Установление строения О-антигенных полисахаридов бактерий: Трифторметансульфокислота как новый сольволитический реагент для расщепления гликозидных связей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.03, кандидат химических наук Перепелов, Андрей Вячеславович

• Перепелов, Андрей Вячеславович
• кандидат химических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат химических наук Перепелов, Андрей Вячеславович

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ Литературный обзор

1. Специфические методы избирательного расщепления

1.1. Дезаминирование гексозаминов

1.2. Щелочное ß-элиминирование уроновых кислот

1.3. Распад по Смиту

2. Неспецифические методы избирательного расщепления

2.1. Частичный кислотный гидролиз

2.2. Ацетолиз

2.3. Сольволиз безводным фтористым водородом

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 41 1. Строение О-специфических полисахаридов

1.1. Полисахариды бактерий рода Pseudoalteromonas

1.1.1. Pseudoalteromonas tetraodonis IAM 14160т

1.1.2. Pseudoalteromonas sp. KMM

1.1.3. Pseudoalteromonas haloplanktis KMM

1.2. Полисахариды бактерий вида Vibrio cholerae

1.2.1. Vibrio cholerae

1.3. Полисахариды бактерий рода Proteus

1.3.1. Полисахариды Proteus, не содержащие необычных неуглеводных заместителей

1.3.1.1. Proteus vulgaris

1.3.1.2. Proteus vulgaris

1.3.1.3. Proteus vulgaris

1.3.1.4. Proteus vulgaris

1.3.1.5. Proteus vulgaris

1.3.2. Полисахариды Proteus, содержащие остатки неуглеводных органических кислот

1.3.2.1. Proteus vulgaris

1.3.2.2. Proteus mirabilis

1.3.2.3. Proteus vulgaris

1.3.2.4. Proteus mirabilis

1.3.3. Полисахариды Proteus, содержащие ортофосфатные группы

1.3.3.1. Proteus vulgaris

1.3.3.2. Proteus mirabilis

1.3.3.3. Proteus mirabilis 041 61 2. Методы структурного анализа полисахаридов

2.1. Спектроскопия ЯМР

2.1.1. Первичный анализ спектров ЯМР

2.1.2. Отнесение сигналов в спектрах Н-и С-ЯМР

2.1.3. Анализ данных по константам спин-спинового взаимодействия

2.1.4. Анализ данных по химическим сдвигам

2.1.5. Анализ пространственных корреляций 'н,'н (ядерных эффектов

Оверхаузера), многосвязевых корреляций Н, С и трехсвязевых корреляций H, Р

2.2. Химические методы

2.2.1. Установление состава полисахаридов

2.2.1.1. Кислотный гидролиз

2.2.1.2. Идентификация продуктов гидролиза методом ГЖХ-МС

2.2.1.3. Кислотный алкоголиз

2.2.1.4. Сольволиз безводной трифторметансульфокислотой

2.2.2. Модификации полисахаридов

2.2.2.1. О-Дезацетилирование

2.2.2.2. Дефосфорилирование

2.2.2.3. Дезацеталирование

2.2.3. Анализ методом метилирования

2.2.4. Избирательное расщепление полисахаридов

2.2.4.1. Распад по Смиту

2.2.4.2. Парциальный сольволиз безводной трифторметансульфокислотой 89 2.3. Установление структуры О-специфического полисахарида Proteus vulgaris с использованием химических и физических методов. Пример

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Установление строения О-антигенных полисахаридов бактерий: Трифторметансульфокислота как новый сольволитический реагент для расщепления гликозидных связей»

Настоящая работа посвящена изучению строения О-антигенных полисахаридов бактерий, важных в медицинском отношении или имеющих потенциальное значение для биотехнологии, а также разработке и применению новых химических подходов и методов для структурного анализа сложных углеводов. Работа является частью проводимого в Лаборатории химии углеводов ИОХ РАН систематического химического исследования бактериальных полисахаридов и выполнена в рамках проектов, финансируемых грантом государственной поддержки ведущих научных школ РФ и грантами РФФИ.

О-Антигенные полисахариды являются компонентами липополисахаридов (ЛПС), расположенных на наружной мембране клеточной поверхности и непосредственно участвующих во взаимодействии бактерий с окружающей средой и другими биологическими системами, в том числе с иммунной системой животных и человека. У грам-отрицательных бактерий молекулы ЛПС имеют сходное общее строение и состоят из трех компонентов: полисахаридной цепи, олигосахарида «кора» (сердцевины) и липидной части (липида А), которые, в свою очередь, различаются как по структуре, так и по своим функциям. Строению, биосинтезу и биологическим свойствам ЛПС посвящено множество обзоров и монографий [1-10].

Иммуноспецифичность грам-отрицательных бактерий определяется тонкой структурой полисахаридной цепи ЛПС, направленной от клетки в сторону окружающей среды и называемой О-специфическим полисахаридом или О-антигеном. Полисахаридная цепь построена из регулярно повторяющихся олигосахаридных звеньев, включающих разнообразные моносахариды. Биосинтез гетерополисахаридов осуществляется путем полимеризации олигосахарида (так называемого биологического повторяющегося звена), предварительно собранного на липиде-носителе, с возможными постполимеризационными, часто нестехиометрическими модификациями (например, О-ацетилированием).

Полисахарид ковалентно присоединяется к кору, представляющему собой высший олигосахарид (до тетрадекасахарида). Кор ЛПС обогащен кислотными функциями (фосфатные группы, остатки альдулозоновых, реже уроновых кислот), что способствует целостности и стабильности внешней мембраны за счет образования ионных мостиков с катионами двухвалентных металлов (Са2+, М§2+) и позволяет регулировать проницаемость мембраны для низкомолекулярных соединений, включая антибиотики. По сравнению с чрезвычайно разнообразными по структуре О-антигенами строение кора более консервативно; обычно, оно одинаковое или очень близкое для бактерий одного вида, а иногда и рода.

