Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Быстрова, Ольга Витальевна

• Быстрова, Ольга Витальевна
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Быстрова, Ольга Витальевна

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Общее строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

2.2. Строение области кора липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

2.2.1. Семейство Aeromonadaceae.

2.2.1.1. Род Aeromonas

2.2.2. Семейство Alcaligenaceae.

2.2.2.1. Род Bordetella

2.2.3. Семейство Alteromonodaceae.

2.2.3.1. Род Shewanella

2.2.4. Семейство Bradyrhizobiaceae.

2.2.4.1. Род Bradyrhizobium

2.2.5. Семейство Burkholderiaceae.

2.2.5.1. Род Burkholderia

2.2.6. Семейство Campylobacteraceae.

2.2.6.1. Род Campylobacter

2.2.7. Семейство Chlamydiaceae.

2.2.7.1. Род Chlamydia

2.2.8. Семейство Enterobacteriaceae.

2.2.8.1. Род Citrobacter

2.2.8.2. Род Erwinia

2.2.8.3. Род Escherichia

2.2.8.4. Род Hofnia

2.2.8.5. Vor Klebsiella

2.2.8.6. Род Proteus

2.2.8.7. Род Plesiomonas

2.2.8.8. Род Salmonella

2.2.8.9. Род Shigella

2.2.8.10. Род Serratia

2.2.8.11. Род Yersinia

2.2.9. Семейство Francisellaceae.

2.2.9.1. Род Francisella

2.2.10. Семейство Helicobacteriaceae.

2.2.10.1. Род Helicobacter

2.2.11. Семейство Legionellaceae.

2.2.11.1. Род Legionella

2.2.12. Семейство Moraxellaceae.

2.2.12.1. Род Acinetobacter

2.2.12.2. Род Moraxella

2.2.13. Семейство Neisseriaceae.

2.2.13.1. Род Neisseria

2.2.14. Семейство Pasteurellaceae.

2.2.14.1. Род Haemophilus

2.2.14.2. Род Histophilus

2.2.14.3. Род Mannheimia

2.2.15. Семейство Pseudomonadaceae.

2.2.15.1. Род Pseudomonas

2.2.16. Семейство Rhizobiaceae.

2.2.16.1. Род Agrobacterium

2.2.16.2. Род Rhizobium

2.2.16.3. Род Sinorhizobium

2.2.17. Семейство Vibrionaceae.

2.2.17.1. Род Vibrio

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa»

