes from rat liver // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1966.- V. 55.- P. 1283-1292.

46. Northup P.V., Hummond W.S., LaVia M.F. The inhibition of splenic ribonuclease by liver cell extract // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1967.- V. 57.- P. 237-246.

47. Gribnau A.A.M., Schoenmakers J.G.G., Kraaikamp M., Bloemendal H. High purification of the RNase inhibitor from rat liver byaffinity chromatography // Biochem. Biophys. Res, Commun.1970.- V. 38,- N 6.- P. Ю64-Ю68.

48. Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии.-М.: Мир, 1970.-390 с.

49. Herres D.G., Mathias А.P., Rabin B.R. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease. 3. The

50. Roth J.S., Milstein S.W. Ribonuclease I. A new assay method32with P -labeled yest ribonucleic acid // J. Biol. Chem.- 1952.-V. 196,- N 2.- P. 489-497.

51. Crook E.M., Mathias A. P., Rabin B.R. Spectrophotometric assay of bovine pancreatic ribonuclease by the use of cytidine 2 *:3' -phosphate // Biochem. J.- 1960.- V. 74,- N 2.- P. 234-238.

52. Roth J.S. Ribonuclease IX. Further studies on ribonuclease inhibitor // Biochim. Biophys. Acta.- 1962.- V. 61,- N 6.- P. 903921.

53. Chromatography, electrophoresis, immunochemistry, molecular biology, HPLC: Katalog M / Bio-Rad'.- USA., 1987.- 27 p.

54. Biochemical catalogue N 12: Tecnical bulletin / Paesel.- FRG., 1986.- 78 p.

55. Molecular biology: Catalogue / Amersham.- United Kingdom., 1985.* 40 p.

56. Biochemical and organic compounds for resarch and diagnostic clinical reagents / Sigma.- USA., 1988.- 243 p.

57. Berns A.J.M., Zweer A., Gribnau A.A.M., Bloemendal H. Proteolytic activity of partly purified ribonuclease inhibitor from rat liver // Biochim. Biophys. Acta.- 1971.- V. 247,- N 1.1. P. 62-65.

58. Takahashi Y., Mase K. and Sugano H. Preparation of polysomes from rat brain tissues // Biochim. Biophys. Acta.- 1966.- V. 1191. N 3.- P. 627-629.

59. Bont W.S., Rezelman G., Meisner J., Bloemendal H. Studies on cytoplasmic ribonucleic acid from rat liver. VIII Stability of polyribosomes from normal and regenerated rat liver // Arch. Biochem. Biophys.- 1967.- V. 119,- N 1.- P. 36-40.

60. Buel G.N., Wickens M.P., Payvar P., Schimke R.T. Synthesis of full length cDNA from four partially purified oviduct m RNAs // J. Biol. Chem.- 1978.- V. 253.- 2471-2492.

61. Scheel G. and Blackburn P. Role of mammalian RNase inhibitor in cell-free protein synthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1979.- V. 76,- N 10.- P. 4898-4902.

62. Gillis S., Stollar V. Translation of vesicular stomatitis and sindbis virus m RNAs in cell-free extracts of Aedes albopictus cells // J. Biol. Chem.- 1981.- V. 256,- N 13.- P. 13188-13189.

63. Pelham H.R.B., Jakson R.J. An efficient m RNA-dependent tranlation system from reticulocyte lysates // Sur. J. Biochem.- 1976.-V. 67,- N 1,- P. 247-256.

64. Abelson J. RNA processing and the inervening sequence problem// Ann. Rev. Biochem.- 1979.- V. 48.- P. 1035-Ю69.

65. Crick P. Splite gene and RNA splicing // Science.- 1979.- V. 204 N 4390.- P. 264- 271.

66. Davidson E.H. and Britten R.J. Regulation of gene expression: possible role of repetitive sequences // Science.- 1979.- V.204,-N 4397.- P. 1052-1059.