Кор, в свою очередь, присоединяется к липиду А, наиболее консервативной по структуре части ЛПС, функция которой заключается в фиксации ЛПС в мембране за счет гидрофобных взаимодействий с фосфолипидом. Липид А определяет токсические свойства ЛПС, который, таким образом, является эндотоксином, вызывающим целый ряд патофизиологических изменений при бактериальных инфекциях. Соединение кора с липидом А осуществляется кислотолабильной гликозидной связью остатка З-дезокси-D-лгш/7/о-октулозоновой кислоты, что широко используется для расщепления липополисахарида на углеводную и липидную части с целью последующего раздельного их изучения, в том числе и структурного анализа.

Интерес к изучению строения бактериальных ЛПС, включая структуру 0-специфических полисахаридов, постоянно возрастает. Это связано как с практическими целями, такими как классификация микроорганизмов, серодиагностика инфекционных заболеваний, создание искусственных вакцин, так и с фундаментальными задачами биохимии, иммунологии и микробиологии - выяснением взаимосвязи между структурой и функцией биополимеров, изучением механизмов специфического иммунного ответа и взаимодействия между антигеном и антителом, поиском хемотаксономических маркеров для выявления филогенетических взаимосвязей между различными бактериями.

В качестве объектов структурного исследования нами выбраны О-специфические полисахариды бактерий, относящихся к родам Proteus и Pseudoalteromonas и к виду Vibrio cholerae. Бактерии Proteus и Vibrio cholerae являются важными в медицинском отношении микроорганизмами. Первые вызывают заболевания мочеполовых путей и некоторые инфекционные болезни, вторые являются возбудителями азиатской холеры и кишечных расстройств. Род Pseudoalteromonas включает морские микроорганизмы, многие из которых представляют интерес для биотехнологии как продуценты биологически активных веществ. Основной целью исследования было создание химической основы для существующих серологических классификаций бактерий Proteus и Vibrio cholerae и классификация на основе О-антигенов бактерий Pseudoalteromonas, для которых серологическая классификационная схема отсутствует.

Всего в настоящей работе установлено строение 12 полисахаридов Proteus mirabilis и Proteiis vulgaris, одного полисахарида Vibrio cholerae и двух полисахаридов Pseudoalteromonas, а также уточнена установленная ранее структура еще одного полисахарида Pseudoalteromonas. В составе этих полисахаридов идентифицирован ряд новых производных моносахаридов, ранее не обнаруженных в природных углеводах. На основании полученных структурных данных и результатов иммунохимического исследования уточнена классификационная схема бактерий Proteus и получено обоснование серологических взаимосвязей между различными штаммами этого рода на молекулярном уровне.

Установление строения таких сложных углеводов как О-антигены исследуемых бактерий потребовало создание новых, адекватных методов структурного анализа. В частности, для решения задачи селективного расщепления полисахаридов с высокоустойчивыми гликозидными связями предложен новый сольволитический реагент -трифторметансульфокислота. Этот реагент, более эффективный и более удобный в работе по сравнению с ранее применявшимся для сольволиза полисахаридов безводным фтористым водородом, был успешно использован для получения как олигосахаридных фрагментов, так и сложных производных моносахаридов. Предложены также новые производные для надежной идентификации методом ГЖХ неуглеводных заместителей и несущих их аминосахаров.

Результаты работы опубликованы в 14 статьях [11-24] и 9 тезисах докладов и были представлены автором на X Европейском симпозиуме по углеводам (Голвей, Ирландия, 1117 июля 1999 г.), Международном симпозиуме по современным проблемам микробиологической биохимии и биотехнологии (Пущино, Московская обл., 25-30 июня 2000 г.), XX Международном симпозиуме по углеводам (Гамбург, Германия, 27 августа-1 сентября 2000 г.) и I Германо-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Борстель, Германия, 5-6 сентября 2000 г.).

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов, а также включает список литературы и приложение (табулированные данные ЯМР спектров). Литературный обзор посвящен рассмотрению известных методов избирательного расщепления бактериальных полисахаридов. В биоорганической химии всегда уделялось большое внимание методам химической деградации биополимеров, а селективная деградация полисахаридов не потеряла свою

Заключение диссертации по теме «Органическая химия», Перепелов, Андрей Вячеславович

выводы

1. Установлены новые структуры О-антнгенных полисахаридов 15 штаммов важных в медицинском отношении бактерий Proteus и Vibrio cholerae, а также морских бактерий Pseudoalteromonas, имеющих потенциальное значение для биотехнологии.

2. В составе изученных полисахаридов впервые в природе идентифицирован ряд необычных производных моносахаридов, таких как амиды уроновых кислот с аминокислотами, N-ацилированные аминосахара и новый изомер N-ацетилмурамовой кислоты.

3. Впервые для сольволитического расщепления гликозидных связей в полисахаридах предложена трифторметансульфокислота. Этот новый удобный и высокоэффективный реагент успешно использован в структурном анализе сложных бактериальных полисахаридов как для выделения необычных производных моносахаридов, так и для избирательного расщепления с целью получения олигосахаридных фрагментов.

4. Предложены М,0-метилированные полиолы в качестве удобных производных для анализа необычных аминосахаров и диаминосахаров и их N-ацильных заместителей методом ГЖХ/масс-спектрометрии. С использованием этого подхода уточнена установленная ранее структура полисахарида Pseudoalteromonas haloplanktis.