Род Pseudomonas семейства Pseudomonadaceae объединяет грамотрицательные микроорганизмы, занимающие в природе различные экологические ниши. В их числе находится синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa - условно-патогенный микроорганизм, проявляющий себя при состояниях, связанных с резким угнетением иммунной системы, часто вследствие термических ожогов и хирургических операций, а также при предрасполагающих заболеваниях, таких как муковисцидоз и рак.Липополисахарид (ЛПС) является одним из основных компонентов наружной мембраны клеточной оболочки грамотрицательных бактерий и общепризнанным фактором их патогенности. ЛПС играет важную роль во взаимодействии бактерий с окружающей средой, включая организм хозяина, по отношению к которому он проявляет себя как эндотоксин и антиген. Септический шок, вызываемый эндотоксином, остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и высокой летальности. Вместе с тем эндотоксин способен оказывать и благотворное влияние, стимулируя неспецифическую устойчивость организма к бактериальным инфекциям.ЛПС имеет сложное строение, включая в себя три различные по составу и функциональному назначению области - 0-полисахарид (0-антиген), липидный участок, - так называемый, липид А и соединяющий их олигосахарид, называемый кором.Изучение строения ЛПС необходимо для понимания на молекулярном уровне патофизиологических процессов, происходящих при бактериальных инфекциях, и механизмов функционирования защитных систем животных и человека.Особый интерес к кору ЛПС Р. aeruginosa связан с тем, что он является бактериальным лигандом, ответственным за узнавание микроорганизма рецепторами эпителиальных клеток. Узнавание и последующее поглощение бактериальных клеток являются важными этапами процесса очистки слизистой оболочки дыхательных путей при хронической респираторной инфекции, вызываемой Р. aeruginosa у больных муковисцидозом. Потенциальное терапевтическое значение может иметь препарат полного кора, под действием которого улучшается способность эпителиальных клеток поглощать бактерии Р. aeruginosa за счет продуцирования большего числа рецепторов.Другим перспективным подходом к лечению инфекционных заболеваний представляется использование протективных антител к кору ЛПС Р. aeruginosa, имеющему сходную структуру у всех штаммов. Предполагается, что увеличение устойчивости микроорганизма к клеточному поглощению, способствующее поддержанию хронической инфекции, связано с изменениями в строении кора и липида А. Таким образом, выяснение строения кора и липида А имеет большое значение для понимания того, как бактерия инициирует и поддерживает хроническую инфекцию, и для создания новых терапевтических подходов для борьбы с ней.В то время как у больных муковисцидозом хроническая инфекция вьвывается шероховатыми штаммами, ЛПС которых лишен 0-полисахаридной цепи, больные с ослабленной иммунной системой страдают от синегнойной инфекции, которая вызывается гладкими штаммами Р. aeruginosa, продуцирующими полный ЛПС. Эти штаммы являются серологически гетерогенными, и их классифицируют на основе иммуноспецифичности ЛПС, которая определяется тонкой структурой 0-полисахаридной цепи, 0-Полисахариды построены из повторяющихся олигосахаридных звеньев, причем установлено, что наибольший вклад в иммуноспецифичность вносит терминальный участок последнего повторяющегося звена, находящегося на невосстанавливающем конце цепи. В связи с этим важной задачей является также установление строения О-полисахаридов различных 0-серогрупп Р. aeruginosa, включая структуру, так называемого, биологического повторяющегося звена - олигосахарида путем полимеризации которого в процессе биосинтеза ЛПС образуется высокомолекулярный 0-полисахарид. Данные о структуре биологического повторяющегося звена, а также о строении области связывания 0-полисахарида с кором ЛПС способствуют лучшему пониманию путей биосинтеза ЛПС, а также генетических и биохимических механизмов диверсификации поверхностных структур микробной клетки.Липополисахариды Р. aeruginosa систематически изучаются с 70-х годов, и к началу нашей работы было установлено строение химических повторяющихся звеньев О-полисахаридов типовых штаммов всех 0-серогрупп Р. aeruginosa, а также липида А. В то же время структура биологического повторяющегося звена бьша установлена лишь для одного 0-полисахарида, а данные о строении олигосахарида кора были неполными и в некоторых аспектах противоречивыми.Целью настоящей работы было выяснение строения кора ЛПС клинического изолята Р. aeruginosa от больного муковисцидозом и типовых штаммов серогрупп Р. aeruginosa, строения биологических повторяющихся звеньев О-полисахаридов всех 0-серогрупп Р. aeruginosa, а также места присоединения и типа связи между 0-полисахаридом и кором. В результате этой работы впервые удалось установить полную структуру ЛПС Р. aeruginosa, выявить консервативные и вариабельные элементы структур кора и О-полисахаридов, а также сделать ряд выводов о молекулярных основах иммуноспецифичности и об особенностях биосинтеза ЛПС этих бактерий.Диссертация включает "Литературный обзор", в котором дана общая характеристика ЛПС грамотрицательных бактерий, приведены данные о структурах кора бактерий, принадлежащим к различным семействам и родам, и выявлены общие и специфические особенности строения этой части ЛПС. В главе "Результаты" дано соответствие между некоторыми из существующих схем серологической классификации Р. aeruginosa и описана общая стратегия структурного анализа ЛПС, включая различные подходы к деградации ЛПС, а также химические, масс-спектрометрические и ЯМР-спектроскопические методы исследования. Во второй части этой главы приведены особенности и результаты структурного анализа каждого из исследованных штаммов Р. aeruginosa. В главе "Обсуждение результатов" проведен сравнительный анализ установленных в ходе работы структур с привлечением лит. данных по этой теме и обсуждается значение полученных результатов для понимания биологической роли и путей биосинтеза ЛПС Р. aeruginosa. В экспериментальной части описано выделение ЛПС и его компонентов и приведены методики их структурного анализа.Работа была поддержана грантами РФФИ 02-04-04005, АФГИР RN1-422 и RB1-2042, ННИО 436 RUS 113/314/0-3 и ИНТАС YS 2001-2/6, а также Грантами поддержки ведущих научных школ РФ 00-15-97373 и НШ-1557.2003.3. Часть работы по изучению кора и липида А была проведена в Центре медицины и биологических наук Исследовательского центра Борстеля (Борстель, Германия). Результаты работы опубликованы в шести статьях [1-6] и тезисах трех докладов [7-9] и бьши представлены автором в виде стендовых и устного доклада на XX Международном симпозиуме по углеводам (Гамбург, Германия, 2000 г.), XI и XII Европейских симпозиумах по углеводам (Лиссабон, Португалия, 2001 г.; Гренобль, Франция, 2003 г.) и II Германо-польскороссийской конференции по бактериальным углеводам (Москва, 2002 г.).Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.х.н. Юрию Александровичу Книрелю за постановку задачи, определение основных направлений работы, помощь при интерпретации результатов и подготовке статей для печати. Автор благодарит проф. Александра Степановича Шашкова за съемку и помощь в интерпретации спектров ЯМР, Буко Линднера, Хермана Моля и Анну Николаевну Кондакову за съемку масс-спектров, к.х.н. Нину Алексеевну Кочарову за передачу своего опыта проведения химических экспериментов, зав. лаб. химии углеводов проф.Владимира Николаевича Шибаева за внимание к работе и обсз^ждение ее биосинтетических аспектов. Автор искренне признателен академику Николаю Константиновичу Кочеткову за интерес к работе, а также коллективу Лаборатории химии углеводов за товарищескую поддержку.2. ЛИТЕРАТУРНЬШ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Быстрова, Ольга Витальевна