67. Perry R.P. Processing of RNA // Ann. Rev. Biochem.- 1976.-V. 45.-P. 605-629.

68. Duane C. Eichler, Todd P. Tatar, Linda S. Lasater. Effect of human placental ribonuclease inhibitor in cell-free ribosomal RNA synthesis // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1981.- V. 10,-N 2.- P. 396-403.

69. Boyer S.H., Smith K.D., Noyes A.N., Youg K. Adjuvantes to immunological methods for m RNA purification // J. Biol. Chem.1. V. 258.- P. 2068-2071.

70. Методы получения особочистых неорганических веществ / Л,: 1969.

71. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ,- М,: Мир,1985.-78 с.

72. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of the bacteriophage T4 // Nature.- 1970.- V. 227.»1. P. 680.

73. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение: Пер, с англ.- М,: Мир, 1986.-260 с.

74. Фихте Б.А., Гуревич Г.А. Дезинтеграторы клеток.- М.:Наука, 1988.-27 с,

75. Исаев A.C., Ремнев Ю.В. Методы выделения белкового ингибитора РНКаз из плаценты человека // Тез, докл. I отраслевой конф,-конкурса молодых ученых,-М., 1989, С. 41-42.

76. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф. Аффинная хроматография.Методы: Пер. с англ.-М.: Мир, 1988.-170 с.

77. Вакцина гриппозная, инактивированная, элюатно-центрифужная, жидкая: Производственный регламент /Утв. Госуд. инст. стандартизации и контроля мед. и биологич. препаратов 26 мая 1989 г. М., 1989.-185 с.

78. Ю1.Дарбе А.Практическая химия белка:Пер. с англ.- М.: Мир,1989.-293 с.

79. Ремнев Ю.В. Выделение РНК-зависимой ДНК-полимеразы методами * аффинной хроматографии, характеристика фермента и разработкаего промышленной технологии. Дис канд.биол.наук.-Оболенск,1985.-87 с.

80. Исаев А.С., Ремнев Ю.В.,Шитикова Г.Е.,Ершова О.А. Белковый ингибитор РНКаз. Новый реактив для генной инженерии // Тез. докл. первой научно-технической конф. ПО "Восток".- п.Восточный, 1987.-С. 13-14.

81. При расчете экономической эффективности за базу сравнения принят аналогичный биопрепарат, выпускаемый фирмой Boehringer Mannheim (ФРГ).

82. Основными факторами, обеспечивающими экономический эффект,• является сумма инвалютных рублей, высвобождаемая за сче;: аннулирование импорта препарата и экономия во внутренние рублях от замены импортного биопрепарата, на отечественный.

83. Экономический эффект от использования новых препаргтов, позволяющих обеспечить производств«/ продукции с прекращением импорта, расчитывается по формуле : Э = ( З'К • Kj 3) • А - Ен s ,

84. Ен- нормативный отраслевой коэффициент эффективности, б предпроизводственные затраты, руб. Приведенные затраты ( 3 ) расчитываются по формуле:3 = С + Ец'К, где

85. С себестоимость единицы продукции, руб., К - удельные капиталовложения в производственные фонды, руб. По производству ингибитора РНКаз К = 0 и формула приобретает вид: 3 = С.

86. Таким образом, экономическая эффективность определяется по формуле:

87. Э = ( В-К-Кх- С ) -А Ен. Б

88. Исходные данные для вычисления экономической эффективности производства ингибитора РНКаз из плаценты человека: В 0,5 западно-германских марок К - 0,35 руб. Кг 2,01. С 0,29 руб.

89. На основании представленной утвержденной научно-технической документации1. ПРИКАЗЫВАЮ:

90. Центральной заводской лаборатории начать выпускопытно-промышленной партии ингибитора РНКаз из плаценты человека, начиная с I квартала 1989 года.

91. Выпуск ингибитора проводить по заявкам организаций