5. Полученные данные подтвердили обоснованность серологической классификации большинства изученных штаммов Proteus и Vibrio cholerae на основе О-антигенов. В то же время предложено включить некоторые штаммы Proteus в две новые сложные серогруппы в качестве подгрупп и тем самым уточнена классификация этих бактерий.

6. Серологическое родство штаммов Proteus, входящих в сложные серогруппы в качестве подгрупп, а также некоторых штаммов, принадлежащих к различным серогруппам, впервые получило обоснование на уровне структур О-антигенных полисахаридов.

7. Данные по структуре полисахаридов, полученные в настоящей работе и ранее, являются химической основой для отсутствующей до сих пор классификации бактерий рода Pseudoalteromonas.

3. Заключение

Настоящее исследование направлено в первую очередь на создание химической основы классификации микроорганизмов, что является важным как с фундаментальной точки зрения, так и в связи с ролью, которую бактерии играют в патологии человека и как потенциальные источники продуктов биотехнологического производства. Если для двух из исследованных таксонов бактерий, Vibrio cholerae и Proteus, существуют серологические классификационные схемы, то для морских бактерий Pseudoalteromonas, такую схему еще только предстоит создать, и полученные данные по структуре антигенных полисахаридов могут быть положены в ее основу.

Сопоставление химических и серологических характеристик О-антигенов исследованного штамма Vibrio cholerae 08 и большинства штаммов Proteus показало их хорошее соответствие. В частности, оно продемонстрировало, что классификация штамма в отдельную серогруппу или в подгруппу в составе сложной серогруппы имеет в своей основе уникальность структуры О-антигенного полисахарида. В то же время структурные данные показали, что два штамма Proteus vulgaris, ранее помещавшиеся в различные серогруппы 037 и 046, целесообразно объединить в одну серогруппу (037), а серогруппу 014 следует расширить за счет включения в нее ранее неклассифицированного штамма Proteus mirabilis. Обоснованность этих предложений нашла полное подтверждение в серологических исследованиях О-антигенов этих штаммов, и, таким образом, уточнена классификация бактерий Proteus.

Штаммы Proteus известны своей перекрестной серологической реактивностью, обусловленной наличием в О-антигенных полисахаридах одинаковых или близких по структуре эпитопов - фрагментов, являющихся детерминантами иммуноспецифичности. В тех случаях, когда серологическое родство выражено наиболее ярко, перекрестно реагирующие штаммы относят в одну серогруппу в качестве подгрупп. Кроме уже отмеченных выше сложных серогрупп 014 и 037, нами изучались штаммы сложных серогрупп 019 и 023, и во всех случаях были выявлены элементы структуры, способные играть роль общих эпитопов. Кроме того, получили обоснование на молекулярном уровне и менее выраженные серологические взаимосвязи между некоторыми штаммами Proteus, относящимися к различным серогруппам.

В связи с этим следует отметить, что, даже зная точную структуру повторяющихся звеньев, предсказать заранее какую степень серологического родства обусловит тот или иной общий структурный элемент О-антигенов можно только предположительно. Это связано с важностью не только первичной, но и пространственной структуры О-антигена, так как именно последняя определяет в конечном счете доступность определенных участков полисахарида для взаимодействия с антителами. Выявление конформационных особенностей антигенов, в том числе изменений пространственной структуры, происходящих при переходе от свободного состояния к комплексу с антителом, является отдельным, быстро развивающимся направлением физико-химической биологии.

В составе изученных полисахаридов обнаружен целый ряд необычных моносахаридов и неуглеводных заместителей, причем многие из образованных ими производных ранее в природе обнаружены не были. По химическому строению они могут быть разделены на три группы:

1) сложные N-ацильные производные аминосахаров - 2,3-диамино-2,3-дидезокси-Б-глюкуроновая кислота и 4-амино-4,6-дидезокси-0-глюкоза, ацилированные N-формил-Ь-аланином по N-3 и М-[(Я)-3-оксибутирил]-Ь-аланином по N-4 соответственно;

2) амиды уроновых кислот с аминокислотами - 2,3-диамино-2,3-дидезокси-0-маннуроновой кислоты с L-аланином и D-галактуроновой кислоты с Ме-[(7?)-1-карбоксиэтил]-Ь-лизином, а также первичные амиды 2,3-диамино-2,3-дидезокси-0-глюкуроновой и -маннуроновой кислот;

3) простой эфир моносахарида с молочной кислотой - 2-ацетамидо-2-дезокси-4-0-[(7?)-1-карбоксиэтил]-0-глюкоза (новый изомер N-ацетилмурамовой кислоты - обязательного компонента пептидогликана клеточной стенки прокариотов).

Эти соединения расширили список известных компонентов природных полисахаридов, который насчитывает в настоящее время более 100 моносахаридов и их производных, обнаруженных в основном в бактериальных источниках.

Особенности состава и строения изученных полисахаридов, такие как присутствие вышеперечисленных сложных производных моносахаридов, различных фосфат-содержащих групп, диаминосахаров и диаминоуроновых кислот с высокоустойчивыми гликозидными связями, определяли стратегию их структурного анализа. Как и в современных исследованиях других сложных биополимеров, основные данные о структуре полисахаридов были получены с помощью спектроскопии ЯМР, важным преимуществом которой является бездеструктивный характер анализа. Однако несмотря на то, что спектроскопия ЯМР в принципе позволяет установить полное строение повторяющихся звеньев полисахаридов, на практике во всех случаях наряду с ней использовались химические методы анализа. Сюда прежде всего относятся полный кислотный гидролиз и метилирование, проводившиеся для независимого подтверждения моносахаридного состава и положений замещения моносахаридов, а также определение абсолютных конфигураций моносахаридов и неуглеводных компонентов. Для определения положения аминогрупп и N-ацильных заместителей в диаминосахарах нами предложены новые производные для ГЖХ/масс-спектрометрии - ТЧ,0-метилированные полиолы, которые в отличие от обычно применяемых в моносахаридном анализе О-ацетилированных полиолов дают при фрагментации под электронным ударом необходимые диагностические ионы.