выводы

1. Установлена полная структура липополисахарида P. aeruginosa, включая строение липида А, олигосахарида кора и О-полисахарида.

2. Показано, что существование двух гликоформ кора, только к одной из которых может присоединяться О-полисахарид, является общей структурной особенностью липополисахаридов шероховатого и гладких штаммов P. aeruginosa.

3. Впервые продемонстрировано присутствие О-ацетильных групп и случайный характер их распределение во внешней области кора в основном на терминальном остатке рамнозы. Определены места присоединения фосфатных групп и дифосфоэтаноламина на остатках гептозы внутренней области кора.

4. Установлено строение биологических повторяющихся звеньев О-полисахаридов в одиннадцати серогруппах P. aeruginosa (из них в девяти серогруппах впервые). Тем самым выявлены моносахариды, находящиеся на невосстанавливающем конце О-полисахаридов и вносящие наибольший вклад в иммуноспецифичность бактерий.

5. Найдено, что первым моносахаридом повторяющихся звеньев О-полисахаридов одиннадцати серогрупп P. aeruginosa является Ы-ацетил-6-дезокси-0-гексозамин, который вне зависимости от конфигурации его связи во внутренних повторяющихся звеньях О-полисахаридов присоединяется к остатку рамнозы кора ß-гликозидной связью. Эти данные свидетельствуют о сходстве путей биосинтеза О-полисахаридов различных серогрупп.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Быстрова, Ольга Витальевна, 2004 год

1. Bystrova,O.V., Lindner,В., Moll,H., Kocharova,N.A., Knirel,Y.A., Zähringer,U., Pier,G.B. (2003) Structure of the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa 0-12 with a randomly O-acetylated core region. Carbohydr. Res. 338, 1895-1905.

2. Быстрова,О.В., Линднер,Б., Моль X., Кочарова,Н.А., Шашков,А.С., Книрель,Ю.А., Цэрингер,У., Пайер,Дж.Б. (2004) Полное строение липополисахарида Pseudomonas aeruginosa иммунотипа 5. Биохимия, 69,211-217.

3. Bystrova,O.V., Lindner,В., Kocharova,N.A., Shashkov,A.S., Knirel,Y.A., Zähringer,U., Pier,G.B. (2003) Lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa: conserved and variable structural features. Abstr. Xllth Eur. Carbohydr. Symp. 188.

4. Bystrova,O.V., Shashkov,A.S., Kocharova,N.A., Knirel,Y.A., Lindner,В., Zähringer,U., Pier,G.B. (2001) Studies on the lipopolysaccharide core and O-chain structures in Pseudomonas aeruginosa immunotype 1. Abstr. Xlth Eur. Carbohydr. Symp. PB027.

5. Raetz,C.R.H. (1990) Biochemistry of endotoxins. Ann. Rev. Biochem. 59,129-170.

6. Holst,O., Ulmer,A.J., Brade,H., Flad,H.D., Rietschel,E.T. (1996) Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxins. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16, 83-104.

7. Zähringer,U., Lindner,В., Rietschel,E.T. (1994) Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 50,211-276.