Химические методы применялись также для модификации полисахаридов с целью устранения групп, маскирующих их регулярность, и для расщепления полисахаридов с целью выделения производных моносахаридов и олигосахаридных фрагментов. Спектры ЯМР последних имеют лучшее разрешение, чем спектры полисахаридов, что облегчало их интерпретацию, и, кроме того, в отличие от полисахаридов, для анализа моносахаридов и олигосахаридов могла быть использована масс-спектрометрия. Получение олигосахаридных фрагментов полисахаридов являлось важной и, пожалуй, наиболее сложной задачей при проведении структурного анализа. Так, структура некоторых полисахаридов, таких как О-антигены Pseudoalteromonas sp. КММ 634 и Vibrio cholerae 08, не могла быть установлена без их избирательного расщепления. Полученные низкомолекулярные фрагменты использовались также в серологических исследованиях для характеристики эпитопов -иммунодетерминантных участков антигенных полисахаридов, непосредственно участвующих в связывании с антителами. В связи с этим в настоящей работе избирательному расщеплению полисахаридов было уделено значительное внимание.

Из существующих неспецифических методов избирательного расщепления наиболее широко в структурном анализе бактериальных полисахаридов применяются парциальный кислотный гидролиз и сольволиз безводным фтористым водородом (см. литературный обзор). Однако мы нашли эти методы недостаточно эффективными в применении к объектам данного исследования; в частности, с их помощью не удалось расщепить полисахариды Pseudoalteromonas sp. КММ 634 и Vibrio cholerae 08. Это заставило нас искать новые, более эффективные литические реагенты для расщепления гликозидных связей, и в качестве такого реагента нами была предложена безводная трифторметансульфокислота.

В применении к исследуемым полисахаридам трифторметансульфокислота показала себя как высокореакционный и высокоселективный реагент, не вызывающий заметной деструкции Сахаров со свободным восстанавливающим концом. Варьируя условия сольволиза, расщепление полисахаридов могло быть проведено направленно в сторону большего или меньшего фрагмента. Важным преимуществом сольволиза являлась устойчивость амидных связей, что позволяло выделять аминосахара с N-ацильными заместителями и амиды уроновых кислот. И, наконец, сольволиз трифторметансульфокислотой не требовал ни особых мер безопасности, ни специального оборудования, и осуществлялся в обычном стеклянном контейнере. Это дополнительно выгодно отличает новый реагент от ранее применявшегося для сольволиза безводного фтористого водорода, который в обычных условиях является ядовитым газом и требует для работы специального герметичного прибора, не имеющего стеклянных деталей.

Полученные нами первые данные показывают, что закономерности сольволиза безводной трифторметансульфокислотой и фтористым водородом качественно совпадают. В обоих случаях устойчивость гликозидных связей убывает в ряду 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновые кислоты « 2,3-диаминоуроновые кислоты > уроновые кислоты « 2-аминогексозы > гексозы » 2-амино-6-дезоксигексозы > 6-дезоксигексозы. Строгие количественные оценки устойчивости разных типов гликозидных связей по отношению к трифторметансульфокислоте пока отсутствуют, однако накопленные к настоящему времени данные позволяют дать некоторые рекомендации по условиям проведения сольволиза различных полисахаридов. Так, для полисахаридов, не содержащих моносахариды с высокоустойчивыми гликозидными связями, время полного сольволиза не будет превышать нескольких часов при температуре -4°С. Для полисахаридов, состоящих из диаминосахаров, аминоуроновых и уроновых кислот, время, необходимое даже для селективного расщепления полимера, может достигать нескольких суток при комнатной температуре. В будущем представляет интерес испытать в качестве сольволитических реагентов для избирательного расщепления другие сульфокислоты, например, метансульфокислоту, которая как менее реакционноспособный реагент может оказаться более удобной в применении к полисахаридам, состоящим из моносахаридов с лабильными гликозидными связями, таким как 6-дезоксигексозы и 3,6-дидезоксигексозы.

IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактериальные штаммы и выращивание

Штаммы Proteus получены из Чешской национальной коллекции типовых культур (CNCTC, Институт эпидемиологии и микробиологии, Прага). Штаммы Pseudoalteromonas находятся в Коллекции морских микроорганизмов (КММ) Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН; типовой штамм Pseudoalteromonas tetraodonis IAM 14160т получен из Института прикладной микробиологии (Токио, Япония). Штамм Vibrio cholerae 08 (С0845) получен из Национального института холеры и желудочно-кишечных заболеваний (Калькутта, Индия).

Бактерии рода Proteus выращивали на плотной агаровой среде, содержащей питательный бульон, в анаэробных условиях [50]. Бактерии рода Pseudoalteromonas выращивали на среде Йошимицу-Кимура [122]. Бактерии Vibrio cholerae 08 выращивали в ферментере на обогащенном триптонно-дрожжевом экстракте [123]. Бактериальную массу отделяли центрифугированием в конце логарифмической фазы роста, промывали водой и высушивали.

Выделение и мягкая кислотная деградация липополисахаридов

Липополисахариды выделяли из сухих бактериальных клеток экстракцией горячим водным фенолом по методу Вестфаля [123] и очищали обработкой ДНКазой, РНКазой и Протеиназой К [129] с последующим ультрацентрифугированием [123].

Деградацию ЛПС проводили мягким кислотным гидролизом 2% уксусной кислотой при 100°С до выпадения осадка липида (1,5-3 ч), который отделяли центрифугированием (13000 g, 20 мин). Супернатант фракционировали хроматографией на колонке (60 х 2,5 см) с гелем Sephadex G-50 (S) (Pharmacia, Швеция) в 0,05 М пиридиний-ацетатном буфере (рН4,5), контролируя элюцию с помощью дифференциального рефрактометра (Knauer, Германия). Главным углеводным продуктом кислотной деградации липополисахаридов являлись О-специфические полисахариды, элюирующиеся непосредственно вслед за холостым объемом колонки. Выходы полисахаридов Vibrio cholerae и Proteus в % от веса ЛПС приведены в таблице 5.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Перепелов, Андрей Вячеславович, 2001 год

1. Jansson Р.-Е. // in Endotoxin in Health and Disease, Marcel Dekker, New York. 1999. P. 155178.

2. Книрель Ю. А., Кочетков H. К.//Биохимия 1993. Т. 58. С. 182-201.

3. Книрель Ю. А., Кочетков H. К.//Биохимия 1993. Т. 58. С. 166-181.

4. Книрель Ю. А., Кочетков Н. К. // Биохимия 1994. Т. 59. С. 1325-1383.

5. Reeves, P. R. // in Bacterial Cell Wall, Elsevier, Amsterdam. 1994. P. 281-317.

6. Whitfield, C. //Trends Microbiol. 1995. V. 3. P. 178-185.

7. Wilkinson S. G. // Prog. Lipid Res. 1996. V. 35. P. 283-343.

8. Di Padova F.E., Heumann D, Glauser M.P, Rietschel E.T. // in Endotoxin in Health and Disease, Marcel Dekker, New York. 1999. P. 633-642.

9. Mamat U., Seydel U., Grimmecke D., Hoist O., Rietschel E. T. // in Carbohydrates and Their Derivatives Including Tannins, Cellulose, and Related Lignins, Elsevier, Amsterdam. 1999. P. 179-239.

10. Literacka E., Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Zatonsky G. V., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Kaca W. // FEBS Lett. 1999. V. 456. P. 227-231.

11. Perepelov A. V., Ujazda E., Senchenkova S. N., Shashkov A. S., Kaca W., Knirel Y. A. // Eur. J. Biochem. 1999. V. 261. P. 347-353.

12. Perepelov A. V., Babicka D., Shashkov A. S., Arbatsky N. P., Senchenkova S. N., Rozalski A., Knirel Y. A. // Carbohydr. Res. 1999. V. 318. P. 186-192.

13. Перепелов А. В., Шашков А. С., Сенченкова С. Н., Книрель Ю. А., Литерачка Е., Каца В. // Биохимия 2000. Т. 65. С. 176-179.

14. Перепелов А. В., Шашков А. С., Бабичка Д., Сенченкова С. Н., Бартодзийска Б., Рожальский А., Книрель Ю. А. // Биохимия 2000. Т. 65. С. 1055-1059.

15. Командрова Н. А., Томшич С. В., Шевченко Л. С., Перепелов А. В., Сенченкова С. Н., Шашков А. С., Книрель Ю. А. // Биохимия 2000. Т. 65. С. 1060-1067.

16. Bartodziejska В., Torzewska A., Babicka D., Wykrota М., Rozalski A., Perepelov А. V., Toukach F. V., Knirel Y. A. // Adv. Exp. Med. Biol. 2000. V. 485. P. 243-247.

17. Perepelov A. V., Torzewska A., Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Rozalski A., Knirel Y. A. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 788-793.

18. Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Shashkov A. S., Komandrova N. A., Tomshich S. V., Shevchenko L. S., Knirel Y. A., Kochetkov N. K. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2000. V. 363-366.

19. Perepelov A. V., Babicka D., Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Rozalski A., Knirel Y. A. // Carbohydr. Res. 2000. V. 328. P. 229-234.

20. Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Cedzynski M., Ziolkowski A., Vinogradov E. V., Kaca W., Shashkov A. S., Knirel Y. A. // Carbohydr. Res. 2000. V. 328. P. 441-444.

21. Swierzko A. S., Cedzynski M., Ziolkowski A., Senchenkova S. N., Perepelov A. V., Knirel Y. A., Kaca W. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 2001. V. 49. P. 163-169.

22. Kocharova N. A., Perepelov A. V., Zatonsky G. V., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Jansson P.E., Weintraub A. // Carbohydr. Res. 2001. V. 330. P. 83-92.

23. Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Arbatsky N. P., Shashkov A. S., Rozalski A., Knirel Y. A. // Carbohydr. Res. 2001. V. 331. P. 195-202.

24. Williams J. M. //Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1975. V. 31. P. 9-79.

25. Aspinall G. O., Przybylski E., Ritchie R. G. S., Chung On Wong // Carbohydr. Res. 1978. V. 66. P. 225-243.

26. Lindberg В., Lindqvist В., Lonngren J., Powell D. A. // Carbohydr. Res. 1980. V. 78. P. 111117.

27. Dmitriev B. A., Knirel Y. A., Kochetkov N. K. // Carbohydr. Res. 1973. V. 29. P. 451-457.

28. Дмитриев Б. А., Книрель Ю. А., Кочетков H. К. // Изв. Акад. Наук СССР, Сер. хим. 1974. Т.411-416. С. 2335-2338.

29. Dmitriev В. A., Backinowsky L. V., Lvov V. L., Kochetkov N. К., Hofman I. L. // Eur. J. Biochem. 1975. V. 50. P. 539-547.

30. Dmitriev B. A., Knirel Y. A., Kochetkov N. K., Hofman I. L., Capek K. // Eur. J. Biochem. 1977. V. 76. P. 433-440.

31. Dmitriev B. A., Knirel Y. A., Kochetkov N. K„ Hofman I. L. // Carbohydr. Res. 1975. V. 44. P. 77-85.

32. Tsui F.-P., Schneerson R„ Boykins R. A., Karpas А. В., Egan W. // Carbohydr. Res. 1981. V. 97. P. 293-306.

33. Dmitriev B. A., Knirel Y. A., Kochetkov N. K. // Carbohydr. Res. 1975. V. 40. P. 365-372.

34. Erbing C„ Granath K., Kenne L., Lindberg B. // Carbohydr. Res. 1976. V. 47. P. C5-C7.

35. Kenne L., Lindberg B. // Methods Carbohydr. Chem. 1980. V. 8. P. 295-296.

36. Дмитриев Б. А., Львов В. Jl., Кочетков Н. К., Гофман И. Л. // Биоорг. хим. 1977. Т. 3. С. 1226-1233.

37. Dmitriev В. A., Knirel Y. A., Kochetkov N. K., Hofman I. L. // Eur. J. Biochem. 1976. V. 66. P. 559-566.

38. Erbing C., Kenne L., Lindberg В., Hammarstrom S. // Carbohydr. Res. 1978. V. 60. P. 400-403.

39. Hoist O. // in Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa. 2000 P. 345-353.

40. Knirel Y. A., Widmalm G., Senchenkova S. N., Jansson P.-E., Weintraub A. // Eur. J. Biochem. 1997. V. 247. P. 402-410.

41. Shashkov A. S., Vinogradov E. V., Knirel Y. A., Nifant'ev N. E., Kochetkov N. K., Dabrowski J., Kholodkova E. V., Stanislavsky E. S. // Carbohydr. Res. 1993. V. 241. P. 177-188.

42. Yokota S.-I., Kaya S., KawamuraT., Araki Y„ Ito, E. //J. Biochem. 1986. V. 99. P. 1551-1561.

43. Ovod V., Zdorovenko E. L., Shashkov A. S., KocharovaN. A., Knirel Y. A. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 2372-2379.

44. L'vov V. L., Shashkov A. S., Dmitriev B. A., Kochetkov N. K., Jann В., Jann K. // Carbohydr. Res. 1984. V. 126. P. 249-259.

45. Кочарова H. А., Виноградов E. В., Книрель Ю. А., Шашков А. С., Кочетков Н. К., Станиславский Е. С., ХолодковаЕ. V. // Биоорг. хим. 1988. Т. 14. С. 697-700.

46. Knirel Y. A., Kocharova N. A., Shashkov A. S., Dmitriev В. A., Kochetkov N. К., Stanislavsky Е. S., Mashilova G. М. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 163. P. 639-652.

47. Knirel Y. A., Vinogradov E. V., Shashkov A. S., Dmitriev B. A., Kochetkov N. K., Stanislavsky E. S., Mashilova G. M.//Eur. J. Biochem. 1986. V. 157. P. 129-138.

48. Knirel Y. A., Paredes L., Jansson P.-E., Weintraub A., Widmalm G., Albert M. J. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 232. P. 391-396.

49. Kocharova N. A., Thomas-Oates J. E., Knirel Y. A., Shashkov A. S., Dabrowski U., Kochetkov N. K., Stanislavsky E. S., Kholodkova E. V. // Eur. J. Biochem. 1994. V. 219. P. 653-661.

50. Дмитриев Б. А., Львов В. JI., Рамос Э. Л., Кочетков Н. К., Гофман И. Л. // Биоорг. хим. 1978. Т. 4. С. 760-766.

51. Tarcsay L., Jann В., Jann К. // Eur. J. Biochem. 1971. V. 23. P. 505-514.

52. Grimmecke H. D., Mamat U., Kuhn I., Shashkov A. S., Knirel Y. A. // Carbohydr. Res. 1994. V. 252. P. 309-316.

53. Aspinall G. O., Baillie J. // J. Chem. Soc. 1963. P. 1702-1714.

54. Knirel Y. A., Vinogradov E. V., Shashkov A. S., Dmitriev B. A., Kochetkov N. K., Stanislavsky E. S., Mashilova G. M. // Eur. J. Biochem. 1985. V. 150. P. 541-550.

55. Dmitriev B. A., KocharovaN. A., Knirel Y. A., Shashkov A. S., Kochetkov N. K., Stanislavsky E. S., Mashilova G. M. // Eur. J. Biochem. 1982. V. 125. P. 229-237.

56. Хоменко В. А., Набережных Г. А., Исаков В. В., Соловьева Т. Ф., Оводов Ю. С., Книрель Ю. А., Виноградов Е. В. // Биоорг. хим. 1986. Т. 12. С. 1641-1648.

57. Kocharova N. A., Knirel Y. A., Shashkov A. S., Kochetkov N. К., Pier G. В. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 11291-11295.

58. Vinogradov E. V., Paramonov N. A., Knirel Y. A., Shashkov A. S., Kochetkov N. K. // Carbohydr. Res. 1993. V. 242. P. CI 1-C14.

59. Knirel Y. A., Zych K., Vinogradov E. V., Shashkov A. S., Sidorczyk Z. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 815-820.

60. Knirel Y. A., Vinogradov E. V., Mort A. J. // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1989. V. 47. P. 167-202.

61. Baumann P., Gauthier M. J., Baumann L. // in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology V.l. Williams and Wilking, Baltimore, MD. 1984. P. 343-352.

62. Gauthier G., Gauthier M., Christen R. // Int. J. Syst. Bacterid. 1995. V. 45. P. 755-761.

63. Austin B. // J. Appl. Bacteriol. 1989. V. 67. P. 461-470.

64. Fenical W. // Chem. Rev. 1993. V. 93. P. 1673-1683.

65. Hanniffy O., Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Tomshich S. V., Komandrova N. A., Romanenko L. A., Knirel Y. A., Savage A. V. // Carbohydr. Res. 1998. V. 307. P. 291-298.

66. Hanniffy O., Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Tomshich S. V., Komandrova N. A., Romanenko L. A., Knirel Y. A., Savage A. V. // Carbohydr. Res. 1999. V. 321. P. 132-138.

67. Muldoon J., Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Tomshich S. V., Komandrova N. A., Romanenko L. A., Knirel Y. A., Savage A. V. // Carbohydr. Res. 2001. V. 330. P. 231-239.

68. Zubkov V. A., Nazarenko E. L., Gorshkova R. P., Ivanova E. P., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Paramonov N. A., Ovodov Y. S. // Carbohydr. Res. 1995. V. 275. P. 147-154.

69. Назаренко E. JL, Зубков В. А., Шашков А. С., Книрель Ю. А., Горшкова Р. П., Иванова Е. П., Оводов Ю. С.//Биоорг. хим. 1993. Т. 19. С. 740-751.

70. Gorshkova R. P., Nazarenko Е. L., Zubkov V. A., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Paramonov N. A., Meshkov S. V., Ivanova Е. Р. // Carbohydr. Res. 1997. V. 299. P. 69-76.

71. Горшкова Р. П., Назаренко Е. JL, Зубков В. А., Иванова Е. П., Оводов Ю. С., Шашков, А. С., Книрель Ю. А. // Биоорг. хим. 1993. Т. 19. С. 327-336.

72. Rougeaux Н., Talaga P., Carlson R. W., Guezennec J. // Carbohydr. Res. 1998. V. 312. P. 5359.

73. Командрова H. А., Томшич С. В., Исаков В. В., Романенко JI. А. // Биохимия 1998. Т. 63. С. 1200-1204.

74. Rougeaux H., Guezennec J., Carlson R. W., Kervarec N., Pichon R., Talaga P. // Carbohydr. Res. 1999. V. 315. P. 273-285.

75. Горшкова P. П., Назаренко E. Jl., Исаков В. В., Зубков В. А., Горшкова Н. М., Романенко Л. А., Иванова Е. П. // Биоорг. хим. 1998. Т. 24. С. 839-841.

76. Muldoon J., Perepelov А. V., Shashkov A. S., Gorshkova R. P., Nazarenko E. L., Zubkov V. A., Ivanova E. P., Knirel Y. A., Savage A. V. // Carbohydr. Res. 2001. In press.

77. Knirel Y. A., Senchenkova S. N., Jansson P.-E., Weintraub A., Ansaruzzaman M., Albert M. J. // Eur. J. Biochem. 1996. V. 238. P. 160-165.

78. Cox A. D., Perry M. B. // Carbohydr. Res. 1996. V. 290. P. 59-65.

79. Knirel Y. A. // CRC Crit. Rev. Microbiol. 1990. V. 17. P. 273-304.

80. Vinogradov E. V., Knirel Y. A., Shashkov A. S., Kochetkov N. K. // Carbohydr. Res. 1987. V.170. P. C1-C4.

81. Kenne L., Lindberg В., Schweda E., Gustafsson В., Holme T. // Carbohydr. Res. 1988. V. 180. P. 285-294.

82. Hermansson K„ Jansson P.-E., Holme Т., Gustavsson B. // Carbohydr. Res. 1993. V. 248. P. 199-211.

83. Kondo S., Sano Y., Isshiki Y., Hisatsune K. // Microbiology 1996. V. 142. P. 2879-2885.

84. Sano Y„ Kondo S., Isshiki Y., Shimada Т., Hisatsune K. // Microbiol. Immunol. 1996. V. 40. P. 735-741.

85. Stamm W. E. // in Clinical infection diseases: a practical approach, Oxford University Press, New York. 1999. P. 549-656.

86. Wilson C., Thakore A., Isenberg D., Ebringer A. // Rheumatol. Intern. 1997. V. 16. P. 187189.

87. Larsson P. // Methods Microbiol. 1984. V. 14. P. 187-214.

88. Penner J. L., Hennessy C. // J. Clin. Microbiol. 1980. V. 12. P. 304-309.

89. Knirel Y. A., Vinogradov E. V., Shashkov A. S., Sidorczyk Z., Rozalski A., Radziejewska-Lebrecht I., Kaca W. // J. Carbohydr. Chem. 1993. V. 12. P. 379-414.

90. Knirel Y. A., Kaca W., Rozalski A., Sidorczyk Z. // Polish J. Chem. 1999. V. 73. P. 895-907.

91. Dumanski A. J., Hedelin H., Edin-Liljegren A., Beauchemin D., McLean R. J. C. // Infect. Immun. 1994. V. 62. P. 2998-3003.

92. Cedzynski M., Swierzko A. S., Ziolkowski A., Rozalski A., Kaca W., Paramonov N. A., Vinogradov E. V., Knirel Y. A. // Microbiol. Immunol. 1998. V. 42. P. 7-14.

93. Yao Z., Valvano M. A. // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 4133-4143.

94. Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Vinogradov E. V., Zatonsky G. V., Knirel Y. A., Literacka E., Kaca W. // Carbohydr. Res. 2000. V. 329. P. 453-457.

95. Kondakova A. N., Perepelov A. V., Bartodziejska В., Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Wykrota M., Knirel Y. A., Rozalski A. // Carbohydr. Res. 2001. In press.

96. Knirel Y. A., Kochetkov N. K. // FEMS Microbiol. Rev. 1987. V. 46. P. 381-384.

97. Torzewska A., Kondakova A. N., Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Shashkov A. S., Rozalski A., Knirel Y. A. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2001. In press.

98. Тукач, Ф. В., Кондакова A. H., Арбатский Н. П., Сенченкова С. Н., Шашков А. С., Книрель Ю. А., Чих, К., Сидорчик 3. // Биохимия 2001. В печати.

99. Vinogradov Е. V., Sidorczyk Z., Swierzko A., Rozalski A., Daeva Е. D., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Kochetkov N. К. //Eur. J. Biochem. 1991. V. 197. P. 93-103.

100. Haruhiko Т., Kotani S., Tanaka S., Ogawa Т., Takahashi I., Tsujimoto M., Komuro Т., Shiba Т., Kusumoto S., Kusunose N., Hasegawa A., Kiso M. // Eur. J. Biochem. 1988. V. 175. P. 573-580.

101. Шашков А. С., Тукач Ф. В., Сенченкова С. Н., Жолковски, А., Парамонов Н. А., Каца В., Книрель Ю. А., Кочетков Н. К. // Биохимия 1997. Т. 62. С. 509-513.

102. Kocharova N. A., Vinogradov Е. V., Borisova S. A., Shashkov A. S., Knirel Y. А. // Carbohydr. Res. 1998. V. 309. P. 131-133.

103. Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Shashkov A. S., Rozalski A., Knirel Y. A. // Carbohydr. Res. 2002. В печати.

104. Shashkov A. S., Arbatsky N. P., Toukach F. V., Knirel Y. A., Moll H., Zahringer U., Zych K, Sidorczyk Z. // Eur. J. Biochem. 1999. V. 261. P. 392-397.

105. Zych K., Knirel Y. A., Paramonov N. A., Vinogradov E. V., Arbatsky N. P., Senchenkova S. N., Shashkov A. S., Sidorczyk Z. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. V. 21. P. 1-9.

106. Zych K., Kowalczyk M., Toukach F. V., Paramonov N. A., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Sidorczyk Z. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1997. V. 45. P. 435-441.

107. Vinogradov E. V., Kaca W., Knirel Y. A., Rozalski A., Kochetkov N. K. // Eur. J. Biochem.1989. V. 180. P. 95-99.

108. Rundlof Т., Widmalm G. // Anal. Biochem. 1996. V. 243. P. 228-233.

109. Shashkov A. S., Kondakova A. N., Senchenkova S. N., Zych K., Toukach F. V., Knirel Y. A., Sidorczyk Z. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 601-605.

110. Vinogradov E. V., Kaca W., Shashkov A. S., Krajewska-Pietrasik D., Rozalski A., Knirel Y. A., Kochetkov N. K. //Eur. J. Biochem. 1990. V. 188. P. 645-651.

111. Amano K.-I., Cedzynski M., Swierzko A. S., Kyohno K., Kaca W. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1996. V. 44. P. 235-240.

112. Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Shashkov A. S„ Kaca W., Knirel Y. A. // Carbohydr. Res. 2002. Submitted for publication.

113. Bock K., Pedersen C. // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1983. V. 41. P. 27-66.

114. Knirel Y. A., Paramonov N. A., Shashkov A. S., Kochetkov N. K„ Yarullin R. G., Farber S. M., Efremenko V. I. // Carbohydr. Res. 1992. V. 233. P. 185-193.

115. Lipkind G. M., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Vinogradov E. V., Kochetkov N. K. // Carbohydr. Res. 1988. V. 175. P. 59-75.

116. Jansson P.-E., Kenne L., Widmalm G. // Carbohydr. Res. 1989. V. 188. P. 169-191.

117. Shashkov A. S., Lipkind G. M., Knirel Y. A., Kochetkov N. K. // Magn. Reson. Chem. 1988. V. 26. P. 735-747.

118. Sojar H. T., Bahl O. P. //Arch. Biochem. Biophys. 1987. V. 259. P. 51-57.

119. Woodward H. D., Ringler N. J., Selvakumar R. R., Simet I. M., Bhavanandan V. P., Davidson E. A. //Biochemistry 1987. V. 26. P. 5315-5322.

120. Edge A. S. B., Faltynek C. R., Hof L., Rechert L. E. Jr., Weber P. // Anal. Biochem. 1981.1. V. 118. P. 131-137.

121. Youschimizu M., Kimura T. // Fish. Pathol. 1999. V. 10. P. 243-259.

122. Westphal 0., Jann K. // Methods Carbohydr. Chem. 1965. V. 5. P. 83-91.

123. Gerwig G. J., Kamerling J. P., Vliegenthart J. F. G. // Carbohydr. Res. 1978. V. 62. P. 349-357.

124. Leontein K„ Lindberg B., Lonngren J. // Carbohydr. Res. 1978. V. 62. P. 359-362.

125. Gerwig G. J., Kamerling J. P., Vliegenthart J. F. G. // Carbohydr. Res. 1979. V. 77. P. 1-7.

126. Conrad H. E. // Methods Carbohydr. Chem. 1972. V. 6. P. 361-364.

127. Jansson P.-E., Kenne L., Schweda E. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1987. P. 377-383.

128. Lambden P. R., Heckels J. E. // J. Immunol. Methods 1982. V. 48. P. 233-240.

129. Fujioka M., Tanaka M. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 90. P. 297-300.

130. Garegg P. J., Jansson P.-E., Lindberg B., Lindh F., Lonngren J., Kvarnstrom I., Nimmich

131. W. // Carbohydr. Res. 1980. V. 78. P. 127-132.

132. Knirel Y. A., Paramonov N. A., Vinogradov E. V., Kochetkov N. K., Sidorczyk Z., Zych K. // Carbohydr. Res. 1994. V. 259. P. C1-C3.